Bu protokol, yara almaya yanıt olarak kalsiyum ve apoplastik glutamanın dinamiklerini izleyerek bitki sistemik sinyal sisteminin aktivitesinin bitki çapında gerçek zamanlı görüntülenmesini sağlar. Bu tesis çapında gerçek zamanlı görüntüleme yöntemi, bitkilerdeki hızlı ve uzun mesafe sinyallerinin dinamiklerini anlamak için sağlam bir araç sunarak yüksek uzamsal zamansal çözünürlüğü ve kullanım kolaylığını birleştirir. Bu protokol, diğer bitki türlerinde hem biyotik hem de abiyotik stres yanıtlarında sistem kalsiyum sinyalinin mekansal ve zamansal özellikleri hakkında yeni bir fikir verme potansiyeli sunmaktadır.
Prosedürü gösteren takuya Uemura olacak, laboratuvarımdan doktora sonrası. 1X objektif lens ve sCMOS kamera ile donatılmış motorlu floresan stereo mikroskobu açarak başlayın. Cihaz ayarlarını, 450 ila 490 nanometre arasında ışık ileten bir filtre kullanılarak seçilen 470 nanometre merkezli uyarım ışığıyla ışınlamak için yapılandırın.
510 ila 560 nanometre arasında iletim yapan bir filtre kullanarak emisyon ışığı alın. Kapağı bitkiyi içeren tabaktan çıkarın ve objektif merceğin altına yerleştirin. Bitkiden gelen floresan sinyalini kontrol edin.
Daha sonra bitkiler yeni çevre koşullarına adapte olana kadar karanlıkta yaklaşık 30 dakika bekleyin. Tüm bitkiyi görüş alanında görmek için odağı ve büyütmeyi ayarlayın. Ardından, mikroskop görüntüleme yazılımını kullanarak floresan sinyallerini algılamak için alma parametrelerini ayarlayın.
Kayıt süresini 11 dakika olarak ayarlayın. Bitkiyi mikroskoptan mavi ışık ışınlaması için alıştırmaya başlamadan önce beş dakika boyunca görüntü, sonra kayda başlayın. Ortalama taban çizgisi floresan kaydını, yara veya glutamat uygulamasından en az 10 kare önce belirlemek.
Yara kaynaklı sitozolitik kalsiyum iyonunun ve apoplastik glutamat konsantrasyon değişikliklerinin gerçek zamanlı görüntülenmesi için, yaprak L1'in petiole veya orta bölgesini makasla kesin. Glutamatın gerçek zamanlı görüntülenmesi için sitozolitik kalsiyum değişikliklerini tetikledi, ana damar boyunca L1 yaprağının ucundan makasla yaklaşık bir milimetre kesin. En az 20 dakika sonra yaprağın kesilmiş yüzeyine 10 milimolar glutamat 10 mikrolitre uygulayın.
Zaman içinde floresan yoğunluğu analizi için, floresan yoğunluğunun analiz edilmesi gereken yerde ilgi çekici bir bölge tanımlayın. Kalsiyum dalgasının hız hesaplaması için iki ROI tanımlayın. Görüntüleme yazılımında zaman ölçümüne tıklayın, tanımlayın ve daire içine edin.
Ek açıklamalar ve ölçüm, uzunluk ve basit çizgiye tıklayarak iki bölge arasındaki mesafeyi ölçün. Ölçüye tıklayarak zaman içinde her yatırım getirislerindeki ham floresan değerlerini ölçün, ardından floresan sinyalini her zaman noktasında sayılara dönüştürmek için ham verileri elektronik tablo yazılımına dışa aktarın. Kaydedilen verilerdeki ilk 10 karenin ortalama F değerini hesaplayarak F sıfır olarak ilahi olan temel floresan değerini belirleyin, ardından metin el yazmasında açıklandığı gibi F verilerini normalleştirin.
Kalsiyum hızı dalga analizi için, önceden uyarılmış değerlerin üzerinde önemli bir sinyal yükselme noktasını, her yatırım getirisinde bir kalsiyum artışının tespitini temsil eden olarak tanımlayın. Herhangi bir kalsiyum dalgasının hızlarını belirlemek için iki ROI arasındaki kalsiyum artışındaki zaman farkını ve aralarındaki mesafeyi hesaplayın. Sitozolitik kalsiyum iyon ve apoplastik glutamat konsantrasyonlarında yara ile tetiklenen bir değişikliğin yayılması burada gösterilmiştir.
GCaMP-3'i ifade eden bitkilerde bir yaprağın yaprak sapını kesmek kalsiyumda önemli bir artışa yol açtı. Lokal olarak indüklendi ve daha sonra vaskülat boyunca yayıldı. Sinyal birkaç dakika içinde komşu yapraklara hızla yayılmış.
Bir yaprak ve temel chitinase I tutkal koklayıcı ifade eden bitkiler kesildikten sonra, kesilen bölge çevresinde hızlı bir apoplastik glutamat artışı gözlendi. Birkaç dakika içinde, sinyal de vaskülatörden yayılır. Glutamat uygulaması ile tetiklenen kalsiyum sinyal yayılımının gerçek zamanlı görüntülenmesi için, CCaMP-3'ü ifade eden bitkilerdeki bir yaprağın kenarı kesildi.
Bu, lokal sitosoleik kalsiyum iyon konsantrasyonu artışına neden oldu, ancak sinyal birkaç dakika içinde kayboldu. Yaklaşık 10 dakika sonra, kesilen yüzeye glutamat uygulandı ve sitosolik kalsiyum konsantrasyonunda hızlı bir lokal artışa ve daha sonra bu sinyalin distal yapraklara yayılmasına neden oldu. Sistemik yapraktaki yaranın neden olduğu katı kalsiyum konsantrasyonu içindeki değişiklikleri ölçmek için, GCaMP-3 sinyal yoğunluğunun zaman seyri değişimi iki ilgi çekici bölgede ölçüldü.
Mekanik hasara yanıt olarak apoplastik glutamat konsantrasyon değişiklikleri de ölçüldü. Glutamat izi, yaralandıktan yaklaşık 100 saniye sonra tek bir tepe noktası sergiledi. Bu deney sıcaklık ve nem kontrollü koşullar altında yapılmalıdır, çünkü bu çevre koşullarındaki değişikliklerle yükselmektedir.
Bu protokol, laboratuvar sinyal sisteminin arızalı ve putatif elemanlarının mutantlar kullanarak uzun mesafeli sinyalizasyonun altında kalan moleküler mekanizmalar hakkında içgörüler sağlama potansiyeli sunar.
