Bu proje Ulusal Sağlık Enstitüleri (5 P20 RR016461 ve 8 P20 GM103499) hibe tarafından desteklenen, Ulusal Bilim Vakfı (EPS-0903795). Furman Üniversitesi Araştırma ve Mesleki Büyüme ve Furman Avantajı ödülleri tarafından sağlanan fazla destek.

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu önerileri ile tam uyum içinde yürütülmüştür. Hayvan protokolü Furman Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (: A3242-01 İzni numarası) tarafından onaylanmıştır. Kullanılan tamponlar Tamponlar ve Çözümleri Tablo bulunabilir yaparken bu protokolde kullanılan tüm malzemeler ve ekipmanlar, Malzeme ve Ekipmanları Tablo bulunabilir. Fare dalaklarından Lenfositler 1. Tek Hücre Süspansiyon <ol><li> CO 2 boğulma yoluyla fareler Kurban. Servikal dislokasyon ile ötenazi onaylayın. Not: Aynı cinsiyetten (örneğin / 6 C57B) iki 6-8 haftalık izojenik farelerden alınan dalak kullanın. Tipik olarak, iki dalak işlenir. </li><li> Bolca% 70 etanol çözeltisi ve baş sola dönük öyle ki şark hayvanları püskürtün. </li><li> Forseps kullanarak, yukarı ve uzağa t hayvanın derisini kaldırınO beden. Makas kullanarak, hayvanın karın yakın deri yoluyla küçük bir çentik kesti. Parmaklarınızı kullanarak, arka ayakları başından boyundan periton maruz çentik her tarafını çekin. Dalak periton altında doğrudan görünür olmalıdır. </li><li> Forseps kullanarak, periton kaldırın ve dalak maruz küçük bir kesi yapmak. Forseps ile dalak çıkarın ve herhangi bir yağ ve bağ dokusu uzak kızdırmak için makas kullanın. </li><li> % 2 fetal sığır serumu ile takviye edilmiş 10 ml PBS içeren 50 ml&#39;lik bir konik tüp içine dalak yerleştirin (bundan sonra PBS + 2% &#39;si adlandırılır). Tek hücre süspansiyonu başlamak için hazır olana kadar buz üzerinde tüp tutun. Not: tipik geri kazanım dalak başına milyon 60-90 arasındaki hücreleri, ve tipik olarak, 2.000.000 hücre numune başına ihtiyaç vardır. Bir doku kültürü kaputu aşağıdaki tüm adımları gerçekleştirir. </li><li> Steril 100 mm doku kültürü çanak içine dalak süzün. </li><li> T iki buzlu mikroskop slaytlar elde edilir ve basılı tutuniki kaba buzlu yüzeyler birbirlerine karşı içe bakacak şekilde o slaytlar. PBS +% 2 çözeltisi içinde slaytlar Islak petri tabak içine dökülmüştür. </li><li> Hala batık kenarları, kızakların buzlu yüzeyleri arasındaki dalak tutun ve birbirlerine (Şekil 1A) karşı ileri ve geri slaytlar hareket ettirerek yavaşça dalak öğütmek. Hücreler Petri kabı içine düşecek. Tüm hücreleri serbest ve dalak kalıntıları (Şekil 1B) beyaz görünür edilene kadar taşlama devam edin. </li><li> Bir pipet hücre süspansiyonu çizin ve yeni bir steril 50 ml konik tüp içine 70 mikron filtre ile yavaşça filtre. Kırmızı hamurun küçük parçalar filtresi (Şekil 2A) üzerinde mevcut olacağını not edin. <ol><li> Filtre yükselir, hafifçe gerekli bu süreci tekrarlayarak, sıvı süzülmesini ve 50 ml konik tüp içine geri filtreyi yerleştirin ve devam etmesi için hafifçe yukarı kaldırın. Fazla 5 sple işleme durumundaens, bu iki grup halinde bölmek ve her biri için yeni bir filtre kullanmak gerekli olabilir. </li></ol></li><li> 3 ml şırınga durdurucu kısmı kullanılarak yavaşça süzgeç (Şekil 2B) üzerinden kalan hücrelerin içeren kırmızı bir hamuru basın. Tüm kırmızı pulpa filtresi (Şekil 2C) geçti emin olmak için filtre alt ve yanları hem de basın emin olun. </li><li> Doku kültürü çanak 10 mlof PBS +% 2 ekleyin ve kalan hücrelerin kurtarmak için slaytlar, şırınga tıpa ve çanak yıkamak için kullanabilirsiniz. 50 ml konik tüp içine aynı 70 mikron hücre süzgecinden bu geçirin. Bu adımı Gerektiği kadar tekrarlayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de filtre hücre süspansiyonu santrifüj. </li><li> Yavaşça süzün ve atın süpernatant dikkatli değil pelet rahatsız. PBS +% 2 eser miktarda bir tüp içinde kalır. Tüp Cap ve pelet tamamen yeniden süspanse kadar pelet fiske. </li><li> Reklama göre Lyse kırmızı kan hücreleriACK Liziz Tamponu Ding 2 mL (0.15 M NH4CI, 1 mM KHCO 3, 0,1 mM EDTA, 4 ° C &#39;de 7.2, mağaza pH) konik tüp dalak başına döndürmek ve sağlamak için tüp ters tüm hücrelerin ACK tamponu ile temas durumuna gelir. Yavaşça oda sıcaklığında 1 dakika boyunca girdap tüp. </li><li> PBS +% 2 ACK tamponu nötralize etmek için tüp ekleyerek 50 ml hücre süspansiyonu hacmi getirin. 4 ° C&#39;de 300 x g&#39;de 5 dakika boyunca tüpü 10 kez ve santrifüj ters çevirin. Santrifüj işlemi tamamlandıktan sonra, pelet, beyaz (Şekil 3) az olmalıdır. </li><li> Yavaşça süzün ve atın süpernatant dikkatli değil pelet rahatsız. , Tüp içinde PBS +% 2 eser miktarda bırakın tüp kap, ve onu tekrar süspansiyon pelet fiske. </li><li> T hücre ortamı [% 10 FBS, 10 mM HEPES (pH 7.0), 2 mM Glutamax, 1 mM sodyum piruvat, 1 x temel olmayan amino asitler, 1 x penisilin / streptomisin ve 50 mM β-merkaptoetanol] ve ayrıca 10 ml ekleme nazikçe tarafından pelletiniYukarı ve aşağı pipetleme. Sonra yeni 50 ml konik tüp içine yeni bir 70 mikron filtre ile süspansiyon filtre. </li><li> Orijinal tüp durulayın ve filtre hücrelerin geri kalanını içeren tüp içine 70 mikron filtre ile bu geçmek için T hücre medya başka bir 5-10 ml kullanın. Ikiden fazla dalak işleme durumunda, T-hücresi ortamı hacmi geri kazanımı maksimize etmek arttırılabilir. </li><li> Hazır boyanmış olması kadar buz üzerinde hücreleri tutun. Hücreler sayıldı ve canlılığı erişilebilir olmalıdır. <ol><li> Hücreleri saymak için, 24 PBS +% 2 ilave edildi ve 3 ml 0.4% tripan mavisi ile hücrelerin 3 ml birleştirir. Yük, gelişmiş bir Neubauer hemasitometre Her hazne içine bu 10 mi. Tripan mavisi eksklüzyonu ile değerlendirilen Canlılık,% 85-95 arasında, tipik olarak. </li></ol></li></ol> 2. Canlılık ve Yüzey Boyama <ol><li> 4 ° C&#39;de 300 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüjleme ile pellet hücreleri. 1 x 10 7 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyona kadar, T hücresi ortam içinde tekrar süspansiyon hücreleri. TransfU-altlı 96-gözlü doku kültür plakasının bir oyuğuna er 2.000.000 hücreleri (100 mi). </li><li> 4 ° C&#39;de 300 x g&#39;de 10 dakika boyunca 96-kuyu plaka santrifüjleyin. </li><li> Iyi lavabonun içine plaka içindeki sıvıyı iterek her süpernatantı (hücre pelet kuyuda kalır) ve temiz bir kağıt havlu üzerine plakayı dabbing. 200 ul PBS içinde yeniden süspanse bunların hücreleri yıkayın 4 ° C &#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile takip etti. Aksi belirtilmedikçe tüm yıkar bu şekilde gerçekleştirin. Not: düzeltilebilir PI leke engel olacak şekilde PBS +% 2 kullanmayınız. </li><li> Plaka hafifçe vurarak Süpernatantı ve her kuyuya taze hazırlanmış ticari leke (örneğin, düzeltilebilir kırmızı ölü hücre leke) 100 ml ekleyin. <ol><li> PBS içinde 1:10 seyreltilmiştir DMSO içinde reaktif boya stok çözeltisi 1:10 seyreltilmesiyle leke sağlayın. Işıktan koruyarak 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin plaka. </li></ol></li><li> P santrifüjGeç 4 ° C&#39;de 300 x g&#39;de 10 dakika süre ile. Ileri Bu noktada, kapalı doku kültürü kaput ışığı ile plaka ile tüm çalışmaları gerçekleştirmek. </li><li> Plaka hafifçe vurarak Süpernatantı ve sonra Fc blok çözeltisi 100 ml ekleyin. Fc blok stok çözelti 1 seyreltilmesi ile Fc blok çözüm olun: PBS içinde 100. </li><li> Seyreltik antikorlar, PBS içinde yüzeyi boyama (örneğin, anti-CD4 veya anti-CD8) kullanılmış ve her bir oyuğa 100 ml ilave edilmesi. Işıktan korunan 4 ° C &#39;de 30 dakika süre ile 96 oyuklu plaka inkübe edin. Not: Yüzey leke antikorları en iyi performans için titre edilmelidir. Üreticinin protokolü, 400 seyreltme: 200 ya da 1: Tipik haliyle, bir 1 kullanılır. </li></ol> Histon H3 3. Hücre içi Boyama <ol><li> Yüzey leke inkübe edildikten sonra, PBS içinde iki kere yıkama hücreleri. </li><li> Son yıkamadan sonra, her bir göze% 4 paraformaldehit içinde 100 ul ilave edin. Oda sıcaklığında 5 dakika için 96 oyuklu plaka inkübe edin. Olduğu zaman dilüe olabilme tarafından% 4 paraformaldehid olunPBS içinde% 16 paraformaldehit ing. Bu taze olun. </li><li> PBS içinde iki kere hücreleri yıkayın. </li><li> Perm / blokaj çözeltisi Yap (stok Perm çözeltisi PBS +% 2 civarında,% 0.02 Triton X-100, mağaza, 4 ° C) 100 ml stok Perm solüsyonu için normal tavşan serumu 2 ml karıştırılarak hazırlanır. 60 ml / numune için yeterli olun. </li><li> Hafifçe kabarcıklar yapmamaya özen, aşağı yukarı pipetleme iyi de her bir örnek için 40 ml Perm / Blok ekleyin ve karıştırın. Karanlıkta 45 dakika boyunca oda sıcaklığında plaka inkübe edin. Adım 3.6 Perm / Blok kalan kaydedin. </li><li> Aşama 3.5 ayrılmış Perm / Blok çözeltisi içinde floresan konjuge Histon H3K4me1 antikor seyreltilir ve her oyuğa, bu seyreltme 10 ul ekle. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. 4 ° C&#39;de 1 saat boyunca karanlıkta 96 oyuklu plaka inkübe edin. Not: Üreticinin talimatları izleyerek R-Fikoeritrin çekimi kiti kullanılarak konjuge bir H3K4me1 antikor kullanın. </li><li> Iki kez PBS +% 2 hücreleri yıkayın. </li><li> 200 hücrelerin yeniden süspansePBS +% 2 ul akış sitometri analizi için FACS tüpler örnekleri aktarın. Numuneler, karanlıkta 4 ° C&#39;de saklanabilir. Optimal sonuçlar için iki gün içinde numuneleri analiz. Tekli boyanan numuneler tazminat kontrol akış sitometrisi olarak kullanılabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Bravo-Ferrada, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+surface+damage+on+cell+envelope+assesed+by+afm+and+flow+cytometry+of+lactobacillus+plantarum+exposed+to+ethanol+and+dehydration.">Study of surface damage on cell envelope assesed by afm and flow cytometry of lactobacillus plantarum exposed to ethanol and dehydration.</a> J Appl Microbiol. , (2015).</li><li>Agola, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Bead-Based+Flow+Cytometry+for+Assaying+Rab7+GTPase+Interaction+with+the+Rab-Interacting+Lysosomal+Protein+(RILP)+Effector+Protein.">Quantitative Bead-Based Flow Cytometry for Assaying Rab7 GTPase Interaction with the Rab-Interacting Lysosomal Protein (RILP) Effector Protein.</a> Methods Mol Biol. 1298, 331-354 (2015).</li><li>Toh, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+flow+cytometry+to+analyze+intracellular+location+and+trafficking+of+cargo+in+cell+populations.">Application of flow cytometry to analyze intracellular location and trafficking of cargo in cell populations.</a> Methods Mol Biol. 1270, 227-238 (2015).</li><li>Rawlings, J. S., Gatzka, M., Thomas, P. G., Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+condensation+via+the+condensin+II+complex+is+required+for+peripheral+T-cell+quiescence.">Chromatin condensation via the condensin II complex is required for peripheral T-cell quiescence.</a> EMBO J. 30, 263-276 (2011).</li><li>Lee, M. D., Bingham, K. N., Mitchell, T. Y., Meredith, J. L., Rawlings, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+mobilization+is+both+required+and+sufficient+for+initiating+chromatin+decondensation+during+activation+of+peripheral+T-cells.">Calcium mobilization is both required and sufficient for initiating chromatin decondensation during activation of peripheral T-cells.</a> Mol Immunol. 63, 540-549 (2015).</li><li>Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental immunology. , (2013).</li><li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+in+lymphocyte+activation+and+disease.">Calcium signalling in lymphocyte activation and disease.</a> Nat Rev Immunol. 7, 690-702 (2007).</li><li>Isakov, N., Altman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C(theta)+in+T+cell+activation.">Protein kinase C(theta) in T cell activation.</a> Annu Rev Immunol. 20, 761-794 (2002).</li><li>Macian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NFAT+proteins:+key+regulators+of+T-cell+development+and+function.">NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function.</a> Nat Rev Immunol. 5, 472-484 (2005).</li><li>Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+by+calcium,+calcineurin+and+NFAT.">Transcriptional regulation by calcium, calcineurin and NFAT.</a> Genes Dev. 17, 2205-2232 (2003).</li><li>Rawlings, J. S., Rosler, K. M., Harrison, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK/STAT+signaling+pathway.">The JAK/STAT signaling pathway.</a> J Cell Sci. 117, 1281-1283 (2004).</li><li>Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STATs:+signal+transducers+and+activators+of+transcription.">STATs: signal transducers and activators of transcription.</a> Cell. 84, 331-334 (1996).</li><li>Moriggl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stat5+is+required+for+IL-2-induced+cell+cycle+progression+of+peripheral+T+cells.">Stat5 is required for IL-2-induced cell cycle progression of peripheral T cells.</a> Immunity. 10, 249-259 (1999).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını var olduğunu beyan ederiz.

Biz T hücrelerinde kromatin yoğunlaşması değerlendirilmesi için izin veren bir protokol geliştirmiştir. Bu Histon H3 antikorlar saf hücrelerde kolaylıkla kendi epitoplarını erişemez basit bir gözleme dayanır fakat T hücresi aktivasyonu üzerine, bu aynı antikorlar epitoplara bağlanan edebiliyoruz. Tedavi grupları arasında MFI Histon H3 lekelenmesini karşılaştırarak, yoğunlaşma veya yoğunlaşması nispi derecede tespit edilebilir. Biz timosit geliştirme sırasında ve T hücre aktivasyonu 4 sırasında göreceli yoğunlaşma durumunu belirlemek için bu protokolü kullanılır. Biz de Dekondenzasyon sürecini 5 kontrol mekanizmaları araştırmak için bu protokolü kullanılır. Bu protokol, kromatin kondensasyonu durumunu tespit etmek için bir histon H3 antikoru kullanımına dayanır. T hücresi aktivasyonu 4 boyunca histon modifikasyon hiçbir genel değişiklik olduğundan, kromatin değerlendirmek için H3K4me1 antikor kullanabilmektedirlerBu protokolde durum. Biz değiştirilmemiş histon H3 karşı ortaya antikorlar kullandık; Ancak, üretilen sinyal çok daha zayıf genel oldu. Değiştirilmemiş histon H3 karşı antikorlar Western blot daha iyi çalışırken bizim deneyim, modifiye Histone H3 karşı yükseltilmiş antikorlar, immünofloresan daha iyi çalışması ve sitometri deneyleri akış. Biz bu teşebbüs değil, her ne kadar diğer histon proteinlere karşı antikorların kullanımı mümkün olduğuna dikkat edilmelidir. Perm / Blok ve Histone H3 antikor adımlar protokolde en kritik adımlar. Kullanılan Perm / Blok çözeltisi miktarı hazır Perm çözeltisi yapılan her optimize edilmesi gerekmektedir. Bu stok çözeltinin farklı yoğunluktaki performansının karşılaştırılması ile yapılabilir. Tipik bir deneyde, 3 saat (Şekil 4) aktive kişilerce naiv T hücrelerinde kromatin durumunu karşılaştırılmasını içerir. Bir aşkın MFI en büyük değişiklik üreten seyreltme seçmelisinizsüre analiz. Stok çözeltisi, birinci aşamada 3,5 Perm / Block ilave o zaman adım 3,4 sonrasında kadar 100 ml olarak PBS +% 2 içinde yeniden süspansiyona tarafından Perm / Blok gücünü azaltmak için PBS +% 2 seyreltilebilir. Benzer bir deney, bir pilot floresan konjuge Histon H3 antikoru, antikorun, bir yeni bir parti etiketli her defasında farklı bir dilüsyonları test etmek için kullanılır. Bu adımlar (aktivasyon 3 saat içerisinde, örneğin) ilk T hücresi aktivasyonunda kondansasyon farklılıkların başarılı bir şekilde saptanması için özellikle kritiktir. Bazen, Histon H3 antikoru ile leke yapmaz dolayısıyla permeabilize olsun ve do not hücreler vardır. Bu Perm / Blok eklerken hücreleri de yeniden süspanse değilse ne ya edebilir Perm / Blok yeterince güçlü değilse. Bu hücreler histon H3 boyanma bir histogram görüntülenmesi sırasında eksene karşı bastırdı olaylar gibi görünecektir. Genel MFI çarpık olacak bu olaylar bu yana, bu olaylar gatin tarafından analiz ihmal edilebilirg histon H3 pozitif hücrelerin normal dağılım. Ek destek Sorun Giderme Kılavuzu (Tablo 1) bulunabilir. Bir tamir edilebilir ölü hücre leke dahil tahlilinde hücre canlılığının değerlendirmesi için olanak sağlar. Bazı uyaranlara hücre ölümüne neden olabilir, çünkü T hücresi aktivasyonunu manipüle bu derece önemlidir. Böyle bir durumda, histon H3 antikoru sonuçlarının yanlış yorumlanmasına yol canlı hücrelere göre farklı ölü hücreleri histonlar bağlanabilir. Bu protokol, kromatin durum yüksek bir verim analizine izin, 96 kuyucuklu bir plaka biçiminde kullanım için tasarlanmıştır. 6-8 haftalık dişi fareden bir dalak genellikle protokolü kullanılarak milyon 60-90 arası hücreleri verecektir. Boyama protokolü örnek başına 2.000.000 hücre gerektirdiğinden, kolayca tek bir 96-çukurlu plaka tek bir dalak üç kopya halinde birden fazla tedavi grupları ve zaman noktaları test edilebilir. Bu p mümkündürörnek başına daha az hücreleri ile protokol ERFORM; Bununla birlikte, bağlı santrifüj adımları sayısı ve bu adımların her biri hücrelerin doğal kaybı, çok hücrelerin sayısını azaltmak için tavsiye edilmez. Biz başarıyla numune başına 1.000.000 hücreleri ile protokol tamamladık. Bu CD4 + T yardımcı hücreleri ve CD8 + sitotoksik T-hücrelerinde, kromatin durumunu incelemek için bu protokolü kullanılır. Protokol standardı bir yüzey boyama dahildir, bu mümkün olmaktadır. Protokolü kolay popülasyon spesifik yüzey belirteçleri karşı antikorlar kullanılarak, diğer lenfosit alt bölgesindeki kromatin incelenmesi için adapte edilebilir. Bu protokol, aynı zamanda kolayca ilgili yüzey belirteçleri tanıyan antikorlar sürece diğer hücre türleri için kullanılabilir ve uygun sabitleme / permeabilizasyon koşulları bilinmektedir olan uyarlanabilir.

Akış sitometri hücre popülasyonlarında birden fazla fiziksel ve floresan parametre analizi için geliştirilmiş bir lazer tabanlı bir teknolojidir. Bu teknoloji ile ilgili veya hücre içindeki sıvı karşılaşma akımında süspanse hücreler olarak bir lazer, heyecan verici bir floresan markör çalışır. Bu işaretler daha sonra tespit edilir ve foto-çoklayıcı tup ile belirlenir ışık yayar. Akış sitometrisi, geleneksel hücre popülasyonları tanımlamak için kullanılmış olsa da, bu, hücre zarı bütünlüğünün, protein-protein etkileşimleri ve protein değiş 1-3 dahil olmak üzere hücre özelliklerinin bir dizi incelenirken yararlı bir teknoloji olduğu kanıtlanmıştır. Bu teknolojisi, in vitro 4&#39;te aktive T hücrelerinde kromatin durumunu tespit etmek için kullanılabilir sağlayan bir protokol geliştirilmiştir. Ayrıca T hücrelerinin 5 aktivasyonu ile uyarılan kromatin yoğunlaşması mekanizmasını araştırmak için bu protokolü kullanılır. T hücresi activation ve proliferasyonu uygun bir immün tepkisi için kritik öneme sahiptir. T hücreleri, bağışıklık sistemi içinde lenfositlerin belirli bir alt grubu, uygun bağışıklık tepkilerinin ve immünolojik hafızanın geliştirilmesi için gereklidir. Bir antijen (6 gözden) hareketsiz T hücrelerinin hücre dışı yüzeyinde yer alan, T hücre reseptörünün (TCR), başlıca uyumluluk kompleksi içinde mevcut olduğunda Aktivasyon başlatılır. Bu hücre içi Ca2 + konsantrasyonu 7 ve (8-10 gözden) aktivasyonu için gerekli transkripsiyon faktörlerinin nükleer translokasyonunun bir artışa sonuçlanan T hücreleri içinde, dinamik ve çok düzenli moleküler olaylar dizisi tetikler. Bir kez, T hücreleri, interlökin-2 (IL-2), JAK (Janus Kinaz) / STAT kullanan güçlü bir büyüme faktörü yanıt yeteneği kazandırmak aktif (sinyal ileticisi ve bir aktivatör) yolu aktive T klonal proliferasyonunu tahrik etmek Hücreler 11. Kısaca, IL-2 ile uyarılması,STAT proteinleri latent sitosolik transkripsiyon faktörü ailesinin bir fosforilasyon ile sonuçlanır. Fosforile sonra STAT proteinleri dimerize, nükleuslar transloke edilebilir ve hücre döngüsü ilerlemesinde yer de dahil olmak üzere gen ekspresyonunu tahrik. T hücrelerinde, T hücre çoğalması için gerekli olan 12,13 STAT5 yoluyla, IL-2 sinyaller. Aktive edilmiş T hücrelerinin klonal genişlemesini sağlamak için, antijen TCR nişan (naif T hücreleri) yaşamamış bu hücrelerin, IL-2 için güçlü etkileri göz ardı etmek için bir mekanizma olmalıdır. Bu kromatin durumunun düzenlenmesi yoluyla elde edilir. Saf T hücreleri, IL-2 bir uyarıya yanıt olarak STAT5 DNA nişan yasaklayan bir yoğunlaştırılmış kromatin sahiptirler. Aktivasyonu üzerine, kromatin decondenses ve STAT5 klonal proliferasyonunu 4 izin hedef genlerin promotörleri erişebilir. İlginç bir şekilde, kromatin durumundaki bu değişiklik histon protein, epigenetik modifikasyonu bağımlı değildirns (inceleme için, 14 bakınız) Ayrıca T-hücresi aktivasyonu sırasında 4 histon modifikasyonu hiçbir genel bir değişiklik görüldüğü gibi. Bu çalışmaları gerçekleştirirken, biz histon proteinlerine karşı yükseltilmiş antikorlar da naif hücrelerde kendi epitopları erişim zorluk olduğunu keşfetti, ama aktivasyon üzerine bu daha kolay kendi epitopları 4 bağlamak olabilir. Bu nedenle, histon, antikor kromatin yoğunlaşması durum için bir okuma olarak hizmet vermektedir. Burada yöntem, T hücrelerinin kromatin durumunu değerlendirmek için floresan konjuge Histon H3 antikorları tespit etmek için akış sitometrisi kullanımı sunulmaktadır. Bir hücre popülasyonunda kromatin kondensasyonu Histon H3 boyama ortalama florasan yoğunluğu (MFI) olarak ölçülür. Kromatin dekondenzasyon anlamına T hücresi aktivasyonu, Histone H3 boyama artar MFI, bağlamında. Hücre içi Histon H3 boyama ile kromatin durumunu ölçülmesine ek olarak, bu protokol, aynı zamanda incorporates hücre alt popülasyonlarının analizini izin, boyama ve canlı hücreler için bir fixable leke yüzey.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:584px;" width="585">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">100mm tissue culture dish</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Precleaned frosted microscope slides</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sterile cell strainer, 70mm nylon mesh</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">3mL syringe, Luer-Lok tip</td>
			<td style="width:83px;">BD</td>
			<td>309585</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Falcon 50mL polypropylene conical tube</td>
			<td style="width:83px;">Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">LIVE/DEAD fixable red dead cell stain kit</td>
			<td style="width:83px;">Life Technologies</td>
			<td>L23102</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies sells versions of this kit with different colors</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Fc Block</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:83px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Normal rabbit serum</td>
			<td style="width:83px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R9133</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Anti-H3K4me1 antibody</td>
			<td style="width:83px;">Abcam</td>
			<td>ab8895</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">R-Phycoerythrin conjugation kit</td>
			<td style="width:83px;">Abcam</td>
			<td>ab102919</td>
			<td style="width:167px;">Alternatively, the LYNX rapid RPE kit from AbD Serotec can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of flow cytometry to assess the state of chromatin in t cells

Uygun bir immün tepkisi sırasında hareketsiz T hücrelerinin, antijen-spesifik T hücre reseptörü antijen sunma üzerine aktive olmaktadır. Bu antijeni tanıyan bir reseptör taşıyan yalnızca T hücrelerinin klonal bir çoğalmaya neden olur. Kromatin Dekondenzasyon T hücre aktivasyonunun bir özelliğidir ve T hücreleri antijen nişan sonra çoğalmaya yeteneği kazanmak için gereklidir. Kromatin yoğunlaşması bu değişiklik, histon proteinlere karşı antikorlar kullanılarak tespit edilebilir. Bu antikorlar aktive T hücreleri yanı olabildiğince naif T hücrelerinin kendi epitoplara bağlanan olamaz. Biz aynı anda fixable ölü hücre leke T hücre-spesifik yüzey belirteçleri, parça canlılığını leke ve Histone H3 proteinlerinin hücre içi boyama yoluyla kromatin durumunu ölçmek için nasıl açıklar. Boyanmış hücreler akış sitometrisi ile analiz edilir ve kromatin kondensasyonu durumu Histon H3 leke ortalama floresan yoğunluğu (MFI) olarak ölçülür. ChromatT hücresi aktivasyonu sırasında yoğunlaşması olarak MFI bir artış olarak gösterilmiştir

