Bu çalışma Scripps Mikroarray Core Tesisleri&#39;nde, ve Centers for Disease Control (JCP) bir sözleşme ile kısmen desteklenmiştir. RPdV Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü (NWO) bir Rubicon ve VENI hibe bir alıcı. NIGMS hibe GM62116 (JCP) tarafından finanse Konsorsiyumu Fonksiyonel Glikomik için (http://www.functionalglycomics.org/) Bu çalışmada kullanılan çeşitli glikan sağladı. Bu Scripps Araştırma Enstitüsü&#39;nden yayın 29.113 olduğunu.

NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm aşamalar oda sıcaklığında gerçekleştirilir. 1. Dizi İnşaat <ol><li> Glycan Hazırlama ve Plaka Kur <ol><li> baskı tampon stok hazırlayın. Ana dibazik sodyum fosfat, 150 mM stok çözeltisi, 500 ml yapmak. Ayrıca monobazik sodyum fosfat solüsyonu, 150 mM&#39;lik bir stok çözeltiden 50 ml yapmak. Bir şişe içinde, 8.5 olan bir pH elde edilene kadar yavaş yavaş monobazik çözeltisi ile iki bazlı sodyum fosfat çözeltisi titre, karıştırma çubuğu ve pH metre manyetik kullanılmıştır. % 0.005 Tween-20 ekleyin. </li><li> glıkan örnekleri hazırlayın. Paa konjüge glikanlar, (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA), 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA) ve 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA (Şekil 1A seyreltilir )) 100 ug seyreltilmiş edilecek / step1.1.1. Tek değerli glıkanlardan tampon baskı mi,diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ- (CH2) 3, NH2, 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - (CH2) 3 NH2) ve 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ - adım 1.1.1 baskı tamponu içinde 100 | iM kadar (CH2) 3, NH2)). Son olarak, ızgara belirteçleri / iniş ışıkları olarak kullanmak için, amin işlevselleştirilmiş boyaları hazırlar. Boya işaretleyici noktalar 1 uM&#39;de yazdırılır. NOT: Atto488-NHS boya bizim baskı kullanılmaktadır. Ancak, sürgülü tarayıcı tarafından okunabilen herhangi bir amin işlevselleştirilmiş boya bu amaç için uygundur. </li><li> Transfer baskı robot için kullanılan 384-çukurlu mikrotiter plakalarına her glıkan örnek 10 ul. sızdırmaz tüplerde -20 ° C&#39;de baskı tampon çözeltisi içinde Kullanılmayan glıkanlar. Tansfer baskı plakasına boya marker 10 ul. </li></ol></li><li> Baskı NOT: Tüm steps endişe dokunmadan veya eldiven ile yapılmalıdır slaytlar hareket olduğunu. <ol><li> düzeni doğru yapılandırmasına göre baskı kafasına arrayer işaretçilerine yerleştirin. Bu düzen için tüm örnekler ve diziler yazdırmak için bir iğne kullanın. Aynı örnek noktaları birbirlerinin yanında tam olarak basılı olmayan şekilde, her bir tarafında, bir özelliğe atlama (özelliği, belirli bir bileşiğin, tek bir nokta olarak tanımlanır), altı blok glikanlar Baskı. NOT: Son kullanıcı yapılandırmasını karar vermelidir. </li><li> çanta, açık kutuları slaytları çıkarın ve her slayt ultra-yüksek saflıkta Azot gazı üfleme yüzeylerinde olabilecek toz parçacıkları veya plastik küçük parçalar çıkartın. arrayer sahnede, yukarı slaytlar istenilen sayıda, kaplamalı tarafı yerleştirin. </li><li> Program arrayer, baskı pimleri ucunda aşırı sıvı kaldırmak için, poli-L-lizin kaplı slaytlar üzerine &quot;ön noktalar&quot; 3 kullanarak, kaynak plakasına ziyaret başına 27 noktalar parametreleri kullanmak <ol><li> MPU (Ana Güç Ünitesi) ve İklim Kontrol Birimi açın. bilgisayarda Açık Fayans Analizi yazılımı. </li><li> Yazdırmak için seçin düzen. 1 tek pin - Seçenek → Pin Aracı dizisi 1 x 1 Yazıcı aracı yazdırmak için kullanılacak seçin. Hedef sekmesi → Aracı Dizi Tanımı → Baskı Desen seçin ve (nokta-to-spot mesafesi), satırlar ve örnekleri karşılamak için sütun sayısı basılacak sahayı ekleyin ve bu dizinin bir 8 için numune baskı kalıbı ( x 8 baskı desen 7 toplam numuneler için 340 mikron sahada) kullanılır. </li><li> Hedef → Slayt Düzeni seçin ve 48-kuyu (4 x 12) slayt şablonuna her kopyalayan dizinin baskı izin bloğu-blok mesafeyi programlamak. Kaynak seçin ve (6 numune kuyuları ve 1 boya işaretleyici iyi karşılamak için kullanılacak olan bu baskı 7 kaynak alıcılar için) (1 pimi kullanırken her bir örnek için 1) kaynak alıcılar sayısını ekleyin. NOT: YEŞİL açmalısınız kaynak diyalog numarası olduğunu göstermek içinKaynak ziyaretleri baskı kalıbı içinde basılacak örnekleri eşleşir. </li><li> Hedef → Adaptör Plakası seçin ve Düzen slayt hazırlama ve sayısını ayarlamak (5 slaytlar 1 ön tespit slayt bu baskı için bir kerede yazdırılır). </li><li> Ön lekelenme slayt (MAVİ) ve &quot;gerçek&quot; slaytlar yerleri yakından ilgilenerek, tepsiyi etkinleştirmek ve tepsiye slaytlar istenilen sayıda eklemek için T1 butonuna tıklayarak tepsiyi serbest bırakın. </li><li> vakum engellemek ve vakum etkinleştirmek için Tamam&#39;a tıklayın kalan tüm vakum portlarında düz cam slaytlar yerleştirin. Tüm slaytlar yerinde tutulur emin olun ve ana konumuna tepsiyi geri dönmek için Tamam&#39;a tıklayın. </li><li> plaka tutucu içine baskı plakasını yükleyin ve raf yerine doğru ayarlanmış olduğundan emin olun. GO tıklayın ve baskı süreci devam etmesine izin. </li></ol></li><li> dizi başına 6 noktalar çoğaltır kalan 24 noktalar (4 diziler / kaynak ziyareti) yazdırın. </li><li> 384 gözlü levhalar yükve yazıcının içine yazdırmaya başlamak. 55 ve% 65 arasında baskı boyunca, baskı sırasında, bağıl nemi muhafaza edin. Yazıcı 5 slaytlar yazdırdıktan sonra durur. NOT: Bu tahlilde mikroarray belirli bir 8 x 8 desen baskılı edilirken, farklı mikroarray baskı robotları istenen düzeni sağlamak için ekipman özel programlama gerektirir. Bu onların ekipmanların özellikleri verilen en uygun desen belirlemek için son kullanıcıya kadar. </li></ol></li><li> Nemlendirme / Sabitleme NOT: slaytlar baskı bitirdikten sonra, geçici bir immobilizasyon adımı olarak da adlandırılan nemlendirme uğrarlar. sonrası baskı nemlendirme yeniden ıslatma noktalar ve tam engelleme sağlayarak örnek eki homojenize yardımcı olur. <ol><li> Hemen 30 dakikalık bir süre için baskı sonra% 100 nem odasında slaytlar koyun. slaytlar, büyük bir cam çanak alt düz çok ıslak kağıt havlu koyarak koyarak odasına ConstructBazı tür bir test tüpü raf, baskı tarafı yukarı olarak raf, tür ve nem tuzak plastik wrap ile sızdırmazlık üzerinde. </li><li> Number kuruma kutusunda bir alkol / solvent dirençli işaretleme kalemi ve mağaza ile slaytlar. Gecede birbirinden ayrılacak. </li></ol></li><li> Numaralandırma, Engelleme ve Depolama <ol><li> 50 mM borat tamponu 50 mM etanolamin - engelleme tampon hazırlayın. İlk olarak, bir manyetik karıştırma çubuğu içeren bir şişe içinde 50 mM nihai konsantrasyona kadar, GKD 2 O, borik asit çözülür. tüm katı çözünene kadar bir karıştırma plakası üzerinde kuvvetli bir şekilde solüsyonu ilave edin. Sürekli karıştırılırken, arzu edilen 50 mM konsantrasyon elde etmek üzere, bir 16.54 M stok çözeltisinden etanolamin uygun miktarda. 