We are indebted to E. Karplus, from Sciences Wares, USA, for his precious and useful help and advices. We thank E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier, and J. Stinnakre for their contribution to the development and improvement of this technique. We also thank B. Pfeiffer and G. Rubin, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, USA, for the pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP line. This work was supported by the Chateaubriand Fellowship, French Embassy, Washington, USA to A. Lark, by the National Science Foundation (IOS 1352882) to T. Kitamoto, and by the French ANRs (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, and FlyBrainImaging, 2011), the Conseil R&#233;gional Ile-De France (NeRF and DIM), the IFR-144, the Physique-Chimie-Biologie Interface Program of the CNRS (2009), and by the CNRS, France to JR Martin.

Numunelerin hazırlanması 1. <ol><li> Çözeltilerinin hazırlanması ve kurmak <ol><li> Standart Gıda ortamında 24 ° C&#39;de tüm Drosophila melanogaster hatlarını korumak. Arka ve şişede düşük yoğunluklu onları tutmak standart boyut ve sinekler ağırlığını oluşturmak için. <ol><li> Bir şişede 10 erkek ile 10 kadın bakire ekleyin, onları dostum izin ve taze bir şişeye 2 günde aktarabilirsiniz. Sinekler Eclose başladığında Sonra 10 gün sonra, her gün sinekleri hasat. Sineklerin yaşı kesin kaydını tutun ve iyi durumda tutmak. </li><li> 3. günde, kadınlarda gelen erkek ve dişiler ayrı flakon başına 20 sinekler tutmak. 4 ya da 5 gün eski at sinekleri kaydedin. </li></ol></li><li> Aşağıdaki konsantrasyonları ile Ringer çözeltisi hazırlayın: 130 mM NaCI, 5 mM KCI, 2 mM MgCI2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES ve 36 mM sukroz ve hassas 7.3 çözeltinin pH&#39;ının ayarlanması. 25 mikron perfüzyon çözümleri hazırlayın; Ringer çözeltisi içinde M nikotin ve 100 mM KCI. </li><li> Bir eğim ile (ucunun ucundan yaklaşık 35 °) bir jilet şekli ucunu kullanarak ve bahşiş 1 ½ santimetre ötesinde fazla baz kaldırın: 1000 ul pipet hazırlayın. </li><li> İnkübasyon süresince numune saklama için kutu (23 cm x 17 cm x 8,5 cm) hazırlayın. Bunların hazırlanması tamamlandıktan olarak örnekleri yerleştirmek için küçük bir raf aparatı altında [örnek kuruma önlemek için] alt suyla doymuş iki sünger (12 cm x 8 cm x 3 cm) yerleştirin. </li><li> GFP-aequorin sentezlenmesini tahrik etmek için bir GAL4 hattının UAS-GFP-aequorin en az 1 kopyasını ve bir kopyasını ihtiva eden ve böylece sinek örnekleri hazırlayın. OK107 Gal4 hattı (öncelikle mantar organları bir çizgi sürüş ifadesi) Bu hazırlık UAS-GFP-aequorin ile çarpı işareti vardır. Not: kutusunun içinde su geçirmez olmalıdır ve dış inkübasyon sırasında koelenterazin bozulmasını önlemek için kutuyu girmesini ışık engellemelidir. </li></ol></li><li> HazırlıkNumunelerin preparasyonu <ol><li> Buz bir cam şişeye aktararak Drosophila uyutmak ve pipet konumlandırma için soğutulmuş Petri kabı taşındı önce 2 dakika süreyle buz üzerinde tutmak. Diseksiyon mikroskobu altında buz üzerinde 100 mi Petri kabındaki hafif nemli filtre kağıdı üzerinde pipet uçları hazırlayın. </li><li> Yavaşça forseps yer pipet içine sinek. </li><li> Hafifçe bastırın ve baş ucu kenarı geçmiş tamamen ve dorsal bölge kısmen uç şekillendirme (Şekil 2B) sırasında çıkarılan bölüm maruz şekilde sinek hizalamak bir fırça kullanma. </li><li> Diş tutkal iki bileşenin, küçük (yaklaşık 3-4 | il) kısımları birleştirin. Pipetlemeyin ucu kenarına ve çevresinde geri aşağı baş ve boyun ön etrafında dikkatli tutkal sürün ve - baş tacı kaçınarak. 2 dakika süreyle tutkal kurumasını bekleyin. </li><li> Kayıt odasının (Şekil 2D) ve gen delikten yapıştırılmış sinek ile yerleştirin pipettly yerine sabitlemek için düğmesine basın. </li><li> Silikon yapıştırıcı (yaklaşık 3-4 ul) iki bileşeni birleştirin. Bölme ve pipet ucu buluştuğu Ringer solüsyonu sızıntısı önlemek için kenarı boyunca odasının düz tarafında tutkal sürün. 2 dakika süreyle tutkal kurumasını bekleyin. </li></ol></li><li> Teşrih <ol><li> Perfüzyon kanalı, kısa kenarı boyunca bandı yapıştırın ve odasının arkasına kadar uzanan. </li><li> Floresan lamba mikroskop altında sırayla diseksiyonu blokta sinek odasına yerleştirin. Odasına Ringer çözeltisi pipetleyin 1 mi. </li><li> Manikür kaldırmak için ince bir cerrahi bıçak kullanın. Antennal bölgeye başın arka paralel kesiler olun. Sonra sonra önceki kesiler bağlayan anten üzerinde dik bir kesi yapmak gözün kenarında kesti. Başın arka kısmında olduğu için son bir kesi paralel yapın. Manikür (Şekil 2C) kaldırmak için ince sivri forseps kullanın. </li><li> Yavaşça bir kavramak ince keskin forseps kullanınBeyin ve [floresanlama] mantar vücut açıkça görülünceye kadar uzak solunum doku maruz temizleyebildiğini d. </li><li> Dikkatle