Name: fluorescence and bioluminescence imaging of subcellular ca2+ in aged hippocampal neurons
Uploaded: 2015-12-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons at JoVE.com

This work was supported by Ministerio de Econom&#236;a y competitividad (BFU2012-37146) and Junta de Castilla y Le&#242;n (BIO103/VA45/11, VA145U13 and BIO/VA33/13), Spain. MCR was supported by Junta de Castilla y Le&#242;n (Spain) and the European Social Fund. We thank the late Dr. Philippe Br&#251;let (1947-2013) for the mitochondrial GFP Aequorin plasmid.

Etik Beyanı: Hayvan denekleri Prosedürler Avrupa Sözleşmesi 123 / Avrupa Konseyi ve Direktifi 86/609 / EEC sayılı ile anlaşarak Valladolid Üniversitesi hayvan barınağı tesisi tarafından onaylanan protokoller çerçevesinde ele alınmıştır. Sıçan Hipokampal Nöronlar 1. Kısa ve Uzun Vadeli Kültürü <ol><li> Poli-D-lisin hazırlanması, 12 mm cam lamelleri kaplama. <ol><li> En az 24 saat süre ile etanol içinde 12 mm çapında bir cam lamelleri sterilize edin. Bunları steril koşullar altında kurumaya bırakın. </li><li> Petri kabındaki parafilm şeridi lamelleri dağıtın. 1 mg / ml poli-D-lisin 200 ul her bir lamel yüzeyi kapatılır. O / N tedavi izin verin. </li><li> Ertesi gün, steril koşullar altında 90 dakika boyunca iki kez damıtılmış, steril su ile her 15 dakikada bir lamelleri yıkayın. </li><li> Neurobasal Kültür Ortamı 500 ul ile dört sıra çok kaplı plaka Dolgu ile sabitleştirilir. Neurobasal Kültür Ortamı ile takviye edilmelidir% 10 fetal bovin serumu,% 2 B27, 1 ug / ml gentamisin ve 2 mM L-glutamin. </li><li> Çok kaplı plaka lamelleri yerleştirin. Kullanılana kadar nemlendirilmiş 37 ° C ve% 5 CO2 inkübatör koruyun. </li></ol></li><li> Yenidoğan sıçanlarda hipokampal nöronlar izolasyonu. <ol><li> Steril koşullar altında, bir şişeye (20 ul / ml) içinde 1,8 ml papain çözeltisi (şirketinden satın alınmış) hazırlayın: 20 ul&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek için / 1.8 mi Hank artı% 0.6 BSA içinde 40 ul papain ilave ml (ul hesaplanmalıdır ) satıcılar koşullarına bağlı olarak değişebilir. Hank% 0.6 BSA% 4 sığır serumu albümini 15 ml HBSS ortamı 85 ml karıştırılması ile hazırlanır (BSA, 100 mi HBSS içinde BSA 4 g çözme hazırlanır). Steril bir kaput içinde hazırlayın. </li><li> Kullanımdan önce 37 ° C &#39;de 30 dakika boyunca Hank artı% 0.6 BSA içinde papain inkübe edin. Kullanım öncesi 0,22 um filtre kullanılarak çözelti filtre. </li><li> Dulbecco&#39;nun ekleyerek Ham F-12 ortamı hazırlamakIki kez damıtılmış steril su içinde 900 ml Eagle Ortamı tozu (L başına 13.5 g) modifiye edilmiştir. Sonra 6 gr HEPES ve 336 mg NaHCO 3 ekleyebilir ve NaOH 4 N. 1 L çözelti elde ve 0.20 mikron polietersülfon kullanarak filtrelemek için steril su ekleyin kullanarak 7.42 pH ayarlamak (PES) üst filtreyi şişe. Bir steril bir muhafaza içinde bu işlemi uygulayın. Sonunda Kullanmadan önce steril koşullar altında CO 2 ile çözüm doyurabilecek. Mağaza çözümleri 4 ºC de ve onları soğutulmuş kullanın. </li><li> Dekapitasyon yenidoğan (P0) fare yavrular Euthanize ve steril HBS orta kafa yıkayın. Steril makas yardımı ile kafatası açın. Bir spatula ile beyin ekstrakte edin ve Ham F-12 ortamı içinde hızlı bir şekilde yıkayın. </li><li> Her yarımkürede (Şekil 1B) bir neşter yardımıyla bir çapraz kesim yapın ve Ham F-12 orta içeren Petri taşımak. </li><li> Diseksiyon forseps yardımıyla ve büyüteç altında dikkatlice atın meninksler. </li> &lt;li&gt; büyüteç kullanarak korteks üzerinde karakteristik bir içbükey konumda hipokampus tanımlayın. Sonra bir sınır dikkatlice çekerek ve göz makas kullanarak konumundan kaldırarak korteksten hipokampus ayırın. </li><li> Steril Hank ortamında Ca + 2 ve Mg yoksun 2+ artı% 0.6 BSA ile doldurulmuş bir 4-iyi levhaya hipokampal doku transferi ve hipokampal doku yıkayın. Çıkarmadan medya aynı göz makas kullanarak küçük parçalar halinde doku (2 x 2 civarında mm) kesti. </li><li> 1,8 ml önceden süzüldü papain çözeltisi ihtiva eden bir şişeye hipokampal parçaları aktarın. Sonra sıra, hafifçe çalkalanarak 37 ºC&#39;de inkübe. 15 dakika sonra, (nihai 50 ng / ml), DNase I çözeltisinin 90 ul ve 15 dk daha inkübe edilir. </li><li> 10 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne doku aktarın ve taze Neurobasal Kültür Ortamı ile fragmanları yıkayın. 5 ml&#39;lik plastik pip ile doku parçaları geçirerek hücre süspansiyonu eldeette. </li><li> 5 dakika boyunca 160 x g&#39;de santrifüjleyin hücre süspansiyonu. Bir plastik steril Pasteur pipeti kullanarak Süpernatantı ve Neurobasal Kültür Orta 1 ml pipet otomatik bir 1 ml dikkatlice pelet askıya. </li><li> Bir Neubauer sayım odasını kullanarak hücre yoğunluğu ölçün. Neubauer odasına üzerine cam lamel koyun. Hücre süspansiyonu 10 ul ekle. Hücre süspansiyonu homojen ve hiçbir kabarcıklar yapma odasına girer emin olun. Mikroskop altında hücrelerin sayısını ve 30 x 10 3 hücre içeren 40-80 ul uygun bir damla elde etmek için gelen hesaplamaları gerçekleştirmek. Toplam hücre sayısı, kullanılan hayvanların sayısına bağlı olacaktır. </li></ol></li><li> Kısa ve sıçan hipokampal nöronlarının uzun dönemli kültür. <ol><li> Her bir ila yaklaşık 50 ul arasında bir damla yaklaşık 30 x 10 3 hücreleri Neurobasal Kültür Ortamı 500 ul ihtiva eden dört oyuklu çok kaplı plaka üzerinde önce hazırlanan ve inkübatör plaka muhafazade bir poli-D-lizin kaplı 12 mm çapında bir cam lamel ihtiva eden çok kaplı plaka. </li><li> Kültür değiştirmeden deneylerde önce in vitro 2-5 gün (DIV, kısa vadeli, genç kültürler) ya da&gt; 15 DIV (Uzun vadeli, yaşlı kültürler) için nemlendirilmiş 37 ºC ve% 5 CO2 inkübatör primer hipokampal hücreleri korumak Ortam. </li></ol></li></ol> Sitosolik Ca 2. Floresans Görüntüleme 2+ Konsantrasyon <ol><li> Floresan görüntüleme test çözümleri hazırlanması. <ol><li> NaCl 145, KCI 5, MgCl2 1, CaCl2 1, glükoz 10, sodyum HEPES, 10 (pH 7.42): mM ihtiva eden bir dış HEPES-tamponlu tuzlu su (HBA) çözeltisi hazırlayın. </li><li> NaCl 146, KCI 5, glükoz CaCl 2 1, 10 ve 10 HEPES (pH 7.42): mM ihtiva eden bir dış, Mg2 + içermeyen, HEPES-tamponlu tuzlu su (HBA) çözeltisi hazırlayın. </li><li> Bir Fina NMDA Mg2 +, -ücretsiz olarak, HEPES-tamponlu salin (HBA) çözme100 mcM l konsantrasyonu ve 10 mcM glisin ile tamamlar. </li><li> (MM olarak) çözerek yerine NaCl KCI ihtiva eden bir HBS çözeltisi hazırlayın: KCI 145, MgCl2 1, CaCl2 1, 10 ve 10 HEPES (pH 7.42) glikoz. </li></ol></li><li> Floresan kalsiyum prob fura2 / AM ile hipokampal hücre yükleme. <ol><li> Inkübatör kapalı lamelleri içeren hücre kültürü alın ve 500 HBS ul başına iyi içeren yeni bir dört iyi çok kaplı plaka aktararak RT&#39;de HBS ortamı ile yıkayın. </li><li> Fura2 kuluçkaya bırakılır / karanlık bir yerde, oda sıcaklığında (25 ° C) sıcaklıkta 60 dakika boyunca (aynı HBA ortam içinde hazırlandı) AM 4 uM. </li><li> 60 dakika sonra, taze HBS orta lamelleri yıkayın. </li></ol></li><li> Sitozolik kaydedilmesi floresan görüntüleri [Ca 2 +] kültürlü hücrelerde. <ol><li> Lamba, mikroskop, perfüzyon sistemi, floresan kamera ve bilgisayarı açın. </li><li> Bir termostatlı bir platformda lamelleriters mikroskop sahnede açık 12 mm cam lamelleri ve 40X objektif (1.3 yağ, NA) kullanarak mikroskobik alanı seçin. Ya da yokluğunda test maddelerinin mevcudiyetinde (37 ° C) önceden ısıtılmış HBS ortamı ile sürekli hücreleri serpmek. / Dakika yaklaşık 5-10 ml bir oranda akış muhafaza edin. Not: canlı hücreler için hücre perfüzyon Sistem, açık 12 mm cam lamelleri için termostatlı bir platform içine monte edilir. Bir valf kontrol cihazı ile donatılmış 8 hatları yerçekimi ile çalışan bir perfüzyon sistemi çözümleri serpmek için kullanılır. Bir vakum pompası herhangi bir aşırı yayıcıyı çıkarmak için sorumludur. Solutions içinde boru ısıtma sistemi kullanılarak ısıtılır. </li><li> Deklanşör hem uyarma dalga boylarında kapalı bir arka plan görüntüsü yakalama. </li><li> 340 ve 380 nm dönüşümlü hücreler Epi-aydınlatır. Tutanak ışığı 520 nm bir fura-2 dikroik ayna tarafından süzülür bir floresan kamera, her 5-10 sn yayılan. </li><li> Kayıt süresi bittiğinde, tam sekans o saklamakf görüntüleri daha fazla analiz için bilgisayara 520 nm&#39;de yayılan. </li></ol></li><li> Kaydedilen floresan görüntü analizi. <ol><li> Deney dosyasını açın. AQUACOSMOS yazılımı kullanarak, &#39;Oranı&#39; üzerine tıklayın ve istediğiniz oran aralığını seçin. Oranı görüntü bir dizi elde etmek için elde edilen görüntüler olarak piksel oranı piksel hesaplayın. </li><li> &#39;Arka plan eleme&#39; ayarlayarak arka plan çıkarın. Basın &#39;başlangıç ​​hesabı&#39;. </li><li> Basın &#39;her zaman dizisi&#39; düğmesi ve ilgi antik bölgeleri silmek (ROI). Tek tek hücrelerin kantitatif analiz için, bireysel nöronlar karşılık gelen faiz veya İB&#39;nin yeni bölgeleri kurmak. Her ROI ve her görüntüye karşılık gelen her bir piksel ortalama tüm oran değerleri, bireysel ROI (hücreler) için bu oran floresan değerleri bir kayıt elde etmek. </li><li> Bir grafik progr her ROI karşılık gelen oran floresan değerlerini ihraç bireysel kayıtları grafiğini içinduyuyorum. </li><li> Uygun bir veri analizi kullanılarak her bir uyarıya cevap olarak oran floresanın artışların büyüklüğü tahmin edilmesi ve yazılımı grafik için ilgili hesaplamalar sağlayın. </li></ol></li></ol> Mitokondriyal Ca 3. Biyoparlaklık Görüntüleme 2+ Konsantrasyon <ol><li> MitGAmut plazmid ile kültürlenmiş hipokampal nöronlar transfeksiyonu. NOT: Hücreler ilk olarak mitokondri hedefli sekans ve yeşil flüoresan proteini (GFP) kaynaşmış bir Ca2 + bağlama sahası eksik mutasyona uğramış Aequorini içeren mitGAmut plazmid ile transfekte edilir. Bu yapı, mitokondriyal Ca 2 + alımı büyük artışlar algılar ve GFP floresan ile transfekte edilmiş hücrelerin tanımlanmasına izin verir. Plazmid geliştirilmiş ve nazik P. brulet ve birlikte çalışanlar 18 (CNRS, Paris, Fransa) tarafından temin edildi. <ol><li> Cenin sığır serumu eksik Neurobasal kültür vasatı içeren, Neurobasal TF Hazırlama, B27, gentamicve 2 mM L-glutamin. </li><li> Neurobasal TF 50 ul artı bir viyal (Çözelti A) 2.5 ul transfeksiyon reaktifi hazırlayın. 50 Neurobasal TF ul artı 4 ug bir şişe içinde mitGAmut plazmid (Çözelti B) hazırlayın. Sallayarak olmadan 20 dakika boyunca karıştırma izin çözüm A. üzerinde hafifçe çözüm B ekleyin. </li><li> Taze Neurobasal TF 200 ul içeren yeni çok kaplı plakalara hipokampal nöron içeren lamelleri aktarın. </li><li> Her lamel üzerinde damla çözüm A + B 100 ul damla ekleyin. 30 dakika boyunca çalkalayarak kuluçkalayın. Orta çıkarın. Taze Neurobasal TF hücrelerin bir kez yıkayın. Orijinal Neurobasal Kültür Orta lamelleri dönün. </li><li> 37 ° C ve% 5 transfeksiyonundan sonra CO2 seviyesinde ilave bir 24 saat boyunca kültür nöronları etkin ekspresyonu ve probun hedef izin vermek. </li></ol></li><li> Biyoparlaklık görüntüleme için deney çözeltilerinin hazırlanması. <ol><li> Olarak NMDA 100 uM ya da 145 mM KCI içeren HBS çözümler hazırlayınYukarıda (2.1 Adım). 10 mM Ca içeren 2+ artı 100 mcM digitonin HBS çözeltisi hazırlayın. </li></ol></li><li> Coelenterazine n mitokondri hedefli aequorin Sulandırma. <ol><li> HBS 200 ul ihtiva eden bir dört plaka transfekte hipokampal nöronlar içeren transfer lamelleri. </li><li> 4 uM&#39;lik bir son konsantrasyon elde boyunca HBS&#39;de 200 ul coelenterazine n (200 uM) 4 ul ekleyin ve yavaşça karıştırın. RT (25 ° C), 2 saat boyunca karanlıkta inkübe edin. </li></ol></li><li> Mitokondriyal kaydedilmesi biyolüminesans görüntüleri [Ca 2 +]. <ol><li> Mikroskop, lamba, perfüzyon sistemi, biyolüminesans kamera ve bilgisayarı açın. </li><li> Termostatlı bir (37 ° C) perfüzyon odasına yeniden lamelleri aktarın ve 5-10 ml / dk&#39;lık bir oranda önceden ısıtılmış HBS çözeltisi ile sürekli olarak serpmek. </li><li> 40X objektif (yağ, NA: 1.3) kullanılarak, a ifade hücreleri içeren mikroskobik alan seçinFITC filtreleri kullanarak yeşil flüoresan proteini (GFP) ekspresyonu ile bağlantılı bir floresan emisyonu ile gösterildiği gibi poaequorins. Tipik bir alanı 1-2 transfekte edilmiş hücreleri içerebilir. Bir CCD kamera kullanarak, GFP floresan görüntü yakalamak. </li><li> Mikroskop ışığı kapatın. Işık yolunda bulunan dichroic içeren kutu çıkarın. Uyarma ışık kapatın ve tam karanlık koyu-kutusunu kapatın. </li><li> Ya da test solüsyonları 37 ° C&#39;de önceden ısıtılmış olmayan HBS ortamı ile 5-10 ml / dakika hücreleri serpmek. </li><li> Fotonik emisyon görüntüleri bir görüntü işlemcisi ile ele bir foton sayma makinesi ile her 10 saniyede yakalayın. </li><li> Her bir deneyin sonunda, kalan tüm foton emisyon serbest bırakmak için HBS&#39;de 10 mM digitonin 0.1 mM CaCl2 ile hücreleri geçirgenliği. Not: Bu fotonik emisyonlar toplam fotonik emisyonları, Ca 2 + konsantrasyonlarda kalibrasyon için gerekli bir değerini tahmin etmek için yukarı eklenmelidir &lt;./ li&gt; <li> GFP ilişkili floresan görüntü ile bilgisayarda saklayın biyolüminesans görüntüleri foton sayma görüntüleme önce ele geçirdi. </li></ol></li><li> Mitokondriyal [Ca2 +] yansıtan biyoışıldama görüntülerin analizi. <ol><li> Özel bir yazılım kullanılarak fotonik emisyonları ölçmek. Fotonik emisyon mitokondriyal serbest Ca dönüştürülebilir 2 + konsantrasyonu ([Ca2 +] mit) Brini ve ark., 15 tarafından tarif edilen algoritmasını kullanarak yapar. </li><li> Deney ve GFP floresan görüntüyü açın. Deneyin başında çekilen floresan görüntülerine göre transfekte hücrelerin şekli çizerek özel yazılım yardımı ile ilgi (ROI) Seç bölgeleri. </li><li> Her görüntü aynı ROI yapıştırın. Her ROI toplam fotonik emisyonları zaman içinde her noktada her hücre için parlaklık emisyon değeri (L) elde etmek için özel bir yazılım ile hesaplanır. </li><li> Tüm fotonik emiss ekleyinTüm fotonik emisyonları içeren bir biyoışıldama görüntü elde etmek, özel bir yazılım kullanarak, permeabilization digitonin sonra elde edilenler dahil biyoışıldama görüntüleri, iyonlar. </li><li> Hesaplamalar için belirli bir yazılıma ilgi her bölge için fotonik emisyonların ihracat değerleri. Bunu yapmak için, her zaman her ROI için biyoparlaklık değerlerini hesaplamak için &#39;Grafik&#39; üzerine tıklayın. &#39;Toplam değeri&#39; seçin ve &#39;tüm görüntüleri mevcut yatırım getirisini kullanın. Basın &#39;hesapla&#39;. Bir çalışma sayfasına &#39;txt.file&#39; ve ihracat verileri kaydetmek. Her ROI için, [Ca 2 +] mit aşağıdaki algoritmayı kullanılarak hesaplanır: [Ca2 +] (M) = [R + (R · K TR) - 1] / [K R - (R · K R)]; burada, R = [L / (L toplam λ)] 1 / n L ilgi her bölgede ölçüm zamanında yayılan lüminesan olup. L toplamıdırÇevrede her bir bölgesi için ölçüm zamanında o anda dokusunda mevcut sayım eklenmesinden sonra kalan toplam lüminesans. λ, K TR K R ve n, değerleri aequorin kombinasyonuna bağlıdır (doğal tipte veya mutasyona uğramış) ile coelenterazin kullanılan (vahşi tip veya n tipi) sabitler yanı sıra kayıt sıcaklığı 16 bulunmaktadır. Burada kullanılan kombinasyon için 37 ºC&#39;de, (AEQ ve coelenterzine n mutasyona uğramış), aşağıdaki değerleri kullanılır: K R = 8.47 x 10 7, K TR = 165,6 x 10 3, n 1204 ve λ = 0.138 =. </li></ol></li><li> Uygun bir veri analizi kullanılarak her uyarıcıya yanıt olarak biyolüminesans artışların boyutunu tahmin ve yazılım grafik için ilgili hesaplamalar yapmak. </li></ol>

<ol>
	<li>Sattler, R., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+glutamate+receptor-mediated+excitotoxic+neuronal+cell+death.">Molecular mechanisms of glutamate receptor-mediated excitotoxic neuronal cell death.</a> Molecular Neurobiology. 24 (1-3), 107-129 (2001).</li><li>MacDermott, A. B., Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Smith, S. J., Barker, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA-receptor+activation+increases+cytoplasmic+calcium+concentration+in+cultured+spinal+cord+neurones.">NMDA-receptor activation increases cytoplasmic calcium concentration in cultured spinal cord neurones.</a> Nature. 321 (6069), 519-522 (1986).</li><li>Choi, D. W., Maulucci-Gedde, M., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+neurotoxicity+in+cortical+cell+culture.">Glutamate neurotoxicity in cortical cell culture.</a> The Journal of Neuroscience. 7 (2), 357-368 (1987).</li><li>Kure, S., Tominaga, T., Yoshimoto, T., Tada, K., Narisawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+triggers+internucleosomal+DNA+cleavage+in+neuronal+cells.">Glutamate triggers internucleosomal DNA cleavage in neuronal cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 39-45 (1991).</li><li>Calvo, M., Sanz-Blasco, S., Caballero, E., Villalobos, C., Nunez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+to+excitotoxicity+in+aged+hippocampal+cultures+and+neuroprotection+by+non-steroidal+anti-inflammatory+drugs:+role+of+mitochondrial+calcium.">Susceptibility to excitotoxicity in aged hippocampal cultures and neuroprotection by non-steroidal anti-inflammatory drugs: role of mitochondrial calcium.</a> Journal of Neurochemistry. 132 (4), 403-417 (2015).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+subunits+have+differential+roles+in+mediating+excitotoxic+neuronal+death+both+in+vitro+and+in+vivo.">NMDA receptor subunits have differential roles in mediating excitotoxic neuronal death both in vitro and in vivo.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (11), 2846-2857 (2007).</li><li>Zhou, M., Baudry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+NMDA+neurotoxicity+reflect+developmental+changes+in+subunit+composition+of+NMDA+receptors.">Developmental changes in NMDA neurotoxicity reflect developmental changes in subunit composition of NMDA receptors.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2956-2963 (2006).</li><li>Brewer, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+vulnerability+of+hippocampal+neurons+with+age+in+culture:+temporal+association+with+increases+in+NMDA+receptor+current,+NR2A+subunit+expression+and+recruitment+of+L-type+calcium+channels.">Increased vulnerability of hippocampal neurons with age in culture: temporal association with increases in NMDA receptor current, NR2A subunit expression and recruitment of L-type calcium channels.</a> Brain Research. 1151, 20-31 (2007).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+remodelling+and+disease.">Calcium signalling remodelling and disease.</a> Biochemical Society Transactions. 40 (2), 297-309 (2012).</li><li>Stout, A. K., Raphael, H. M., Kanterewicz, B. I., Klann, E., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate-induced+neuron+death+requires+mitochondrial+calcium+uptake.">Glutamate-induced neuron death requires mitochondrial calcium uptake.</a> Nature Neuroscience. 1 (5), 366-373 (1998).</li><li>Pivovarova, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+calcium+overload+in+a+subpopulation+of+mitochondria+triggers+delayed+death+in+hippocampal+neurons.">Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (24), 5611-5622 (2004).</li><li>Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Place+navigation+impaired+in+rats+with+hippocampal+lesions.">Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions.</a> Nature. 297 (5868), 681-683 (1982).</li><li>Geinisman, Y., Detoledo-Morrell, L., Morrell, F., Heller, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+markers+of+age-related+memory+dysfunction:+behavioral,+electrophysiological+and+morphological+perspectives.">Hippocampal markers of age-related memory dysfunction: behavioral, electrophysiological and morphological perspectives.</a> Progress in Neurobiology. 45 (3), 223-252 (1995).</li><li>Sodero, A. O., Weissmann, C., Ledesma, M. D., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+stress+from+excitatory+neurotransmission+contributes+to+cholesterol+loss+in+hippocampal+neurons+aging+in+vitro.">Cellular stress from excitatory neurotransmission contributes to cholesterol loss in hippocampal neurons aging in vitro.</a> Neurobiology of Aging. 32 (6), 1043-1053 (2011).</li><li>Brini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfected+aequorin+in+the+measurement+of+cytosolic+Ca2++concentration+([Ca2+]c).+A+critical+evaluation.">Transfected aequorin in the measurement of cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]c). A critical evaluation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (17), 9896-9903 (1995).</li><li>Villalobos, C., Alonso, M. T., Garc&#236;a-Sancho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+calcium+oscillations+inside+intracellular+organelles.">Bioluminescence imaging of calcium oscillations inside intracellular organelles.</a> Methods in Molecular Biology. 574, 203-214 (2009).</li><li>Villalobos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redistribution+of+Ca2++among+cytosol+and+organella+during+stimulation+of+bovine+chromaffin+cells.">Redistribution of Ca2+ among cytosol and organella during stimulation of bovine chromaffin cells.</a> FASEB Journal. 16, 343-353 (2002).</li><li>Rogers, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+local+Ca2++dynamics+with+genetically+encoded+bioluminescent+reporters.">Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters.</a> The European Journal of Neuroscience. 21 (3), 597-610 (2005).</li><li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM.">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> Journal of Visualized Experiments. (23), 1067 (2009).</li></ol>

None of the authors have competing interests or conflicting interests.

Yaşlanan beyinde hücre içi Ca 2+ yeniden şekillenmesi homeostasis bilişsel kaybı ile ilgili olmuştur, iskemik hasar, eksitotoksisite ve nörodejenerasyon yatkınlık artmıştır. In vitro bu hipotezi araştırmak için Ca 2+ görüntüleme prosedürleri mevcuttur. Ne yazık ki, eski hipokampal nöronlar uygulanabilir kültürleri güvenilir değildir. Son zamanlarda, bu gözlenmiştir olduğu sıçan hipokampal nöronlarının ROS birikimi lipofusin granüller, heterokromatik odakl...

Eksitotoksisite NOS&#39;nin, iskemi gibi nörolojik akıntılar nöronal hasar ve hücre ölümüne neden olan en önemli mekanizmalardan biri olduğu ve Alzheimer hastalığı 1 gibi nörodejeneratif hastalıklarda. Nörotoksisite Bu tip ağırlıklı Ca glutamat oyunculuk aracılık 2+ -geçirgen, İyonotropik NMDA reseptörleri (NMDAR) 2. Glutamata kültürlenmiş nöronların nöronal apoptoz 4 neden eksitotoksisite 3, yol açabilir. Biz ve diğerleri daha önce NMDA kaynaklı apoptosise nöronal açığı in vitro gelişimi ve 5-8 yaşlanma değişebilir bildirmişlerdir. Bu yaygın sitosolik içermeyen Ca2 + konsantrasyonu ([Ca2 +] cyt) &#39;de bir artış hücrelerin aktivasyonuna yol açtığı kabul edilmektedir. Bu artış çok yüksek ve / veya yeterince sürekli olduğu, ancak hücre ölümünü 9 tetikleyebilir. Ayrıca, önerilmiştirbu eksitotoksisite mitokondriyal Ca2 + alımı 10, glutamat ile indüklenen hücre ölümü 11 karşı mitokondriyal uncoupler korunan nöronlarla nöronları tedavi yana gerektirir. Mitokondri Ca 2 + çok fazla alırsan, mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözenek açılması sitokrom c ve diğer pro-apoptotik faktörlerin ve uyaran apoptoz serbest lider oluşabilir. Son zamanlarda bu mitokondriyal Ca 2 + alımı doğrudan doğruya tek bir hipokampal nöronlar 5 NMDA ile indüklenen Ca2 + mitokondriyal alımını bu makalede rapor bir yöntemi ölçülerek, nörotoksitisi yaşa bağlı duyarlılık ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Böyle öğrenme, hafıza ve diğer bilişsel süreçler 12 gibi fizyolojik süreçlerde yer hipokampus, yaşlanma ve nörodejeneratif hastalıkların 13 derece hassastır. Bu, in vitro olarak birkaç hafta sonra, ileri sürülmektedir, kültürlenmişhipokampal nöronlar yaşlı nöronlar 14 tipik özelliklerinden bir sayısını göstermektedir. Buna göre, uzun vadeli kültürlü hipokampal nöronlar yaşlanma gelişmiş eksitotoksisitenin Ca 2 + aracılı mekanizmalar araştırmak için kapsamlı bir model sağlayabilir. Sunulan yöntemin genel amacı, bu nedenle, uzun vadeli kültürlü hipokampal nöronlarda NMDA reseptör agonistleri tarafından ortaya çıkarılan diferansiyel Ca 2+ yanıtları da dahil olmak üzere yaşlanan beyinde hücre içi Ca 2 + homeostazı veya Ca 2+ yeniden önemli değişiklikleri araştırmak amacıyla, bir . Yöntem sırasıyla, sıçan hipokampal nöronların kültürü ayrıntılı bir açıklamasını ve bireysel nöronlar floresan ve biyolüminesans görüntüleme Sitozolik ve mitokondrial Ca 2 + konsantrasyonları izleme içerir. Kültürlü nöronlar sitozolik Ca 2 + floresan görüntüleme standart bir prosedürdür. Bununla birlikte, bu yöntem, alt için daha az güvenilirdirHücresel Ca mitokondriyal Ca 2 + 2 + olmak üzere ölçümleri. Bu nedenleri bile mM düzeyinde düşük mcM seviyesinden mitokondri değişebilir Ca 2 + konsantrasyonları için sentetik probların uygun hedefleme ve uygunsuz afinite eksikliği sayılabilir. Örneğin aequorin gibi proteinlere göre Ca 2 + prob kullanımı, hücre içi organellere hedef ve spesifik Ca 2+ bağlama siteleri 15 eksik farklı coelenterazines veya mutasyona uğramış problar kullanılarak farklı türevleri Ca 2 + eğilimleri kullanımına izin verdi. Bu şekilde, mitokondri hedefli Aequorini eksprese eden hücrelerin biyoışıldama görüntüleme bireysel nöronlar mitokondriyal Ca 2 + konsantrasyonlarının izlenmesini izin verebilir. Ancak, bu işlem biyoparlaklık görüntüleme 16-18 için foton sayma kameraları ya da ultrasensitif CCD kamera kullanımını gerektirebilir. Daha fazla establ teyit edilmelidir yeni sonuçlar doğurabilir Bu yöntemÖrneğin olarak ished beyin yaşlanması modelleri, eski hayvanlardan beyin dilimleri.

<table><tbody><tr><td>Neurobasal Culture Medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>HBSS medium</td><td>Gibco</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>Ham&#039;s F-12 medium</td><td>Gibco</td><td>31330-038</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (from bovine pancreas)</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bobine Serum</td><td>Lonza</td><td>DE14-801E</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-032</td><td></td></tr><tr><td>12 mm glass coverslips</td><td>Labolan</td><td>0111520/20012</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>LS003127</td><td></td></tr><tr><td>4-well multidish plaques</td><td>Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Petry dishes</td><td>JD Catalan s.l.</td><td>2120044T</td><td></td></tr><tr><td>Sterile pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>431030</td><td></td></tr><tr><td>Fura2-AM</td><td>Life Technologies</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Coelenterazine n</td><td>Biotium</td><td>BT-10115-2250 uG</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>NMDA</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>M3262</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert S100 TV microscope</td><td>Carl Zeiss Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xcite ilumination system</td><td>EXFO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA ER fluorescence camera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VIM photon counting CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VC-8 valve controller</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SH-27B heating system&amp;nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aquacosmos Software</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescence and bioluminescence imaging of subcellular ca2+ in aged hippocampal neurons

Nörodejenerasyon ve iskemi ilişkili nöron hücre ölümüne Duyarlılık fazlasıyla yaşlı beyinde artmış, ancak sorumlu mekanizmalar kötü bilinmektedir. Eksitotoksisite, her iki saldırılar ile uyarılan nöron hasarına katkıda bulunduğuna inanılan bir yöntem, Ca2 + akışını ve mitokondriyal Ca 2 + aşırı teşvik glutamat reseptörlerinin aktivasyonu aracılık eder. Hücre içi Ca 2 + homeostazı hücre içi Ca 2 + homeostasis veya yeniden yapılanmasında önemli bir değişiklik eski nöronlar nöron hasarı lehine olabilir. Yaşlanma Ca 2 + yeniden modellemenin araştınlması için in vivo nöronlar arası bazı yönleri benzer sıçan hipokampal nöronlarının uzun dönemli kültürlerde canlı hücre görüntüleme kullandık. Bu amaç için, hipokampal hücreleri ilk etapta, taze yeni doğmuş sıçan Hipokampuslardan gelen dağınık ve poli-D-lizin kaplı cam lamelleri kaplama vardır. Sonra kültürler birkaç gün boyunca kontrollü bir ortam içinde muhafaza veya W birçok edilirsırasıyla, genç ve yaşlı nöronların araştırılması için eeks. İkinci olarak, kültürlenmiş nöronlar fura2 ile yüklenir ve dijital fluoresan oranı görüntüleme kullanarak sitosolik Ca2 + konsantrasyonu ölçümlerine tabi tutulur. Üçüncü olarak, kültürlenmiş nöronlar mitokondri hedeflenen düşük meyil aequorin ve GFP bir tandem ifade eden plasmidler ile transfekte edilir. 24 saat sonra, hücre içinde aequorin koelenterazin ile yeniden ve nöronlar mitokondriyal Ca2 + konsantrasyonunun izlenmesi için biyolüminesans görüntüleme tabi tutulur. Bu üç adım prosedür, örneğin glutamat reseptör agonisti NMDA ve bu ve diğer cevaplar yaşlanma etkilenir olmadığı karşılaştırma gibi ilgili uyaranlara sitosolik ve mitokondriyal Ca 2 + tepkilerinin izlenmesine olanak sağlar. Bu prosedür nasıl etki sitozolik ve mitokondriyal Ca 2+ seçilen uyaranlara yanıtları yanı sıra nöron hücresi önlemeyi amaçlayan seçilen ilaçların test yaşlanma gibi yeni anlayışlar verebiliryaşla ilişkili hastalıklarda ölüme.

Burada Ca 2 + biçimlenme ve sitozolik ve mitokondriyal üzerindeki NMDA etkilerini değerlendirmek için basit bir yöntem tarif [Ca 2 +] yaşlı nöronlarda. Şekil 1 izole ve neonatal sıçanların hipokampal nöronlar kültürü için prosedürün şemasını göstermektedir. Başlamadan önce, steril, poli-D-lizin kaplı cam lamelleri hazırlamak ve 4-iyi bir çanak onları bulmak gerekir. Ardından, yenidoğan sıçanlar öldürüldü ve beyin kaldırılır. Hipokampus izole ...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons at JoVE.com

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Subselüler Ca Floresans ve Biyoparlaklık Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Yaşlı Hipokampal Nöronlar

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

fluorescence-bioluminescence-imaging-subcellular-ca2-aged-hippocampal

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

8.3K Görüntüleme.  Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas. Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging. 

Video: Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Hipotalamik Fare Beyin Dilimleri GFP etiketli Nöronlar in Görüntüleme Kalsiyum Cevapları

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Nörobilim

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These amyloid fibrils can sequester endogenous metastable proteins as well as components of the proteostasis network (PN) and thereby exacerbate protein misfolding in the cell. There are a limited number of tools available to assess the aggregation process of amyloid proteins within an animal. We present a protocol for fluorescence lifetime microscopy (FLIM) that allows monitoring as well as quantification of the amyloid fibrilization in specific cells, such as neurons, in a noninvasive manner and with the progression of aging and upon perturbation of the PN. FLIM is independent of the expression levels of the fluorophore and enables an analysis of the aggregation process without any further staining or bleaching. Fluorophores are quenched when they are in close vicinity of amyloid structures, which results in a decrease of the fluorescence lifetime. The quenching directly correlates with the aggregation of the amyloid protein. FLIM is a versatile technique that can be applied to compare the fibrilization process of different amyloid proteins, environmental stimuli, or genetic backgrounds in vivo in a non-invasive manner.

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Fluorescence lifetime imaging monitors, quantifies and distinguishes the aggregation tendencies of proteins in living, aging, and stressed C. elegans disease models.

Yaşlanma C. Floresan Yaşam Boyu Görüntüleme Kullanarak Elegans Amiloid Yapıların Karakterizasyonu

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...

Biyokimya

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from subcellular to network levels and at temporal scales from milliseconds to weeks. In addition, two-photon imaging can be combined with a variety of behavioral tasks to explore the causal relationships between brain function and behavior. However, in mammals, limited penetration and scattering of light have limited two-photon intravital imaging mostly to superficial brain regions, thus precluding longitudinal investigation of deep-brain areas such as the hippocampus. The hippocampus is involved in spatial navigation and episodic memory and is a long-standing model used to study cellular as well as cognitive processes important for learning and recall, both in health and disease. Here, a preparation that enables chronic optical access to the dorsal hippocampus in living mice is detailed. This preparation can be combined with two-photon optical imaging at cellular and subcellular resolution in head fixed, anesthetized live mice over several weeks. These techniques enable repeated imaging of neuronal structure or activity-evoked plasticity in tens to hundreds of neurons in the dorsal hippocampal CA1. Furthermore, this chronic preparation can be used in combination with other techniques such as micro-endoscopy, head-mounted wide field microscopy or three-photon microscopy, thus greatly expanding the toolbox to study cellular and network processes involved in learning and memory.

This method describes a chronic preparation that allows optical access to the hippocampus of living mice. This preparation can be used to perform longitudinal optical imaging of neuronal structural plasticity and activity-evoked cellular plasticity over a period of several weeks.

Canlı fareler içinde dorsal hipokampal CA1 uzunlamasına Iki foton görüntüleme

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

Davranış

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

Xenopus laevis'te Nöronal Öncül Karakterizasyonu için Floresan Kalsiyum Görüntüleme ve Daha Sonra Yerinde Hibridizasyon

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Gelişim Biyolojisi

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high spatial and temporal resolution. Combined with electrophysiology, it is widely used to study activity-related calcium signals in small subcellular compartments such as dendrites and dendritic spines. In addition to calcium transients, synaptic activity also induces postsynaptic sodium signals, the properties of which are only marginally understood. Here, we describe a method for combined whole-cell patch-clamp and multi-photon sodium imaging in cellular micro domains of central neurons. Furthermore, we introduce a modified procedure for ultra-violet (UV)-light-induced uncaging of glutamate, which allows reliable and focal activation of glutamate receptors in the tissue. To this end, whole-cell recordings were performed on Cornu Ammonis subdivision 1 (CA1) pyramidal neurons in acute tissue slices of the mouse hippocampus. Neurons were filled with the sodium-sensitive fluorescent dye SBFI through the patch-pipette, and multi-photon excitation of SBFI enabled the visualization of dendrites and adjacent spines. To establish UV-induced focal uncaging, several parameters including light intensity, volume affected by the UV uncaging beam, positioning of the beam as well as concentration of the caged compound were tested and optimized. Our results show that local perfusion with caged glutamate (MNI-Glutamate) and its focal UV-uncaging result in inward currents and sodium transients in dendrites and spines. Time course and amplitude of both inward currents and sodium signals correlate with the duration of the uncaging pulse. Furthermore, our results show that intracellular sodium signals are blocked in the presence of blockers for ionotropic glutamate receptors, demonstrating that they are mediated by sodium influx though this pathway. In summary, our method provides a reliable tool for the investigation of intracellular sodium signals induced by focal receptor activation in intact brain tissue.

We describe the combination of focal UV-induced photo-activation of neuro-active compounds with whole-cell patch-clamp and multi-photon imaging of intracellular sodium transients in dendrites and spines of hippocampal neurons in acute tissue slices of the mouse brain.

Çoklu foton İntrasellüler Sodyum Görüntüleme CA1 piramidal Nöronlar Glutamatın UV-aracılı Odak uncaging ile birlikte

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

Bioluminescent Kalsiyum Göstergesi GFP-aequorin dayanarak Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşım

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

Amiyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Subselüler Ca Floresans ve Biyoparlaklık Görüntüleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler