We thank Dr. M. Rosenberg for her advice and help with anatomical sectioning. We also thank D. Eisler for his technical assistance. This research was supported by grants from FP7-PEOPLE-IRG-2008, Binational Agriculture research and Development (BARD; IS-4246-09), and Israel Science Foundation (ISF; 592/13).

1.植物成長<ol><li>表面の種子を滅菌します。 <ol><li>湿式または乾式法により（30ミリグラムまで）の種子を滅菌します。例として、乾燥滅菌法のために、少なくとも4時間、一晩まで、閉じたデシケーター中でガラスビーカーに、50ミリリットル漂白剤に1ミリリットルの氷のHCl 37％を追加します。化学フード内で、この手順を実行します。 </li></ol></li><li> 0.5×ムラシゲ＆スクーグ（MS）培地中の0.8％植物寒天を含むプレート上で無菌種子を広げます。パラフィルムまたは多孔質テープでプレートを包み、アルミホイルでカバーしています。 </li><li>均一な発芽を促進するために4日 - 1 4℃でプレートを保管してください。 </li><li> シロイヌナズナの苗を成長させるのに適した成長室にプレートを転送します。寒天培地の上に根の成長を維持し、侵入を防止するために、垂直方向に板を置きます。 </li><li> 7日発芽（DAG）の後固定液するために苗木を転送します。 </li></ol> 2.固定<ol><li> 50ミリリットルリチャードソンSolutioを準備蒸留水で1％のホウ砂（緩衝剤）、1％メチレンブルーおよび1％アズール（組織学的染料）の等容量を組み合わせることにより、n個。使用前に0.22μmのPVDFフィルターユニットを駆動シリンジで濾過。 </li><li> 0.05 Mナトリウムカコジル酸（緩衝剤）中の1.25％グルタルアルデヒド：固定液の50ミリリットルを準備します。 注：これらの物質は毒性があり、化学フード内で処理する必要があります。 </li><li>最終的な固定液を得るために、固定溶液にリチャードソン溶液100μlを（2.1を参照）（2.2を参照）を追加します。 </li><li>マーク対応するサンプル名で6ウェルプレートの各ウェル。 </li><li>苗木、一度転送は、完全に液体で覆われるように、ウェルに（2.3を参照）3ミリリットル、最終的な固定液を - 2を配置します。 </li><li>慎重に各ウェルに10苗まで、鉗子を使用して、転送します。パラフィルムを使用してプレートをシール。 4℃で、暗闇の中で、少なくとも一晩、一週間まで保管してください。 </li></ol> 3.脱水<ol> &lt;LI&gt;苗を脱水します。ここに記載されているように、エタノールの濃度の増加を含む、新たな6ウェルプレートのウェル間にそれらを転送する：10％エタノールを15分間、 15分間、30％エタノール。 15分間、50％エタノール。 15分間70％エタノール。 15分間85％のエタノール。 15分間、95％エタノール。一晩、最低でも4°C、95％エタノール。慎重にプラスチックピンセットで好ましく、その子葉、によってそれらを把握することにより、苗を処理します。 </li></ol> 4.潜入<ol><li>浸透媒体を準備します。小さなガラス瓶で50ミリリットルの基本的な樹脂液キットでhistoresinキット活性化因子の1袋の内容物を混合。 20分間磁石をかき混ぜます。浸透媒体は、数週間、4℃で維持することができます。 </li><li>マーク・各対応するサンプル名で新しい6ウェルプレートのウェルと2でいっぱい - 浸潤培地の3ミリリットル。 </li><li>ピンセットを用いて浸透培地に95％エタノール溶液から苗木を移します。苗は府であることを確認しますLLY媒体によって覆われます。 </li><li>植物組織に最大の浸透を確実にするために、少なくとも4日間、4℃で保管してください。 </li></ol> 5.ブロックの準備<ol><li>金型を埋め込むの各ウェルの中に小さなラベル、サンプル名と鉛筆でマークされたが、置きます。 </li><li> 15 mlの浸潤培地（4.1を参照）1mLの硬化剤を添加することにより培地を埋め込む準備します。重合の問題を回避するために、15ミリリットル未満のボリュームを準備しようとしないでください。 </li><li>メディアを埋め込む200μlで金型内に各ウェルの半分を記入し、金型の形状に切断オーバーヘッドフィルム片で覆いますが、それぞれの側に大きなサイズに1ミリメートル。重合を可能にするために、少なくとも2時間室温でインキュベートします。 5時間を超えないようにしてください。 </li><li>培地を埋め込む追加のバッチを調製し（5.2を参照）、根の先端が金型内に配置されている間、重合を回避するために、氷上に保ちます。 </li><li>メスを用いて解剖スコープの下で各根端をカットし、非常に慎重に位置iトン：垂直方向の横断面または水平方向に縦断面のため、約2時 - 金型外周から3ミリメートル。オーバーヘッドフィルムで解決し、カバーを遮断して型を完全に埋めます。それが重合された後、ブロッキング溶液がわずかに縮小することに注意してください。 </li><li>最低でも、2時間室温で保管してください。 </li><li>ブロックを乾燥させるため、乾燥シリカゲルと箱に入れて、最低でも、室温で一晩おきます。 </li></ol> 6.セクショニング<ol><li>ナイフメーカーでガラス棒からガラスナイフを準備します。組織切片用にガラスナイフを使用してください。正方形にガラス棒をカットした後、ダイヤモンドスコアリングツールを使用して、2つのナイフを生産するために斜めの正方形をカットします。 </li><li>セクショニング機を使用して3ミクロン幅のスライス、 - 2へのセクションをブロックします。スライドガラスの上に置いてスライス、蒸留水の液滴の上に、低熱に設定したヒートブロック上にスライドを配置 - 水が蒸発するまで、（50〜60℃）。 </li></ol><ol><li>元の溶液の0.2％に（2.1を参照してください）​​リチャードソン液を希釈し、スライスをカバーするために、それの1ミリリットルを使用します。 5秒間ヒートブロック上に置き、次いで蒸留水で洗浄します。 </li><li>ホットプレート上でスライドを乾燥させます。解剖顕微鏡下で観察し、顕微鏡下で彼らの後に識別を容易にするために、関心のスライスの位置を示すために、マーカーでスライドの背面をマーク。 </li><li>マウンティング培地100μlを添加して、カバースリップでカバーしています。 </li></ol> 8.画像取得<ol><li>リター情報と偏光子/干渉光学フィルタ（ 図1 AD）を得るのに適しPolscopeシステムを装備した光学顕微鏡下でルートセクションを含む覆われたスライドを配置します。 </li><li>サンプル全体の明確な可視化を可能にする選択倍率（ 例えば 、本研究では40X）と顕微鏡の焦点を合わせますブロック部が、無根元セクションが含まれている空のフィールド上の電子。無傷できれいな地域を探してみてください。背景を設定するには、この領域を使用します。 </li><li>イメージング・システムおよびソフトウェアのパラメータを設定します。設定範囲を17 nmまで。 （8.2を参照）、「自動露出」を適用し、空のフィールドから背景画像を得ます。一つの背景画像は、実験ごとに使用されます。 </li></ol>セルロースミクロフィブリル配向の9 Polscope分析<ol><li>縦断面の分析。 <ol><li>顕微鏡下で長手方向部分を含むスライドを置き、それのリター画像を得ます。関心の根元部に顕微鏡の焦点を合わせます。新しいファイル名を指定します。 </li><li> 「ライブAbrio &quot;窓からabrioの画像（位相差情報と画像）をキャプチャします。 図2Cに示すように、セルの周囲に沿って実行して染色されたセルロースによって識別することができ、細胞壁を含み、セクションをキャプチャするようにしてください。</li></ol></li><li>画像解析。 <ol><li>画像スタック内の関連する画像をダブルクリックします。 「表示設定」タブで「オリエンテーション擬似カラー」を選択します。 </li><li>セルロースミクロフィブリル角度を推定するには、カラーホイールの場合と細胞壁の対応する陰に一致します。 注： 図2Cにおけるカラーホイールは、ミクロフィブリルの長軸に沿った方向を示しているミクロフィブリルに沿って存在する光の遅相軸を反映しています。セルロースミクロフィブリル角度、色、セルの長軸により示される角度です。たとえば、インセットで伸長細胞は、細胞の長軸に対して約90°傾いたシアン色を示します。 </li><li>細胞壁の平均ミクロフィブリル傾角を定量化するために、ソフトウェアのツールバーから「燃性および方位角スタンプ」ツールを使用します。ツール、ポイントを選択し、一方で得られた画像中の関心領域をクリックしてください。 注：このウィル度の角度（方位）（ 図2C）の表示におけるリットル結果。 </li><li>プラグインメニューから代替オープンアクセス偏光画像解析ソフトウェアでは、ランチ「ポル・アナライザ」プラグイン。新しい開いたウィンドウで、「複屈折」タブを開いてを選択し、背景ファイルと画像ファイルを保存します。 </li><li>画像ウィンドウでは、「仕様」を選択します。そして、「ROIのピクセルサイズを「（この研究のために5ピクセルを使用）を調整。 &quot;仕様&quot;でウィンドウを選択し、「結果表内の値を示して」。 </li><li>画像ウィンドウ内の関心領域をマークするために、多角形ツールを使用してください。セルロースミクロフィブリルの配向を得るために、「オリエンテーションライン」を選択します。 注：これは度の角度（方位）の表示になります。 注：2つの方法のいずれかにより算出された平均角度は、その後、スライドに沿って根元部の位置に正規化する必要があります。からのずれを修正するにはスライドに沿って全体の根元部の水平位置、（セクションへと根の成長軸、 図2Cに沿って垂直つまり、）その長軸に沿ってセルに隣接するセル壁の平均ミクロフィブリル傾角を定量化します。根元部が正確スライドに沿って配置されている場合、この角度は180°です。ミクロフィブリル角度を計算するために、180°から隣接するセル壁の平均測定ミクロフィブリル角度を引きます。スライド上に平らに細胞壁の平均測定ミクロフィブリル角度になった違いを追加します。 </li></ol></li></ol>結晶セルロース蓄積の10 Polscope分析<ol><li>横（クロス）セクションを使用してください。彼らのセルロースミクロフィブリルは（9で決定されるように）同様の角度で整列しているときに、結晶セルロース蓄積が細胞のみの間で比較することができることに注意してください。 </li><li>画像スタック内の関連する画像をダブルクリックします。 P」を選択表示設定」タブ」の「seudo色。 </li><li>燃性を測定しました。ズームアップ画像に。 「リージョン」を選択し、関心のあるすべての領域をマークします。すべての値を「クリップボードにコピー」「測定」タブに移動します。 <ol><li> Excelにデータを転送し、（リターダンスの領域を意味する）必要な情報を抽出します。データを正規化します。 注：スライス間の厚さの違いを考慮するために、スライド内の特定の細胞壁のエッジに対する相対値を表します。標準化するために、同じ画像内の異なる細胞壁の平均リターダンスによって目的の細胞壁に対応する平均燃性を分けます。例えば、外側の表皮細胞壁は、私たちの研究では、内側皮質細胞壁に正規化しました。 </li></ol></li><li>サンプルあたり3根を最小限に抑えて、ルートごとに少なくとも3つのセクションのための測定を繰り返します。 </li></ol>

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	<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+the+plant+cell+wall.">Growth of the plant cell wall.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6, 850-861 (2005).</li><li>Wolf, S., Hematy, K., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+control+and+cell+wall+signaling+in+plants.">Growth control and cell wall signaling in plants.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 381-407 (2012).</li><li>Mazeau, K., Heux, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Dynamics+Simulations+of+Bulk+Native+Crystalline+and+Amorphous+Structures+of+Cellulose.">Molecular Dynamics Simulations of Bulk Native Crystalline and Amorphous Structures of Cellulose.</a> J. Phys. Chem. 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The authors have no conflicts of interest.

解剖学的情報を維持しながら、ここでは、 シロイヌナズナの根を構成する異なる組織における結晶セルロースの蓄積を決意するための方法を提示します。このように、それは、細胞の解像度で、植物の成長過程を理解することに向けた追加のステップを提供します。この方法はまた、付加的な植物種および器官の研究に適用することができます。 この方法を適用?...

植物細胞壁は動的な構造です。増殖している細胞は、一次細胞壁、細胞を拡大することを可能にする組織で囲まれています。堆積物を植物の機械的支持を強化し、より剛性の二次壁を成長させることやめる細胞。両方の細胞壁は、異なる発達段階や組織1,2間で異なる別の構造（例えば 、ヘミセルロースおよびペクチン）の多糖類のマトリックス中に埋め込 ​​まれたセルロースミクロフィブリルで構成されています。セルロースはしっかり結晶構造のミクロフィブリルを形成するように整列されている（1,4）-β-D-グルカンの鎖として合成されます。アモルファスセルロースはグルカン鎖が少ない順序付けられている領域を意味します。結晶と非晶質領域との間の比が3それぞれ、機械的強度及び粘弾性特性を提供することにより、細胞壁の機械的特性に影響を与えると考えられて一つのパラメータです。いくつかの方法がありましたX線回折及び交差分極/固体NMR 4を回転マジック角を検出し、それらのうち、セルロース配置の二つの形態を定量化するために開発されました。 X線回折は、試料5中の非晶質セルロースドメインに対する結晶の割合を決定するために用いることができます。別の方法は、それぞれ、結晶質および非晶質セルロースまたは他のポリマーとの間で区別するために、酸不溶および酸可溶性物質に細胞壁コンテンツの分画を使用しています。このアプローチでは、標識グルコース（[14 C]グルコース）の組み込みは、セルロース6,7を定量化するために使用されます。これらの方法は、せいぜい、全臓器分析のための植物材料を大量に必要とし、従って、細胞壁構造における組織特異的な変化に対して不十分敏感です。セルラー解像度でセルロースミクロフィブリルの可視化の変化を同定することができる蛍光色素8,9、と組み合わせるライブイメージング研究で達成することができますセルロースミクロフィブリルの向き。これらの色素を定量化するために使用されていないが、それらは結晶セルロースに特異的ではなく、細胞壁8の正常な構造を妨害し得ます。 Polscopeは、光ビームを分割し、光10の一部を遅延させる結晶セルロースの能力に依存イメージング技術です。光の位相差は、光の伝播方向に垂直に横たわるミクロフィブリルのために最強です。同様の配向のミクロフィブリルのために、光のリターダンス11より大きい、結晶化度が高いです。したがって、polscope、セルロースミクロフィブリルの相対的なレベルと方向の両方を研究するために使用されます。 彼らは急速に12を展開する前に、根は、細胞分裂のシリーズを受け、根の先端に、細胞は、幹細胞ニッチに由来その間線形成長を示します。ルートを含む細胞は、単方向（異方性）に拡大します方法、セル壁13の特性に影響を与える小分子シグナル伝達ホルモンによって指示されます。ホルモンに対する微分応答は、時間と空間に、バランスのとれた臓器成長14を確保する手段を提供します。したがって、細胞壁構造の高分解能の分析は、より良い全体の臓器の成長に細胞型特異的応答との間の接続を理解するために必要な重要な情報を提供することができます。ここで、我々は高品質の解剖学のセクションで観察されるように、 シロイヌナズナの根に結晶セルロースの組織特異的な蓄積を研究するpolscopeの実装を報告しています。この方法は、最近、ホルモン活性15の空間的な摂動に応答して、結晶セルロースの細胞型特異的蓄積を明らかにしました。

<table><tbody><tr><td>Murashige &amp;amp; Skoog (MS)</td><td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>Borax</td><td>LOBA CHEMIE&amp;nbsp;</td><td>6038</td><td></td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Sigma</td><td>M-9140</td><td></td></tr><tr><td>Azure</td><td>Sigma</td><td>861065</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Driven 0.22 mm PVDF Filter&amp;nbsp;</td><td>MILLEX-GV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>EMS</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Cacodylate</td><td>Sigma</td><td>C-0250</td><td></td></tr><tr><td>Leica kit historesin&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>7022 18 500</td><td></td></tr><tr><td>embedding molds</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3530</td><td></td></tr><tr><td>film 100 &amp;micro; P.P.C.&amp;nbsp;</td><td>www.Jolybar.com</td><td></td><td>overhead film</td></tr><tr><td>Knivemaker</td><td>LKB</td><td>7800</td><td></td></tr><tr><td>Ultratome III</td><td>LKB</td><td>8800</td><td>Ultratome</td></tr><tr><td>Shandon immumount&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td>9990402</td><td>mounting medium</td></tr><tr><td>light microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>Abrio imaging system</td><td>CRI</td><td>Abrio imaging system</td><td></td></tr><tr><td>Abrio V2.2 software</td><td>CRI</td><td>Abrio V2.2 software</td><td></td></tr><tr><td>Open access polarized light image analysis software &amp;nbsp;</td><td>OPS</td><td>OpenPolScope</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.openpolscope.org/&quot;&gt;http://www.openpolscope.org/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

high resolution quantification of crystalline cellulose accumulation in arabidopsis roots to monitor tissue-specific cell wall modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

私たちは、モデルの臓器15-17としてシロイヌナズナの根を使用して、ブラシノステロイド（のBR）への細胞型特異的応答の影響を研究しています。 BR受容体BRI1を対象としているときに、BRI1変異体のバックグラウンドで、非有毛細胞（ 図2A、B）と呼ばれる表皮細胞のサブセットには、隣接セルの一方向性の細胞増殖を阻害し、そして?...

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High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

結晶セルロース蓄積中の高解像度の定量化<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;ルーツは、組織特異的な細胞壁の変更を監視します

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

high-resolution-quantification-crystalline-cellulose-accumulation

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

8.1K ビュー.  Technion-Israel Institute of Technology. Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

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Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls are composed of cellulose and non-cellulosic polysaccharides together with proteins, phenolic compounds and water. 90% of the cell wall is composed of&#160;polysaccharides (e.g., pectins) and arabinogalactan proteins (AGPs). The fluorescent immunolocalization of specific glycan epitopes in plant histological sections remains a key tool to uncover remodeling of wall polysaccharide networks, structure and components.
Here, we report an optimized fluorescent immunolocalization procedure to detect glycan epitopes from AGPs and pectins in plant tissues. Paraformaldehyde/glutaraldehyde fixation was used along with LR-White embedding of the plant samples, allowing for a better preservation of the tissue structure and composition. Thin sections of the embedded samples obtained with an ultra-microtome were used for immunolocalization with specific antibodies. This technique offers great resolution, high specificity, and the chance to detect multiple glycan epitopes in the same sample. This technique allows subcellular localization of glycans and detects their level of accumulation in the cell wall. It also permits the determination of spatio-temporal patterns of AGP and pectin distribution during developmental processes. The use of this tool may ultimately guide research directions and link glycans to specific functions in plants. Furthermore, the information obtained can complement biochemical and gene expression studies.

This protocol describes in detail how the plant material for immunolocalization of Arabinogalactan proteins and pectins is fixed, embedded in a hydrophilic acrylic resin, sectioned and mounted on glass slides. We show cell wall related epitopes will be detected with specific antibodies.

植物組織の細胞壁におけるアラビノガラクタンタンパク質およびペクチンの蛍光免疫局在化

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

発生生物学

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find cost-effective and sustainable solutions has become a topical and critical task. Lignocellulosic biomass is poised to become the primary source of biomass for the conversion to liquid biofuels1-6. However, the recalcitrance of these plant cell wall materials to cost-effective and efficient degradation presents a major impediment for their use in the production of biofuels and chemicals4. In particular, lignin, a complex and irregular poly-phenylpropanoid heteropolymer, becomes problematic to the postharvest deconstruction of lignocellulosic biomass. For example in biomass conversion for biofuels, it inhibits saccharification in processes aimed at producing simple sugars for fermentation7. The effective use of plant biomass for industrial purposes is in fact largely dependent on the extent to which the plant cell wall is lignified. The removal of lignin is a costly and limiting factor8 and lignin has therefore become a key plant breeding and genetic engineering target in order to improve cell wall conversion.
Analytical tools that permit the accurate rapid characterization of lignification of plant cell walls become increasingly important for evaluating a large number of breeding populations. Extractive procedures for the isolation of native components such as lignin are inevitably destructive, bringing about significant chemical and structural modifications9-11. Analytical chemical in situ methods are thus invaluable tools for the compositional and structural characterization of lignocellulosic materials. Raman microscopy is a technique that relies on inelastic or Raman scattering of monochromatic light, like that from a laser, where the shift in energy of the laser photons is related to molecular vibrations and presents an intrinsic label-free molecular "fingerprint" of the sample. Raman microscopy can afford non-destructive and comparatively inexpensive measurements with minimal sample preparation, giving insights into chemical composition and molecular structure in a close to native state. Chemical imaging by confocal Raman microscopy has been previously used for the visualization of the spatial distribution of cellulose and lignin in wood cell walls12-14. Based on these earlier results, we have recently adopted this method to compare lignification in wild type and lignin-deficient transgenic Populus trichocarpa (black cottonwood) stem wood15. Analyzing the lignin Raman bands16,17 in the spectral region between 1,600 and 1,700 cm-1, lignin signal intensity and localization were mapped in situ. Our approach visualized differences in lignin content, localization, and chemical composition. Most recently, we demonstrated Raman imaging of cell wall polymers in Arabidopsis thaliana with lateral resolution that is sub-&mu;m18. Here, this method is presented affording visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species without staining or labeling of the tissues.

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

A method based on confocal Raman microscopy is presented that affords label-free visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species.

ラベルフリーその場で</em植物細胞壁の木化の>イメージング

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find ...

生物学

Atomic Force Microscopy to Study the Physical Properties of Epidermal Cells of Live Arabidopsis Roots

A method is described here to characterize the physical properties of the cell wall of epidermal cells of living Arabidopsis roots through nanoindentations with an atomic force microscope (AFM) coupled with an optical inverted fluorescence microscope. The method consists of applying controlled forces to the sample while measuring its deformation, allowing quantifying parameters such as the apparent Young's modulus of cell walls at subcellular resolutions. It requires a careful mechanical immobilization of the sample and correct selection of indenters and indentation depths. Although it can be used only in external tissues, this method allows characterizing mechanical changes in plant cell walls during development and enables the correlation of these microscopic changes with the growth of an entire organ.

Atomic Force Microscopy to Study the Physical Properties of Epidermal Cells of Live Arabidopsis Roots

The atomic force microscopy indentation protocol offers the possibility to dissect the role of the physical properties of the cell wall of a particular cell of a tissue or organ during normal or constrained growth (i.e., under water deficit).

生きた シロイヌナ ズナ根の表皮細胞の物性を調べる原子間力顕微鏡

A method is described here to characterize the physical properties of the cell wall of epidermal cells of living Arabidopsis roots through ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

の長期、高分解能共焦点タイムラプスイメージング<em&gt;シロイヌナズナ子葉</em発芽過程&gt;表皮

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories can face is the development and attainment of these methods. Observation of phenotypes in a process of interest is a typical objective of research labs studying gene function and this is often achieved through image capture. A particular process that is amenable to observation using imaging approaches is the corrective growth of a seedling root that has been displaced from alignment with the gravity vector. Imaging platforms used to measure the root gravitropic response can be expensive, relatively low in throughput, and/or labor intensive. These issues have been addressed by developing a high-throughput image capture method using inexpensive, yet high-resolution, flatbed scanners. Using this method, images can be captured every few minutes at 4,800 dpi. The current setup enables collection of 216 individual responses per day. The image data collected is of ample quality for image analysis applications.

This protocol describes a process for rapid collection of images of Arabidopsis seedlings responding to a gravity stimulus using commercially-available flatbed scanners. The method allows for inexpensive, high-volume capture of high-resolution images amenable for downstream analysis algorithms.

シロイヌナズナ根重力屈性反応の高分解能時間経過画像を収集するためにフラットベッドスキャナを使用して

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) micro/nano-indentations, for a JPK&#160;AFM. Specifically, in this protocol we measure the apparent Young&#8217;s modulus of cell walls at subcellular resolutions across regions of up to 100 &#181;m&#160;x 100 &#181;m in floral meristems, hypocotyls, and roots. This requires careful preparation of the sample, the correct selection of micro-indenters and indentation depths. To account for cell wall properties only, measurements are performed in highly concentrated solutions of mannitol in order to plasmolyze the cells and thus remove the contribution of cell turgor pressure.
In contrast to other extant techniques, by using different indenters and indentation depths, this method allows simultaneous multiscale measurements, i.e. at subcellular resolutions and across hundreds of cells comprising a tissue. This means that it is now possible&#160;to spatially-temporally characterize the changes that take place in the mechanical properties of cell walls during development, enabling these changes to be correlated with growth and differentiation. This represents a key step to understand how coordinated microscopic cellular changes bring about macroscopic morphogenetic events.
However, several limitations remain: the method can only be used on fairly small samples (around 100 &#181;m in diameter) and only on external tissues; the method is sensitive to tissue topography; it measures only certain aspects of the tissue&#8217;s complex mechanical properties. The technique is being developed rapidly and it is likely that most of these limitations will be resolved in the near future.

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

細胞壁の弾性特性のAFMベースのマッピング：ティッシュ、携帯電話、および細胞内の解像度で

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

の組織化学的染色<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;二次細胞壁の要素

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

ホールマウント胚珠内でのクロマチン修飾や核構造の定量的、単一細胞分析のための効率的な方法<em&gt;シロイヌナズナ</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. Upon wounding of a leaf, an increase in cytosolic calcium ion concentration (Ca2+ signal) occurs at the wound site. This signal is rapidly transmitted to undamaged leaves, where defense responses are activated. Our recent research revealed that glutamate leaking from the wounded cells of the leaf into the apoplast around them serves as a wound signal. This glutamate activates glutamate receptor-like Ca2+ permeable channels, which then leads to long-distance Ca2+ signal propagation throughout the plant. The spatial and temporal characteristics of these events can be captured with real-time imaging of living plants expressing genetically encoded fluorescent biosensors. Here we introduce a plant-wide, real-time imaging method to monitor the dynamics of both the Ca2+ signals and changes in apoplastic glutamate that occur in response to wounding. This approach uses a wide-field fluorescence microscope and transgenic Arabidopsis plants expressing Green Fluorescent Protein (GFP)-based Ca2+ and glutamate biosensors. In addition, we present methodology to easily elicit wound-induced, glutamate-triggered rapid and long-distance Ca2+ signal propagation. This protocol can also be applied to studies on other plant stresses to help investigate how plant systemic signaling might be involved in their signaling and response networks.

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Extracellular glutamate-triggered systemic calcium signaling is critical for the induction of plant defense responses to mechanical wounding and herbivore attack in plants. This article describes a method to visualize the spatial and temporal dynamics of both these factors using Arabidopsis thaliana plants expressing calcium- and glutamate-sensitive fluorescent biosensors.

シロイヌナズナにおける局所および全身創傷信号の広視野、リアルタイムイメージング

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. ...

シロイヌナズナ実生のクロロフィル生合成の高分解能イメージング

Non-invasive Assay for Chlorophyll Biosynthesis Kinetics Determination during Early Stages of Arabidopsis De-etiolation

Chlorophyll biosynthesis is a hallmark of de-etiolation, one of the most dramatic stages in the plant life cycle. The tightly controlled and highly dynamic process of chlorophyll biosynthesis is triggered during the shift from the dark to the light in flowering plants. At the moment when etiolated seedlings are exposed to the first traces of sunlight, rapid (in order of seconds) conversion of protochlorophyllide into chlorophyllide is mediated by unique light-accepting protein complexes, leading via subsequent metabolic steps to the production of fully functional chlorophyll. Standard techniques for chlorophyll content analysis include pigment extraction from detached plant tissues, which does not apply to studying such fast processes. To investigate chlorophyll kinetics in vivo with high accuracy and spatiotemporal resolution in the first hours after light-induced de-etiolation, an instrument and protocol were developed. Here, we present a detailed procedure designed for statistically robust quantification of chlorophyll in the early stages of Arabidopsis de-etiolation.

著者スポットライト:脱エチオレーション中のクロロフィル合成の非侵襲的高分解能測定

Here, we describe an advanced tool designed for chlorophyll biosynthesis monitoring during the early stages of Arabidopsis seedling de-etiolation. The novel methodology provides non-invasive real-time chlorophyll fluorescence imaging at high spatial and temporal resolution.

シロイヌナズナ脱etiolationの初期段階におけるクロロフィル生合成速度測定のための非侵襲的アッセイ

Chlorophyll biosynthesis is a hallmark of de-etiolation, one of the most dramatic stages in the plant life cycle. The tightly controlled and highly ...

結晶セルロース蓄積中の高解像度の定量化

要約

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植物組織の細胞壁におけるアラビノガラクタンタンパク質およびペクチンの蛍光免疫局在化

ラベルフリーその場でイメージング

生きたシロイヌナズナ根の表皮細胞の物性を調べる原子間力顕微鏡

の長期、高分解能共焦点タイムラプスイメージング

シロイヌナズナ根重力屈性反応の高分解能時間経過画像を収集するためにフラットベッドスキャナを使用して

細胞壁の弾性特性のAFMベースのマッピング：ティッシュ、携帯電話、および細胞内の解像度で

の組織化学的染色

ホールマウント胚珠内でのクロマチン修飾や核構造の定量的、単一細胞分析のための効率的な方法

シロイヌナズナにおける局所および全身創傷信号の広視野、リアルタイムイメージング

シロイヌナズナ脱etiolationの初期段階におけるクロロフィル生合成速度測定のための非侵襲的アッセイ

結晶セルロース蓄積中の高解像度の定量化

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植物組織の細胞壁におけるアラビノガラクタンタンパク質およびペクチンの蛍光免疫局在化

ラベルフリーその場でイメージング

生きた シロイヌナ ズナ根の表皮細胞の物性を調べる原子間力顕微鏡

の長期、高分解能共焦点タイムラプスイメージング

シロイヌナズナ根重力屈性反応の高分解能時間経過画像を収集するためにフラットベッドスキャナを使用して

細胞壁の弾性特性のAFMベースのマッピング：ティッシュ、携帯電話、および細胞内の解像度で

の組織化学的染色

ホールマウント胚珠内でのクロマチン修飾や核構造の定量的、単一細胞分析のための効率的な方法

シロイヌナズナにおける局所および全身創傷信号の広視野、リアルタイムイメージング

シロイヌナズナ脱etiolationの初期段階におけるクロロフィル生合成速度測定のための非侵襲的アッセイ

生きたシロイヌナズナ根の表皮細胞の物性を調べる原子間力顕微鏡