Bir C57B / 6 fare lenfositler protokole göre tek bir hücre süspansiyonu içine işlenmiş ve standart bir hemasitometre kullanılarak sayıldı. Hücreler 2 x 10 T-hücresi ortamında, 6 / ml 15 ml&#39;lik üç kopya halinde konik tüpler tohumlandı ve tedavi edilmezse, ya da 37 ° C &#39;de 3 saat boyunca 1 mg / ml çözünür anti-CD3 antikorları (klon 4C11) ile uyarıldı standart bir doku kültürü kuluçka makinesine kondu. Ölü hücreler boyandı ve daha sonra hücreler, daha sonra protokole göre FITC CD8 ve CD4 APC-antikorları kullanılarak boyandı sathı edildi. Histone erişilebilirlik akış sitometri (Şekil 4) ile analiz edilmiştir. Her iki naif CD4 + ve CD8 + T hücreleri, ortalama floresan yoğunluğu (MFI) bir yoğunlaştırılmış kromatin durumunu gösteren, düşüktür. Hücreler, anti-CD3 ile aktif hale zamanda kromatin yoğunluğu azaltılmış olduğunu göstermektedir (p &lt;0.001, Student t-testi) belirgin bir MFI artar antikorlar. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig1.jpg" /> Buzlu mikroskop slaytlar kullanarak tek bir hücre süspansiyonu içine dalak işlemek için Şekil 1. Tekniği. (A) dalak iki mikroskop slaytlar buzlu yüzeylerde bastırılır. (B) slaytlar dalak kalıntıları beyaz olana kadar 100 mm Petri kabı içine ileri geri birbirlerine serbest lenfositler karşı taşınır. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53533/53533fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53533/53533fig2.jpg" /> Bir dalak sonra kalan 70 mm&#39;lik hücre süzgecinden kırmızı hamuru kalan basın bir şırınga tıpa kullanılması Şekil 2. (A). Kırmızı hamuru i<html> tek bir hücre süspansiyonu içine işlenir ve 70 mm&#39;lik bir hücre süzgecinden geçirildi s. (B) 3 ml&#39;lik şırınga durdurucu kısmı hafifçe hücre süzgecinden kırmızı hamuru kalan basın için kullanılır. (C) şırınga kullandıktan sonra, neredeyse hücre süzgecinden sol hiçbir kırmızı hamuru olmamalıdır. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53533/53533fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53533/53533fig3.jpg" /> Kırmızı kan hücrelerinin Şekil 3. ACK lisiz. Lizizi ACK önce tek bir fare dalak oluşturulan tek bir hücre süspansiyonu (A) Santrifüj. (B), kırmızı kan hücrelerinin lize ACK sonra hücre topağı beyaz olmalıdır.= &quot;_ blank&quot; olsun&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53533/53533fig4.jpg" /> Şekil protokolünün 4. Temsilcisi sonuçları. (A) Ayırıcı şeması CD4 + T lenfositleri kromatin durumunu analiz etmek için kullanılır. (B ve C) T hücreleri tedavi edilmediği ya da (üç kopya halinde), 3 saat boyunca 1 mg / ml çözünebilir anti-CD3 antikorları ile aktive edildi. Hücreler daha sonra CD4 + hücreleri (B) ve CD8 + hücreleri (C) kromatin yoğunlaşması belirlemek için akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. Veri H3K4me1 boyamanın ortalama floresan yoğunluğu Standart Sapma ± araçlardır. * p &lt;0.001 (Öğrenci t testi) <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53533/53533fig4large.jpg" target="_blank">h tıklayınız</a>ere bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için. <img alt="tablo 1" src="/files/ftp_upload/53533/53533table1.jpg" /> Tablo 1:. Sorun Giderme Kılavuzu ortak sorunları ve olası çözümleri hızlı bir başvuru.

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells at JoVE.com

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Akış Sitometrinin Kullanımı T Hücrelerinde Kromatin Devleti değerlendirmek için

Akış sitometri T hücreleri içinde kromatin durumunu değerlendirmek için kullanılabilir. Bu protokol, bilim adamları, floresan Histon H3 antikorların ortalama florasan yoğunluğu (MFI) bir artış gösterdiği, T hücresi aktivasyonu sırasında kromatin yoğunlaşması kanıt yorumlama sağlar

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

the-use-of-flow-cytometry-to-assess-the-state-of-chromatin-in-t-cells

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.8K Görüntüleme.  Furman University.  Akış sitometri T hücreleri içinde kromatin durumunu değerlendirmek için kullanılabilir. Bu protokol, bilim adamları, floresan Histon H3 antikorların ortalama florasan yoğunluğu (MFI) bir artış gösterdiği, T hücresi aktivasyonu sırasında kromatin yoğunlaşması kanıt yorumlama sağlar 

Video: The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Insan In Vitro Bağışıklık Dengesizlik Erken Devlet Tanıma Tarama Aracı Olarak Bastırılması

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt; A Akış Sitometri bazlı analiz kullamlarak

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

Otoimmünite karşı Kök Hücre türetilmiş antijen-özgü düzenleyici T hücrelerinin gelişimini

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. Diet-induced obesity (DIO) is a valuable model in studying the role of macrophage heterogeneity; however, adequate macrophage isolations are difficult to acquire from inflamed tissues. In this protocol, we outline the isolation steps and necessary troubleshooting guidelines derived from our studies for obtaining a suitable population of tissue-resident macrophages from mice following 18 weeks of high-fat (HFD) or high-fat/high-cholesterol (HFHCD) diet intervention. This protocol focuses on three hallmark tissues studied in obesity and atherosclerosis including the liver, white adipose tissues (WAT), and the aorta. We highlight how dualistic usage of flow cytometry can achieve a new dimension of isolation and characterization of tissue-resident macrophages. A fundamental section of this protocol addresses the intricacies underlying tissue-specific enzymatic digestions and macrophage isolation, and subsequent cell-surface antibody staining for flow cytometric analysis. This protocol addresses existing complexities underlying fluorescent-activated cell sorting (FACS) and presents clarifications to these complexities so as to obtain broad range characterization from adequately sorted cell populations. Alternate enrichment methods are included for sorting cells, such as the dense liver, allowing for flexibility and time management when working with FACS. In brief, this protocol aids the researcher to evaluate macrophage heterogeneity from a multitude of inflamed tissues in a given study and provides insightful troubleshooting tips that have been successful for favorable cellular isolation and characterization of immune cells in DIO-mediated inflammation.

This protocol allows a researcher to isolate and characterize tissue-resident macrophages in various hallmark inflamed tissues extracted from diet-induced models of metabolic disorders.

Yalıtım, karakterizasyonu ve obezite ile ilgili iltihap tarafından etkilenen dokular makrofajlar arıtma

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

Plazma zarı verimliliği memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden yüksek üretilen iş ölçümü

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

Çok renkli akış sitometresi tabanlı Quantification mitokondri ve T hücrelerde organellerin

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Nötrofil kütle sitometri analizi için tüm kemik Iliği hazırlanması-Lineage hücreler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the key steps to investigate TRMs. There are slight variations in lymphocyte isolation protocols for different organs. Kidney is an essential non-lymphoid organ with numerous immune cell infiltration especially after pathogen exposure or autoimmune activation. In recent years, multiple labs including our own have started characterizing kidney resident CD8+ T cells in various physiological and pathological settings in both mouse and human. Due to the abundance of T lymphocytes, kidney represents an attractive model organ to study TRMs in non-mucosal or non-barrier tissues. Here, we will describe a protocol commonly used in TRM-focused labs to isolate CD8+ T cells from mouse kidneys following systemic viral infection. Briefly, using an acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection model in C57BL/6 mice, we demonstrate intravascular CD8+ T cell labeling, enzymatic digestion, and density gradient centrifugation to isolate and enrich lymphocytes from mouse kidneys to make samples ready for the subsequent flow cytometry analysis.

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Following viral infection, kidney harbors a relatively large number of CD8+ T cells and offers an opportunity to study non-mucosal TRM cells. Here, we describe a protocol to isolate mouse kidney lymphocytes for flow cytometry analysis.

Akış Sitometri Analizi için Fare Böbrek-Resident CD8+ T hücrelerinin izolasyonu

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

Akış Sitometrinin Kullanımı T Hücrelerinde Kromatin Devleti değerlendirmek için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler