Este projecto foi apoiado por subsídios da National Institutes of Health (5 P20 RR016461 e 8 P20 GM103499), a National Science Foundation (EPS-0903795). Um apoio adicional fornecida pela Research e Crescimento Profissional da Universidade Furman e prêmios Advantage Furman.

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo animal foi aprovada pelo (número Permit: A3242-01) Comitê Animal Care Institucional e Use Universidade Furman. Todos os materiais e equipamento utilizados no presente protocolo podem ser encontrados na Tabela de materiais e equipamentos, enquanto que os tampões usados ​​podem ser encontrados na Tabela de tampões e soluções. 1. suspensão única célula de linfócitos de rato baços <ol><li> Sacrifício camundongos através de asfixia com CO2. Confirme a eutanásia por deslocamento cervical. Nota: Use os baços de dois 6-8 semanas de idade camundongos isogênicos (por exemplo, C57B / 6) do mesmo sexo. Tipicamente, dois baços são processados. </li><li> Pulverize os animais profusamente com uma solução de etanol a 70% e orientar de modo que a cabeça está virada para a esquerda. </li><li> Usando fórceps, levantar a pele do animal para cima e para fora a partir de tele corpo. Com uma tesoura, um pequeno entalhe cortado através da pele perto do abdómen do animal. Utilizando os dedos, puxam-se os lados do entalhe para expor o peritoneu do pescoço para o início das patas traseiras. O baço deve ser visível diretamente abaixo do peritônio. </li><li> Usando fórceps, levantar o peritoneu e fazer uma pequena incisão para expor o baço. Remover o baço com uma pinça e usar a tesoura para arreliar fora qualquer adiposo e tecido conjuntivo. </li><li> Colocar o baço em um tubo de 50 ml contendo 10 ml de PBS suplementado com 2% de Soro Fetal Bovino (daqui em diante referida como PBS + 2%). Mantenha o tubo em gelo até estar pronto para iniciar a suspensão de células individuais. Nota: A recuperação típica é de entre 60-90 milhões de células por baço, e tipicamente, são necessários 2 milhões de células por amostra. Realiza todas as seguintes etapas em um capuz de cultura de tecidos. </li><li> Decantar os baços em uma estéril 100 mm prato de cultura de tecidos. </li><li> Obter duas lâminas de microscópio fosco e segure tele desliza de modo que as duas superfícies viradas para dentro fosco em bruto em direcção um ao outro. Molhar as lâminas na + 2% de solução PBS derramado na placa de Petri. </li><li> Segurar o baço entre as superfícies foscas das lâminas, com as bordas ainda submersas, e moer suavemente o baço, movendo as lâminas e para trás de encontro uns aos outros (Figura 1A). As células vão cair na placa de Petri. Continue moagem até que todas as células foram liberados e os restos do baço aparecem em branco (Figura 1B). </li><li> Desenha-se a suspensão de células em uma pipeta e filtrá-la lentamente através de um filtro de 70 um para um novo tubo de 50 ml estéril cónico. Note-se que pequenas pedaços de polpa vermelha estará presente no filtro (Figura 2A). <ol><li> Se o filtro sobe, levante suavemente-lo um pouco para permitir que o líquido escorrer através de e coloque o filtro de volta no tubo de 50 ml e continuar, repetindo este processo conforme necessário. Se o processamento de mais de 5 spleens, pode ser necessário dividir-se em dois lotes e utilizar um filtro para cada novo. </li></ol></li><li> Usando a parte de batente de uma seringa de 3 ml de pressionar suavemente a polpa vermelha contendo as restantes células através do filtro (Figura 2B). Certifique-se de pressionar a parte inferior do filtro ambos os lados e para assegurar que toda a polpa vermelha passou através do filtro (Figura 2C). </li><li> Adicionar 10 mlof PBS + 2% para a cultura de tecidos prato e usar isso para lavar o slides, seringa rolha, e prato para recuperar as células restantes. Passe esta através do mesmo filtro de células 70 mm no tubo cônico de 50 mL. Repita este passo, conforme necessário. </li><li> Centrifugar a suspensão de células filtrada a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Gentilmente decantar e desprezar o sobrenadante, cuidado para não perturbar o sedimento. Uma quantidade vestigial de PBS + 2% será deixado no tubo. Tapar o tubo e apertar o sedimento até o pelete é ressuspenso completamente. </li><li> Lisar glóbulos vermelhos por anúncioDing 2 mL de ACK Tampão de Lise (0,15 M NH 4 Cl, 1 KHCO 3 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,2, armazenar a 4 ° C) por cada baço ao tubo cónico e rodar e inverter o tubo para assegurar que todas as células entrar em contacto com o tampão ACK. Agite suavemente o tubo durante 1 min a RT. </li><li> Levar o volume da suspensão de células para 50 ml por adição de PBS + 2% do tubo para neutralizar o tampão ACK. Inverter o tubo 10 vezes e centrifugar durante 5 minutos a 300 xg, a 4 ° C. Após a centrifugação é completa, o sedimento deve ser branco (Figura 3). </li><li> Gentilmente decantar e desprezar o sobrenadante, cuidado para não perturbar o sedimento. Deixar uma quantidade vestigial de PBS + 2% no tubo, a tampa do tubo, e agite o sedimento para ressuspender-lo. </li><li> Adicionar 10 ml de meio de células T [10% FBS, HEPES 10 mM (pH 7,0), 2 mM de GlutaMax, piruvato 1 mM de sódio, aminoácidos não essenciais 1x, 1x penicilina / estreptomicina e 50 mM de β-mercaptoetanol], e mais ressuspender o sedimento por delicadamentepipetando para cima e para baixo. Depois filtra-se a suspensão através de um novo filtro de 70 um para um novo tubo de 50 ml. </li><li> Use outros 5-10 ml de meio de células T para enxaguar o tubo original e esta passar através do filtro de 70 um para o tubo contendo o resto das células filtradas. Se o processamento de mais de dois baços, o volume de meio de células T pode ser aumentada para maximizar a recuperação. </li><li> Manter as células em gelo até estar pronto para ser manchada. As células devem ser contados e viabilidade acessado. <ol><li> Para contar as células, combinar 3 ml de células com 24 ml de PBS + 2% e 3 ml de 0,4% de azul de tripano. Carga de 10 ml desta em cada câmara de um hemocitômetro Neubauer melhorada. A viabilidade, tal como avaliado por exclusão de azul de tripano, é tipicamente entre 85-95%. </li></ol></li></ol> 2. Viabilidade e coloração da superfície <ol><li> Células de pellets por centrifugação durante 10 min a 300 xg, a 4 ° C. Ressuspender as células em meio de células T a uma concentração de 1 x 10 7 células / ml. Transfer de 2 milhões de células (100 ml) para um poço de uma placa de 96 poços de cultura de tecido de fundo em U. </li><li> Centrifugar a placa de 96 poços durante 10 min a 300 xg, a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante de cada cavidade por um