This project was funded by intramural PanFlu funds from the Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Plasmids used to prepare reassortant viruses were kindly provided by Robert Webster, St Jude Children's Research Hosptial, Memphis, TN. We are indebted to Ewan Plant and Haruhiko Murata for critical review of the manuscript.

Kuş bileşenleri ile tüm canlı yeniden düzenlenmiş virüsler biyogüvenlik düzeyi Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı (USDA) ve kurumsal biyogüvenlik komitesi tarafından kullanım için onaylanmıştır bir laboratuvarda -Gelişmiş uygulamaları 2 (BSL2) kullanılarak ele alınması gerekir. Reaktifler ve başlangıç ​​materyalinin hazırlanması 1. Not: Tüm reaktiflerin kaynağını elde etmek için malzemeler Tablo bakın. <ol><li> Fetuin kaplı plakalar <ol><li> 90 ml 10 mi 10x kaplama tampon karıştırarak kaplama tamponu hazırlayın H2O deiyonize </li><li> -20 ° C&#39;de 500 ul alikolar içinde 1x kaplama tamponu ve mağaza 25 mg / ml&#39;de fetuin bir stok çözelti hazırlayın. </li><li> 1x kaplama tamponu içinde 1000 kat stok çözelti seyreltilerek kaplama hemen Plakalar, önceden fetuin (25 ug / ml) bir çalışma çözeltisi hazırlayın. </li><li> al içine fetuin çalışma çözeltisi 100 ul dağıtmak için bir çok kanallı pipet kullanınyüksek protein bağlama kapasitesine sahip 96 oyuklu bir plakanın l kuyu. </li><li> Daha sonra 10 kişilik gruplar halinde plakaları yığını ve folyo sarın bir plaka kapatıcı ile her plaka örtün. </li><li> bir deney yapmadan önce bir buzdolabına (2-8 ° C) en az 18 saat tabak yerleştirin. Not: Levhalar önceden kaplandı ve 2 aya kadar 2-8 ° C&#39;de kaplama çözeltisi ile depolanabilir. </li></ol></li><li> Dilüentler <ol><li> 94.2 ml karıştırın virüsü ve Numune seyreltileri (2- (N-morfolino) etansülfonik asit (MES), pH 6.5, 20 mM CaCl2,% 1 sığır serumu albümini (BSA) ve% 0.5 Tween 20) yapmak için seyreltici hazırlamak 1X MES, 2 mi CaCl2 (10 mg / ml) ile pH 6.5, 3.3 ml% 30 BSA ve 0.5 ml Tween 20. </li><li> 2 mi CaCl2 (10 mg / ml) ile 94.7 mi 1 x MES, pH 6.5 karışımı, PNA-HRPO (MES, 20 mM CaCl2 ve% 1 BSA ile pH 6.5) seyreltici hazırlamak ve 3.3 ml% 30 BSA . </li></ol></li><li> Nöraminidaz (NA) Not: H6Nx virüsü reassyayınlanan yöntemler 5,10 aşağıdaki ortants (bu H6 alt tipi HA ve ilgi NA var), oluşturulur. onlar in-house mevcut değilse bir ortak çalışan inaktive reassortant virüsü şişeleri talep edin. inaktif virüs kullanırken, hazırlık inaktivasyonu süreci NA aktivitesi üzerinde önemli bir etkisi yoktu gösteri yoluyla ELLA kullanıma uygun olduğunu teyit etmektedir. <ol><li> Kültür, bir embriyo halindeki tavuk yumurtalarının 11 H6Nx Virüsün stok ve -80 ° C&#39;de susuz alantoik akışkan, 0.5 ml lik kısımlar halinde saklayın. </li><li> Her bir deney için yeni bir virüs kısım kullanın. dondurmak ve alikotları çözülme etmeyin. </li></ol></li><li> Serum numuneleri ve Kontroller <ol><li> Tüm serum Isı inaktive (test örnekleri, örneğin, ön ve son aşılama serumlar, hem de kontrol, örneğin, bilinen NI titeri ile, örnek) 45-60 dakika boyunca 56 ° C&#39;de bir su banyosu içinde. ısıl işlem öncesi veya sonrasında -20 -70 ° C &#39;de sera saklayın. samp Eğerles defalarca test edilmiş numune Tekrar tekrar dondurulup çözülmüş değildir, böylece dondurmadan önce birkaç alikotları yapmak gerekmektedir. </li><li> Burada inceliği yüksek olan en azından düşük titreye sahip bir başka tespit etmek (&gt; 5 mi), uygun bir miktarda mevcuttur, insan serumlarının NI titrelerini ölçmek için Ella&#39;yı kullanın. olarak 100 ul alikotları Mağaza ≤-20 ° C aynı örnek deney performansı izlemek için bir çok deneylerde bir kontrol olarak kullanılabilir, böylece. </li></ol></li><li> Yer fıstığı aglutinini (PNA) -Horseradish peroksidaz (HRPO) <ol><li> PNA-HRPO seyreltici (MES, CaCI2 ve% 1 BSA ile pH 6.5) hazırlayın. </li><li> 1 ml seyreltici PNA-HRPO, 1 mg eriterek PNA-HRPO stok çözelti hazırlayın. -20 ° C&#39;de 20-200 ul alikotları saklayın. </li><li> (Pozitif kontrol ile maksimal OD sonuçlanan miktarını belirlemek için bu reaktifin 2000 dilüsyonları (virüs sadece) ve bir arka plan: 500, 1: 750, 1: 1000 ve 1 yeni PNA-HRPO çok test 1 kullanmadan önce Resim virüsü) tşapka &lt;pozitif sinyal% 10. <ol><li> bölüm 2.1&#39;de anlatıldığı gibi dörtlü virüs dilüsyonları olun. </li><li> Bölüm 2.2&#39;de tarif edildiği gibi, bir fetuin-kaplı plakaya dilüsyonları aktarın ve 37 ° C&#39;de inkübe plakası. </li><li> 16-18 saat sonra plaka yıkanır ve 1 ekleyin: plaka satır çoğaltmak için, PNA-HRPO 2.000 seyreltileri (100 ul / oyuk): 500, 1: 750, 1: 1,000 ve 1 ile. </li><li> 2.3.9 adımları 2.3.4 anlatıldığı gibi tahlil tamamlayın. </li><li> &gt; 10 kez arka plan maksimum sinyal sonuçlandı seyreltme seçmek için verileri gözden geçirin. </li></ol></li><li> Kullanımdan hemen önce, 1.5.3 tanımlanan PNA-HRPO optimal dilüsyon hazırlanır. </li></ol></li><li> Yıkama tampon maddesi (0.01 M fosfat tamponlu tuz (PBS), pH 7.4,% 0.05 Tween 20 (PBS-T)) büyük hacim hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın. </li><li> Peroksidaz substratı (o-fenilendiamin dihidroklorür (OPD)) hazırlanması: Not: 3,3 alternatif peroksidaz alt tabakalar &#39;Kullanılabilir,, 5,5&#39;-tetrametilbenzidin (TMB) <ol><li> Deney gününde 100 mi dH 2 O 1 kapsül çözülmesiyle fosfat sitrat tamponu hazırlayın. </li><li> Kullanımdan hemen önce, fosfat sitrat tamponu, 20 ml 1 OPD tablet (10 mg) içinde çözülür. </li></ol></li><li> Durdurma solüsyonu (1 NH 2 SO 4) hazırlayın: SO 4 973 ml dH 2 O. 27,2 ml stok% 98 H 2 eklemek Karıştırın ve daha sonra oda sıcaklığında saklayın. </li></ol> NA Miktarının Belirlenmesi 2. ELLA kullanın için <ol><li> 96 oyuklu bir plaka içerisinde virüs seyreltmeleri hazırlanması <ol><li> sütun seyreltme plaka 1-11 içine 120 ul numune seyreltici (bölüm 1.2) koyun. </li><li> sütun 1 için ek 96 ul örnek seyreltici ekleyin. </li><li> Çözülme ve sonra bu virüsün 1:10 seyreltme verir sütunda 1. kuyuları çoğaltmak için 24 ul eklemeden önce virüs şişesini vorteks. </li><li> aktararak, örnek seyreltici içinde virüs seri 2 kat seyreltileri yapmakbirinden her iyi seyreltme için bir sonraki kullanarak temiz pipet uçları 120 ul. </li></ol></li><li> Bir Fetuin kaplı Plate virüs seyreltmeleri aktarın <ol><li> PBS-T (bölüm 1.6) ile fetuin kaplı plaka 3 kere yıkayın ve daha sonra herhangi bir aşırı yıkama tamponu çıkarmak için emici kağıt havlu üzerine her plaka kurulayın. </li><li> fetuin kaplı plaka 11 sütun her bir kuyucuğa 1 Örnek seyreltici (bölüm 1.2.1) 50 ul ekle. </li><li> sütun 12 numune seyreltici 100 ul (Bu kuyular, negatif kontrol olarak) eklenir. </li><li> Aktarım sütun fetuin kaplı levhanın tekabül eden gözleri seyreltme plaka 1-11 seyreltilmiş virüs, 50 ul. </li><li> Bir plaka kapatıcı ile örtün ve plaka daha sonra 37 ° C de, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde yerleştirin. </li><li> Geri kalan adımlar (16-18 saat sonra) yapılacaktır hangi zaman not alın. </li></ol></li><li> NA Tayini tamamlayın <ol><li> inkübasyon (16-18 saat) tamamlandığında, aktarmaktezgah plaka ve plaka mühürleyen çıkarın. </li><li> PBS-T (bölüm 1.7) ile plaka 6 kez yıkayın ve sonra ters ve emici kağıt havlu üzerinde pat tüm sıvı kuyulardan kaldırıldı sağlamak. </li><li> tüm oyuklara (1.5.3 belirlenen seyreltmede) 100 ul / oyuk PNA-HRPO solüsyonu ilave edin ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca plaka inkübe edin. </li><li> Kuluçka sonunda için az 15 dakika önce, Bölüm 1.7&#39;de tarif edildiği gibi, OPD solüsyon hazırlanır. </li><li> PNA-HRPO kaldırmak ve her kuyuya OPD substrat 100 ul eklemeden önce kuru leke test plakaları 3 kere yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında tam olarak 10 dakika boyunca inkübasyona bırakılır. </li><li> 100 ul / 1 N sülfürik asit ilave ederek reaksiyonu durdurun. </li><li> 0.1 saniye süreyle 490 nm&#39;de optik yoğunluk (OD) ölçmek için, bir plaka okuyucu kullanarak. </li><li> Kaydedin ve tüm veri dosyalarını ihracat. </li></ol></li><li> Seroloji için kullanılır edilecek Virüs Seyreltme seçin <ol><li> OD 490 araziler bir grafik çizmek </sub&gt; Her virüs dilusyondaki değerleri. (Bu genellikle titrasyon eğrisinin başında bir plato karşılık gelen sinyal), minimum sinyal (arka plan kontrolü sağlamak plakanın 12. kolonunda hiçbir virüs içeren kuyu) maksimum sinyal tanımlamak için titrasyon eğrisini kontrol edin ve giriş seyreltme (eğrisinin, yani lineer bölge) ile orantılıdır OD neden virüs seyreltmeleri. </li><li> maksimum sinyal yaklaşık% 90 verir ve doğrusal aralıkta virüs seyreltme seçin. Seçilen seyreltme OD en azından arka plan sinyali daha fazla 10 kat olduğunu doğrulayın. Bu, özellikle virüs stokları kullanan tüm deneyleri için seçilen bir virüs seyreltme kullanın. Alternatif virüsün NA aktivitesini ölçmek ve ELLA 15-20 ~ μU NA faaliyet / ml kullanın: Not. </li></ol></li></ol> 3. Lektin Deneyi enzim-bağlanmış Not: Şekil 2 shoSeyreltme ve deney plakalarının setup ws. <ol><li> Numune seyreltileri yapmak <ol><li> buz üzerinde ısı ile inaktive örnekleri yerleştirin. Not: 8 sera, her plaka seyreltilebilir. </li><li> Bir plaka üzerinde 1:10 başlayan dilüsyonları kullanarak kurmak için, sütunlar 3-11 tüm kuyulara 120 ul örnek seyreltici ekleyin. </li><li> 2. sütun için, örnek seyreltici 216 ul her bir numune için 24 ul ekle. yukarı pipetleme ve 3 kez aşağı iyi numune karıştırın ve daha sonra bir sonraki sütuna 120 ul aktarın. </li><li> pipet uçları değiştirdikten sonra, aşağı yukarı pipetleme kuyu içeriğini karıştırın ve daha sonra bir sonraki sütuna 120 ul aktarın. </li><li> numunenin kadar adımı yineleyin 3.1.4 sütuna 11 devredilmiştir ve kalan 120 ul atılır. </li></ol></li><li> Fetuin kaplı Plate Örnekleri ve Virüs ekle <ol><li> Virüs, girdap bir şişe çözülme ve 2. adımda seçilen seyreltme de seyreltici (bölüm 1.2) virüs tekrar süspansiyon.4.2. Her bir deney plakası için virüsün en az 5 ml hazırlayın. Plakalar yıkanır ve serum numuneleri plakaya ilave edilinceye kadar buz üzerinde seyreltilmiş virüs tutun. </li><li> Deney için gerekli olan fetuin kaplı plakaların sayısına dair karar (genellikle plaka başına 4 sera uygulanır). PBS-T ile fetuin kaplı plaka 3 kere yıkayın ve sonra her plaka ters ve aşırı yıkama tamponu çıkarmak için emici kağıt havlu üzerine leke. </li><li> sütun 2-11 yinelenen kuyulara seyreltme plaka her serum kontrolü veya dilusyonun 50 ul aktarmak için çok kanallı pipet kullanın. </li><li> Negatif kontrol (sütun 12) dışında tüm oyuklara seyreltilmiş virüs, 50 ul ekle. </li><li> sütun 1 çukurlara örnek seyreltici 50 ul ilave edin ve kolon 12 örnek seyreltici 100 ul ilave edin. </li><li> Bir plaka kapatıcı ile kuyu Kapak ve yavaşça plaka kenarlarına dokunarak ya da 10 sn orta hızda bir plaka karıştırıcısı üzerinde koyarak karıştırın. </li><li> Bir humidif plaka koyun16-18 saat boyunca 37 ° C&#39;de ied inkübatör. </li></ol></li><li> PNA-HRPO ekleyin ve bölüm 2.3&#39;de anlatıldığı gibi tahlil tamamlamak </li></ol> 4. Veri Analizi <ol><li> Analiz Sonuçlarının Geçerlilik belirleyin <ol><li> Arka plan değerleri (hiçbir virüs) pozitif kontrol (virüs ve hiçbir serumu)% 10&#39;dan daha az olduğundan emin olun. </li><li> aynı koşullar kullanılarak farklı deneylerde kontrol serumları çalıştırmak titreleri medyan titreye 2 kat içinde olduğundan emin olun. </li><li> kontrol kuyuları bu OD ölçümleri (≤20% farklı) tutarlı ve yinelenen örnek kuyuların o OD ölçümleri (≤10% farklı) tutarlı onaylayın. </li><li> Geçersiz sonuçların kök nedenini belirlemek ve 4.1.1, 4.1.2 veya 4.1.3 listelenen kriterler, yerine getirilmediği takdirde tahlil tekrarlayın. Gidermek için çalışırken Tablo 1&#39;de sunulan faktörleri göz önünde bulundurun. </li></ol></li><li> % 50 uç nokta titerinin atama <ol><li> Her bir deney plakası, su içintüm okumalardan ortalama arka plan (oyuklara ilave hiçbir antijen) btract. </li><li> Formülü kullanarak her serum seyreltme de yüzde inhibisyon hesaplayın: 100 x (OD virüs yalnızca kontrol - OD test örneği) / OD virüsü sadece kontrol. </li><li> Maksimum sinyalin en az% 50 inhibisyon ile sonuçlanmıştır yüksek dilüsyon tanımlar. </li><li> % 50 uç-nokta titeri olarak seyreltisinin tersi bildirin. Not:% 50 inhibisyon herhangi seyreltme elde değil ise, titre, test edilen ilk seyreltme daha az, örneğin, &lt;10 01:10 test ilk seyreltme olduğunu. </li></ol></li><li> % 50 engelleyici konsantrasyonunun hesaplanması (IC50) <ol><li> Regresyon analizi gerçekleştiren bir program sonuçlarını aktarmak sonra tüm okumalardan ortalama arka plan çıkarma ve aşağıdaki gibidir: IC 50 titresi belirlemek için dört parametre lojistik regresyon kullanın. </li><li> Maksimum seti ile, doğrusal olmayan regresyon kullanınvirüs, sadece kontrolü ve minimum tam% 50 inhibisyon ile karşılık gelen seyreltmenin tespit etmek için, sıfıra ayarlanır. </li><li> IC50 titresi olarak seyreltisinin tersi bildirin. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kilbourne, E. D., Laver, W. G., Schulman, J. L., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+activity+of+antiserum+specific+for+an+influenza+virus+neuraminidase.">Antiviral activity of antiserum specific for an influenza virus neuraminidase.</a> J Virol. 2 (4), 281-288 (1968).</li><li>Compans, R. W., Dimmock, N. J., Meier-Ewert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+antibody+to+neuraminidase+on+the+maturation+and+hemagglutinating+activity+of+an+influenza+A2+virus.">Effect of antibody to neuraminidase on the maturation and hemagglutinating activity of an influenza A2 virus.</a> J Virol. 4 (4), 528-534 (1969).</li><li>Schulman, J. L., Khakpour, M., Kilbourne, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+specific+immunity+to+viral+neuraminidase+on+influenza+virus+infection+of+mice.">Protective effects of specific immunity to viral neuraminidase on influenza virus infection of mice.</a> J Virol. 2 (8), 778-786 (1968).</li><li>Murphy, B. R., Kasel, J. A., Chanock, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+serum+anti-neuraminidase+antibody+with+resistance+to+influenza+in+man.">Association of serum anti-neuraminidase antibody with resistance to influenza in man.</a> N Engl J Med. 286 (25), 1329-1332 (1972).</li><li>Sandbulte, M. R., Gao, J., Straight, T. M., Eichelberger, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+miniaturized+assay+for+influenza+neuraminidase-inhibiting+antibodies+utilizing+reverse+genetics-derived+antigens.">A miniaturized assay for influenza neuraminidase-inhibiting antibodies utilizing reverse genetics-derived antigens.</a> Influenza Other Respi Viruses. 3 (5), 233-240 (2009).</li><li>Lambre, C. R., Terzidis, H., Greffard, A., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+anti-influenza+neuraminidase+antibody+using+a+peroxidase-linked+lectin+and+microtitre+plates+coated+with+natural+substrates.">Measurement of anti-influenza neuraminidase antibody using a peroxidase-linked lectin and microtitre plates coated with natural substrates.</a> J Immunol Methods. 135 (1-2), 49-57 (1990).</li><li>Couzens, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+enzyme-linked+lectin+assay+to+measure+influenza+A+virus+neuraminidase+inhibition+antibody+titers+in+human+sera.">An optimized enzyme-linked lectin assay to measure influenza A virus neuraminidase inhibition antibody titers in human sera.</a> J Virol Methods. 210C, 7-14 (2014).</li><li>Eichelberger, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparability+of+neuraminidase+inhibition+antibody+titers+measured+by+enzyme-linked+lectin+assay+(ELLA)+for+the+analysis+of+influenza+vaccine+immunogenicity.">Comparability of neuraminidase inhibition antibody titers measured by enzyme-linked lectin assay (ELLA) for the analysis of influenza vaccine immunogenicity.</a> Vaccine. 34 (4), 458-465 (2016).</li><li>Westgeest, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+an+enzyme-linked+lectin+assay+suitable+for+rapid+antigenic+characterization+of+the+neuraminidase+of+human+influenza+A(H3N2)+viruses.">Optimization of an enzyme-linked lectin assay suitable for rapid antigenic characterization of the neuraminidase of human influenza A(H3N2) viruses.</a> J Virol Methods. 217, 55-63 (2015).</li><li>Hoffmann, E., Neumann, G., Kawaoka, Y., Hobom, G., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+transfection+system+for+generation+of+influenza+A+virus+from+eight+plasmids.">A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 6108-6113 (2000).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Animal Influenza Diagnosis and Surveillance. , (2002).</li><li>Cate, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+dosage+influenza+vaccine+induced+significantly+more+neuraminidase+antibody+than+standard+vaccine+among+elderly+subjects.">A high dosage influenza vaccine induced significantly more neuraminidase antibody than standard vaccine among elderly subjects.</a> Vaccine. 28 (9), 2076-2079 (2010).</li><li>Couch, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+correlates+and+predictors+of+immunity+to+naturally+occurring+influenza+in+humans+and+the+importance+of+antibody+to+the+neuraminidase.">Antibody correlates and predictors of immunity to naturally occurring influenza in humans and the importance of antibody to the neuraminidase.</a> J Infect Dis. 207 (6), 974-981 (2013).</li><li>Fritz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuraminidase-Inhibiting+Antibody+Response+to+H5N1+Virus+Vaccination+in+Chronically+Ill+and+Immunocompromised+Patients.">Neuraminidase-Inhibiting Antibody Response to H5N1 Virus Vaccination in Chronically Ill and Immunocompromised Patients.</a> Open Forum Infect Dis. 1 (2), (2014).</li><li>Fries, L. F., Smith, G. E., Glenn, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombinant+viruslike+particle+influenza+A+(H7N9)+vaccine.">A recombinant viruslike particle influenza A (H7N9) vaccine.</a> N Engl J Med. 369 (26), 2564-2566 (2013).</li><li>Monto, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+to+Influenza+Virus+Neuraminidase:+An+Independent+Correlate+of+Protection.">Antibody to Influenza Virus Neuraminidase: An Independent Correlate of Protection.</a> J Infect Dis. 212 (8), 1191-1199 (2015).</li><li>Fritz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vero+cell-derived+whole-virus+H5N1+vaccine+effectively+induces+neuraminidase-inhibiting+antibodies.">A vero cell-derived whole-virus H5N1 vaccine effectively induces neuraminidase-inhibiting antibodies.</a> J Infect Dis. 205 (1), 28-34 (2012).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest.

enzim bağlı lektin deney serumunda NI antikor titreleri ölçmek için pratik bir yöntem. ELLA 1990 tarafından Lambre ve diğ., Tanımlanmış olsa da, standart serolojik test olarak kabul edilmesi klinik örneklerde 12-16 NI antikor titreleri ölçmek için tahlil yapmak sayıda laboratuarlar, daha yakın zamanda olmuştur. Bazı değişiklikler ölçülür NI titerleri için büyük bir etkisi olmadan protokol safhaları yapılabilir. Örneğin, PBS seyreltici olarak kullanılabilir, ancak önerilen tampon maddesi içinde, virüs titrasyon eğrileri (MES, pH 6.5) ve karşılaştırmak için çok yararlıdır, PBS bir karar verilmeden önce, bazı NA alt türleri önemli ölçüde enzim aktivitesi azalmış gibi pH değeri&gt; 7.0. Optimal pH kullanılmadığında, virüsün maksimum sinyal tahlilinde antijen (yani, virüs) aşırı bir miktarının kullanımı ile sonuçlanan, daha az olduğu; Bu koşullar altında, deney düşük bir duyarlılık gösterebilir. bazı hayırmuamele edilmemiş sera Ella test edilir, n-spesifik inhibisyonu gözlenir. Bu termal olarak β-önleyicileri varlığını gösteren, ısı (45 dakika boyunca 56 ° C) ile ayrıldı. Diğer spesifik olmayan önleyicileri (α ve γ-sınıfı) grip HA özellikle H3N2 virüsü hemaglütinasyon ve enfektivitesini ile ilgili olarak, tarif edilmiştir. H3N2 virüs NA kaynağı olarak kullanılmaktadır Gerçekte, spesifik olmayan inhibisyonunun Ella görülmektedir; Bu inhibisyon sıyalıdaz 9, küçük bir miktarı ile, serum numunelerinin işlenmesi suretiyle uzaklaştırılır. Diğer serolojik deneylerde olduğu gibi, negatif ve pozitif kontroller deney performansını değerlendirmek için bir araç sağlamak için her bir deneyde dahil edilmelidir. Tahlil kabul kriterlerini yerine getirmediğini zaman neden tespit edilmelidir. Tablo 1 sorunları gidermek için ele alınabilecek deneyde potansiyel adımların bir listesini sağlar. Ella protokol provBu raporda aryans NA kaynağı olarak, bir kuş gribi virüsünün HA köken ihtiva reassortant virüsleri kullanır. Bu bir izin düşük patojenik kuş virüslerinin ile çalışmak için gerekli olduğundan tahlil yapmadan bir sınırlama sunar. Onlar inaktive edildikten sonra H6Nx reassortant virüsler laboratuarlar arasında paylaşılabilir. Bu nedenle reassortant virüsü üreten laboratuvar inaktivasyonu tam olduğunu göstermiştir kez tahlil işbirlikleri yoluyla yapılabilir ve hazırlık onun NA aktivitesini korumuştur. H6Nx reassortant virüs kullanılarak kısıtlama NA bulaşıcı olmayan kaynaklar kullanılarak aşılabilir. Diğer virüs benzeri partiküller (VLP&#39;ler) 15 kullanılmış Örneğin, Bazı laboratuarlar, yeniden birleştirici NA 17 arıtılmış kullanılmıştır. Ancak, rekombinant NA ne VLP&#39;ler ne hazır ve bu nedenle bir antijenik-uyumsuz kuş HA ile grip virüsleri kullanmaya devam. GelenekselNI, antikor titrelerini ölçecek bir yöntem çeşitli nedenlerden dolayı pratik değildir; En endişe renk reaksiyonu üretmek için gerekli olan zararlı kimyasallar bulunmaktadır. Buna ek olarak, numunenin büyük hacimleri gerekli ve tahlil gerçekleştirmek için hantal vardır. Bunun aksine, ELLA kolay uygulanabilir ve örneklerin arasında makul sayıda titrasyonunu sağlayan bir biçimde yer almaktadır. Ella değişkenlik göstermek olduğunu tahlil verimleri tekrarlanabilir sonuçlar 7,8 incelenen çalışmalardan elde edilen veriler. Ella dolayısıyla mümkün NI antikor titreleri rutin ölçümünü yaptı, ve o serolojik çalışmalar yürüten laboratuarlar tarafından daha sık kullanılan olacağı tahmin edilmektedir. Ella yaparken dikkat edilmesi gereken birkaç önemli adım vardır. İlk olarak, UA aktivitesinin spesifik olmayan önleyicileri çıkarılmalıdır. Bu inhibitörler genellikle, ısıya ve 45 dakika boyunca 56 ° C&#39;de ısı işlemi ile yok edilir. Isıl işlem dışı speci temizlemek için yeterlidirH6 reassortant virüs NA kaynağı olarak kullanıldığı zaman H3N2 virüsleri Ella kullanıldığında FIC örneklerinden inhibitörleri, ancak, hemaglutinin bağlanan serum faktörler de ELLA müdahale ve sıyalıdaz küçük bir miktarı ile muamele ile çıkarılmalıdır tedavi 9 ısıtmak için önce. Bu tahlilin duyarlılığı azaltır İkinci olarak, antijen, örneğin, yeniden düzenlenmiş H6Nx virüs aşırı miktarda, kullanılmamalıdır. Virüsün dikkatli titrasyon nedenle önemli bir adımdır; Her bir deneyde kullanılan antijen miktarı de arka plan üzerinde olan bir sinyal sağlaması gerekir, ve titrasyon eğrisinin, yani lineer aralığında olmalıdır sinyali (optik yoğunluk) virüsü seyreltme ile orantılı olması gerekir. Rutin seroloji ek olarak, Ella mevsimsel grip virüslerinin UA arasındaki antijenik farklılıkları değerlendirmek için kullanılabilir. içerme a virüs suşları seçerken bu bilgiler çok yararlı olabilirs aşı adayları ve NA antijenik sürüklenme sonucu bağışıklık baskıların daha büyük bir anlayış kolaylaştıracaktır. Buna ek olarak, domuz ya da kuş gribi virüslerinden UA antijenik analizi ortaya çıkan suşlarının pandemik potansiyeli belirlenmesinde kritik bilgiler verebilir.

Nöraminidaz (NA) grip virüslerinin yüzeyinde eksprese edilen bir glikoproteindir. Bu enzim aktivitesi, enfekte olmuş hücreleri 1,2 yeni oluşan virüs partikülü için gereklidir. Aktivitesi Na önleyen antikorlar, hayvan modellerinde 3 virüs titrelerini ve hastalık belirtilerini azaltır ve insanlarda 4 hastalığa karşı direnç ile ilişkilidir. Geleneksel tahlil rutin seroloji için pratik değildir NI antikor titreleri ölçmek için, çünkü NA inhibisyonu (NI) titreleri aşağıdaki aşılama artış, bu nedenle ancak çok geçmiş grip immünojenite çalışmaları bu son nokta içermiyordu, aşının etkinliğinin bir göstergesi hizmet edebilir. NI titrelerini ölçmek için geleneksel bir yöntemdir yok 1 ile gliko yarılır sialik asit miktarının miktarının dayanır. genellikle thiobarbituric asit (TBA) yöntemi olarak adlandırılan bu yöntem, sialik ac dönüştürmek için tehlikeli kimyasallar kullanmaktadırspektrometresi ile tayin edilebilir bir kromofor id. Deney ayrı cam borular kullanılmaktadır, çünkü, örneklerin çok sayıda test deneyi hantal yapmak için uygun değildir. 96 gözenekli plakalara tahlilin minyatürleştirme, ancak bu deney de zehirli kimyasal kullanımı gerektirir ve bu nedenle ideal değildir, daha pratik bir biçimde 5 elde edilir. NI, antikor titrelerini ölçecek alternatif bir deney Lambre ve ark., 6 tarafından geliştirilmiştir. Bu deney, sialik asit Na tarafından serbest bırakıldığında açıkta kalır glikoproteinler, galaktoz sondan bir önceki şeker miktarı ölçülerek enzim aktivitesini ifade etmektedir. yer fıstığı aglutinini (PNA) galaktoz spesifik olarak bağlanan bu yana, bir PNA-yaban turpu peroksidaz (HRPO) konjügat kolorimetrik okunmasını elde etmek için kullanılabilir. ölçülen optik yoğunluğu numunede NA aktivitesi orantılıdır. NI titerleri yüksek dilüsyon saptanmasıyla ölçülürUA aktivitesinin en az% 50 inhibe eden serum. Bu enzim-bağlanmış lektin deneyi (ELLA) NA için alt-tabaka olarak, fetuin, yüksek glikosile serum proteini ile kaplanmış 96 oyuklu plakalarda yapılır. NI titreleri ölçen tahliller için önemli bir, NA kaynağıdır. Aşılanmış veya enfekte bireylerden elde edilen serumlar NA&#39;ya hemaglutinin (HA) için antikorlar gibi antikorlar içeriyor olmasıdır. HA bağlanan antikorlar NA aktivitesine müdahale edebilir ve bu nedenle, testte kullanılan gereken bir antijenik uyuşmayan HA ihtiva eden HA-özel antikorlarla spesifik olmayan inhibisyonu, arıtılmış, Na ya da bütün virüs önlemek için. Bu virüsler, klasik reassortment veya ters genetik ile üretilebilir; Amaç çalışılmaktadır virüsün hedef suşu ile ilgili olmayan bir alt tip HA içeren bir virüs kurtarmak için, ve NA. Bu makalede açıklanan tahlil dev tarafından oluşturulan influenza A virüsleri istihdaminfluenza A virüsleri, alt tipleri H1N1 ve H3N2 5&#39;ten alt tip H6 ve HA ve hedeflenen NA içeren genetik ERSE. ELLA tarafından oluşturulan Sonuçlar ve minyatür TBA deneyleri bu yöntemlerin benzer alt tip özgüllük ve duyarlılık 7 ile karşılaştırılabilir olduğunu göstermektedir. ELLA tehlikeli kimyasalların kullanılmasını gerektirir ve bu nedenle NI titrelerini ölçmek için tercih edilen bir yöntemdir etmez. Sadece birkaç adımda (Şekil 1), gerçekleştirilmesi kolaydır: Örnekler seyreltilir ve eklenen bir fetuin-kaplı plakaya virüsü (NA kaynağı) aktarılır. Plaka O / N inkübe ve PNA-HRPO eklemeden önce yıkanır. 2 saat inkübasyondan sonra, plaka yıkanmış ve peroksidaz substratı ilave edilir; Renk reaksiyonu durdurulur ve son olarak optik yoğunluk ölçülür NA aktivitesinin en az% 50 inhibisyon ile sonuçlanmıştır örnek inceltilmesi ile karşılıklı% 50 uç-nokta titeri olarak rapor edilir. Içi laboratuvar çalışması reproducibili değerlendirmek içinELLA Ty plaka-plaka değişkenliği az ve operatör için işleticinin tekrarlanabilirlik titresi 7 en fazla 2 misli farklar ile sonuçlandığını göstermiştir. Ella değişkenlik Bir sonraki arası laboratuar çalışması farklı laboratuarlarda yapılan ve bir standardın bu içerme ayrıca sonuçlarında 8 değişkenliği azaltabilir zaman tahlil iyi tekrarlanabilirlik sahip olduğunu göstermiştir. ELLA klinik öncesi ve klinik çalışmalara influenza aşısı 7 serum panelleri NI antikor titreleri ölçmek için uygun olan ve aynı zamanda influenza virüsleri 9 NBS arasında antijenik farklılıkları değerlendirmek için de kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Coating buffer&amp;nbsp;</td><td>KPL</td><td>50-84-01</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;fetuin</td><td>Sigma</td><td>F3385</td><td></td></tr><tr><td>5x MES, pH 6.5&amp;nbsp;</td><td>KD-Medical</td><td>PBS-0134</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>30% BSA</td><td>Sigma</td><td>A8327</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Lectin PNA-HRPO</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;L7759</td><td></td></tr><tr><td>PBS-T</td><td>Sigma</td><td>P3563-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>o-Phenylenediamine dihydrochloride</td><td>Sigma</td><td>P8287</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-citrate buffer</td><td>Sigma</td><td>P4922</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric acid</td><td>Sigma</td><td>258105</td><td></td></tr><tr><td>96-well&amp;nbsp; Maxisorp plates</td><td>NUNC</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>96-well round bottom well plates</td><td>NUNC</td><td>267245</td><td></td></tr><tr><td>Plate sealers</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>14-245-192B</td><td></td></tr><tr><td>Chicken eggs</td><td>Charles River Laboratories</td><td>9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) chicken eggs</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette</td><td>Variety of suppliers &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Rainin, Eppendorf</td><td>8 or 12 channel manual pipette 50-250 &amp;micro;l volume</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips</td><td>Depends on pipettor brand</td><td>Depends on pipettor brand</td><td></td></tr><tr><td>Plate reader, with 490 nm filter</td><td>Perkin Elmer</td><td>Victor V</td><td></td></tr><tr><td>Water bath set to 37 &amp;deg;C</td><td>Variety of suppliers&amp;nbsp;</td><td>Variety of models</td><td></td></tr><tr><td>Water bath set to 56 &amp;deg;C</td><td>Variety of suppliers&amp;nbsp;</td><td>Variety of models</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerator set to 4 &amp;deg;C</td><td>Variety of suppliers&amp;nbsp;</td><td>Variety of models</td><td></td></tr><tr><td>Incubator set to 37 &amp;deg;C</td><td>Variety of suppliers&amp;nbsp;</td><td>Variety of models</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring influenza neuraminidase inhibition antibody titers by enzyme-linked lectin assay

nöraminidaz antikorları (NA), grip virüsü bulunan en bol yüzey proteini, gribe karşı koruma doğru katkıda bulunur. Geleneksel yöntemler NA inhibe ölçmek için (NI) antikor titreleri rutin seroloji için pratik değildir. Bu protokol, enzim-bağlantılı lektin tahlili (ELLA), büyük bir glikoprotein alt-tabaka, fetuin ile kaplanmış 96 oyuklu plakalarda gerçekleştirilir NI titrelerini ölçmek için pratik bir alternatif metodu tarif eder. NA böler terminal siyalik fetuin gelen asitler, sondan bir önceki şeker açığa, galaktoz. Yer fıstığı aglutinini (PNA) bir kromojenik peroksidaz substrat ilave edildikten sonra, bir PNA-at turbu peroksidaz eşleniği kullanılarak belirlenebilir galaktoz özgünlük ve desialylation dolayısıyla ölçüde bir lektindir. ölçülen optik yoğunluğu NA aktivitesi ile orantılıdır. NI antikor titrelerini ölçmek için, seranın seri haldeki seyreltileri 37 ° CO inkübe edilir / sabit bir miktar O ile fetuin kaplı plakalar üzerine Kf NA. UA aktivitesinin ≥50% inhibisyonu ile sonuçlanır en yüksek serum seyreltisi karşılığı NI antikor titresi olarak belirlenmiştir. Ella influenza enfeksiyonu veya aşılamadan sonra insan antikor yanıtlarının rutin değerlendirilmesi için pratik bir format sağlar.

Bu makalede yer alan deney 2 96 çukurlu levha düzenini göstermektedir. Şekil 1 &#39;de şematik olarak gösterilen ve serum numunelerinin seri seyreltmeleri fetuin kaplı plakaya transfer etmeden önce bir seyreltme plakası hazırlanır olduğunu belirtir. deneyinin kritik bir parametre deneyinde kullanılan nöraminidaz miktarıdır; Bu reassortant virüsünün titrasyonu ile belirlenir. H6N1 ve H6N2 virüs titrasyon örnekleri arasında. Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir H6N1 1:10, 1:20 ve 1:40 seyreltileri ile optik yoğunluk şartları maksimum okuma elde edildiği gibi olduğu gösteren, benzer. Bir 1:80 seyreltmede, Okuması maksimumunun yaklaşık% 90 olmuştur ve bu nedenle, bu virüs dilüsyon takip eden deneylerde kullanıldı. Serum titrasyonları örnekleri, Şekil 4&#39;te gösterilmiştir. Şekil bir insan serum numunesinin ti gösterirH6N1 ve H6N2 virüslere karşı trated. Her bir veri noktası serum seri seyreltmeleri ile elde edilmiştir NA aktivitesinin yüzde inhibisyonu göstermektedir; H6N1 deneyde ilk serum seyreltisi 1:80 idi; ≥50% inhibisyon ile sonuçlanır en yüksek dilüsyon NC NA / 99 (N1) karşı NI antikor titresi bu örnekte gösterilen serum titresi 640 olduğu H6N2 deneyde serum birinci seyreltme 5. oldu ve WI NA / 05 (N2) karşı 160. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54573/54573fig1.jpg" /> . Şekil 1. ELLA protokolünün şematik bir antijen (virüs) seyreltme (A) belirlenmesi tahlilinde (protokol aşama 2) &#39;de kullanılacak: virüs seyreltmeleri ile ölçülen bir fetuin kaplı plaka ve NA aktivitesi eklenir protokolün adım 2.3 de tarif edildiği gibi PNA-HRPO bağlanması ile terminal galaktoz artıklarını miktarının; (B </stron<html> Serum NI antikor titreleri (protokol adım 3) g&gt;) belirlenmesi. Örnekler seyreltilir ve daha sonra virüs ilave bir fetuin-kaplı plakaya aktarılır. Plaka O / N PNA-HRPO ekleyerek ve bir renk reaksiyonu oluşturmak için gerekli adımları tamamlamadan önce inkübe edilir. Son olarak, renk reaksiyon durdurulur ve optik yoğunluk ölçülür. NA aktivitesinin en az% 50 inhibisyon ile sonuçlanır dilusyonun karşılıklı% 50 uç nokta titresi olarak bildirilir. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54573/54573fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54573/54573fig2.jpg" /> Şekil 2 diyagram ELLA plakası ayarlamak gösterir. Serum örneklerinin seri seyreltmeleri bir seyreltme plakası olarak yapılmış ve daha sonra bir fetuin-kaplı plakaya aktarılır.<html> 3fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54573/54573fig3.jpg" /> H6N1 ve H6N2 virüsü titrasyonları Şekil 3. Örnek. H6N1 BR / 07 seri seyreltileri (A NA / Brisbane / / 2007 (H1N1) 59 mavi sembollerle gösterilmiştir) ile H6N2 UR / 07 (NA A / Uruguay / 716 / kırmızı sembollerin gösterilen 2007 (H3N2)) 18 fetuin kaplı plakalarda sıcak ve tarif edildiği gibi belirlenmiştir PNA-HRPO ile reaktivite için kuluçkalanmıştır. Ortalama 2 kuyu OD 490nm virüsü seyreltinin tersine karşılık karşısına yerleştirilmiştir. ELLA kullanım için seçilen H6N1 seyreltme 1:80 ve bu dilüsyonlar maksimum optik yoğunluk yaklaşık% 90 ile sonuçlanmıştır ve lineer aralığında olduğu için seçilen H6N2 seyreltme 1:40 idi.3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54573/54573fig4.jpg" /> N1 NA (kırmızı semboller) ve N2 karşı serum (mavi semboller) alt tipleri Şekil 4. Titrasyon. NA engelleme titreleri reassortant virüslere karşı ölçüldü H6N1 NC / 99 (içerdiği A NA / Yeni Kaledonya / / 1999 20 (H1N1) ) ve H6N2 WI / 05 (içerdiği A NA / Wisconsin / 67/2005 (H3N2)). serum seri seyreltmeleri için yüzde enzim inhibisyon% 50 inhibisyon gösteren kesikli yatay çizgi ile gösterilmiştir. A UA karşı NA inhibisyon titreleri / Yeni Kaledonya / / 1999 20 (H1N1) (NC / 99) ve A / Wisconsin / 67/2005 2 9.3 (640) ve 2 7.3 idi (WI / 05) (H3N2) ( 160), sırasıyla. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54573/54573fig4large.jpg" target="_blank">daha büyük bir ettik görmek için buraya tıklayınız</a>Bu rakamın rsion. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Sorun </td><td> Olası neden (ler) </td><td> Çözüm </td></tr><tr><td> Zayıf sinyal veya virüs titrasyon ulaşılan hiçbir yayla </td><td> i) düşük NA enzim aktivitesi ii) virüs stok optimum koşullarda saklanmayan </td><td> i) seyreltici NA aktivite için en uygun olan pH değerine sahip olduğunu teyit; pH değeri en uygunudur ise, yeni bir virüs stoku hazırlamak veya virüs konsantre ii) regrow ve kısım stok; -80 ° C depolamadan önce kuru buz üzerinde ek-freeze küçük şişeler </td></tr><tr><td> pozitif hücre kontrol kuyuları Zayıf ya da hiç renk </td><td> i) Virüs seyreltme yanlış atanmış Dondurulmuş virüsü alikotları ii) Flakon-to-vial değişkenliği iii) PNA- HRPO denatüre ya da çok fazla seyreltildi iv) OPD yanlış hazırlanan </td><td> ben); Tekrarlama virüs titrasyonu ii) değişkenlik olmadığından emin olmak için aynı partiden birkaç şişeleri titre edilir. önemli değişkenlik varsa, taze alikotları hazırlamak iii) PNA- HRPO retitrate optimum virüsü hazırlanan çözeltisi iv) OPD taze hazırlanması tekrarlayın </td></tr><tr><td> Pozitif kontrol serumları ile zayıf veya hiç engelleme </td><td> Deneyde kullanılan I) &#39;in çok fazla virüs ii) Serum kötüleşti </td><td> i) tekrar virüs titrasyon ii) yeni antiserumlar Kontrol saklama koşulları elde </td></tr><tr><td> Negatif kontrol serumları ile Engellenmesi </td><td> Serum i) yetersiz ısı işlemi Deneyde kullanılan ii) çok az virüsü </td><td> i) serum ısı inaktivasyonu tekrar ii) tekrarlayın virüs titrasyonu </td></tr><tr><td> yüksek arka plan </td><td> plakaların i) Olası bulaşma ii) PNA- HRPO konsantrasyonu çok çok yüksek / düşük </td><td> i) yeni kaplanmış plakalar kullanılarak tekrar ii) kullanmak için doğru seyreltme belirlemek için PNA-HRPO titre </td></tr><tr><td> Virüs titrasyonu düşük sulandırmalarda NA aktivitesinin belirgin inhibisyon göstermektedir </td><td> i) alantoik akışkan NA için alt-tabaka içerebilir </td><td> Bir sakroz yastığı yoluyla topak haline edilmiştir ii) Kullanım virüsü </td></tr></tbody></table> Performans kriterlerine uymayan tahlillerin Tablo 1. Kök neden analizi. Bu tablo, Ella gerçekleştirirken oluşabilecek sorunlar için olası nedenleri ve çözümler sunmaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay at JoVE.com

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Enzim-linked Lektin Testi tarafından Grip Nöraminidaz İnhibisyon antikor titreleri Ölçme

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

measuring-influenza-neuraminidase-inhibition-antibody-titers-enzyme

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.5K Görüntüleme.  Food and Drug Administration. We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Video: Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens. The ability to detect and quantify these responses in humans is an important diagnostic tool. The enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) is gaining popularity for its ability to identify cellular immune responses against microbial antigens, including immunosuppressed populations such as those with HIV infection, transplantation, and steroid use. This assay has the capacity to quantify the immune responses against specific microbial antigens, as well as distinguish if these responses are Th1 or Th2 in character. ELISPOT is not limited to the site of inflammation. It is versatile in its ability to assess for immune responses within peripheral blood, as well as sites of active involvement such as bronchoalveolar lavage, cerebral spinal fluid, and ascites. Detection of immune responses against a single or multiple antigens is possible, as well as specific epitopes within microbial proteins. This assay facilitates detection of immune responses over time, as well as distinctions in antigens recognized by host T cells. Dual color ELISPOT assays are available for detection of simultaneous expression of two cytokines. Recent applications for this technique include diagnosis of extrapulmonary tuberculosis, as well as investigation of the contribution of infectious antigens to autoimmune diseases.

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Identification of microbial targets of adaptive immunity in idiopathic diseases can be accomplished by the use of the enzyme-linked immunospot assay.

Enzim-linked immünospot Testi (ELISPOT): Th-1 Mikrobiyal antijenlere karşı hücresel immün cevaplar Kantitasyonu

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

Tüm Influenza Kantitatif Analiz Basit Slot Blot Tahliller Evrensel Antikorlar kullanarak Viral Hemagglutinins ve nöraminidaz yazın

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

Human Papillomavirüs Roman T hücre epitopları Karakterizasyonu için interferon-γ Enzim bağlı immünospot Assay Kullanımı

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Floresans tabanlı Nöraminidaz İnhibisyonu Tahlili antivirallerin nöraminidaz inhibitörü Class Nezle Virüslerinden eğilimi değerlendirilebilir

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak antikor yanıt için Microneutralization tarafından insan Sera A(H3N2) virüsleri nötralize grip ölçme deneyi

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

An Optimized Hemagglutination Inhibition (HI) Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

Antibody titers are commonly used as surrogate markers for serological protection against influenza and other pathogens. Detailed knowledge of antibody production pre- and post-vaccination is required to understand vaccine-induced immunity. This article describes a reliable point-by-point protocol to determine influenza-specific antibody titers. The first protocol describes a method to specify the antigen amounts required for hemagglutination, which standardizes the concentrations for subsequent usage in the second protocol (hemagglutination assay, HA assay). The second protocol describes the quantification of influenza-specific antibody titers against different viral strains by using a serial dilution of human serum or cell culture supernatants (hemagglutination inhibition assay, HI assay).
As an applied example, we show the antibody response of a healthy cohort, which received a trivalent inactivated influenza vaccine. Additionally, the cross-reactivity between the different influenza viruses is shown and methods to minimize cross-reactivity by using different types of animal red blood cells (RBCs) are explained. The discussion highlights advantages and disadvantages of the presented assays and how the determination of influenza-specific antibody titers can improve the understanding of vaccine-related immunity.

An Optimized Hemagglutination Inhibition HI Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

The presented protocols describe how to perform a hemagglutination inhibition assay to quantify influenza-specific antibody titers from serum samples of influenza vaccine recipients. The first assay determines optimal viral antigen concentrations by hemagglutination. The second assay quantifies influenza-specific antibody titers by hemagglutination inhibition.

Grip özgü antikor titreleri ölçmek için bir en iyi duruma getirilmiş hemaglütinasyon inhibisyon (hı) tahlil

Antibody titers are commonly used as surrogate markers for serological protection against influenza and other pathogens. Detailed knowledge of antibody ...

Tıp

ELISA Assays: Indirect, Sandwich, and Competitive

Source: Whitney Swanson1,2, Frances V. Sjaastad2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4 
1 Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
2 Center for Immunology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
3 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
4 Masonic Cancer Center, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is frequently used to measure the presence and/or concentration of an antigen, antibody, peptide, protein, hormone, or other biomolecule in a biological sample. It is extremely sensitive, capable of detecting low antigen concentrations. The sensitivity of ELISA is attributed to its ability to detect the interactions between a single antigen-antibody complex (1). Moreover, the inclusion of an enzyme-conjugated antigen-specific antibody permits the conversion of a colorless substrate into a chromogenic or fluorescent product that can be detected and easily quantitated by a plate reader. When compared to the values generated by titrated amounts of a known antigen of interest, the concentration of the same antigen in the experimental samples can be determined. Different ELISA protocols have been adapted to measure antigen concentrations in a variety of experimental samples, but they all have the same basic concept (2). Choosing the type of ELISA to perform, indirect, sandwich, or competitive, depends on a number of factors, including the complexity of the samples to be tested and the antigen-specific antibodies available to use. The indirect ELISA is frequently used to determine the outcome of an immunological response, such as measuring the concentration of an antibody in a sample. The sandwich ELISA is best suited for analyzing complex samples, such as tissue culture supernatants or tissue lysates, where the analyte, or antigen of interest, is part of a mixed sample. Finally, the competitive ELISA is most often used when there is only one antibody available to detect the antigen of interest. Competitive ELISAs are also useful for detecting a small antigen with only a single antibody epitope that cannot accommodate two different antibodies due to steric hinderance. The protocol will describe the basic procedures for the indirect, sandwich, and competitive ELISA assays.
The indirect ELISA assay is commonly used to measure the amount of antibodies in serum or in the supernatant of a hybridoma culture. The general procedure for the indirect ELISA assay is:
<ol>
	<li>Coat wells with antigens</li>
	<li>Add serum or hybridoma culture supernatant containing antibody (primary or 1&#176; antibody)</li>
	<li>Incubate and wash</li>
	<li>Add secondary (or 2&#176;) enzyme-conjugated antibody</li>
	<li>Incubate and wash</li>
	<li>Add substrate</li>
</ol>
The sandwich ELISA assay differs from the indirect ELISA assay in that the method does not involve coating the plates with a purified antigen. Instead, a &#34;capture&#34; antibody is used to coat the wells of the plate. The antigen is &#34;sandwiched&#34; between the capture antibody and a second &#34;detection&#34; enzyme-conjugated antibody - where both antibodies are specific for the same antigen, but at different epitopes (3). By binding to the capture antibody/antigen complex, the detection antibody remains in the plate. Either monoclonal antibodies or polyclonal antisera can be used as the capture and detection antibodies. The main advantage of the sandwich ELISA is that the sample does not have to be purified before analysis. Moreover, the assay can be quite sensitive (4). Many commercially available ELISA kits are of the sandwich variety and use tested, matched pairs of antibodies. The general procedure for the sandwich ELISA assay is:
<ol>
	<li>Coat wells with capture antibody</li>
	<li>Add test samples containing antigen</li>
	<li>Incubate and wash</li>
	<li>Add enzyme-conjugated detection antibody.</li>
	<li>Incubate and wash</li>
	<li>Add substrate</li>
</ol>
Most commercially available sandwich ELISA kits come with enzyme-conjugated detection antibodies. In cases where an enzyme-conjugated detection antibody is not available, a secondary enzyme-conjugated antibody specific for the detection antibody can be used. The enzyme on the secondary antibody performs the same role, which is to convert the colorless substrate to a chromogenic or fluorescent product. The above-mentioned secondary enzyme-conjugated antibody would more like to be used in a &#34;homemade&#34; sandwich ELISA developed by an investigator who has generated their own monoclonal antibodies, for example. One drawback to using a secondary enzyme-conjugated antibody is to be sure it only binds to the detection antibody, and not the capture antibody bound to the plate. This would result in a measurable product in all wells, regardless of the presence or absence of antigen or detection antibody.
Finally, the competitive ELISA assay is used to detect soluble antigens. It is simple to perform, but it is only suitable when the purified antigen is available in a relatively large amount. The general procedure for the competitive ELISA assay is:
<ol>
	<li>Coat wells with antigen</li>
	<li>Incubate and wash</li>
	<li>Preincubate test sample with enzyme-conjugated primary antibodies</li>
	<li>Add mixture to well</li>
	<li>Incubate and wash away any unbound enzyme-conjugated primary antibody</li>
	<li>Add substrate</li>
</ol>
The &#34;competition&#34; in this assay comes from the fact that more antigen in the test sample used in step 3 will result in less antibody available to bind to the antigen coating the well. Thus, the intensity of the chromogenic/fluorogenic product in the well at the end of the assay is inversely related to the amount of antigen present in the test sample.
A key component in any type of ELISA is the titrated standards of known concentrations that will allow the user to determine the antigen concentration present in the test samples. Typically, a series of wells are designated for creating a standard curve, where known amounts of a purified recombinant protein are added to the wells in decreasing amounts. When these wells are processed at the same time as the test samples, the user can then have a reference set of absorbance values obtained from a microplate reader for known protein concentrations to go along with the absorbance values for the test samples. The user can then calculate a standard curve to which the test samples can be compared for determining the amount of protein of interest present. The standard curve can also determine the degree of precision of the user&#39;s dilution making.
Finally, the last step in each of the ELISA types listed above calls for the addition of a substrate. The degree of conversion of the substrate to product is directly related to the amount of enzyme present in the well. Horseradish peroxidase (HRP) and alkaline phosphatase (AP) are the most common enzymes found conjugated to antibodies. As expected, there are a number of substrates available specific for either enzyme that produce a chromogenic or fluorescent product. Moreover, substrates are available in a range of sensitivities that can increase the overall sensitivity of the assay. The user must also take into consideration the type of instrumentation available for reading the plate at the end of the experiment when picking the type of substrate to use, along with its corresponding enzyme-conjugated antibody.
Commonly used chromogenic substrates for HRP include 2,2&#39;-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS) and 3,3&#39;,5,5&#39;-tetramethylbenzidine (TMB), whereas p-Nitrophenyl Phosphate (PNPP) is used for AP. ABTS and TMB produce water-soluble green and blue colored reaction products, respectively. The green ABTS product has two major absorbance peaks, 410 and 650 nm, while the blue TMB product is best detected at 370 and 652 nm. The colors of ABTS and TMB change to yellow upon the addition of an acidic stop solution, which is best read at 450 nm. Color development for ABTS is slow, while it is fast for TMB. TMB is more sensitive than ABTS, and may produce a higher background signal if the enzymatic reaction proceeds too long. PNPP produces a yellow water-soluble product after AP conversion that absorbs light at 405 nm.

Source: Whitney Swanson1,2, Frances V. Sjaastad2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
...

Education

JoVE Science Education

İleri Biyoloji

İmmünoloji

An Assay to Measure Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers

Source: Gao, J., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54573">Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates an assay measuring influenza neuraminidase (NA) inhibiting antibody titers in a serum sample. A serum sample containing antibodies against NA is added to a fetuin-coated microwell plate. Upon adding the virus, the antibodies prevent viral NA from cleaving fetuin and exposing its galactose moiety. A peroxidase-conjugated lectin is then added, which binds to the exposed galactose. The NA-inhibiting antibody titer is determined using a colorimetric test, where a peroxidase substrate gets cleaved by the immobilized lectin-conjugated peroxidase to produce color.

İnfluenza Nöraminidaz İnhibisyonu Antikor Titrelerini Ölçmek İçin Bir Test

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of Reagents and ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Antikor Tabanlı Teknolojiler

Karakterizasyon ve Fonksiyonel Analiz

A Microneutralization Assay to Measure Neutralizing Antibody Titers in Human Serum

Source: Gross, F. L. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/56448">Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2017)
This video demonstrates Microneutralization assays to measure neutralizing antibodies using Madin-Darby Canine Kidney cells overexpressing &#945;2,6-linked sialic acid in human sera. This assay is often used for influenza human serology