9.2&#39;lik bir son pH ayarlamak için konsantre sodyum hidroksit ekleyin. </li><li> 1 saat engelleme tampon çözeltisi içinde basılmış slaytlar daldırın. </li><li> 1 saat sonra, tampon engelleme herhangi bir aşırı izlerini kaldırmak için GKD 2 O slaytlar durulayın.Uygun bir atık konteynerine engelleme tampon imha edin. </li><li> Cam boyama sahiplerine slaytlar aktarın ve kuru dönerler. 5 dakika için 10 x g hızında, sallanma plaka tutucular ile donatılmış bir santrifüje yerleştirerek Kuru diziler. </li><li> slaytlar kuru sonra, hemen kuluçkaya veya saklanabilir. Depolama koşulları kapalı bir plastik torba içinde -20 ° C &#39;dir. </li></ol></li></ol> 2. Analiz Glycan Bağlayıcı Proteinler <ol><li> diziler uyacak hibridize edilecek olan nemlendirilmiş bir odada hazırlayın. Basit bir bölme nemlendirilmiş kağıt havlu ve slaytlar dinlenme olacak bunun üzerine bir raf ile alt katmanlı bir Pyrex çanak oluşur. </li><li> Biyotinile lektinler kullanarak, SNA (Sambuka nigra aglutinin) ve tampon tarama 10 ug Streptavidin-555 boya / ml + 2 ug / ml ECA (Erythrina cristagalli aglutinin), (PBS +% 0.01 Tween-20). HA (bu örnekte A / Vietnam / 1203-1204 H5N1 A / KY / 07 H1N1), kullanım içinDaha önce tarif edildiği gibi 34, 20 ug bir başlangıç ​​konsantrasyonu mi, önceden kompleks /. Fare-α-Strep: Kısaca, bir HA hale blokaj tamponunda Keçi α-fare-Alexa647 karışımı (PBS +% 3 BSA +% 0.01 Tween-20), bir, 4: 2: 1 mol oranında. NOT: Dizi lektinler ile incelendi glukanlardır hareketsiz ve algılanabilir (Şekil 1B) olduğunu tespit etmek için. </li><li> 384 plaka 20 ul glıkan bağlayıcı protein-antikor karışımı çözeltisini ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. tampon 10 ul örnek 10 ul karıştırılarak, bunların uygun bir tampon, 8 kez, 1: seri olarak lektin ve HA örnekleri 1 seyreltin. </li><li> Pipet 8 mikro-çukurlu yüzeye örnek ul ve 90 dakika için sızdırmaz nemlendirme (% 100 bağıl nem) odasında inkübe edilir. </li><li> Deiyonize H2O kenarları tutarak ve bir PBS karışımı ve% 0.05 Tween içinde dört kez onları daldırılarak seferinde slaytlar bir yıkama, PBS içinde daha sonra dört kez, ve son olarak da dört defa kullanmaengelleme adımında tarif edilen aynı kurutma protokolünü 10 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje diziler kuru dönerler. </li></ol> 3. Tarama ve Veri Analizleri NOT: glikan mikroarrayler mikrodizin tarayıcının üreticisine bağlı olarak, farklı ayarlarla taranabilir. Lazer gücü ve çözünürlüğü değiştirilerek, enstrüman dinamik aralık (Şekil 1C) içinde mümkün olduğunca çok sayıda sinyallerle bir görüntü üretebilir. <ol><li> Bir floresan slayt tarayıcı kullanın ve hemen glikan bağlama proteinleri ile inkübasyondan sonra diziler tarayın. slayt doğru tarama cihazına yerleştirilir sağlamak için özen gösterin. <ol><li> Açık tarama yazılımı. programı açmak için Başlat düğmesini tıklatın. Tarayıcı navigasyon paneli menüsünde Tarayıcı → Bağlan ya da yeşil renkli: tarayıcıya bağlayın. </li><li> Tarayıcının açık robotu kapı. belirli bir düzen içinde robotun yuvalara slaytlar yerleştirin. Kapat autoloader kapı. Clauto Araçlar navigasyon panelindeki Tran &quot;okuma yükleyici&quot; tarayıcı slaytlar algılar. </li><li> Set tarama parametresi: deney (örneğin 635 lazer gücü yüksek, algılama kazanç% 50) uygun Tarayıcı → Tarama parametreleri. Tarama slaytlar: Tarayıcı → taraması. Tarama görüntüleri ve adı bireysel taramaları kaydetmek için bir klasör oluşturarak yolu seçin. Gerçek tarama için bu önceden yapın. her slayt için tekrarlayın. Taramayı başlatmak için Tamam&#39;a tıklayın. </li></ol></li><li> slaytları enstrüman kurmak ve taramak için tarayıcı yazılımını kullanın. Set tarayıcı iteratif% 25,% 50 ve% 75 kazanç ayarlarını artan düşük lazer gücü (5 mW) tarama için. NOT: Ayarlar test ve optimize edilmiş, ancak her tarama muhtemelen photobleaching nedeniyle boyaların floresan çıkışını düşürebilirsiniz akılda tutmak olabilir. <ol><li> Açık veri toplama ve mapix yazılımı gibi analiz yazılımı. programı açmak için Başlat düğmesini tıklatın. Açık tarama görüntü: Açık im → Dosyayaş. Açık GAL dosyası: → açık ızgara analiz ve uygun GAL dosyayı seçin. </li><li> bloklar moduna girin: Görüntü → bloklar moduna ızgara taşımak için. slaytta uygun konuma ızgara ayarlamak için ızgara işaretleri kullanabilirsiniz. basılı dizi maç için gerekli bireysel blok ayarlayın. </li><li> noktalar moduna girin: Image noktalar modu → yerini ve blok içinde tek tek noktalar boyutunu ayarlamak için. Bir kez tüm bloklar ve lekeler ayarlanır ve yerinde, ölçü sinyal yoğunlukları ile → fotometrik hesaplamaları analiz edin. Çıktı dosyası olarak kaydedin. </li></ol></li><li> Slaytlar tarama bitirdikten sonra, görüntüler (- G Şekil 1D) yüklü görüntü işleme programı ile sinyallerin bağlanması için analiz edilir. görüntü analizi için, taranmış TIFF resmin üzerine bir GAL (Dizi Listesi) dosyası yükleyin. Not: GAL dosya nokta düzeni desen ve her nokta konumu kimliklerini hem de içerir. diziler için GAL dosyaları crNumunelerin kimliklerini ve 384-kaynak plaka kendi konumunu içeren bir sekme ile sınırlandırılmış metin dosyasını kullanarak yazıcı yazılımı tarafından eated. </li><li> Düzgün GAL ızgara yerleştirmek için mikrodizinlerinde basılı ızgara işaretleyici / iniş ışıkları kullanın. Bireysel noktalar tek tek hareket gerekebilir, ama iyi basılmış dizi genellikle ızgara içinde bloklar kolaylıkla yerleştirilmesini sağlayacaktır. ızgara yerleştirilmesini takiben, yazılım tarafından nokta yoğunlukları toplamak ve bir sekme ile sınırlandırılmış metin dosyası (.txt) olarak kaydedilir. <ol><li> elektronik tablo programı kullanarak, tarayıcıdan çıktı dosyasını açın. klasör konumuna uygun makro dosyasını açın. Görünüm → Makro → MakroÇalıştır tıklayın. NOT: önceden yazılmış, ham çıktı verileri kopyalamak gereksiz satır ve sütunları kaldırmak, numune verileri sıralamak, ortalama sinyaldir eksi arka plan değerlerini hesaplamak ve her biri için grafikleri içeren bir yayılma sayfalık çalışma sayfasına bileşke değerler arsa olacaktır altı samples dizinin üzerinde test. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Tumpey, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-amino+acid+change+in+the+hemagglutinin+of+the+1918+influenza+virus+abolishes+transmission.">A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission.</a> Science. 315 (5812), 655-659 (2007).</li><li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+balance+of+the+hemagglutinin+and+neuraminidase+activities+accompanies+the+emergence+of+the+2009+H1N1+influenza+pandemic.">Functional balance of the hemagglutinin and neuraminidase activities accompanies the emergence of the 2009 H1N1 influenza pandemic.</a> J Virol. 86 (17), 9221-9232 (2012).</li><li>Bouvier, N. M., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+influenza+viruses.">The biology of influenza viruses.</a> Vaccine. 26, D49-D53 (2008).</li><li>Freidl, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+at+the+animal-human+interface:+a+review+of+the+literature+for+virological+evidence+of+human+infection+with+swine+or+avian+influenza+viruses+other+than+A(H5N1).">Influenza at the animal-human interface: a review of the literature for virological evidence of human infection with swine or avian influenza viruses other than A(H5N1).</a> Euro Surveill. 19 (18), (2014).</li><li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+recognition+of+avian-like+receptors+in+human+influenza+A+H7N9+viruses.">Preferential recognition of avian-like receptors in human influenza A H7N9 viruses.</a> Science. 342 (6163), 1230-1235 (2013).</li><li>Paulson, J. C., de Vries, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H5N1+receptor+specificity+as+a+factor+in+pandemic+risk.">H5N1 receptor specificity as a factor in pandemic risk.</a> Virus Res. 178 (1), 99-113 (2013).</li><li>Tzarum, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+receptor+binding+of+the+hemagglutinin+from+a+human+H6N1+influenza+virus.">Structure and receptor binding of the hemagglutinin from a human H6N1 influenza virus.</a> Cell Host Microbe. 17 (3), 369-376 (2015).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human-Infecting+H10N8+Influenza+Virus+Retains+a+Strong+Preference+for+Avian-type+Receptors.">A Human-Infecting H10N8 Influenza Virus Retains a Strong Preference for Avian-type Receptors.</a> Cell Host Microbe. 17 (3), 377-384 (2015).</li><li>Carroll, S. M., Higa, H. H., Paulson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+cell-surface+receptor+determinants+of+antigenically+similar+influenza+virus+hemagglutinins.">Different cell-surface receptor determinants of antigenically similar influenza virus hemagglutinins.</a> J Biol Chem. 256 (16), 8357-8363 (1981).</li><li>Gambaryan, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+receptor-binding+phenotypes+of+influenza+virus+isolates+from+different+hosts+using+synthetic+sialylglycopolymers:+non-egg-adapted+human+H1+and+H3+influenza+A+and+influenza+B+viruses+share+a+common+high+binding+affinity+for+6'-sialyl(N-acetyllactosamine).">Specification of receptor-binding phenotypes of influenza virus isolates from different hosts using synthetic sialylglycopolymers: non-egg-adapted human H1 and H3 influenza A and influenza B viruses share a common high binding affinity for 6'-sialyl(N-acetyllactosamine).</a> Virology. 232 (2), 345-350 (1997).</li><li>Rogers, G. N., D'Souza, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+binding+properties+of+human+and+animal+H1+influenza+virus+isolates.">Receptor binding properties of human and animal H1 influenza virus isolates.</a> Virology. 173 (1), 317-322 (1989).</li><li>Rogers, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+amino+acid+substitutions+in+influenza+haemagglutinin+change+receptor+binding+specificity.">Single amino acid substitutions in influenza haemagglutinin change receptor binding specificity.</a> Nature. 304 (5921), 76-78 (1983).</li><li>Paulson, J. C., Rogers, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resialylated+erythrocytes+for+assessment+of+the+specificity+of+sialyloligosaccharide+binding+proteins.">Resialylated erythrocytes for assessment of the specificity of sialyloligosaccharide binding proteins.</a> Methods Enzymol. 138, 162-168 (1987).</li><li>Paulson, J. C., Sadler, J. E., Hill, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+specific+myxovirus+receptors+to+asialoerythrocytes+by+incorporation+of+sialic+acid+with+pure+sialyltransferases.">Restoration of specific myxovirus receptors to asialoerythrocytes by incorporation of sialic acid with pure sialyltransferases.</a> J Biol Chem. 254 (6), 2120-2124 (1979).</li><li>Chutinimitkul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assessment+of+attachment+pattern+and+replication+efficiency+of+H5N1+influenza+A+viruses+with+altered+receptor+specificity.">In vitro assessment of attachment pattern and replication efficiency of H5N1 influenza A viruses with altered receptor specificity.</a> J Virol. 84 (13), 6825-6833 (2010).</li><li>Glaser, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+amino+acid+substitution+in+1918+influenza+virus+hemagglutinin+changes+receptor+binding+specificity.">A single amino acid substitution in 1918 influenza virus hemagglutinin changes receptor binding specificity.</a> J Virol. 79 (17), 11533-11536 (2005).</li><li>Herfst, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airborne+transmission+of+influenza+A/H5N1+virus+between+ferrets.">Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets.</a> Science. 336 (6088), 1534-1541 (2012).</li><li>Nobusawa, E., Ishihara, H., Morishita, T., Sato, K., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Change+in+receptor-binding+specificity+of+recent+human+influenza+A+viruses+(H3N2):+a+single+amino+acid+change+in+hemagglutinin+altered+its+recognition+of+sialyloligosaccharides.">Change in receptor-binding specificity of recent human influenza A viruses (H3N2): a single amino acid change in hemagglutinin altered its recognition of sialyloligosaccharides.</a> Virology. 278 (2), 587-596 (2000).</li><li>Gambaryan, A. S., Matrosovich, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+solid-phase+enzyme-linked+assay+for+influenza+virus+receptor-binding+activity.">A solid-phase enzyme-linked assay for influenza virus receptor-binding activity.</a> J Virol Methods. 39 (1-2), 111-123 (1992).</li><li>Totani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoenzymatic+synthesis+and+application+of+glycopolymers+containing+multivalent+sialyloligosaccharides+with+a+poly(L-glutamic+acid)+backbone+for+inhibition+of+infection+by+influenza+viruses.">Chemoenzymatic synthesis and application of glycopolymers containing multivalent sialyloligosaccharides with a poly(L-glutamic acid) backbone for inhibition of infection by influenza viruses.</a> Glycobiology. 13 (5), 315-326 (2003).</li><li>Gambaryan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+specificity+of+influenza+viruses+from+birds+and+mammals:+new+data+on+involvement+of+the+inner+fragments+of+the+carbohydrate+chain.">Receptor specificity of influenza viruses from birds and mammals: new data on involvement of the inner fragments of the carbohydrate chain.</a> Virology. 334 (2), 276-283 (2005).</li><li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+specificity+of+influenza+A+viruses+correlates+with+the+agglutination+of+erythrocytes+from+different+animal+species.">Receptor specificity of influenza A viruses correlates with the agglutination of erythrocytes from different animal species.</a> Virology. 227 (2), 493-499 (1997).</li><li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+human-type+receptor+binding+specificity+by+new+H5N1+influenza+virus+sublineages+during+their+emergence+in+birds+in+Egypt.">Acquisition of human-type receptor binding specificity by new H5N1 influenza virus sublineages during their emergence in birds in Egypt.</a> PLoS Pathog. 7 (5), e1002068 (2011).</li><li>Chandrasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+topology+determines+human+adaptation+of+avian+H5N1+virus+hemagglutinin.">Glycan topology determines human adaptation of avian H5N1 virus hemagglutinin.</a> Nat Biotechnol. 26 (1), 107-113 (2008).</li><li>Blixt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printed+covalent+glycan+array+for+ligand+profiling+of+diverse+glycan+binding+proteins.">Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (49), 17033-17038 (2004).</li><li>Childs, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-binding+specificity+of+pandemic+influenza+A+(H1N1)+2009+virus+determined+by+carbohydrate+microarray.">Receptor-binding specificity of pandemic influenza A (H1N1) 2009 virus determined by carbohydrate microarray.</a> Nat Biotechnol. 27 (9), 797-799 (2009).</li><li>Nycholat, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+Sialylated+Poly-N-acetyllactosamine+Chains+on+N-+and+O-Linked+Glycans+by+Human+and+Avian+Influenza+A+Virus+Hemagglutinins.">Recognition of Sialylated Poly-N-acetyllactosamine Chains on N- and O-Linked Glycans by Human and Avian Influenza A Virus Hemagglutinins.</a> Angew Chem Int Ed Engl. , (2012).</li><li>Rillahan, C. D., Paulson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+microarrays+for+decoding+the+glycome.">Glycan microarrays for decoding the glycome.</a> Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).</li><li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sialylated+glycan+microarray+reveals+novel+interactions+of+modified+sialic+acids+with+proteins+and+viruses.">A sialylated glycan microarray reveals novel interactions of modified sialic acids with proteins and viruses.</a> J Biol Chem. 286 (36), 31610-31622 (2011).</li><li>Gulati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+H3N2+Influenza+Viruses+Isolated+from+1968+To+2012+Show+Varying+Preference+for+Receptor+Substructures+with+No+Apparent+Consequences+for+Disease+or+Spread.">Human H3N2 Influenza Viruses Isolated from 1968 To 2012 Show Varying Preference for Receptor Substructures with No Apparent Consequences for Disease or Spread.</a> PLoS One. 8 (6), (2013).</li><li>Stevens, J., Blixt, O., Paulson, J. C., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+microarray+technologies:+tools+to+survey+host+specificity+of+influenza+viruses.">Glycan microarray technologies: tools to survey host specificity of influenza viruses.</a> Nat Rev Microbiol. 4 (11), 857-864 (2006).</li><li>de Vries, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+hemagglutinin+protein+of+the+new+pandemic+H1N1+influenza+virus:+maintaining+optimal+receptor+binding+by+compensatory+substitutions.">Evolution of the hemagglutinin protein of the new pandemic H1N1 influenza virus: maintaining optimal receptor binding by compensatory substitutions.</a> J Virol. 87 (24), 13868-13877 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+receptor+binding+preferences+of+recombinant+human+A(H3N2)+virus+hemagglutinins.">Structure and receptor binding preferences of recombinant human A(H3N2) virus hemagglutinins.</a> Virology. 477, 18-31 (2015).</li><li>de Vries, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influenza+A+virus+hemagglutinin+glycosylation+state+affects+receptor-binding+specificity.">The influenza A virus hemagglutinin glycosylation state affects receptor-binding specificity.</a> Virology. 403 (1), 17-25 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

IAV reseptör özgüllüğünü değerlendirmek kuş virüslerinin pandemik potansiyeli analizinde önemli bir adımdır. virüs, sialik asit tanıma bu hücreden bağlanarak ve salma gibi biyolojik özellikleri ile bağlantılıdır. kuş virüsleri bağlayıcı α2-6 ulaşmak ve türlerin bariyer pandemik hazırlık sağlayan geçmek için Bilgi amino asit mutasyonları gereklidir. Çeşitli deneyler reseptör özelliklerini belirlemek için kullanılır; Ancak, tüm tersi sadece ölçüm avidite ve özgünl?...

Yabani kuşları IAV doğal rezervuarı vardır, ama IAV kümes hayvanları ve insanlar da dahil olmak üzere memelilerde, türün engelini geçmek edebilmektedir. İnsan virüsler α2-6 bağlantılı sialik asitleri (insan-tipi reseptörler) bağlamak oysa Kuş iAVS, α2-3 bağlantılı sialik asitleri (avian tip reseptörler) tanır. Etkin bir şekilde çoğaltılması ve avyan IAV insan tipi reseptör 1 bağlanma ihtiyacı insanlar arasında aktarabilmelidir için. IAVS kendi hemagglutinin (HA) ve nöraminidaz (NA) zarf glikoproteinler antijenliğini karakterize seroloji dayalı ayrılır. UA, viral yaşam çevrimi ve yarılır sialik asit 2 diğer ucunda reseptör imha edici enzim ise HA, sialik asitleri bağlanır. H1N1, H2N2 ve H3N2 dahil olmak üzere tüm insan bulaşmasını virüsleri, bir kuş kökeni 3 var. İnsan geçitler birkaç kuş yıllardır son iki aşkın H5N1, H7N7, H7N9 ve ile meydana gelmiş olan en iyi bilinen; however, diğer alt tipler daha düzensiz insanları enfekte olan (H6N1, H7N1, • H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. Neyse ki, bu virüslerin hiçbiri tam olarak insan tipi α2-6 bağlı sialik asit reseptörleri 5-8 adapte olmuş gibi görünüyor. kuş ya da diğer zoonotik virüslerin Adaptasyon insan sağlığı üzerinde yıkıcı bir etkisi olabilir insan konaklarda çoğaltma ve iletim karşılamak için. Bu nedenle, bu virüsler ortaya çıkan grip virüslerinin dünya çapında gözetim yardımcı olacak insan tipi reseptörlere bağlanmasının gelişen nasıl ön bilgi. Reseptör tercihi belirlenmesi ilk farklı türlerin eritrositler kullanılarak aydınlatılmıştır ve grip araştırmacılar 9-12 arasında bir tercih tahlil kalır oldu. avyan virüs α2-3 sialik asit ve sialik asit bağlantılı α2-6 insan virüsleri tanır gösterim orijinal enzimatik li her ihtiva edecek şekilde eritrositlerin hemaglutinasyonu kullanılarak bir deneyde dayalı13,14 nkages. okuma hemaglütinasyon, virologists için standart bir deney olsa da, altta yatan glıkan yapıları, sadece uç bağlantısı tanımlanmış değildir. Ayrıca, hücrelerin yeniden sialylate için kullanılan Sıyalıltransferazlar, sınırlı kullanılabilirlik, bu testte 15-18 kullanımını kısıtlamıştır. Daha sonra, reseptör bağlanma tercihleri ​​belirleyen diğer yöntemler plaka bazlı tahlillerde 19,20 poli-akrilamid (PAA) ya da poli-glutamat (PGA) yapılarıyla bağlantılı sialilatlı glıkan yapıları kullanılarak eklenir. Çeşitli varyasyonlarının, sağlam, güvenilir ve çok hassas ELISA tipi deney 21-23 sonuçlanan, her biri mikrotitre plakaları için glikanlar veya virüs ya kaplanması mümkündür. Seçenek olarak ise, biotin bağlantılı glıkanlar PAA / PGA yerini alabilir ve streptavidin kaplı plakalar 2,24 konjuge edilebilir. bazı özel sera gerekli olabilir, ancak ELISA PAA bağlantılı standart ve çeşitli glıkanlar kolaylıkla are commercially ve olmayan piyasada mevcut (Fonksiyonel Glikomik için Konsorsiyumu (http://www.functionalglycomics.org)). Glikan mikroarray teknolojileri çok farklı glukanlardır lekeli olarak, reseptör özgüllüğünü belirlemek için paha biçilmez bir araç olarak ortaya çıkmıştır, ve farklı yapıları geniş bir dizi bağlayıcı tek bir tahlil 25-29 içinde değerlendirilebilir. Bu yapılara IAV bağlanmasının IAV, tercihen 30-33 kabul glıkan yapılarının daha iyi anlaşılmasını sağlar. Glıkan mikroarray&#39;ler bağlayıcı tahlili gerçekleştirmek için örnek hacminin küçük miktarlarda ihtiyaç ve sadece nokta (2 nl) başına glıkanın dakika miktarda kullanır. Ancak, bu diziler genelde glukanlardır reseptörlerinin özgüllüğünü değerlendirmek için sadece kullanılır. Birden fazla konsantrasyon aralıklarında birden virüsler veya hemagglutinin proteinlerin analizi nedeniyle gerekli slaytlar sayısına engelleyici olabilir. Ayrıca, bugüne kadar, hiçbir nispi avidite tahlil glikan ar kullanılarak geliştirilmiştirışını teknikleri. kıyasla glıkan mikrodizi teknikleri ve ELISA bazlı deneylerde PAA-bağlantılı glıkanların duyarlılık elde düşük örnek gereksinimi birleştirmek için, benzer ya da daha iyi çözünürlük ile yüksek verimli analizi için izin verecek bir çok-çukurlu glıkan dizi geliştirmeye çalıştılar geleneksel ELISA bazlı bir deney için. Aynı zamanda, biz tüketilen biyolojik ve raportör kimyasalların miktarını en aza indirmek istedik. Nihai sonuç, özellikle IAV özgüllük izlemek için geliştirilmiş bir minyatür avidite miktar tayini testinde, ve diğer glıkan bağlayıcı proteinleri değerlendirmek için de geçerlidir. Teflon maske ile 48 mikro kuyulara ayrılmış bir cam slayt kullanarak 6 farklı glukanlardır kuyu başına 6 tekrarlı fark vardır. mikroarray platformu reseptörü aynı eğilimler çeşitli avantajlara sahip makro ELISA formatında görülen bağlayıcı tanıyor. Bu çok sayıda satır kaplama, karşı minimum numune kullanılarak (I) 6 tekrar bileşiğin baskı dahil IOyuk başına 100 ul kullanılarak na plakası; (II) çok farklı bileşikler kontrolleri de dahil olmak üzere tek bir kuyuda, aynı anda analiz; (III) bir kuluçkalama hacminde ve büyük bir azalma; (IV) floresan okuma kullanarak daha büyük bir dinamik aralık. Tek bir slayt 18x ​​96 oyuklu plakalara denk olduğu hesaplanabilir. Aşağıdaki protokol imalatı ve analiz herhangi bir laboratuvar özelliğine sahip mikroarray&#39;ler bu minyatür ELISA biçimi üretmek gerekir gördü.

<table><tbody><tr><td>NEXTERION&amp;reg; Slide H MPX-48&amp;nbsp;</td><td>Schott</td><td>1091525</td><td>Microwell slides</td></tr><tr><td>ProScanArray Plus&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>discontinued</td><td>confocal microarray scanner</td></tr><tr><td>Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software</td><td>Innopsys</td><td>-</td><td>confocal microarray scanner</td></tr><tr><td>MicroGrid II&amp;nbsp;</td><td>Digilab</td><td>-</td><td>microaray printer</td></tr><tr><td>SNA</td><td>Vector Labs</td><td>B-1305&amp;nbsp;</td><td>Plant Lectin</td></tr><tr><td>ECA</td><td>Vector Labs</td><td>B-1145&amp;nbsp;</td><td>Plant Lectin</td></tr><tr><td>Anti-Strep Antibody</td><td>IBA</td><td>2-1509-001&amp;nbsp;</td><td>Anitbody for HA binding</td></tr><tr><td>Anti-Mouse Alexa-647</td><td>Life</td><td>A-21235</td><td>Anitbody for HA binding</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287&amp;nbsp;</td><td>detergent</td></tr><tr><td>di-basic Sodium Phosphate</td><td>Sigma</td><td>255793</td><td>printing buffer component</td></tr><tr><td>mono-basic Sodium phosphate</td><td>Sigma</td><td>229903&amp;nbsp;</td><td>printing buffer component</td></tr><tr><td>poly-l-lysine solution</td><td>Sigma</td><td>P8920&amp;nbsp;</td><td>pre-spotting slide component</td></tr><tr><td>sodium hydroxide</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td>pre-spotting slide component</td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Sigma</td><td>493546</td><td>pre-spotting slide component</td></tr><tr><td>phosphate buffered saline</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td>incubation/washing buffer</td></tr><tr><td>SMP4B pins</td><td>Telechem</td><td>SMP4B</td><td>printing pin</td></tr><tr><td>Compressed Nitrogen (Grade5)</td><td>Praxair</td><td>UN1066</td><td>general dusting/drying tool</td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Sigma</td><td>B6768-500G</td><td>Slide blocking reagent</td></tr><tr><td>ethanolamine</td><td>Sigma</td><td>E9508-500ML</td><td>Slide blocking reagent</td></tr><tr><td>Atto 488</td><td>AttoTec</td><td>AD 488-91</td><td>Gridmarker on array</td></tr><tr><td>PAA-LNLN</td><td>Consortium for Functional Glycomics</td><td>PA368</td><td>Spotted glycans</td></tr><tr><td>PAA-3SLNLN</td><td>Consortium for Functional Glycomics</td><td>PA362</td><td>Spotted glycans</td></tr><tr><td>PAA-6SLNLN</td><td>Consortium for Functional Glycomics</td><td>PA343</td><td>Spotted glycans</td></tr><tr><td>LNLN</td><td>Consortium for Functional Glycomics</td><td>Te98</td><td>Spotted glycans</td></tr><tr><td>3SLNLN</td><td>Consortium for Functional Glycomics</td><td>Te175</td><td>Spotted glycans</td></tr><tr><td>6SLNLN</td><td>Consortium for Functional Glycomics</td><td>Te176</td><td>Spotted glycans</td></tr><tr><td>384-well microtiter plate</td><td>Matrix TechCorp</td><td>4361</td><td>Printing plate</td></tr><tr><td>VWR lab marker</td><td>VWR</td><td>52877-150</td><td>Slide Numbering</td></tr><tr><td>Wheaton slide staining dish</td><td>Sigma</td><td>Z103969-1EA</td><td>Blocking and Drying</td></tr></tbody></table>

