We thank Dr. M. Rosenberg for her advice and help with anatomical sectioning. We also thank D. Eisler for his technical assistance. This research was supported by grants from FP7-PEOPLE-IRG-2008, Binational Agriculture research and Development (BARD; IS-4246-09), and Israel Science Foundation (ISF; 592/13).

1. Bitki Büyüme <ol><li> Yüzey tohumları sterilize edin. <ol><li> Islak ya da kuru bir yöntemle (30 mg kadar) tohum sterilize edin. Bir örnek olarak, kuru bir sterilizasyon yöntemi, en az 4 saat ve gece boyunca kadar kapalı bir kurutucuda bir cam beher içinde, 50 mi ağartıcı 1 ml buzlu HCI% 37 ekleyin. Bir kimyasal kaputu bu adımı gerçekleştirin. </li></ol></li><li> 0.5x Murashige &amp; Skoog (MS) ortamında% 0.8 bitki agar ile plakalar üzerinde steril tohumlarını yaymak. Parafilm veya gözenekli bantla plakaları sarın ve alüminyum folyo ile kapatın. </li><li> eşit bir şekilde çimlenmesine teşvik etmek için 4 gün 1 - 4 ° C&#39;de plakaları saklayın. </li><li> Arabidopsis fide yetiştirmek için uygun bir büyüme odasına plakaları aktarın. agar ortamı üstündeki kök büyümesini sürdürmek için ve penetrasyonu önlemek için dikey tabak yerleştirin. </li><li> Aktarım fidanları çimlenme (DAG) 7 gün sonra sabitleştirici için. </li></ol> 2. Sabitleme <ol><li> 50 mi Richardson Solutio hazırlanmasıiki kez damıtılmış su içinde% 1 boraks (tampon maddesi),% 1 metilen mavisi ve% 1 Azure (histolojik boyalar) eşit hacimlerde bir araya getirilmesiyle n. Kullanmadan önce 0.22 mikron PVDF Filtre Ünitesi Driven bir Şırınga süzülür. </li><li> 0.05 M Sodyum kakodilat (tamponlama ajanı)% 1.25 Glutaraldehyde: fiksatif 50 ml hazırlayın. Not: Bu malzemeler toksik olan ve kimyasal bir kaput ele alınması gerekir. </li><li> Nihai sabitleme bir çözüm elde etmek sabitleme çözeltisine Richardson çözeltisi 100 ul (2.1 bakınız) (2.2) ekleyin. </li><li> Marka, karşılık gelen Örnek adı, 6 gözlü bir plakanın her bir. </li><li> fide, bir kez transfer tamamen sıvı ele alınacaktır, böylece kuyulara (2.3 bakınız) 3 ml nihai tespit çözümü - 2 yerleştirin. </li><li> Dikkatle her kuyuya 10 fidan kadar, forseps kullanarak, aktarın. Parafilm kullanarak plakaları Seal. En az bir gece için, ve bir haftaya kadar karanlıkta 4 ° C&#39;de saklayın,. </li></ol> 3. Dehidrasyon <ol> &lt;li&gt; fidan kurutmak. Burada yer alan gibi, etanol artan konsantrasyonlarda içeren, yeni 6-delikli plakalara arasında transfer:% 10 etanol, 15 dakika boyunca; 15 dakika boyunca% 30 etanol; 15 dakika boyunca% 50 etanol; 15 dakika boyunca% 70 etanol; 15 dakika boyunca% 85 etanol; 15 dakika boyunca% 95 etanol; gece boyunca, en azından 4 ° C,% 95 etanol. dikkatle plastik forseps ile tercih onların kotiledon, onları tutarak fidan tutun. </li></ol> 4. Sızma <ol><li> infiltrasyon ortamı hazırlayın. Küçük bir cam şişeye 50 mi bazik reçine sıvı kiti ile historesin kiti aktivatör 1 torbanın içeriği karıştırın. 20 dakika için mıknatıslı karıştırın. Sızma ortamının bir kaç hafta boyunca 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Mark her gelen numune adıyla yeni bir 6-plaka kuyu ve 2 ile doldurun - infiltrasyon orta 3 ml. </li><li> forseps kullanarak sızma ortamına% 95 etanol çözeltisinden fidan aktarın. fidan fu olduğundan emin olunLly ortam ile kaplı. </li><li> Bitki dokularının içine maksimum nüfuz sağlamak için, en az 4 gün süreyle 4 ° C&#39;de depolayın. </li></ol> 5. Blok Hazırlık <ol><li> küçük etiketler, kalıp gömme her bir kuyu içinde, örnek adıyla kalem işaretli yerleştirin. </li><li> 15 ml sızma orta (4.1) 1 ml sertleştirici ekleyerek orta gömme hazırlayın. Polimerizasyon sorunları önlemek için, bir sesini daha küçük 15 ml hazırlamak için çalışmayın. </li><li> de 200 ul gömme ortamı ile kalıp içinde, her yarım doldurmak ve kalıp şekline kesilmiş bir üst filmi parçası ile kapak ama her iki tarafta, 1 mm daha büyük bir boyuta. polimerizasyonun izin vermek için, en az 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin. 5 saat aşmayın. </li><li> gömme orta ek bir toplu hazırlayın (5.2) ve kök uçları kalıp içinde düzenlenmiş edilirken polimerizasyonu önlemek için, buz üzerinde tutmak. </li><li> neşter kullanılarak bir diseksiyon kapsamında her kök ucu kesilmiş ve çok dikkatli bir i konumlandırmakT: dikey enine kesitler ya da yatay uzunlamasına kesit, yaklaşık 2 de - kalıp çeperine ile 3 mm. bir üst film ile çözelti ve kapağı bloke tamamen kalıp doldurun. o polimerize sonra engelleme çözümü biraz küçültmek unutmayın. </li><li> en azından 2 saat boyunca oda sıcaklığında saklayın. </li><li> blok kurutulması için, kuru silika jeli ile bir kutu içinde yer ve en azından, bir gece boyunca oda sıcaklığında bekletin. </li></ol> 6. Kesit <ol><li> Bir bıçak makinesi ile cam çubuklar cam bıçak hazırlayın. Doku kesit cam bıçak kullanın. Bir kare içine cam çubuk kesin ve sonra bir elmas puanlama aracını kullanarak, iki bıçak üretmek için çapraz kare kesti. </li><li> Bir kesit makine kullanarak 3 mikron genişlik dilimleri, - 2 içine Bölüm blokları. su buharlaşana kadar - (60 ° C 50), yer distile su damlacıklarının üstünde bir bardak slayt dilimleri ve düşük ısı için ayarlanmış bir ısı bloğu üzerine slayt yerleştirin. </li></ol><ol><li> Orijinal çözeltisi% 0.2 Richardson çözeltisi (2.1) ile seyreltilir ve dilimleri kapsayacak şekilde 1 ml kullanın. 5 saniye için ısı bloğuna yerleştirilir ve daha sonra damıtılmış su ile yıkayın. </li><li> sıcak bir plaka üzerinde slayt kurutun. Ilgi dilimleri konumunu belirtmek için mikroskop altında daha sonraki kimlik kolaylaştırmak için, bir diseksiyon kapsamında gözlemleyin ve bir işaretleyici ile slayt arka işaretleyin. </li><li> örtücü bir kılıfla montaj orta ve kapak 100 ul ekle. </li></ol> 8. Görüntü Alma <ol><li> Geciktirici bilgi ve polarize / girişim optik filtresi (Şekil 1 AD) elde etmek için uygun Polscope sistemi ile donatılmış bir ışık mikroskobu altında kök bölümleri içeren kapalı slayt yerleştirin. </li><li> Numunenin tamamının açık görselleştirme sağlar seçin büyütme (örneğin, bu çalışmada 40X) ve mikroskop odakBlok bölümü ama hiçbir kök bölümü içeren boş bir alana e. Hiçbir lekeleri ile temiz bölge bulmaya çalışın. arka plan ayarlamak için bu bölgeyi kullanın. </li><li> görüntüleme sistemi ve yazılım parametreleri ayarlayın: Set aralığı 17 nm. (8.2) &quot;Otomatik Pozlama&quot; Uygula ve boş alandan arka plan görüntüsünü alın. Bir arka plan görüntüsü deney başına kullanılır. </li></ol> Selüloz Mikrofibril Oryantasyon 9. Polscope Analizi <ol><li> boyuna kesitlerin analizi. <ol><li> mikroskop altında boyuna kesitler içeren bir slayt yerleştirin ve bunun bir geciktirici görüntü elde. ilgi kök bölümünde mikroskop odaklanın. Yeni bir dosya adı sağlayın. </li><li> &quot;Canlı Abrio&quot; pencereden bir Abrio görüntüsü (retardasyon bilgilerle görüntü) yakalayın. Şekil 2C&#39;de gösterildiği gibi, hücre çevresi boyunca çalışan lekeli selüloz belirlenebilir hücre duvarı içeren bir bölümünü içine almak için edin.</li></ol></li><li> Görüntü analizi. <ol><li> görüntü yığını ilgili resmin üzerine çift tıklayın. &quot;Ekran Ayarları&quot; sekmesinde &quot;Oryantasyon Sözde rengi&quot; i seçin. </li><li> Selüloz mikrofibril açısını tahmin etmek için, renk çarkı bu hücre duvarının karşılık gelen gölge eşleşir. Not: Şekil 2C&#39;de renk çarkı mikrofibrillerin uzun ekseni boyunca yönünü gösterir mikrofibril boyunca uzanan ışık yavaş ekseni yansıtır. selüloz mikro-iplikçiklerinin açısı renk ve hücrenin uzun ekseni ile gösterilen açıdır. Örneğin, içerlek uzayan hücre hücrelerinin uzun eksenine yaklaşık 90 ° eğimli cam göbeği renkli gösterir. </li><li> Hücre duvarının ortalama mikrofibril açısını ölçmek için, yazılımın araç çubuğundan &quot;geciktirici ve Azimut Damgası&quot; aracını kullanın. aracı, noktayı seçerek ve süre elde edilen görüntüde ilgilenilen bölgeye tıklayın. NOT: Bu wilderece açı (azimut) (Şekil 2C) ekranında l sonucu. </li><li> eklenti menüsünden alternatif erişime açık polarize ışık görüntü analiz yazılımı, öğle yemeği &quot;Pol-Analyzer&quot; eklentisi. Yeni açılan pencerede, &quot;Birefringence&quot; sekmesini ve açık seçin ve ardından arka plan dosya ve resim dosyası kaydedin. </li><li> Görüntü penceresinde, &quot;Özellikleri&quot; i seçin. ve (bu çalışma için kullanılması 5 piksel) &#39;YG piksel boyutunu&#39; ayarlayın. &quot;Özelliklerin.&quot; Içinde pencere seçin &quot;Sonuç tablosunda göstermek değerler&quot;. </li><li> Görüntü penceresinde ilgi bölgeyi işaretlemek için Poligon aracını kullanın. selüloz mikrofibril yönünü elde etmek için &quot;Oryantasyon Lines&quot; seçeneğini seçin. Not: Bu derece açı (azimut) ekranında neden olur. NOT: Her iki yöntemden biri ile hesaplanan ortalama açısı daha sonra slayt üzerinde kök bölümünün konumlandırılması normalize edilmelidir. sapma düzeltmek içinslayt boyunca bütün kök bölümünün yatay konumlandırma, (o bölüme dik ve kök büyüme ekseni, Şekil 2C boyunca olduğu) uzun ekseni boyunca hücreyi kuşatan hücre duvarının ortalama mikrofibril açısını ölçmek. Kök bölümü doğru slayt boyunca yerleştirilmiş olduğunda bu açı 180 ° &#39;dir. mikrofibril açısını hesaplamak için, 180 ° &#39;den sınırdaş hücre duvarının ortalama ölçülen mikrofibril açısını çıkarın. slayt üzerine düz yatıyor hücre duvarının ortalama ölçülen mikrofibril açısına sonuçlandı farkı ekleyin. </li></ol></li></ol> Kristalin selüloz Birikimi 10. Polscope Analizi <ol><li> enine (çapraz) bölümleri kullanın. bunların selüloz mikrolitler benzer açıyla sıralanması durumunda (9 belirlenen) bu kristal selüloz birikim hücreler arasında karşılaştırılabilir okuyabilir. </li><li> görüntü yığını ilgili resmin üzerine çift tıklayın. Seç &quot;PEkran Ayarları &quot;sekmesinden&quot; in &quot;renk seudo. </li><li> geciktirici ölçmek için. Zoom-in resmin üzerine. &quot;Bölge&quot; i seçin ve ilgi tüm bölgeleri işaretleyin. Tüm değerleri &quot;Panoya kopyala&quot; &quot;ölçümleri&quot; sekmesine ve taşıyın. <ol><li> Excel&#39;e veri aktarımı ve gerekli bilgileri (geciktiricili bölgesini ortalama) ayıklayın. veri normalleştirmek. NOT: dilimler arasındaki kalınlık farklılıkları hesaba slayt belirli bir hücre duvarı kenarına göre değerlerini ifade etmek için. normalleştirmek için, aynı görüntüde farklı bir hücre duvarının ortalama geciktiricili tarafından ilgiyle hücre duvarına karşılık gelen ortalama geciktirici bölün. Örneğin dış epidermal hücre duvarı çalışmamızda iç kortikal hücre duvarı göre normalize edildi. </li></ol></li><li> Örnek başına 3 köklerinin en az, kök başına en az 3 bölümler için ölçümler tekrar edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+the+plant+cell+wall.">Growth of the plant cell wall.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6, 850-861 (2005).</li><li>Wolf, S., Hematy, K., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+control+and+cell+wall+signaling+in+plants.">Growth control and cell wall signaling in plants.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 381-407 (2012).</li><li>Mazeau, K., Heux, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Dynamics+Simulations+of+Bulk+Native+Crystalline+and+Amorphous+Structures+of+Cellulose.">Molecular Dynamics Simulations of Bulk Native Crystalline and Amorphous Structures of Cellulose.</a> J. Phys. Chem. B. 107, 2394-2403 (2003).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cellulose+fiber+structure+by+SEM,+XRD,+NMR+and+acid+hydrolysis.">Studying cellulose fiber structure by SEM, XRD, NMR and acid hydrolysis.</a> Carbohydr Polym. 68, 235-241 (2007).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+microtubules+optimize+cell-wall+crystallinity+to+drive+unidirectional+growth+in+Arabidopsis.">Cortical microtubules optimize cell-wall crystallinity to drive unidirectional growth in Arabidopsis.</a> Plant J. 66, 915-928 (2011).</li><li>Peng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractional+separation+and+structural+features+of+hemicelluloses+from+sweet+sorghum+leaves.">Fractional separation and structural features of hemicelluloses from sweet sorghum leaves.</a> Bioresources. 7, (2012).</li><li>Xu, S. L., Rahman, A., Baskin, T. I., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+leucine-rich+repeat+receptor+kinases+mediate+signaling,+linking+cell+wall+biosynthesis+and+ACC+synthase+in+Arabidopsis.">Two leucine-rich repeat receptor kinases mediate signaling, linking cell wall biosynthesis and ACC synthase in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20, 3065-3079 (2008).</li><li>Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Imaging+of+Cellulose+Reorientation+during+Cell+Wall+Expansion+in+Arabidopsis+Roots.">Real-Time Imaging of Cellulose Reorientation during Cell Wall Expansion in Arabidopsis Roots.</a> Plant Physiol. 152, 787-796 (2010).</li><li>Baskin, T. I., Beemster, G. T., Judy-March, J. E., Marga, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorganization+of+cortical+microtubules+stimulates+tangential+expansion+and+reduces+the+uniformity+of+cellulose+microfibril+alignment+among+cells+in+the+root+of+Arabidopsis.">Disorganization of cortical microtubules stimulates tangential expansion and reduces the uniformity of cellulose microfibril alignment among cells in the root of Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 135, 2279-2290 (2004).</li><li>Iyer, K. R. K., Neelakantan, P., Radhakrishnan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birefringence+of+native+cellulosic+fibers.+I.+Untreated+cotton+and+ramie.">Birefringence of native cellulosic fibers. I. Untreated cotton and ramie.</a> J. Polym. Sci. A-2: Polymer Physics. 6, 1747-1758 (1968).</li><li>Abraham, Y., Elbaum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+microfibril+angle+in+secondary+cell+walls+at+subcellular+resolution+by+means+of+polarized+light+microscopy.">Quantification of microfibril angle in secondary cell walls at subcellular resolution by means of polarized light microscopy.</a> New Phytol. 197, 1012-1019 (2013).</li><li>Petricka, J. J., Winter, C. M., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Arabidopsis+root+development.">Control of Arabidopsis root development.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 563-590 (2012).</li><li>Vanstraelen, M., Benkova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+Interactions+in+the+Regulation+of+Plant+Development.">Hormonal Interactions in the Regulation of Plant Development.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. , (2012).</li><li>Singh, A. P., Savaldi-Goldstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+control:+brassinosteroid+activity+gets+context.">Growth control: brassinosteroid activity gets context.</a> J Exp Bot. 66, 1123-1132 (2015).</li><li>Fridman, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+growth+is+modulated+by+differential+hormonal+sensitivity+in+neighboring+cells.">Root growth is modulated by differential hormonal sensitivity in neighboring cells.</a> Genes Dev. 28, 912-920 (2014).</li><li>Vragovic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translatome+analyses+capture+of+opposing+tissue-specific+brassinosteroid+signals+orchestrating+root+meristem+differentiation.">Translatome analyses capture of opposing tissue-specific brassinosteroid signals orchestrating root meristem differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 923-928 (2015).</li><li>Hacham, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brassinosteroid+perception+in+the+epidermis+controls+root+meristem+size.">Brassinosteroid perception in the epidermis controls root meristem size.</a> Development. 138, 839-848 (2011).</li><li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+cellulose+synthase-associated+protein+required+for+cellulose+biosynthesis.">Identification of a cellulose synthase-associated protein required for cellulose biosynthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 12866-12871 (2010).</li><li>Fendrych, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+controlled+by+ANAC033/SOMBRERO+determines+root+cap+organ+size+in+Arabidopsis.">Programmed cell death controlled by ANAC033/SOMBRERO determines root cap organ size in Arabidopsis.</a> Curr Biol. 24, 931-940 (2014).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest.

Anatomik bilgi korurken Burada, Arabidopsis kökleri oluşturan farklı dokularda kristalin selüloz birikmesine tayini için bir yöntem sunulmaktadır. Bu nedenle, bir selüler çözünürlükte bitki büyüme süreçlerinin anlaşılması yönünde bir adım içerir. Bu yöntem, aynı zamanda, ek bitki türleri ve organların çalışma için uygulanabilir. yöntemi uygulanırken noktalarının sayısı dikkate alınmalıdır. Belirli bir kök bölümü ilk, kristalin selüloz bi...

bitki hücre duvarı dinamik bir yapıdır. Büyüyen hücreleri hücreler genişletmek için izin veren kuruluş olan birincil hücre duvarı ile çevrilidir. depozito bitkinin mekanik destek geliştiren bir daha sert ikincil duvar büyümeye ateşkes Hücreler. Her iki hücre duvarları, farklı gelişim aşamasında arasında değişir ve 1,2 dokular farklı yapılarda (örneğin, hemiselüloz ve pektini) polisakaridlerinin bir matris içine gömülü, selüloz mikro-iplikçiklerinin oluşmaktadır. Selüloz sıkı bir kristalin yapısının mikrofibril oluşturulması için hizalanır (1,4) -β-D-glukan zincirleri olarak sentezlenir. Amorf selüloz glukan zincirleri daha sıralanır bölgeleri belirtir. Kristalin ve amorf alan arasındaki oran, mekanik mukavemet ve viskoelastik özelliklerini sırasıyla 3 sağlayarak hücre duvarının mekanik özelliklerini etkilediği düşünülen bir parametredir. Çeşitli yöntemler olmuşturX-ışını kırınımı ve çapraz polarizasyon / solid-state NMR 4 iplik sihirli açı algılamak ve aralarında selüloz düzenlemesinin iki formlarını ölçmek için geliştirdi. X-ışını difraksiyon numunesi 5 amorf selüloz etki karşı kristalin oranını belirlemek için kullanılabilir. Alternatif bir yöntem, sırasıyla, kristalin ve amorf selüloz ya da başka polimerler arasında ayrım, asit çözünmeyen ve asit çözünür malzeme içine hücre duvarı içeriği fraksiyonasyon kullanır. Bu yaklaşımda, işaretlenmiş glukoz ([14C] glukoz) eklenmesi, selüloz, 6,7 ölçmek için kullanılır. Bu yöntemler, en iyi tüm organ analizi için, bitki malzemesi, büyük hacimli gerektirir ve bu nedenle, hücre duvarı yapısına, doku spesifik varyasyona yetersiz duyarlıdır. Hücresel bir çözünürlükte selüloz mikro-iplikçiklerinin Görselleştirme değişiklikleri tespit olabilir, floresan boyalar ile birlikte 8,9 canlı görüntüleme çalışmaları elde edilebilirselüloz mikro-iplikçiklerinin yönelimi. Bununla birlikte, bu boyalar, miktar tayini için kullanılır, bu selüloz, kristal halindeki özgü değildir ve hücre duvarının 8 normal yapısına müdahale edebilir. Polscope ışık ışınlarını bölünmüş ve ışığı 10 bir kısmını geciktirmek için kristalli selüloz yeteneğine dayanan bir görüntüleme tekniğidir. Işık geriliği ışığı yayılma yönüne dik yalan mikrolitlerin en güçlü olduğu. Benzer bir yönlendirme ile mikro-iplikçikler, ışık geciktirici 11 daha büyük bir kristallik derecesi artar. Bu nedenle, polscope bağıl seviyelerde ve selüloz mikro-iplikçiklerinin yönünü hem de incelemek için kullanılır. Hızla 12 genişletmek önce kökleri, hücre bölünmeleri bir dizi geçmesi, hücreler kök ucunda, kök hücre niş de kaynaklanan sırasında doğrusal bir büyüme sergilemektedir. kök içeren hücreler, bir tek yönlü (anizotropik) genişletmekşekilde, hücre duvarının 13 özelliklerini etkileyen küçük molekül sinyal hormonlar tarafından dikte edildiği gibi. Hormonlar Diferansiyel yanıtları, zaman ve mekan içinde, dengeli bir organ büyümesi 14 sağlamanın bir araç sağlar. Bu nedenle, hücre duvarı yapısının yüksek çözünürlüklü analizi daha iyi tüm organ büyümesine hücre tipine spesifik yanıtlar arasındaki bağlantıyı anlamak için gerekli önemli bilgiler sağlayabilir. Burada, yüksek kaliteli, anatomik bölümlerde görüldüğü gibi Arabidopsis kökleri kristalli selüloz dokuya özel birikmesini çalışma polscope uygulanmasını rapor etmektedir. Bu yöntem, en son hormon aktivitesi 15 uzaysal pertürbasyon yanıt olarak kristalli selüloz hücre tipine spesifik birikimi ortaya çıkardı.

<table><tbody><tr><td>Murashige &amp;amp; Skoog (MS)</td><td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>Borax</td><td>LOBA CHEMIE&amp;nbsp;</td><td>6038</td><td></td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Sigma</td><td>M-9140</td><td></td></tr><tr><td>Azure</td><td>Sigma</td><td>861065</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Driven 0.22 mm PVDF Filter&amp;nbsp;</td><td>MILLEX-GV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>EMS</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Cacodylate</td><td>Sigma</td><td>C-0250</td><td></td></tr><tr><td>Leica kit historesin&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>7022 18 500</td><td></td></tr><tr><td>embedding molds</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3530</td><td></td></tr><tr><td>film 100 &amp;micro; P.P.C.&amp;nbsp;</td><td>www.Jolybar.com</td><td></td><td>overhead film</td></tr><tr><td>Knivemaker</td><td>LKB</td><td>7800</td><td></td></tr><tr><td>Ultratome III</td><td>LKB</td><td>8800</td><td>Ultratome</td></tr><tr><td>Shandon immumount&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td>9990402</td><td>mounting medium</td></tr><tr><td>light microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>Abrio imaging system</td><td>CRI</td><td>Abrio imaging system</td><td></td></tr><tr><td>Abrio V2.2 software</td><td>CRI</td><td>Abrio V2.2 software</td><td></td></tr><tr><td>Open access polarized light image analysis software &amp;nbsp;</td><td>OPS</td><td>OpenPolScope</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.openpolscope.org/&quot;&gt;http://www.openpolscope.org/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

high resolution quantification of crystalline cellulose accumulation in arabidopsis roots to monitor tissue-specific cell wall modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

Bir model, bir organ 15-17 olarak Arabidopsis kök kullanılarak brassinosteroidlerin (BR) için hücre tipine spesifik yanıtların etkisini incelemek. BR reseptör BRI1 hedeflendiğinde, olmayan saç hücreleri olarak adlandırılan epidermal hücrelerin bir alt kümesi (Şekil 2A, B), bu tek yönlü bir komşu hücrelerin hücre genişlemesi ve bütün kök büyüme 15 inhibe etmek bri1 mutantının arka bölgesi. Polscope anali...

Watch this Scientific Journal Video about High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications at JoVE.com

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Kristalin Selüloz Birikimin Yüksek Çözünürlüklü Niceleme<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Kökler Doku spesifik Hücre Duvarı Değişiklikler Monitör

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

high-resolution-quantification-crystalline-cellulose-accumulation

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

8.1K Görüntüleme.  Technion-Israel Institute of Technology. Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Video: High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

Bitki Hücre Duvarları Kapsamlı Kompozisyonel Analiz (Lignocellulosic biyokütle) Bölüm II: Karbonhidratlar

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

Biyoloji

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find cost-effective and sustainable solutions has become a topical and critical task. Lignocellulosic biomass is poised to become the primary source of biomass for the conversion to liquid biofuels1-6. However, the recalcitrance of these plant cell wall materials to cost-effective and efficient degradation presents a major impediment for their use in the production of biofuels and chemicals4. In particular, lignin, a complex and irregular poly-phenylpropanoid heteropolymer, becomes problematic to the postharvest deconstruction of lignocellulosic biomass. For example in biomass conversion for biofuels, it inhibits saccharification in processes aimed at producing simple sugars for fermentation7. The effective use of plant biomass for industrial purposes is in fact largely dependent on the extent to which the plant cell wall is lignified. The removal of lignin is a costly and limiting factor8 and lignin has therefore become a key plant breeding and genetic engineering target in order to improve cell wall conversion.
Analytical tools that permit the accurate rapid characterization of lignification of plant cell walls become increasingly important for evaluating a large number of breeding populations. Extractive procedures for the isolation of native components such as lignin are inevitably destructive, bringing about significant chemical and structural modifications9-11. Analytical chemical in situ methods are thus invaluable tools for the compositional and structural characterization of lignocellulosic materials. Raman microscopy is a technique that relies on inelastic or Raman scattering of monochromatic light, like that from a laser, where the shift in energy of the laser photons is related to molecular vibrations and presents an intrinsic label-free molecular "fingerprint" of the sample. Raman microscopy can afford non-destructive and comparatively inexpensive measurements with minimal sample preparation, giving insights into chemical composition and molecular structure in a close to native state. Chemical imaging by confocal Raman microscopy has been previously used for the visualization of the spatial distribution of cellulose and lignin in wood cell walls12-14. Based on these earlier results, we have recently adopted this method to compare lignification in wild type and lignin-deficient transgenic Populus trichocarpa (black cottonwood) stem wood15. Analyzing the lignin Raman bands16,17 in the spectral region between 1,600 and 1,700 cm-1, lignin signal intensity and localization were mapped in situ. Our approach visualized differences in lignin content, localization, and chemical composition. Most recently, we demonstrated Raman imaging of cell wall polymers in Arabidopsis thaliana with lateral resolution that is sub-&mu;m18. Here, this method is presented affording visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species without staining or labeling of the tissues.

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

A method based on confocal Raman microscopy is presented that affords label-free visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species.

Etiket- In situ</emBitki Hücre Duvarlar Lignification> Görüntüleme

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find ...

Atomic Force Microscopy to Study the Physical Properties of Epidermal Cells of Live Arabidopsis Roots

A method is described here to characterize the physical properties of the cell wall of epidermal cells of living Arabidopsis roots through nanoindentations with an atomic force microscope (AFM) coupled with an optical inverted fluorescence microscope. The method consists of applying controlled forces to the sample while measuring its deformation, allowing quantifying parameters such as the apparent Young's modulus of cell walls at subcellular resolutions. It requires a careful mechanical immobilization of the sample and correct selection of indenters and indentation depths. Although it can be used only in external tissues, this method allows characterizing mechanical changes in plant cell walls during development and enables the correlation of these microscopic changes with the growth of an entire organ.

Atomic Force Microscopy to Study the Physical Properties of Epidermal Cells of Live Arabidopsis Roots

The atomic force microscopy indentation protocol offers the possibility to dissect the role of the physical properties of the cell wall of a particular cell of a tissue or organ during normal or constrained growth (i.e., under water deficit).

Canlı Arabidopsis Köklerinin Epidermal Hücrelerinin Fiziksel Özelliklerini İncelemek için Atomik Kuvvet Mikroskobu

A method is described here to characterize the physical properties of the cell wall of epidermal cells of living Arabidopsis roots through ...

Gelişim Biyolojisi

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

Uzun süreli, yüksek çözünürlüklü Konfokal Time Lapse Görüntüleme<em&gt; Arabidopsis Kotiledon</emÇimlenme sırasında&gt; Epidermis

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories can face is the development and attainment of these methods. Observation of phenotypes in a process of interest is a typical objective of research labs studying gene function and this is often achieved through image capture. A particular process that is amenable to observation using imaging approaches is the corrective growth of a seedling root that has been displaced from alignment with the gravity vector. Imaging platforms used to measure the root gravitropic response can be expensive, relatively low in throughput, and/or labor intensive. These issues have been addressed by developing a high-throughput image capture method using inexpensive, yet high-resolution, flatbed scanners. Using this method, images can be captured every few minutes at 4,800 dpi. The current setup enables collection of 216 individual responses per day. The image data collected is of ample quality for image analysis applications.

This protocol describes a process for rapid collection of images of Arabidopsis seedlings responding to a gravity stimulus using commercially-available flatbed scanners. The method allows for inexpensive, high-volume capture of high-resolution images amenable for downstream analysis algorithms.

Arabidopsis Kök Gravitropic Müdahale Yüksek çözünürlüklü Zaman lapsed Resim Toplama Masaüstü Tarayıcılar kullanma

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) micro/nano-indentations, for a JPK&#160;AFM. Specifically, in this protocol we measure the apparent Young&#8217;s modulus of cell walls at subcellular resolutions across regions of up to 100 &#181;m&#160;x 100 &#181;m in floral meristems, hypocotyls, and roots. This requires careful preparation of the sample, the correct selection of micro-indenters and indentation depths. To account for cell wall properties only, measurements are performed in highly concentrated solutions of mannitol in order to plasmolyze the cells and thus remove the contribution of cell turgor pressure.
In contrast to other extant techniques, by using different indenters and indentation depths, this method allows simultaneous multiscale measurements, i.e. at subcellular resolutions and across hundreds of cells comprising a tissue. This means that it is now possible&#160;to spatially-temporally characterize the changes that take place in the mechanical properties of cell walls during development, enabling these changes to be correlated with growth and differentiation. This represents a key step to understand how coordinated microscopic cellular changes bring about macroscopic morphogenetic events.
However, several limitations remain: the method can only be used on fairly small samples (around 100 &#181;m in diameter) and only on external tissues; the method is sensitive to tissue topography; it measures only certain aspects of the tissue&#8217;s complex mechanical properties. The technique is being developed rapidly and it is likely that most of these limitations will be resolved in the near future.

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Hücre Duvarları Elastik Özelliklerinin AFM-tabanlı Haritalama: doku, hücresel ve Subselüler Çözünürlüklerde

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

Histokimyasal boyama<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Ortaöğretim Hücre Duvar Elemanları

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

Tüm montaj ovüllerindeki in Kromatin Modifikasyonu ve Nükleer Mimarlık Kantitatif, Tek hücreli Analizi için Etkin Bir Yöntem<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. Upon wounding of a leaf, an increase in cytosolic calcium ion concentration (Ca2+ signal) occurs at the wound site. This signal is rapidly transmitted to undamaged leaves, where defense responses are activated. Our recent research revealed that glutamate leaking from the wounded cells of the leaf into the apoplast around them serves as a wound signal. This glutamate activates glutamate receptor-like Ca2+ permeable channels, which then leads to long-distance Ca2+ signal propagation throughout the plant. The spatial and temporal characteristics of these events can be captured with real-time imaging of living plants expressing genetically encoded fluorescent biosensors. Here we introduce a plant-wide, real-time imaging method to monitor the dynamics of both the Ca2+ signals and changes in apoplastic glutamate that occur in response to wounding. This approach uses a wide-field fluorescence microscope and transgenic Arabidopsis plants expressing Green Fluorescent Protein (GFP)-based Ca2+ and glutamate biosensors. In addition, we present methodology to easily elicit wound-induced, glutamate-triggered rapid and long-distance Ca2+ signal propagation. This protocol can also be applied to studies on other plant stresses to help investigate how plant systemic signaling might be involved in their signaling and response networks.

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Extracellular glutamate-triggered systemic calcium signaling is critical for the induction of plant defense responses to mechanical wounding and herbivore attack in plants. This article describes a method to visualize the spatial and temporal dynamics of both these factors using Arabidopsis thaliana plants expressing calcium- and glutamate-sensitive fluorescent biosensors.

Arabidopsis'te Lokal ve Sistemik Yara Sinyallerinin Geniş Alan, Gerçek Zamanlı Görüntülenmesi

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. ...

Arabidopsis Fidesinde Klorofil Biyosentezinin Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Non-invasive Assay for Chlorophyll Biosynthesis Kinetics Determination during Early Stages of Arabidopsis De-etiolation

Chlorophyll biosynthesis is a hallmark of de-etiolation, one of the most dramatic stages in the plant life cycle. The tightly controlled and highly dynamic process of chlorophyll biosynthesis is triggered during the shift from the dark to the light in flowering plants. At the moment when etiolated seedlings are exposed to the first traces of sunlight, rapid (in order of seconds) conversion of protochlorophyllide into chlorophyllide is mediated by unique light-accepting protein complexes, leading via subsequent metabolic steps to the production of fully functional chlorophyll. Standard techniques for chlorophyll content analysis include pigment extraction from detached plant tissues, which does not apply to studying such fast processes. To investigate chlorophyll kinetics in vivo with high accuracy and spatiotemporal resolution in the first hours after light-induced de-etiolation, an instrument and protocol were developed. Here, we present a detailed procedure designed for statistically robust quantification of chlorophyll in the early stages of Arabidopsis de-etiolation.

Yazar Spotlight: De-etiolasyon sırasında klorofil sentezinin non-invaziv yüksek çözünürlüklü ölçümü

Here, we describe an advanced tool designed for chlorophyll biosynthesis monitoring during the early stages of Arabidopsis seedling de-etiolation. The novel methodology provides non-invasive real-time chlorophyll fluorescence imaging at high spatial and temporal resolution.

Arabidopsis De-etiolasyonunun Erken Aşamalarında Klorofil Biyosentez Kinetiğinin Belirlenmesi için Non-İnvaziv Test

Chlorophyll biosynthesis is a hallmark of de-etiolation, one of the most dramatic stages in the plant life cycle. The tightly controlled and highly ...

Kristalin Selüloz Birikimin Yüksek Çözünürlüklü Niceleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Bitki Hücre Duvarları Kapsamlı Kompozisyonel Analiz (Lignocellulosic biyokütle) Bölüm II: Karbonhidratlar

Etiket- In situ Görüntüleme

Canlı Arabidopsis Köklerinin Epidermal Hücrelerinin Fiziksel Özelliklerini İncelemek için Atomik Kuvvet Mikroskobu

Uzun süreli, yüksek çözünürlüklü Konfokal Time Lapse Görüntüleme

Arabidopsis Kök Gravitropic Müdahale Yüksek çözünürlüklü Zaman lapsed Resim Toplama Masaüstü Tarayıcılar kullanma

Hücre Duvarları Elastik Özelliklerinin AFM-tabanlı Haritalama: doku, hücresel ve Subselüler Çözünürlüklerde

Histokimyasal boyama

Tüm montaj ovüllerindeki in Kromatin Modifikasyonu ve Nükleer Mimarlık Kantitatif, Tek hücreli Analizi için Etkin Bir Yöntem

Arabidopsis'te Lokal ve Sistemik Yara Sinyallerinin Geniş Alan, Gerçek Zamanlı Görüntülenmesi

Arabidopsis De-etiolasyonunun Erken Aşamalarında Klorofil Biyosentez Kinetiğinin Belirlenmesi için Non-İnvaziv Test