kavramak ve koelenterazin nüfuz sağlamak için beyini çevreleyen nöroepitelyal doku çimdik ultra keskin forseps kullanın. Not: Alternatif olarak papain neuroepithelia 9 geçirgenliği için kullanılabilir. </li><li> Bir pipet kullanarak, karanlık kutu içinde diseksiyon ve yer örneğinden herhangi enkaz kaldırmak için Ringer solüsyonu ile iki kez yıkayın. </li><li> Odasına 5 uM benzil-koelenterazin içeren Ringer çözeltisi pipetleyin 1 mi. 2 saatlik bir en az oda sıcaklığında koelenterazin inkübasyon kutusunu kapatmak ve izin verir. </li></ol></li></ol> 2. Görüntüleme <ol><li> Kurmak <ol><li> Kayıt sistemini başlatın: 25 ° C mikroskop, bilgisayar, kamera ve drenaj sistemi ve set odaya çevre denetimleri açın. </li><li> Açık Ölçme ve bilgisayardaki Otomasyon Explorer programı. Tıkla &amp;#8220; Aygıtlar ve Arayüzler NI Hareket Cihazlar &quot;, ardından çift tıklayın&quot; &quot;ve nihayet sağ tıklayıp&quot; PCI-7334 &quot;ve&quot; aygıt başlatılamadı &quot;. </li><li> Foton Imager açın. Yeni bir klasör ve adını ilk kayıt dosyası oluşturun. Sistem çalışabilmesi Kamera -80 ° C ulaşmalıdır. </li><li> Set up perfüzyon sistemi - rezervuar için KCl, nikotin ve Ringer çözeltisi ekleyip 2 ml / dak yani her çözüm deşarjları ayarlayın. Deney başlamadan önce Ringer solüsyonu ile yıkayın. </li></ol></li><li> Örnek hazırlayın <ol><li> Yer görüntüleme 5X büyütmede mikroskop altında montaj blok çanak montajı ve delinme yoluyla kanala perfüzyon tüpü yerleştirin. </li><li> Floresan moduna ayarlı mikroskop sonra merkezi ve odak noktası haline mantar organları (MB) getir. 20X ve yeniden merkezi ve odak ayarlayın. </li><li> Ucu böylece drenaj havuz üzerinde Pozisyon drenaj cihazı, sadece Abov drenaj şant yüksekliğini ayarlamake havuzu ve yeterli drenajı sağlamak için 30 sn Ringer çözeltisi çalıştırın. </li><li> Işıktan aparatı kapatmak için kalkan aşağı çekin. Foton kamera otomatik odaklama sistemi kullanılarak ince ayarlamalar yapmak ve MBs bir referans floresan görüntü almak. </li></ol></li><li> Kayıt <ol><li> İstenen kayıt hızı (50 milisaniye kadar 1 sn veya daha fazla) için foton hızını ayarlayın. Seçin foton modu ve açık deklanşör. Günlük girişlerini rekor genotip, cinsiyet, yaş ve örneklem sayısı. YG kutuları tıklayarak ve kontrol tutarken sürükleyerek pozisyon ROI çanak ve hücre gövdeleri (CCB) üzerinden kutuları ve medial loblar ayarlayın. </li><li> (Arzu edildiği kadar) yaklaşık 5 ila 10 dakika boyunca kayıt taban. </li><li> 1 dakika süre ile nikotin uygulanır. Günlüğünde start / stop edin. 5 dakika boyunca Ringer solüsyonu ile yıkanır. </li><li> Kurtarma için 5 dakika bekleyin ve KCl günlük girişini ve zamanlayıcı hazırlar. </li><li> 1 dakika için KCl uygulayın. Günlüğünde start / stop edin. 1 dakika boyunca Ringer solüsyonu ile yıkanır. </li><li> Şalterfloresan moda, son floresan görüntü almak ve Ringer çözeltisi kapatın. </li><li> Basın &quot;Dur&quot;. İletişim kutusu sistemi kapatmak isteyecektir. &quot;Hayır&quot; kayda devam etmek seçin. </li><li> Açık kalkan, hareket drenaj sistemi, 5X geçiş lens objektif, perfüzyon tüpü çıkarın. , Sahneden örnek / kayıt çanak çıkarın durulama ve su ile iki kez merceği silerek 20X lensi temizlemek. </li><li> Bir sonraki kayıt başlatmak için program penceresinin üst kısmında beyaz play butonuna basın. </li></ol></li></ol> 3. Analiz ve Video Oluşturma <ol><li> Foton değerleri ayıklamak <ol><li> Foton analizi programını açın (örneğin, Foton Görüntüleyici) ve açık ilk örnek tablo dosya. </li><li> Ekran kontrol sekmesini seçin. Kontrol tutarken bölgeye tıklayarak ROI seçin. GFP ışıklı CCB ve medial lobları kapsayacak şekilde ilgi bölgelerin büyüklüğü, yönünü ve şeklini ayarlayın. </li><li> Bir ek eklemeve tıklayarak &quot;yatırım getirisi Define&quot; linkine tıklayarak ve yeni yatırım getirisi oluşturmak için ekrandaki sürükleyerek al ROI. </li><li> Foton videoyu oynatmak için &quot;Film&quot; sekmesini seçin. Istediğiniz gibi &quot;sn genişliği&quot; ve &quot;sn adımları&quot; ayarlayın. YG yerleştirme gerektikçe yeniden ayarlayın. </li><li> GFP floresan, nikotin tepki ve KCl tepki temsili ekran görüntüleri seçin. Daha sonra analiz ve karşılaştırma için bir sunum slayt içine Mahsul ekran ve yapıştırma görüntü. </li><li> &quot;Sn genişliği&quot; ve saniyeler içinde kayıt hızı &quot;sn adım&quot; hem de ayarlayın. Uyarıcı başlamadan önce ve hemen tepki bittikten sonra dirsek bölgeye üst paneldeki gri işaretçileri hareket ettirerek analiz uzunluğunu seçin. </li><li> &quot;&gt; OYUN&quot; basın &quot;&lt;&lt; REW&quot; basın &quot;oynarken görüşlerini Askıya&quot; i seçin. &quot;Puan tablosu Count&quot; ve istenen ve çizgi renkleri ROI rengine uyacak şekilde ayarlayın birimleri sekmesini seçin. </li><li> Analiz bittiğindeBasın &quot;İhracat Oranı Verileri Kont&quot;. Kombine