a miniaturized glycan microarray assay for assessing avidity and specificity of influenza a virus hemagglutinins

fonksiyonel reseptörler hücre içine giriş kazanmak için İnfluenza A virüsü (IAV) hemaglutininler hücre yüzeyinde sialik asitleri tanır. Yabani kuşları IAV için doğal rezervuar, ama IAV kümes hayvanları, domuz, at ve insanlara türler bariyerini geçebilir. Kuş virüsler insan virüsleri tercihen bir α2-6 bağlantı (insan-tipi reseptörler) ile sialik asit tanımak ise bir α2-3 bağlantı (avian tip reseptörler) tarafından sondan galaktoz bağlı sialik asit tanır. avyan virüs insan tipi reseptörlere uyum olup olmadığını izlemek için çeşitli yöntemler kullanılabilir. Sentetik sialosides farklı kütüphaneleri ile glikan mikroarray&#39;ler giderek reseptör özgüllüğünü değerlendirmek için kullanılır. Bununla birlikte, bu teknik, birleşmelere ölçmek için kullanılır. avidite ölçümü tipik olarak geleneksel polipropilen 96 oyuklu plakalara adsorbe glıkanlara seri olarak seyreltilmiş hemaglutinin veya virüs bağlanmasının değerlendirilmesi ile elde edilir. a Bu deneyde, glikanlar2-3 ya α2-6 sialik asitler biyotine bağlı olan ve streptavidin plakaları, adsorbe ya da doğrudan plastik adsorbe poliakrilamid (PAA) kuple edilir edilmiştir. Biz önemli ölçüde doğrudan mikro kuyu cam slaytlar PAA-bağlantılı sialosides ve onların olmayan PAA-bağlantılı muadilleri yazdırarak bu testte küçültülmüş var. tek bir slayt üzerinde 48 dizileri ile bu set-up, 6 glıkan olmayan iki sialilatlı kontrolleri dahil olmak üzere 6 farklı glikanlar, sorguya, 8 dilüsyonlarda bağlayıcı proteinlerin aynı anda tahlilleri sağlar. Bu geleneksel plaka deneyinde 18x 96 oyuklu plakalara eşdeğerdir. glikan dizi formatında bileşikleri ve biyolojik tüketimini azaltır ve böylece büyük ölçüde verimliliği arttırır.

Baskı, Tarama ve Veri analizleri Uygun baskı sağlamak için, slayt, her dizi delineates teflon maske içinde benekli ızgara, doğru hizalama için hayati önem taşımaktadır. nedeniyle teflon kaplama doğası gereği, yazdırma sırasında, lekeler MPX slaytlar üzerinde çıplak gözle görülemez. Dikkat poli-L-lizin kaplı slaytlar üzerinde ön lekelerin ortaya sonra ödenir. Doğrudan baskıdan sonra, her slayt nede...

Watch this Scientific Journal Video about A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins at JoVE.com

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Influenza A Virüsü hemaglutininler aviditesi ve özgünlüğünün değerlendirilmesi için Minyatür Glycan Mikroarray Testi

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

a-miniaturized-glycan-microarray-assay-for-assessing-avidity

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.9K Görüntüleme.  The Scripps Research Institute. Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Video: A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

Tüm Influenza Kantitatif Analiz Basit Slot Blot Tahliller Evrensel Antikorlar kullanarak Viral Hemagglutinins ve nöraminidaz yazın

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Enzim-linked Lektin Testi tarafından Grip Nöraminidaz İnhibisyon antikor titreleri Ölçme

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

Bir Kantitatif Mikro-nötralizasyon Testi optimizasyonu

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

Grip Hemagglutinin özel antikorlar tarafından indüklenen Fc-aracılı efektör fonksiyonları değerlendirmek için bir yöntem

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

An Optimized Hemagglutination Inhibition (HI) Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

Antibody titers are commonly used as surrogate markers for serological protection against influenza and other pathogens. Detailed knowledge of antibody production pre- and post-vaccination is required to understand vaccine-induced immunity. This article describes a reliable point-by-point protocol to determine influenza-specific antibody titers. The first protocol describes a method to specify the antigen amounts required for hemagglutination, which standardizes the concentrations for subsequent usage in the second protocol (hemagglutination assay, HA assay). The second protocol describes the quantification of influenza-specific antibody titers against different viral strains by using a serial dilution of human serum or cell culture supernatants (hemagglutination inhibition assay, HI assay).
As an applied example, we show the antibody response of a healthy cohort, which received a trivalent inactivated influenza vaccine. Additionally, the cross-reactivity between the different influenza viruses is shown and methods to minimize cross-reactivity by using different types of animal red blood cells (RBCs) are explained. The discussion highlights advantages and disadvantages of the presented assays and how the determination of influenza-specific antibody titers can improve the understanding of vaccine-related immunity.

An Optimized Hemagglutination Inhibition HI Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

The presented protocols describe how to perform a hemagglutination inhibition assay to quantify influenza-specific antibody titers from serum samples of influenza vaccine recipients. The first assay determines optimal viral antigen concentrations by hemagglutination. The second assay quantifies influenza-specific antibody titers by hemagglutination inhibition.

Grip özgü antikor titreleri ölçmek için bir en iyi duruma getirilmiş hemaglütinasyon inhibisyon (hı) tahlil

Antibody titers are commonly used as surrogate markers for serological protection against influenza and other pathogens. Detailed knowledge of antibody ...

Tıp

Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge to the development of universal influenza vaccines is high antigenic diversity resulting from antigenic drift. Overcoming this challenge requires novel research tools to measure the breadth of serum antibodies directed against many virus strains across different antigenic subtypes. Here, we present a protocol for analyzing the breadth of serum antibodies against diverse influenza virus strains using a protein microarray of influenza antigens.
This influenza antigen microarray is constructed by printing purified hemagglutinin and neuraminidase antigens onto a nitrocellulose-coated membrane using a microarray printer. Human sera are incubated on the microarray to bind antibodies against the influenza antigens. Quantum-dot-conjugated secondary antibodies are used to simultaneously detect IgG and IgA antibodies binding to each antigen on the microarray. Quantitative antibody binding is measured as fluorescence intensity using a portable imager. Representative results are shown to demonstrate assay reproducibility in measuring subtype-specific and cross-reactive influenza antibodies in human sera.
Compared to traditional methods such as ELISA, the influenza antigen microarray provides a high throughput multiplexed approach capable of testing hundreds of sera for multiple antibody isotypes against hundreds of antigens in a short time frame, and thus has applications in sero-surveillance and vaccine development. A limitation is the inability to distinguish binding antibodies from neutralizing antibodies.

We present a protocol for using a protein microarray constructed by printing influenza antigens onto nitrocellulose-coated slides to simultaneously probe serum for multiple antibody isotypes against over 250 antigens from different virus strains, thus allowing measurement of the breadth of serum antibodies across virus subtypes.

Virüs subtypes arasında serum antikorların genişliğini ölçmek için bir Influenza antijen microarray kullanımı

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge ...

The Hemagglutination Inhibition Assay to Detect Serum Antibodies Against a Target Antigen

Source: Kaufmann, L. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/55833">An Optimized Hemagglutination Inhibition (HI) Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers.</a> J. Vis. Exp. (2017)
The video demonstrates a hemagglutination inhibition assay for detecting serum antibodies against specific antigens. Confirmation of hemagglutination inhibition in the test well and hemagglutination in the control well is achieved through distinct visual patterns. This assay plays a crucial role in assessing immune response, vaccine effectiveness, and studying viral infections in virology and immunology.

Bir Hedef Antijene Karşı Serum Antikorlarını Tespit Etmek için Hemaglutinasyon İnhibisyonu Testi

All procedures involving human participants have been performed in compliance with the institutional, national, and international guidelines for human ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

İmmünoloji

İmmünodiyagnostik

Özelleşmiş Analizleri

An Assay to Measure Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers

Source: Gao, J., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54573">Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates an assay measuring influenza neuraminidase (NA) inhibiting antibody titers in a serum sample. A serum sample containing antibodies against NA is added to a fetuin-coated microwell plate. Upon adding the virus, the antibodies prevent viral NA from cleaving fetuin and exposing its galactose moiety. A peroxidase-conjugated lectin is then added, which binds to the exposed galactose. The NA-inhibiting antibody titer is determined using a colorimetric test, where a peroxidase substrate gets cleaved by the immobilized lectin-conjugated peroxidase to produce color.

İnfluenza Nöraminidaz İnhibisyonu Antikor Titrelerini Ölçmek İçin Bir Test

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of Reagents and ...

Antikor Tabanlı Teknolojiler

Karakterizasyon ve Fonksiyonel Analiz

Viral Antigen Microarray Assay to Detect Antibody Isotypes in Serum Against Viral Antigen

Source: Khan, S., et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/59973">Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes.</a> J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we demonstrate the process for detecting antibody isotypes in multiple human serum samples using a microarray slide printed with antigenic subtypes of influenza virus strains.

Viral Antijene Karşı Serumdaki Antikor İzotiplerini Tespit Etmek için Viral Antijen Mikroarray Testi

Source: Khan, S., et al., Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes. J. Vis. Exp. (2019)
In ...