movimento súbito líquido dentro da placa bem na pia (o sedimento de células permanecerá no poço) e secando a placa sobre uma toalha de papel limpa. Lavam-se as células por ressuspensão em 200 ul de PBS seguido de centrifugação a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Executar todas as lavagens desta maneira salvo indicação em contrário. Nota: Não use PBS + 2%, uma vez que irá interferir com a mancha PI solucionáveis. </li><li> Remover o sobrenadante por um movimento súbito da placa e adicionar 100 mL de mancha comercial recentemente preparada (por exemplo, células mortas mancha vermelha fixável) a cada poço. <ol><li> Adicione a mancha por diluição da solução stock de 01:10 corante reactivo em DMSO seguido por uma diluição de 1:10 em PBS. Incubar a placa a 4 ° C durante 30 minutos ao abrigo da luz. </li></ol></li><li> Centrifugar a pfinal durante 10 min a 300 xg, a 4 ° C. Neste ponto para a frente, executar todo o trabalho com a placa com a cultura de tecidos capô luz. </li><li> Remover o sobrenadante por um movimento súbito da placa e, em seguida adicionar 100 ml de solução de bloqueio de Fc. Faça solução bloco Fc diluindo Fc solução estoque bloco 1: 100 em PBS. </li><li> Anticorpos diluído para ser utilizado para a coloração de superfície (por exemplo, anti-CD4 ou anti-CD8) em PBS e adicionar 100 ml a cada poço. Incubar a placa de 96 poços durante 30 min a 4 ° C protegida da luz. Nota: anticorpos mancha de superfície devem ser tituladas para o desempenho ideal. Normalmente, utilizam uma diluição de 1: 400, por protocolo do fabricante: 200 ou 1. </li></ol> 3. A coloração intracelular para histona H3 <ol><li> Após a incubação, a mancha da superfície, lavar as células duas vezes em PBS. </li><li> Após a última lavagem, adicionar 100 uL de paraformaldeído a 4% a cada poço. Incubar a placa de 96 poços durante 5 min à TA. Faça paraformaldeído a 4% por diluting 16% de paraformaldeído em PBS. Faça deste fresco. </li><li> Lavar as células duas vezes em PBS. </li><li> Adicione solução Perm / bloco (solução estoque é Perm PBS + 2% + 0,02% de Triton X-100, armazenar a 4 ° C) através da combinação de 2 ml de soro de coelho normal por 100 ml de solução de estoque de Perm. Faça o suficiente para 60 ml / amostra. </li><li> Adicionar 40 ml Perm / Bloco a cada amostra bem e misture bem cuidado pipetando para cima e para baixo, tomando cuidado para não fazer bolhas. Incubar a placa a temperatura ambiente durante 45 min no escuro. Salve restante Perm / Bloco para a etapa 3.6. </li><li> Dilui-se conjugado anticorpo fluorescentemente Histona H3K4me1 em solução Perm / Bloco reservados na etapa 3,5 e adicionar 10 ul desta diluição para cada cavidade. Misture cuidado pipetando para cima e para baixo. Incubar a placa de 96 poços no escuro durante 1 hora a 4 ° C. Nota: Utilizar um anticorpo conjugado H3K4me1 utilizando o kit de conjugação com R-Ficoeritrina, seguindo as instruções do fabricante. </li><li> Lavar as células duas vezes em PBS + 2%. </li><li> Volte a suspender as células em 200ul de PBS + 2% e transferir as amostras para tubos FACS para análise de citometria de fluxo. As amostras podem ser armazenadas a 4 ° C no escuro. Para resultados óptimos analisar as amostras dentro de dois dias. Isoladamente amostras coradas pode ser utilizada citometria de fluxo como controles de compensação. </li></ol>

<ol>
	<li>Bravo-Ferrada, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+surface+damage+on+cell+envelope+assesed+by+afm+and+flow+cytometry+of+lactobacillus+plantarum+exposed+to+ethanol+and+dehydration.">Study of surface damage on cell envelope assesed by afm and flow cytometry of lactobacillus plantarum exposed to ethanol and dehydration.</a> J Appl Microbiol. , (2015).</li><li>Agola, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Bead-Based+Flow+Cytometry+for+Assaying+Rab7+GTPase+Interaction+with+the+Rab-Interacting+Lysosomal+Protein+(RILP)+Effector+Protein.">Quantitative Bead-Based Flow Cytometry for Assaying Rab7 GTPase Interaction with the Rab-Interacting Lysosomal Protein (RILP) Effector Protein.</a> Methods Mol Biol. 1298, 331-354 (2015).</li><li>Toh, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+flow+cytometry+to+analyze+intracellular+location+and+trafficking+of+cargo+in+cell+populations.">Application of flow cytometry to analyze intracellular location and trafficking of cargo in cell populations.</a> Methods Mol Biol. 1270, 227-238 (2015).</li><li>Rawlings, J. S., Gatzka, M., Thomas, P. G., Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+condensation+via+the+condensin+II+complex+is+required+for+peripheral+T-cell+quiescence.">Chromatin condensation via the condensin II complex is required for peripheral T-cell quiescence.</a> EMBO J. 30, 263-276 (2011).</li><li>Lee, M. D., Bingham, K. N., Mitchell, T. Y., Meredith, J. L., Rawlings, J. 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G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+by+calcium,+calcineurin+and+NFAT.">Transcriptional regulation by calcium, calcineurin and NFAT.</a> Genes Dev. 17, 2205-2232 (2003).</li><li>Rawlings, J. S., Rosler, K. M., Harrison, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK/STAT+signaling+pathway.">The JAK/STAT signaling pathway.</a> J Cell Sci. 117, 1281-1283 (2004).</li><li>Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STATs:+signal+transducers+and+activators+of+transcription.">STATs: signal transducers and activators of transcription.</a> Cell. 84, 331-334 (1996).</li><li>Moriggl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stat5+is+required+for+IL-2-induced+cell+cycle+progression+of+peripheral+T+cells.">Stat5 is required for IL-2-induced cell cycle progression of peripheral T cells.</a> Immunity. 10, 249-259 (1999).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Foi desenvolvido um protocolo que permite a avaliação de condensação da cromatina nas células T. Baseia-se na simples observação de que anticorpos de histona H3 não podem acessar seus epítopos prontamente nas células ingênuo, mas após a ativação das células T, estes mesmos anticorpos são capazes de se ligar aos seus epítopos. Ao comparar a coloração Histona H3 MFI de entre grupos de tratamento, o grau relativo de condensação ou descondensação pode ser determinada. Temos utilizado este protocolo para determinar o status de condensação relativa durante o desenvolvimento de timócitos e durante a activação das células T 4. Temos também utilizado este protocolo para investigar os mecanismos que controlam o processo descondensação 5. Este protocolo baseia-se na utilização de um anticorpo de histona H3 para detectar o estado de condensação da cromatina. Uma vez que não existe qualquer alteração global na modificação da histona durante a activação das células T 4, que é capaz de usar um anticorpo para avaliar H3K4me1 cromatinaestado neste protocolo. Nós usamos anticorpos produzidos contra inalterado histona H3; No entanto, o sinal produzido foi muito mais fraca global. Em nossa experiência, os anticorpos produzidos contra modificado histona H3 funcionam melhor em imunofluorescência e ensaios de citometria de fluxo, enquanto anticorpos contra inalterado histona H3 funcionam melhor em Western blot. Deve ser notado que é também possível a utilização de anticorpos dirigidos contra outras proteínas histona, embora não se tenha tentado-lo. As etapas de anticorpos Perm / Bloco e histona H3 são as etapas mais críticas do protocolo. A quantidade de solução de Perm / Bloco utilizado tem de ser optimizado de cada vez a solução estoque é feita Perm. Isto pode ser feito comparando o desempenho de diferentes diluições da solução de reserva. Uma experiência típica envolve a comparação estado da cromatina em células T naive para aqueles activado durante 3 horas (Figura 4). Deve-se escolher a diluição que produz a maior mudança na MFI maiso período de tempo analisado. A solução-mãe pode ser diluída em PBS + 2% para diminuir Perm / Bloco primeira força por ressuspensão das células na medida em 100 ml de PBS + 2% após o passo 3.4 e, em seguida, adicionando o Perm / Bloco no passo 3.5. Uma experiência piloto similar deve ser usado para testar diferentes diluições do conjugado de anticorpo de histona H3 fluorescentemente cada vez que um novo lote de anticorpo é marcado. Estes passos são especialmente críticos para detecção com sucesso de diferenças de condensação no início da activação das células T (por exemplo, dentro de 3 horas de activação). Ocasionalmente, existem células que não recebem permeabilizadas e, assim, não vai manchar com o anticorpo histona H3. Isso pode acontecer se as células não são suspensas de novo bem ao adicionar o Perm / Bloco ou se o Perm / Bloco não é forte o suficiente. Estas células aparece como eventos pressionados contra o eixo ao visualizar um histograma de Histona H3 coloração. Uma vez que estes eventos irão distorcer a IMF, em geral, esses eventos podem ser omitidos da análise por Gating a distribuição normal de células positivas histona H3. Assistência adicionais podem ser encontradas no Guia de Solução de Problemas (Tabela 1). A inclusão de uma coloração celular morto fixável permite a avaliação da viabilidade celular no ensaio. Isto é absolutamente crítico durante a manipulação de activação das células T, pois certos estímulos podem induzir a morte celular. Em tal caso, o anticorpo pode ligar-se Histona H3 histonas em células mortas de forma diferente do que as células vivas, que conduz a erros de interpretação dos resultados. Este protocolo é concebido para ser utilizado no formato de placa de 96 poços, o que permite uma análise de alto rendimento de estado da cromatina. Um baço de um 6-8 semanas de idade do rato fêmea tipicamente renderá entre 60-90000000 células usando o protocolo. Uma vez que o protocolo de coloração requer 2 milhões de células por amostra, pode-se facilmente ensaiar vários grupos de tratamento e os pontos de tempo, em triplicado, com um único baço em uma única placa de 96 poços. É possível perform o protocolo com menos células por amostra; No entanto, devido ao número de passos de centrifugação e a inerente perda de células em cada uma destas etapas, não é aconselhável para diminuir o número de células por muito. Nós completamos com sucesso o protocolo com 1 milhão de células por amostra. Nós usamos esse protocolo para examinar o status da cromatina em células auxiliares T CD4 + e CD8 + T citotóxicas. Isto é possível porque o protocolo padrão inclui a coloração da superfície. O protocolo pode ser facilmente adaptado para o exame da cromatina em outras subpopulações de linfócitos usando anticorpos contra marcadores de superfície específica populacional. Este protocolo pode também ser facilmente adaptada para outros tipos de células, desde que anticorpos que reconhecem marcadores de superfície relevantes são condições de fixação / permeabilização disponíveis e adequados são conhecidos.

Citometria de fluxo é uma tecnologia baseada em laser desenvolvido para a análise de múltiplos parâmetros físicos e em populações de células fluorescentes. Esta tecnologia funciona como células suspensas numa corrente de fluido de encontro um laser, marcadores fluorescentes excitantes sobre ou no interior das células. Estes marcadores então emitir luz que é detectada e quantificada por tubos fotomultiplicadores. Enquanto citometria de fluxo tem sido tradicionalmente usado para identificar populações de células, que tem provado ser uma tecnologia útil quando se estuda uma matriz de propriedades de células, incluindo a integridade da membrana celular, interacções proteína-proteína e proteína tráfico 1-3. Nós desenvolvemos um protocolo que permite que esta tecnologia a ser utilizada para detectar o estado da cromatina em células T como eles são activados in vitro 4. Temos também utilizado este protocolo para investigar o mecanismo de ativação induzida cromatina descondensação de células T 5. T activatio celularn e proliferação são críticos para uma resposta imunitária adequada. As células T, um subconjunto de linfócitos específicos dentro do sistema imune, são necessárias para as respostas imunitárias adequadas e o desenvolvimento de memória imunológica. A activação é iniciada quando um antigénio é apresentado no contexto do complexo principal de compatibilidade com o receptor de células T (TCR), localizado na superfície extracelular das células T quiescentes (revisto em 6). Isto desencadeia uma série de acontecimentos moleculares dinâmicas e altamente ordenados dentro de células T que culminam num aumento da concentração intracelular de Ca2 + 7 e a translocação nuclear de factores de transcrição necessários para a activação (revisto em 8-10). Uma vez activadas, as células T ganhar a capacidade para responder a Interleucina-2 (IL-2), um factor de crescimento potente que utiliza a JAK (Janus Kinase) / STAT (sinal do transdutor e activador da transcrição) via para conduzir a proliferação clonal de T activadas 11 células. Resumidamente, a IL-2 estimulaçãoresulta na fosforilação de proteínas STAT, uma família de factores de transcrição latentes citosólicas. Uma vez fosforilada, as proteínas STAT dimerizar, translocar para o núcleo e dirigir a expressão de genes, incluindo os envolvidos na progressão do ciclo celular. Em células T, a IL-2 através de sinais de STAT5, que é necessário para a proliferação de células T 12,13. A fim de alcançar a expansão clonal de células T activadas, as células que não sofreram antigénio-TCR acoplamento (células T naive), deve ter um mecanismo para ignorar os efeitos potentes da IL-2. Isto é conseguido através da regulação do estado de cromatina. Células T naive possuir um cromatina condensada que proíbe acoplamento ADN-STAT5 em resposta à estimulação de IL-2. Após a ativação, decondenses cromatina e STAT5 pode acessar os promotores dos genes-alvo, permitindo a proliferação clonal 4. Curiosamente, esta mudança de status da cromatina não é dependente de modificação epigenética de histona proteins (para revisão, ver 14) como observamos nenhuma mudança global na modificação das histonas durante a ativação das células T 4. Durante a realização destes estudos, descobrimos que os anticorpos produzidos contra proteínas histonas também tiveram dificuldade em acessar seus epitopos em células ingênuo, mas que após a ativação poderia mais facilmente vincular os seus epítopos 4. Assim, a ligação do anticorpo para histonas serve como uma leitura para o estado de condensação da cromatina. Aqui apresenta-se a método para utilizar a citometria de fluxo para detectar anticorpos Histona H3 fluorescente conjugada, a fim de avaliar o estado da cromatina nas células T. Condensação da cromatina numa população de células é medido como a intensidade média de fluorescência (IMF) de Histona H3 coloração. No contexto da activação das células T, o MFI de Histona H3 de coloração aumenta, significando a descondensação de cromatina. Além de medir o estado da cromatina via intracelular coloração histona H3, este protocolo também Incorporates superfície coloração e uma mancha solucionáveis ​​por células vivas, que permitam uma análise de subpopulações de células.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:584px;" width="585">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">100mm tissue culture dish</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Precleaned frosted microscope slides</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sterile cell strainer, 70mm nylon mesh</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">3mL syringe, Luer-Lok tip</td>
			<td style="width:83px;">BD</td>
			<td>309585</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Falcon 50mL polypropylene conical tube</td>
			<td style="width:83px;">Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">LIVE/DEAD fixable red dead cell stain kit</td>
			<td style="width:83px;">Life Technologies</td>
			<td>L23102</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies sells versions of this kit with different colors</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Fc Block</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:83px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Normal rabbit serum</td>
			<td style="width:83px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R9133</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Anti-H3K4me1 antibody</td>
			<td style="width:83px;">Abcam</td>
			<td>ab8895</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">R-Phycoerythrin conjugation kit</td>
			<td style="width:83px;">Abcam</td>
			<td>ab102919</td>
			<td style="width:167px;">Alternatively, the LYNX rapid RPE kit from AbD Serotec can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of flow cytometry to assess the state of chromatin in t cells

Durante uma resposta imunitária adequada, as células T em repouso, tornam-se activas sobre a apresentação do antigénio ao seu receptor de células T específico para o antigénio. Isto leva a proliferação clonal de células T apenas aquelas que levam um receptor que reconhece o antigénio. Descondensação da cromatina é uma indicação da activação de células T e é necessária para as células T a adquirir a capacidade de proliferar após acoplamento antigénio. Esta mudança na condensação da cromatina pode ser detectada utilizando anticorpos criados contra as proteínas de histona. Estes anticorpos não podem se ligar aos seus epitopos em células T naive, assim como eles podem, em células T ativadas. Nós descrevemos como manchar simultaneamente específicos de células T, marcadores de superfície viabilidade pista com uma mancha de células mortas solucionáveis, e medir o estado de cromatina via coloração intracelular de proteínas histona H3. As células coradas foram analisadas por citometria de fluxo e estado condensação da cromatina é medida como a intensidade média da fluorescência (IMF) de a mancha Histona H3. Chromatna descondensação durante a activação da célula T é demonstrada como um aumento do MFI

Os linfócitos de um C57B / 6 de ratinho foram processados ​​para uma suspensão de célula única de acordo com o protocolo e contadas utilizando um hemocitómetro padrão. As células foram semeadas em triplicado, a 2 x 10 6 / mL em meio de células T em 15 ml de tubos cónicos e não tratada, ou foram estimuladas com 1 mg / anticorpos anti-CD3 solúvel ml (4C11 clone) durante 3 h a 37 ° C em numa incubadora de cultura de tecidos padrão. As células mortas foram coradas e, em seguida, as células foram então superfície manchada utilizando anticorpos FITC-CD8 e CD4-APC acordo com o protocolo. Acessibilidade histona foi analisada através de citometria de fluxo (Figura 4). Em células T CD4 + e CD8 + naive ambas, a intensidade de fluorescência média (IFM) é baixo, o que significa um estado cromatina condensada. Como as células são activadas com anti-CD3 os aumentos IFM significativamente (p &lt;0,001, teste t de Student), indicando que tem descondensada cromatina. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig1.jpg" /> Figura 1. Técnica para o processamento de baços numa suspensão de células isoladas usando lâminas de microscópio fosco. (A) O baço é pressionado contra as superfícies foscas de duas lâminas de microscópio. (B) Os slides são movidos frente e para trás uns contra os outros linfócitos liberam em uma placa de Petri de 100 milímetros até os restos do baço são brancos. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53533/53533fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig2.jpg" /> Figura 2. Utilizando uma seringa a rolha prima restante polpa vermelha através de um filtro de células de 70 mm. (A), polpa vermelha do baço remanescente após um i<html> s transformados em uma suspensão de células única e passada através do filtro de células de 70 mm. (B) A parte de batente de uma seringa de 3 ml é utilizada para pressionar suavemente restante polpa vermelha através do filtro de células. (C) Depois de utilizar a seringa, deve haver praticamente nenhuma polpa vermelha deixado no filtro de células. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53533/53533fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig3.jpg" /> Figura 3. ACK lise das células vermelhas do sangue. (A) A centrifugação de uma suspensão de células única produzida a partir de um único baço de ratinho antes da lise ACK. (B) Depois de ACK lise dos glóbulos vermelhos do sangue, o sedimento de células deve ser de cor branca.obter = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig4.jpg" /> Figura 4. Os resultados representativos do protocolo. Esquema (A) utilizado para analisar gating estado da cromatina em linfócitos T CD4 +. (B e C), as células T foram deixados sem tratamento ou activada com anticorpos 1 mg / ml de anti-CD3 solúvel, durante 3 horas (em triplicado). As células foram depois analisadas por citometria de fluxo para determinar a condensação da cromatina em células CD4 + (B) e as células CD8 + (C). Os dados são a média ± desvio padrão da intensidade média de fluorescência de coloração H3K4me1. * p &lt;0,001 (teste t de Student) <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53533/53533fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique h</a>ere para ver uma versão maior desta figura. <img alt="tabela 1" src="/files/ftp_upload/53533/53533table1.jpg" /> Tabela 1:. Resolução de Problemas Uma referência rápida para problemas comuns e possíveis soluções.

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The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

A citometria de fluxo para avaliar o estado de cromatina em células T

A citometria de fluxo pode ser utilizado para avaliar o estado da cromatina nas células T. Este protocolo permite que os cientistas interpretar evidência de descondensação da cromatina durante a activação das células T demonstrou por um aumento na intensidade de fluorescência média (IFM) de anticorpos fluorescentes Histona H3

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.8K visualizações.  Furman University.  A citometria de fluxo pode ser utilizado para avaliar o estado da cromatina nas células T. Este protocolo permite que os cientistas interpretar evidência de descondensação da cromatina durante a activação das células T demonstrou por um aumento na intensidade de fluorescência média (IFM) de anticorpos fluorescentes Histona H3 

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Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Humano In Vitro Supressão como ferramenta de triagem para o reconhecimento de um Estado precoce de desequilíbrio imunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Imunologia e Infecção

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Classificação de células activadas por fluorescência Para a purificação de células dendríticas plasmocitï¿½des do rato de Medula Óssea

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

Avaliando Retinal microglia fagocítica Função<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando um ensaio baseado em citometria de fluxo

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

Desenvolvimento de Células-Tronco de derivados de células T regulatórias antígeno específico da Contra Auto-imunidade

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. Diet-induced obesity (DIO) is a valuable model in studying the role of macrophage heterogeneity; however, adequate macrophage isolations are difficult to acquire from inflamed tissues. In this protocol, we outline the isolation steps and necessary troubleshooting guidelines derived from our studies for obtaining a suitable population of tissue-resident macrophages from mice following 18 weeks of high-fat (HFD) or high-fat/high-cholesterol (HFHCD) diet intervention. This protocol focuses on three hallmark tissues studied in obesity and atherosclerosis including the liver, white adipose tissues (WAT), and the aorta. We highlight how dualistic usage of flow cytometry can achieve a new dimension of isolation and characterization of tissue-resident macrophages. A fundamental section of this protocol addresses the intricacies underlying tissue-specific enzymatic digestions and macrophage isolation, and subsequent cell-surface antibody staining for flow cytometric analysis. This protocol addresses existing complexities underlying fluorescent-activated cell sorting (FACS) and presents clarifications to these complexities so as to obtain broad range characterization from adequately sorted cell populations. Alternate enrichment methods are included for sorting cells, such as the dense liver, allowing for flexibility and time management when working with FACS. In brief, this protocol aids the researcher to evaluate macrophage heterogeneity from a multitude of inflamed tissues in a given study and provides insightful troubleshooting tips that have been successful for favorable cellular isolation and characterization of immune cells in DIO-mediated inflammation.

This protocol allows a researcher to isolate and characterize tissue-resident macrophages in various hallmark inflamed tissues extracted from diet-induced models of metabolic disorders.

Isolamento, caracterização e purificação dos macrófagos dos tecidos afetados pela inflamação obesidade

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolamento e cultura In Vitro de macrófagos alveolares murino e humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

Medição de alto rendimento da membrana plasmática, efectuou a eficiência em células de mamíferos

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

Quantificação de baseados em citometria de fluxo multicolor de mitocôndrias e lisossomos em células T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Preparação de medula óssea inteira para análise de citometria de massa de células de linhagem de neutrófilos

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the key steps to investigate TRMs. There are slight variations in lymphocyte isolation protocols for different organs. Kidney is an essential non-lymphoid organ with numerous immune cell infiltration especially after pathogen exposure or autoimmune activation. In recent years, multiple labs including our own have started characterizing kidney resident CD8+ T cells in various physiological and pathological settings in both mouse and human. Due to the abundance of T lymphocytes, kidney represents an attractive model organ to study TRMs in non-mucosal or non-barrier tissues. Here, we will describe a protocol commonly used in TRM-focused labs to isolate CD8+ T cells from mouse kidneys following systemic viral infection. Briefly, using an acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection model in C57BL/6 mice, we demonstrate intravascular CD8+ T cell labeling, enzymatic digestion, and density gradient centrifugation to isolate and enrich lymphocytes from mouse kidneys to make samples ready for the subsequent flow cytometry analysis.

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Following viral infection, kidney harbors a relatively large number of CD8+ T cells and offers an opportunity to study non-mucosal TRM cells. Here, we describe a protocol to isolate mouse kidney lymphocytes for flow cytometry analysis.

Isolamento das células CD8+ T residentes em rim do rato para análise de citometria de fluxo

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

A citometria de fluxo para avaliar o estado de cromatina em células T

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