kayıtlar CCB ve her taraftan ilgi medial lob bölgenin seçin ekran görüntüleri. Cevap görüntüleri ile slayt halinde Mahsul ekran ve yapıştırma görüntü. Bu kaydırma, daha sonra son tahlilde kullanılır. </li></ol></li><li> Örnek Analizi: detaylı ekstre foton verilerin analizinde bir yöntemdir <ol><li> &quot;Puan Exports Count&quot; klasöründeki elektronik tablo dosyalarını açın. </li><li> Hücreleri saat ve dakika zaman görüntülemek için ilk sütun etiketli zaman biçimlendirin. </li><li> Numune için ilgili slayt Referans. Zaman ve iki temsilci ROI için sütunları hariç tüm değerleri kaldırın. </li><li> Nikotin stimülasyon başlangıç ​​zamanını belirleme - ana günlük girdisi dosyasında mevcuttur başlatmak veya vurgulamak değeri öncesinde ek verileri kaldırmak klasör-. </li><li> CCB ve medial lob ve işareti / vurgulamak hem de yüksek / tepe değerini bulun. </li><li> Hem tepki başlangıç ​​ve bitiş zamanını belirlemekGeçen süre noktasını kullanarak bir tahmin oluşturarak CCB ve medial lob slayt yanıtı grafikle ve bu noktalara yakınlık değerleri değişiklikten gerçek değer seçmek değinilecektir. CCB ve medial lob hem de bu noktalar arasındaki bölgeyi vurgulayın. Alternatif olarak, 9 makro kullanın. </li><li> Yeni tablo üzerinde bir deney grubundan tüm örnekleri birleştirin. </li><li> Sıra değerini belirleyerek tepe üzerinde hizalayın her CCB tepe değerine içindir. Bu örnek verileri recopied gereken yaklaşık satır değerini belirlemek için en yüksek satır değeri düşük değerler çıkarma. Tüm tepe değerleri hizalanmış olduğundan emin olun. </li><li> Bilanço kez kopyalayın ve medial lob sütunları veya tek CCB veya medial lob değerleri sayfaları oluşturma CCB sütunları ya silin. </li><li> Tüm CCB yanıtları bittikten sonra verileri kaldırın. Dört satır Toplam fotonlar, Tepki Süresi (süre), Tepe Genlik ve Tepki Gecikme etiketli oluşturun. Kopyala ve orijinal altında yine bu yapıştırın. </li><li>Yanıt sırasında toplam fotonları belirlemek için TOPLA işlevini kullanın. Yanıtın uzunluğunu belirlemek için COUNT işlevini kullanın. Kopyala ve tepe genlik değerini belirlemek için en yüksek değer hücresini bağlamak. COUNT işlevini kullanın - cevap başlangıcına nikotin perfüzyon başından itibaren seçin - Tepki Gecikme belirlemek için. </li><li> Saniye hızını kaydederek (bütün tepe genliği hariç) çarpın bağlantı işlevini kullanarak ve kopyalama değerleri. </li><li> Yani (örn .: Şekil 5B, C, D) istenirse Bar / kutu grafikleri gibi toplam Fotonlar, Tepe Genlik ve Tepki Süresi olarak hesaplanan parametreler için oluşturulabilir. </li><li> Ham veri foton cevaptan sonra sütununda, ortalama fonksiyonunu kullanarak her zaman noktası için ham veri noktaları ortalama. Ortalama (SEM) standart hatasını belirlemek kolon istenen takip bir zaman noktasında ortalama foton değerleri için ise. </li><li> Ortalama bir tepki profile oluşturmak için ortalama sütunu kullanınCCB örneklem grubu için e [Grafik]. Bu x-ekseni değerleri olarak saatini belirterek sütun ve y-ekseni olarak ortalama foton değerleri sütunu seçin ve son olarak saçılım grafiği oluşturma aracını seçin yapmak için. </li><li> Medial lob verilerle bu analiz işlemi tekrarlayın. </li></ol></li><li> Video için Görüntüleri oluşturma <ol><li> Açık foton görüntüleyici. </li><li> Seç ekran kontrol sekmesi. Seçmek kaldırmak ve / veya en aza indirmek için kontrol tutarken ROI tıklayın. </li><li> &quot;Sn genişliği&quot; her çerçevenin içeriğini belirlemek için arzu edildiği gibi (birikim süresi) değiştirin. </li><li> Her çerçevenin üst üste tanımlamak için &quot;sn adım&quot; değiştirin. </li><li> Basın &quot;&lt;&lt; REW&quot; ardından &quot;oynarken ihracat görüşlerini&quot; &quot;OYUN&gt;&quot; seçeneğini seçin. Video için görüntüleri .png dosyaları bir dizi olarak &quot;görünümü ihracatı&quot; klasörüne ihraç edilecek. </li></ol></li><li> Video c için bir yöntem: Sanal Dub kullanarak video yapmakDetaylı reaksiyonundan <ol><li> Görüntüleri içeren görünüm ihracat klasöründeki &quot;Resultats&quot; adlı yeni bir klasör oluşturun. </li><li> Görüntülerin klasörünün içine komut (renommer.VBS) getirin. </li><li> Renommer.VBS çift tıklayın çalıştırmak için. </li><li> Görüntüler otomatik olarak sayısal olarak yeniden adlandırıldı ve &quot;Resultats&quot; klasörüne kopyalanacaktır. </li><li> Açık VirtualDub.exe. </li><li> Açık bir video dosyasını seçin - (sonraki görüntüler otomatik olarak yükleyecektir) ilk resmi seçin. </li><li> Seç videosu - istediğiniz gibi belirleyin kare hızı ayarlayın. </li><li> Video seçin - Seçilen sıkıştırma yarıçapı Cinepak Codec seçin. </li><li> Dosyasında video otomatik olarak oluşturulur AVI olarak kaydet seçeneğini seçin. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Martin, J. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+brain+imaging:+fluorescence+or+bioluminescence,+which+to+choose.">In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose.</a> J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).</li><li>Shimomura, O., Johnson, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxidized+coelenterazine,+the+active+group+in+the+photoprotein+aequorin.">Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 75 (6), 2611-2615 (1978).</li><li>Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+data+on+the+bioluminescent+protein,+aequorin.">Further data on the bioluminescent protein, aequorin.</a> J. Cell. Comp. Physiol. 62 (1), 1-8 (1963).</li><li>Baubet, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+green+fluorescent+protein-aequorin+as+bioluminescent+Ca2++reporters+at+the+single-cell+level.">Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97 (13), 7260-7265 (2000).</li><li>Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S. A., Dow, J. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biogenic+amine+and+a+neuropeptide+act+identically:+tyramine+signals+through+calcium+in+Drosophila+tubule+stellate+cells.">A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells.</a> Proc. Biol. Sci. 280 (1757), 20122943 (2013).</li><li>Leclerc, C., Webb, S. E., Daguzan, C., Moreau, M., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+patterns+of+calcium+transients+during+neural+induction+in+Xenopus+laevis+embryos.">Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos.</a> J. Cell Sci. 113 (19), 3519-3529 (2000).</li><li>Martin, J. -. R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Br&#251;let, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+of+Ca2++signalling+in+the+brain+of+Drosophila.">In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila.</a> PLoS One. 2 (3), e275 (2007).</li><li>Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Ca2++stores+contribute+to+odor-induced+responses+in+Drosophila+olfactory+receptor+neurons.">Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons.</a> J. Exp. Biol. 213 (24), 4163-4173 (2010).</li><li>Murmu, M. S., Stinnakre, J., R&#233;al, E., Martin, J. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-stores+mediate+adaptation+in+axon+terminals+of+Olfactory+Receptor+Neurons+in+Drosophila.">Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila.</a> BMC Neurosci. 12, 105 (2011).</li><li>Pavot, P., Carbognin, E., Martin, J. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKA+and+cAMP/CNG+channels+independently+regulate+the+cholinergic+Ca2+-response+of+Drosophila+mushroom+body+neurons.">PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons.</a> eNeuro. 2 (2), 0054-0068 (2015).</li><li>Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M. S., Martin, J. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+functional+calcium+imaging+of+induced+or+spontaneous+activity+in+the+fly+brain+using+a+GFP-apoaequorin-based+bioluminescent+approach.">In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach.</a> BBA-Mol Cell Res. 1833 (7), 1632-1640 (2013).</li><li>Lima, S. Q., Miesenb&#246;ck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons.">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121 (1), 141-152 (2005).</li><li>Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., Inouye, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+properties+of+recombinant+semisynthetic+aequorins+and+recombinant+fluorescein-conjugated+aequorin+for+measuring+cellular+calcium.">Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium.</a> Cell Calcium. 14 (5), 373-378 (1993).</li><li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling:+dynamics,+homeostasis+and+remodelling.">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (7), 517-529 (2003).</li><li>Fiala, A., Spall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+calcium+imaging+of+brain+activity+in+Drosophila+by+transgenic+cameleon+expression.">In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression.</a> Sci STKE. 2003 (174), PL6 (2003).</li><li>Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain.">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li><li>Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Olfactory+Representations+in+the+Drosophila+Antennal+Lobe.">Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe.</a> Science. 303 (5656), 366-370 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Cabrero ve ark belirtildiği gibi burada sunulan yeni geliştirilmiş biyolojik olarak ışık veren bazlı GFP aequorin bir yaklaşım, böbrek stellat hücreleri gibi diğer hücre tür, hem de istenirse gibi farklı nöronlarında Ca 2 + -Aktiflik in vivo fonksiyonel bir kayıt sağlar. 2013 5. Değişiklikler, sorun çekim, ek bileşenler ve kritik adımlar Drosoph...

Temel desenlendirme ve beyin ve ayrık yapı içinde faaliyet işlevi uzun nörobilim alanındaki yoğun bir çalışma alanı olmuştur. Belki de bu sorunu gidermek için kullanılan en eski başarılı yaklaşımların bazı elektrik aktivitesindeki değişikliğin doğrudan fizyolojik ölçümü vardı - ek yetenekleri getirdi (aktivite için proxy olarak) gerilim, pH veya kalsiyum konsantrasyonları değişikliklerin canlı görüntüleme izin ancak alternatif yöntemler nöronal aktivitenin 1 çalışma. Görüntüleme teknikleri, azaltılmış invaziv ve bütün beyin yapıları içinde etkinliğini izlemek için yeteneği gibi avantajları geniş bir yelpazeye taşırlar. Ayrıca meyve gibi uysal genetik hayvanlarda Drosophila gibi cameleon, GCaMPs ve diğerleri gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri, gelişimini sinek 1 tek nöronlar, nöronal nüfus ve tüm beyni izlemek için araştırmacılar izinyapıları. Daha geleneksel floresan kalsiyum görüntüleme yöntemleri (kalmodulin kaynaştırılmış CFP ve YFP) (kalmodulin erimiş GFP) ya da FRET GCaMPs kullanırken iyi mekansal ve zamansal çözünürlük sağlayan kullanışlı teknikler olduklarını kanıtladılar, ışık uyarma altında yatan sürecinin deneysel bazı sınırlamalar doğurur uygulamaları. Nedeniyle sonuç görüntülü olabilir yapıların derinliğini sınırlar kaçınılmaz üretilen hafif uyarma, otofloresansı, fotoğraf ağartma ve fototoksisite doğası için, kayıtların süresi yanı sıra kayıt gerçek zamanlı süreklilik. Diğer bir deyişle, kayıtlar genellikle bu istenmeyen yan etkileri önlemek için aralıklı olarak gerçekleştirilmelidir. Çünkü bu zorlukların, kalsiyum görüntüleme ek alternatif yöntemler geliştirilmiştir. En umut verici yöntemlerden biri kalsiyum bağlama sonra enzimatik reaksiyon ile üretilen ışık dayanır biyoluminesen görüntüleme vardır. Bioluminescent görüntüleme geleneksel kalsiyum görüntüleme aynı zorluklar yaşamaya değil dolayısıyla hafif uyarma gerektirmez ve etmez. Bio-ışıldar haberci Aequorin - Aequorea victoria izole λ (GFP da isolated- edildiği aynı Jellyfish üç EF ayak yapılarının ile kalsiyum bağlanır ve kofaktörü koelenterazin oksidasyonu ve mavi ışık serbest bırakılmasına yol açacak bir konformasyonal değişiklik geçirmektedir = 469 nm) 2,3. Aequorin çok az arka plan gürültü üreten ve hücre içi kalsiyum tamponlama sistemi 4 ile karışmaz çünkü geçici kalsiyum kontrolü için ideal hale getirir, kalsiyum (Kd = 10 uM) için çok düşük bir çekicilikleri vardır. Aequorin önce Xenopus yumurta 5 üretilen ışık nöral indüksiyon sürecini izlemek için kullanılır olmasına rağmen nöronal aktivitenin gerçek zamanlı görüntüleme için kullanmak için çok loş. Bu meydan okuma, Philippe Br &amp; gidermek için bir çaba içinde251., Pasteur Enstitüsü&#39;nde izin ve arkadaşları denizanası 4 içinde yerli devlet taklit, GFP füzyon ve genleri Aequorin bir genetik yapının yarattı. Bu füzyon gen ürünü GFP olmayan radyatif enerjiyi aktaran koelenterazin, oksidasyonu için önde gelen bir yapısal değişikliğe uğrar aequorin üç EF eli yapıları, üzerinden tekrar kalsiyumu bağlar. Yerine aequorin mavi ışık GFP yeşil ışık (λ = 509 nm) sürümünde bu enerji transfer sonuçları. GFP ve aequorin füzyon aynı zamanda tek başına 4 Aequorin daha 19 65 kat daha parlak füzyon proteini üretmek ışık yardımcı büyük protein stabilitesini bahşeder. Beynin içinde bir biyolüminesens yaklaşımı kullanarak sürekli kayıt süresi ve kaydedilebilir beyin içindeki yapıların sayısı bakımından hem de kalsiyum görüntüleme mevcut deneysel uygulama genişletir. Geniş önceki çalışmaları bağlamında bu hem küresel hem de daha büyük bir anlamıBeynin bölgeselleştirilmiş &quot;etkinliği&quot; çeşitliliği (kalsiyum transientler proxy üzerinden) izlenebilir. Daha da önemlisi aktivite kolaylıkla beyinde bazal fonksiyon tam bir anlayış peşinde kendisini ödünç bir gerçek zamanlı ve sürekli olarak, içinde, daha uzun süre izlenebilir. Son birkaç yıl içinde, laboratuar ve diğerleri, ikili sentezleme sisteminin kontrolü altında GFP-Aequorini (GAL4 / UAS-GFP-aequorin) 5,6 ifade eden transgenik sinekler geliştirdik. Biz doğrudan nikotinik uygulama 9 ile asetilkolin reseptör stimülasyonu aşağıdaki mantar organları Ca 2+ -Aktiflik modüle gibi kokusu 7,8 gibi doğal uyaranlara yanı sıra çalışılan hücresel bileşenleri tarafından üretilen kayıt faaliyetine GFP-aequorin biyoparlaklık kullandık. Buna ek olarak, biz de uzun vadeli gibi önceden ele alınması mümkün olmamıştır deneysel sorular, bir dizi adrese GFP-Aequorini kullanmışSpontan kalsiyum geçici ve derin beyin yapıları 10 görselleştirme görüntüleme. Daha yakın zamanlarda, biz memeli ATP reseptör P2X 2 11 projeksiyon nöronlarının bir katyon kanalı, (PNS) ifade GAL4 / UAS sistemi kullanılmaktadır ve (MB247-LeXA mantar organları GFP-Aequorini ifade etmek LeXA sistemini kullandık, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (B. Pfeiffer, Janelia Çiftliği, ABD) bir nezaket. Bu bize böyle bir koku uyarana karşı tepki olarak daha doğal koşullar, taklit, sırayla mantar organları (PNS bir aşağı hedef) aktive ATP, uygulanmasıyla Fiziksel Durum etkinleştirmek için izin verdi. Genel olarak bu P2X 2 birleştirerek tekniği ve GFP-aequorin deneysel olanakları genişletir. Geniş farklı uyaranlar ve tedirginlikler faaliyet bazal desenlendirme değiştirebilir nasıl yeni çalışmaları başlatarak, daha beyindeki aktivite kalıplarını anlamak için bir fırsat sunuyor.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>1023911000</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>prolabo</td><td>26 764.298</td><td>normapur</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>prolabo</td><td>25 108.295</td><td>normapur</td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Nicotine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3876</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td>Adenosine 5&amp;prime;-triphosphate disodium salt hydrate</td></tr><tr><td>benzyl-coelenterazine</td><td>Prolume, nanolight&amp;nbsp;</td><td>Cat #301 Coelenterazine h</td><td>http://www.prolume.com/</td></tr><tr><td>dental glue</td><td>3M ESPE&amp;trade;</td><td>46954</td><td>Protemp IV</td></tr><tr><td>silicon glue</td><td>3M ESPE&amp;trade;</td><td>36958</td><td>Express 2 Regular Body Quick</td></tr><tr><td>tape</td><td>3M Scotch</td><td>122s</td><td>3M Scotch Magic Tape</td></tr><tr><td>pipette tips</td><td>Corning Incorporated</td><td>4868</td><td>100-1,000 &amp;micro;l Univesal Pipette Tip</td></tr><tr><td>chamber and holder (stage)</td><td></td><td></td><td>hand made</td></tr><tr><td>incubation box</td><td></td><td></td><td>hand made</td></tr><tr><td>forceps (No. 5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Micro-dissecting forceps</td></tr><tr><td>curved forceps</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142</td><td>Micro-dissecting forceps</td></tr><tr><td>glue applicator&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>hand made&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>knife</td><td>Fine Science Tools</td><td>10316-14</td><td>5 mm Depth 15&amp;deg; stab</td></tr><tr><td>EM-CCD camera&amp;nbsp;</td><td>Andor</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td>iXon (cooled to -80 &amp;deg;C)</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td>Eclipse-E800</td></tr><tr><td>immersion objective lens</td><td>Nikon</td><td></td><td>20X Fluor .5w</td></tr><tr><td>dissection microscope with fluorescence</td><td>Leica MZ Fl III</td><td></td><td>leica dissection scope and florescent lamp</td></tr><tr><td>tight dark box</td><td>Science Wares</td><td></td><td>Custom built by Science Wares</td></tr><tr><td>peristaltic pump&amp;nbsp;</td><td>Gilson</td><td></td><td>Minipuls 2</td></tr><tr><td>tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td>depends on thickness</td><td>Tygon R3603, St-Gobain</td></tr><tr><td>perfusion system</td><td>Warner</td><td>64-0135 &amp;nbsp;(VC-66CS)</td><td>Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel</td></tr><tr><td>perfusion regulators</td><td>Leventon</td><td>201108</td><td>Dosi-flow 3</td></tr><tr><td>measurement and automation explorer</td><td>Sciences Wares &amp;amp; National Instruments</td><td>N/A</td><td>software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380</td></tr><tr><td>photon imager&amp;nbsp;</td><td>Science Wares &amp;amp; National Instruments</td><td>N/A</td><td>software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380</td></tr><tr><td>photon viewer</td><td>Science Wares &amp;amp; National Instuments</td><td>N/A</td><td>software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td>software https://www.microsoft.com</td></tr><tr><td>virtual dub</td><td>open access&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>software http://virtualdub.sourceforge.net/</td></tr><tr><td>UAS-GA2</td><td>Martin &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2007, Ref. 1&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>No stocks {currently} publicly available&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA.&amp;nbsp;</td><td>(STOCK #1117340)</td><td>pfeifferb@janelia.hhmi.org</td></tr><tr><td>P2X&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Lima and Misenboeck, Ref. 11&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>No stocks {currently} publicly available&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>OK107</td><td>Bloomington stock center</td><td>854</td><td>http://flystocks.bio.indiana.edu/</td></tr></tbody></table>

in vivo functional brain imaging approach based on bioluminescent calcium indicator gfp-aequorin

In vivo görüntüleme Fonksiyonel fonksiyonu ve beyin hücreleri ve ilgi yapıların fizyolojisi incelemek için güçlü bir yaklaşım haline gelmiştir. En son ışıldar haberci GFP Aequorini (GA) kullanılarak -imaging Ca 2 yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Kofaktörü koelenterazin ilavesi ile - - foton toplayıcı ile izlenebilir parlak ışık yayan Bu yeni teknik kalsiyum bağlanması ve bir moleküldür üreten GFP ve aequorin genlerin füzyonu kullanır. GFP-aequorin geni taşıyan transjenik çizgiler fareler ve Drosophila hem de üretilmiştir. Drosophila olarak, GFP-aequorin geni beyin içinde hedeflenen ifade ve görüntüleme için izin GAL4 / UAS ikili sentezleme sisteminin kontrolü altında yerleştirilmiştir. Bu yöntem, daha sonra tespit etme kabiliyetine sahip olduğu gösterilmiştir hem Ca içeri 2 + -transients ve Ca +2, iç depolardan -released. En önemlisi de sürekli kayıt, beynin içinde büyük derinliklerde görüntüleme daha büyük bir süre için izin verir, ve (8.3 milisaniye kadar) yüksek temporal çözünürlükte kayıt. Burada kayıt ve Ca mantar organları içinde 2+ -Aktiflik, sinek beyinde öğrenme ve hafıza merkezi bir yapı analiz etmek bioluminescent görüntüleme kullanılarak temel yöntem mevcut.

Aequorin için GFP füzyon bize mikroskobu (Şekil 3A, 4A, 6A, 6E) üzerinde floresan modunda GFP uyarma yoluyla önce biyolüminesans görüntüleme ilgi bölgemize görüntülemenizi sağlar. Mantar organları uyarmak için en basit yollarından birisi, iyonotropik nikotinik asetilkolin reseptörlerinin aktivasyonu yoluyla. Asetilkolin Bu, alıcının endogen liganddır, ancak biz, nikotin mantar organlarında daha çoğaltılabilir bir yanıt ürettiği bulunmuştur. Onlar özellikle nikotinik asetil...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin at JoVE.com

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Bioluminescent Kalsiyum Göstergesi GFP-aequorin dayanarak Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşım

Burada bir biyolüminesens muhabir kullanarak yaklaşım -imaging bir roman Ca 2 + sunuyoruz. Bu yaklaşım, Ca2 + bağlanan ve hafif uyarılması için ihtiyacı ortadan kaldırarak, ışık yayan bir kaynaşık konstrukt GFP Aequorini kullanır. Anlamlı bu yöntem derin beyin yapıları ve yüksek temporal çözünürlük uzun sürekli görüntüleme, erişime izin verir.

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

in-vivo-functional-brain-imaging-approach-based-on-bioluminescent

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

12.2K Görüntüleme.  UMR-9197, CNRS/Université Paris Sud.  Burada bir biyolüminesens muhabir kullanarak yaklaşım -imaging bir roman Ca 2 + sunuyoruz. Bu yaklaşım, Ca2 + bağlanan ve hafif uyarılması için ihtiyacı ortadan kaldırarak, ışık yayan bir kaynaşık konstrukt GFP Aequorini kullanır. Anlamlı bu yöntem derin beyin yapıları ve yüksek temporal çözünürlük uzun sürekli görüntüleme, erişime izin verir. 

Video: In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

Katman In Vivo 2-Foton Kalsiyum Görüntüleme Fare 2 / 3

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Biyoloji

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Nörobilim

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible are badly known. Excitotoxicity, a process believed to contribute to neuron damage induced by both insults, is mediated by activation of glutamate receptors that promotes Ca2+ influx and mitochondrial Ca2+ overload. A substantial change in intracellular Ca2+ homeostasis or remodeling of intracellular Ca2+ homeostasis may favor neuron damage in old neurons. For investigating Ca2+ remodeling in aging we have used live cell imaging in long-term cultures of rat hippocampal neurons that resemble in some aspects aged neurons in vivo. For this end, hippocampal cells are, in first place, freshly dispersed from new born rat hippocampi and plated on poli-D-lysine coated, glass coverslips. Then cultures are kept in controlled media for several days or several weeks for investigating young and old neurons, respectively. Second, cultured neurons are loaded with fura2 and subjected to measurements of cytosolic Ca2+ concentration using digital fluorescence ratio imaging. Third, cultured neurons are transfected with plasmids expressing a tandem of low-affinity aequorin and GFP targeted to mitochondria. After 24 hr, aequorin inside cells is reconstituted with coelenterazine and neurons are subjected to bioluminescence imaging for monitoring of mitochondrial Ca2+ concentration. This three-step procedure allows the monitoring of cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to relevant stimuli as for example the glutamate receptor agonist NMDA and compare whether these and other responses are influenced by aging. This procedure may yield new insights as to how aging influence cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to selected stimuli as well as the testing of selected drugs aimed at preventing neuron cell death in age-related diseases.

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Subselüler Ca Floresans ve Biyoparlaklık Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Yaşlı Hipokampal Nöronlar

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

Ex Vivo Endokrin Drosophila içinde sinyal beyin yanıt-e doğru görüntülenmesi için kalsiyum görüntüleme

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

Ex Vivo Hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Fare Kalitesiz Zeytinde Kalsiyum Görüntüleme

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to correlate this with local hemodynamics. This protocol uses transgenic mice that have been prepared with a chronic cranial window and express the genetically encoded calcium indicator, RCaMP1.07, under the &#945;-smooth muscle actin promoter to specifically label mural cells, such as vascular smooth muscle cells and ensheathing pericytes. Steps are outlined on how to prepare a tail vein catheter for intravenous injection of fluorescent dyes to trace blood flow, as well as how to measure brain pericyte calcium and local blood vessel hemodynamics (diameter, red blood cell velocity, etc.) by two photon microscopy in vivo through the cranial window in ketamine/xylazine anesthetized mice. Finally, details are provided for the analysis of calcium fluctuations and blood flow movies via the image processing algorithms developed by Barrett et al. 2018, with an emphasis on how these processes can be adapted to other cellular imaging data.

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

This protocol presents steps to acquire and analyze fluorescent calcium images from brain ensheathing pericytes and blood flow data from nearby blood vessels in anesthetized mice. These techniques are useful for studies of mural cell physiology and can be adapted to investigate calcium transients in any cell type.

Vivo Transgenik Farelerde Beyin Perisit Kalsiyumu ve Hemodinamik Görüntüleme

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the other hand, two-photon imaging can resolve the activity of local neural circuits at the single-cell level. It is critical to make a large cranial window to perform multiple-scale analysis using both imaging techniques in the same mouse. To achieve this, one must remove a large section of the skull and cover the exposed cortical surface with transparent materials. Previously, glass skulls and polymer-based cranial windows have been developed for this purpose, but these materials are not easily fabricated. The present protocol describes a simple method for making a large cranial window consisting of commercially available polyvinylidene chloride (PVDC) wrapping film, a transparent silicone plug, and a cover glass. For imaging the dorsal surface of an entire hemisphere, the window size was approximately 6 x 3 mm2. Severe brain vibrations were not observed regardless of such a large window. Importantly, the condition of the brain surface did not deteriorate for more than one month. Wide-field imaging of a mouse expressing a genetically-encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6f, specifically in astrocytes, revealed synchronized responses in a few millimeters. Two-photon imaging of the same mouse showed prominent calcium responses in individual astrocytes over several seconds. Furthermore, a thin layer of an adeno-associated virus was applied to the PVDC film and successfully expressed GECI in cortical neurons over the cranial window. This technique is reliable and cost-effective for making a large cranial window and facilitates the investigation of the neural and glial dynamics and their interactions during behavior at the macroscopic and microscopic levels.

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

The present protocol describes making a large (6 x 3 mm2) cranial window using food wrap, transparent silicone, and cover glass. This cranial window allows in vivo wide-field and two-photon calcium imaging experiments in the same mouse.

İn Vivo Büyük Bir Kraniyal Pencere Kullanarak Bir Fareden Geniş Alan ve İki Foton Kalsiyum Görüntüleme

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

In Vivo Confocal Fluorescence Imaging of Neural Activity Induced by Sensory Stimulation in Partially Restrained Larval Zebrafish

Zebrafish larvae are a promising vertebrate model system for studying the neural mechanisms of behavior. Their translucence and relatively simple neural circuitry facilitate the use of optogenetic techniques in cellular analyses of behavior. Fluorescent indicators of in vivo neural activity, such as GCaMP6s, have been widely used to study the neural activity associated with simple behaviors in larval zebrafish. Here, we present a protocol for detecting sensory-induced activity in semi-restrained zebrafish larvae using the transgenic line Tg(elav3:GCaMP6s). In particular, we use the chemical agent allyl isothiocyanate to induce a robust, reproducible fluorescent response in a brain region at the border of the hindbrain and spinal cord. We discuss the potential uses of GCaMP6s for optical monitoring of neural activity during a range of behavioral paradigms and the limitations of this technique. Our protocol outlines an accessible approach for monitoring dynamic, behavior-related in vivo neural activity in the larval zebrafish brain.

Here, we present a detailed protocol to examine neural activity in brain regions of transgenic zebrafish that express GCaMP calcium indicators using confocal microscopy.

Zebrafish larvae are a promising vertebrate model system for studying the neural mechanisms of behavior. Their translucence and relatively simple neural ...

Bioluminescent Kalsiyum Göstergesi GFP-aequorin dayanarak Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşım

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler