Bu çalışma Sağlık yardımları HL44485 ve HL28607 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

Etik Beyanı: Tüm prosedürler gözden geçirilecek ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. Mikropipetler, kısıtlayıcılara ve Bloke 1. Ön Fabrikasyon <ol><li> Çekildiğinde, tüpün uzatılmış kısmı yaklaşık 1 cm uzunluğunda ve iki yarısı biraz simetrik olmasıdır, böylece düzeltilmiş bir elektronik çektirmenin kullanarak yarısında birkaç temiz borosilikat cam kapiller tüpler çekin. . Konik Şekil 1&#39;de boyutları ile uyumlu olduğundan emin olun mikropipetler, kısıtlayıcılara ve blokerler için iki yarısı kullanın. <ol><li> Konik suyla yıkanıyor 0,5 mikron zımpara kağıdı ile hava tahrikli taşlama 30 ile mikropipetler. Yatay yaklaşık 30 derece olacak şekilde mikropipet tutucu açısını ayarlayın. </li><li> İyice yıkayın ve bahşiş yoluyla ve şaft temizlemek aseton çekmek için emme kullanarak mikropipetler kurutun. (Mikropipetler inceleyinBir timsah klip mikropipet tutucu ve bir mercek dürbün ağı ile donatılmış 4 × 40 × hedefleri ile küçük bir dik mikroskop kullanılarak Şekil 1A). </li><li> Kimin uzunluk / genişlik oranı 3.1 ila 3.5 ve mezenterinde sert kollajen lifleri nüfuz yardımcı olan bir keskin konik noktası olan bir eğim ile yaklaşık 50 mikron uzunluğunda ucu açılması ile seçin mikropipetler. </li><li> Tozsuz bir kutuda hafifçe farklı boyutlarda 15-20 mikropipetler saklayın. </li></ol></li><li> Adım 1.1 hazırlanan çekti kılcal tüpler) kullanarak kısıtlayıcılara olun. Kör bir uç (Şekil 1B) oluşturulması için bir microflame yakın kısa çekilmiş bir cam kılcal tüp tutun. Tozsuz bir kutuya birkaç saklayın. </li><li> Adım 1.1 hazırlanan çekti kılcal tüpler) kullanarak microoccluders olun. Eğmek hafifçe microflame altında çekti kılcal tüp tutun ve (bir boru adaptörü, örneğin kullanarak., 23G) ince uçlu (ucundan yaklaşık 4 mm) miline 120 dereceye yakın bir açı yapmak ( <strong&gt; Şekil 1C). Marka ve çeşitli saklayın. </li></ol> 2. Hayvan Hazırlama ve Cerrahisi <ol><li> Pentobarbital sodyumla erkek (350-450 g) ya da dişi Sprague-Dawley sıçanları (200-300 g) anestezisi (80-100 mg / kg, Sigma-Aldrich, P3761) deri altı enjeksiyon yoluyla; intraperitoneal kullanarak değil mezenterin korur. </li><li> Cerrahi prosedürler ve deney protokolleri boyunca, gerektiği gibi ilave enjeksiyonlar (30 mg / kg) ile anesteziye devam ediniz. Ayak tutam veya kornea refleksi ile anestezi derinliği belirler. Deney prosedürünün tamamlanmasından sonra, pentobarbital dozda ya da anestezi altında, doymuş potasyum klorid intrakardiyak enjeksiyonu ile sıçan euthanize. </li></ol> 3. Akış Markers olarak kullanılmak üzere Çözümleri ve eritrositler hazırlayın <ol><li> Superfusate ve kontrol perfüzyon çözeltisi (tipik olarak memeli 10 mg içeren Ringer çözeltisi / ml yağ asidi için memeli Ringer çözeltisi hazırlayıniçermeyen sığır serum albumini, BSA). <ol><li> 0.2 mikron şırınga filtreler aracılığıyla filtre Perfüzat mikropipet ucu engelleyebilir minik parçacıkları çıkarmak için; küçük, temiz bir kap içine süzün. </li></ol></li><li> 0,05 ml heparin (1000 U / ml) ihtiva eden küçük bir şırınga, bir 20G iğne içine anestezi uygulanmış sıçan kuyruk damarından 0.2 ml kan alınarak eritrositleri hazırlayın ve yaklaşık 14 ml, memeli Ringer çözeltisi ihtiva eden bir çözelti, 15 ml bir santrifüj tüpüne transfer . <ol><li> Santrifüj yavaşça (7 dakika boyunca maksimum 200 × g) hakkında kırmızı hücrelerin paketi. Süpernatant çizin ve Ringer çözeltisi içinde kırmızı hücrelerin yeniden askıya. </li><li> Santrifüj ve çıkarılmasından sonra süpernatan üç kez daha sonra kullanılmak üzere, tüpün alt paketlenmiş kırmızı hücreleri bırakın. Bu işlem normal seviyelerde 31 daha az,% 0.1 son Perfüzatlar trombositleri azaltır unutmayın. </li></ol></li></ol> 4. Animal üzerine Doku YerleştirTepsi <ol><li> Kılıç şeklinde sürecine göbek altından anestezi sıçan karın Tıraş. Saç de doku dışarı superfusate çekmek için bir fitil teşkil etmeyecek şekilde traş alanı (sağ tarafına yerleştirilmiş sıçan) sağ tarafında etrafında uzanır emin olun. Bir ıslatılmış gazlı bezle veya mendille kesilmiş tüyleri temizleyin. <ol><li> Künt bir dişli forseps ile cildi tutun ve sağlam bir makas kullanarak deri yoluyla bir merkez-line kesi (2-3 cm uzunluğunda) yapmak. Para cezası Kullanma (iris) makas gut zarar görmesini önlemek için tırtıklı forseps ile karın duvarı kaldırarak, linea alba boyunca benzer bir kesi yapmak. </li><li> Hayvan tepside yan hayvan ile hafifçe Ringer solüsyonu ve künt dişli forseps batırılmış pamuk uçlu aplikatörler (ahşap sopa) kullanarak karın boşluğundan bağırsak çekin. Mezenter mezenter dokunmamak için özen mikroskop aracılığıyla (Pote görüntülemek için ayağı üzerinde bol dökümlü böylece iyi dokuda gut düzenleyinntially forseps veya pamuk ya da birlikte) mikrodamarlar zarar. Not: Hayvan tepsisi (Şekil 2A) Pleksiglas inşa ve optik berrak ayağı, (yaklaşık 3 mm derinliğinde) (örneğin cilalı bir kuvars yaklaşık 2 cm&#39;lik dia ve 5 mm yüksek.) Iyi bir ısınma pad bir doku gerektirir Hayvanın sıcaklığı muhafaza edecek şekilde ayarlanır. Ayağı kalınlığı hedefi çalışma mesafesi aşmamalıdır. </li></ol></li><li> Mezenter göz mercekleri ile görünür böylece mikroskop sahnede hayvan tepsisini yerleştirin. </li><li> Sürekli 35-37 ° C de muhafaza memeli Ringer solüsyonu ile mezenter superfuse yerçekimi beslemeli damla hattı yerleştirin. Yerinde gut tutun nemi korumak yardımcı ve yüzeyden fazla Ringer çözeltisi fitil gazlı bez kullanın. Akışını ayarlamak ve tutarlı bir superfusate kalınlığı korumak için atık aspire. </li><li> Olan hedef venüler mikrodamarlar belirlenmesiyakınsak akışı, gerçek kılcal uzak bir ya da iki şube aşağı dallanmamış kesimleri. Dallanmamış gemiyi bul (ideal, uzunluğu 600 ila 1,000 mikron) tempolu kan akımını ve damar duvarına yapışmasını beyaz hücrelerin serbest olması. </li><li> Mikroskop alanının merkezinde test mikrodamar yerleştirin ve seçilen kanulasyon yakın pozisyona koruyucularını taşıyın. </li></ol> 5. Yuvaya Mikropipet ve Dağı Dolgu <ol><li> Sadece kanüle önce, perfüzat kırmızı hücrelerin askıya. Temiz bir borosilikat test tüpünde 0.5 ml perfüzat için eritrosit 7 ul ekleyin. Not:% 1-3 miktarda hematokrite, kullanılabilir, fakat tutarlı hematokrit kırmızı hücrelerden salınan bir maddelerin tutarlı bir perfüzat konsantrasyonlarına neden olur. </li><li> Bir 23G tüp adaptörü ve PE 50 boru (5-15 cm uzunluğunda) ile 1 ml şırınga takın. Şırıngaya perfüzat / kırmızı hücre karışımı çizin. Karıştırın ve tüp tüm kabarcıklar sınırdışı şırınga ters çevirin veadaptörü. Ve deney başlamadan önce birkaç şırınga verimlilik artışı, uygun boru için tozsuz kutu veya plastik torba içinde saklayın. </li><li> O konik bölgeyi dayandığı kadar mikropipet büyük ucunu boru ilerleterek mikropipet doldurun. Mikropipet ucu doldurmak için şırınga pistonu hafif bir hızlı itme uygulayın. Not: Bir küçük akarsu veya damlacık tam dolum kanıtlamak için ucunda görünür olmalıdır. </li><li> Yavaşça pistonu iterek mikropipet milin geniş kısmını doldurmak için ise boru geri çekin. Dikkatlice mikropipet mili hafifçe vurarak geniş şaft küçük kabarcıklarını çıkarın. Not: benzer bir prosedür 32 resmedilmektedir. </li><li> Bir su manometre sürekli bir sıvı bağlantısı sağlayan bir yan portu ile bir pipet tutucu içine mikropipet yerleştirin. Emin olun mikropipet çok ince ilerlemesini kontrol etmek için kullanılan bir hidrolik sürücü takılı tutucu, hafif bir açıyla olduğunu (15-25 °)yatay mikropipet konik kenar gut veya tepsiyi isabet etmez ki. </li><li> Test kabına (Şekil 2) yakın uyum sağlamak için x, y ve z sürücüler vardır hareketli bir mikromanipülatör, hidrolik sürücü bağlama. </li><li> 40 cmH 2 mezenter üzerinde O&#39;ya manometre su sütunundaki sıvı yüksekliğini değiştirmek için bir şırınga ya da suda dolgulu kauçuk ampul kullanılarak mikropipet sıvıya uygulanan hidrostatik basıncı ayarlar. </li><li> Pipet doldurduktan sonra en kısa sürede mikrodamar cannulate; Bu yaklaşık 40 dakika sonra çok az kırmızı hücrelerin damar içine akacak, böylece kırmızı hücreler, pipet altına yerleşirler. </li></ol> 6. Microcannulation ve Mikrovasküler Basınç Ölçümü <ol><li> Mikroskop altında doldurulmuş mikropipet yerleştirmeden önce, yumuşak kavrama doku yeterli bir kuvvet uygulamak mikro damarın yakınındaki doku üzerine koruyucularını basın. BeraberlikMezenterik kollajen liflerde gerilmeler gemi ile aynı hizaya gelecek şekilde hafifçe mikrodamarlarda doğrultusunda doku germe, geri süzgeç. <ol><li> Gemi ile mikropipet hizalayın ve göz mercekleri ile görünüm içine indirin. Seçilen kanulasyon sadece üst ucu yerleştirin ve kısmen geminin içindeki akışını engeller, böylece doku üzerine indirin, ama tıkamaz. </li></ol></li><li> Hidrolik sürücüyü kullanarak damar lümenine yavaşça pipet sürerek gemiyi cannulate. Geminin alt tarafında aracılığıyla itmek için dikkatli olun. Not: mikropipet lümen girerken, Perfüzat hızla lümen dışında geminin kan yıkar ve perfüzat serbestçe aşağı damarlarda normal kan perfüzyon bazı displacing test mikrodamarlarda hayvanın dolaşım distalinde akar. </li><li> Belirtildiği gibi (kanda kadar manometre ayarlayarak perfüzyon basıncını düşürmekperfüze segmentine geri çekilir) hayvanın kırmızı hücreleri tarafından; Bu, kırmızı hücrelerin yavaşça damar lümeni salınım mikrodamar segmentinin uzak ucunda hidrostatik mikrodamar basıncı (P c) ölçen bir denge basıncı belirler. Bu denge basıncının üzerindeki tüm basınçlarında gemi perfüzyon koruyun. </li></ol> 7. Microocclusion ve Veri Toplanması <ol><li> İsteğe bağlı adım: ucu tekrarlanan mikro sırasında deneysel gemi koruyan doku ince ped birikir o ana kadar herhangi bir gemiden mezenterinde olmayan bir kullanım alanına doku bastırın, gemi engellemek için mikro-tıkayıcı kullanmadan önce tıkanıklıklar. </li><li> Mikroskop alanının alt kenarına yakın perfüze geminin üstünde engelleyici yerleştirin. </li><li> Video ve ses ile aşağıdaki kaydedilir. <ol><li> Sözlü blok sitenin konumu ve mercek retikül görüldüğü gibi düşük ekran kenarını kaydedin. </li><li> Ucu ilesadece mikro damarın üzerine yerleştirilen bloker, geminin akım tıkalı kadar yavaşça engelleyici düşürmek için mikromanipülatör ince z denetimini kullanın. Ses üzerine manometre basıncı (P c) unutmayın. 3-10 saniye tipik tıkanıklığı uygulayın ve daha sonra serbest perfüzyon geri, bırakın. , Zamana dayalı 5-10 mikron adımlarla (&gt; bir yerinde ilk bloktan sonra 5 dakika), tıkanıklığı sayısı (3-5) pipet doğru geminin yukarı blok siteyi taşı blok yerinde damar duvarı hasarı önlemek için . </li></ol></li></ol> Veri ve L p Ölçümü 8. Analizi (Su Geçirgenliği) <ol><li> Video oynatımı sırasında, bir sahne mikrometre ve görüntüleri bilinen pozisyonların bir görüntünün kullanımı ile tıkanıklığı sitesine işaretleyici kırmızı hücreden ilk mesafeyi (ℓ 0) belirler. Kaydedilen görüntülerin 3-10 sn boyunca çeşitli çerçevelerde konumundan işaretleyici hücrenin ilk hızı (dℓ / dt) belirleyin. CaydırmakMaden tıkanıklığı (Şekil 3) sırasında çekilen görüntülerden damar yarıçapı (r). </li><li> Hesapla J v / S (dℓ / dt) × (1 / ℓ 0) × (r / 2) Her tıkanıklığı için. Sürüş basıncı bölü (J v / S) olarak sabit basınçta L p hesaplayın (mikrovasküler basıncı - Etkili kolloid osmotik basınç, Tartışma bakın). </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Gemi serbestçe perfüze iken transvasküler sıvı hareketi meydana rağmen L p hesaplamaları Detayları., Böyle bir değişim damar perfüzyon oranının% 0.01&#39;den az, genellikle, çünkü serbest perfüzyon sırasında ölçülecek kadar çok küçük. Perfüzyon geçici mikrodamar, transvasküler akışını kapatılmasıy durdurulur Ancak, (yani, filtrasyon) &#39;de gösterildiği kısaltır gibi işaretleyici kırmızı hücre ve tıkanma sitenin arasında sıvı sütun olarak l?...

Damar sisteminde sayılı Şekilde, mikro çapı genellikle 40 um den az bir kan damarının bir mikropipet vasıtasıyla bilinen bir bileşimin, yapay bir perfüzat akışını kontrol kuran gerektirir. Perfüze gemi normal doku ortamında kalır ve Kanülasyonu zaman hayvanın kanı yukarı ile perfüze. In situ sayılı Şekilde, mikro video görüntüleme veya florometrik bir dizi teknik ile bağlantılı olarak kullanıldığında bu akışları için itici güçler bilinmektedir ve vasküler duvarın geçirgenlik özellikleri olabilir koşullar altında mikro damarların duvarları arasında, su ve çözünmüş madde akımlarının ölçümü sağlar doğrudan değerlendirildi. Bundan başka, doku mikrodamar (perfüze ve superfusate), çevreleyen sıvı bileşimlerini kontrol ederek, mikrovasküler geçirgenliğin ve değişim düzenlenmesi e maruz bırakılmış olan mikrodamar duvarı oluşturan endotelial hücreler sağlayarak araştırılabilirXperimental koşullar zaman tam ölçülen süreler (saat sn) için (agonistler, modifiye perfüzyon koşulları, floresan göstergeler içi kompozisyon ve sinyalizasyon ölçmek için). Buna ek olarak, bariyer düzenleyen önemli hücresel molekül yapılarının ultrastrüktürel ya sitokimyasal değerlendirmeler geçirgenliği ile doğrudan ölçüldüğü aynı Mikro damarların içinde araştırılabilir. Yaklaşım ve böylece kültürlü endotel hücre mono tabakaları ve bozulmamış mikrodamarlar soruşturma endotel bariyer fonksiyonunu değiştirmek için hücresel ve moleküler mekanizmalar soruşturma arasında bir köprü oluşturmaktadır. Daha fazla değerlendirme 1-6 aşağıdaki bakın. Şekilde, mikro bir sınırlaması, sadece ince, saydam ve bir cam mikropipet ile kanülasyon mümkün kılmak için yeterli yapısal bütünlüğe sahip mikrovasküler yatak kullanılabilir olmasıdır. Erken araştırmalar mezenter ve ince deri pektoris m kurbağa mikrodamarlar kullanılır iken7,8 uscle, bugüne kadar memeli modellerinde en sık kullanılan hazırlama sıçan mezenter 9-15 olduğunu. Çoğu araştırmalar 1-4 saatlik sürelerde çalışılan damar geçirgenliği akut değişiklikler üzerinde duruldu, ama daha yeni araştırmalar bir başlangıç ​​perfüzyon 12,16 sonra bireysel damarlarda ölçümler 24-72 saat genişletilmiştir. Bu iletişimde açıklanan yöntemleri etkinleştirmeniz gerekir vasküler geçirgenlik yönetmelik 17 eğitim için daha genetiği değiştirilmiş fare modelleri kullanılabilir hale getirmek için söz yeni geliştirilen CRISPR teknolojisi, bu yeni ve önemli sıçan modellerinde mezenterin venüler mikrodamarlar uygulanacak. Yöntem perfüze gemiye yakın ve geminin bir perfüzyon mikropipet hizalamak için pozisyon microtools için kullanılan hayvan hazırlama ve en az üç mikromanipülatörler hem alacak kadar büyük bir özel inşa mikroskop aşaması ile donatılmış bir inverted mikroskop gerektirirlümen. Örneğin, bir xy mikroskop sahnede (yaklaşık 90 × 60 cm) için özel bir platform pas geçirmez kaplama ile 1 cm kalınlığında çelik levha imal edilebilir. Sahne, bir mühendislik dizin tablosunun veya yatay düzlemde hareket için Teflon sütunlar ya da Bilya üzerinde dik açılarda monte edilir ve desteklenen iki kırlangıç ​​kuyruğu slaytlar takılır. Tipik bir teçhizat (Şekil 2), vasküler düz tek damar kan akışını ve hematokrit, kan perfüze mikrodamarlar yerel oksijen teslimat, yönetmelik ölçmek için böyle olanlar gibi intravital mikrodolaşım deneyler bir dizi için kullanılan mikroskop ve micropositioning ekipmanları ile ortak çok şey var kas tonu, ve bütün dolaşıma enjekte floresan izleyiciler yerel mikrovasküler birikimi. 18-26 Tekniğin temel yönü mikrodamar duvarının belirlenmiş bir yüzey alanı (S) boyunca hacimsel akış (J v) ölçülmesidir. BaşarmakBu, burada açıklanan modifiye Landis tekniği ile basit bir ters mikroskop yeterlidir. Küçük bir video kamera ilave bir zaman baz ile, bir video monitöründe gösterildi ve bir bilgisayara bir dijital formda veya bir video kayıt cihazı üzerinde dijital veya analog bir sinyal olarak kaydedilebilirler, görüntü portu ve video sinyali üzerine monte edilir. Mikrodamar kanüle sonra kamera görülebilir mikro damarın kısmı kanülasyonu bozmadan bir birim olarak sahne ve manipülatörler taşıyarak değiştirilebilir. Transvasküler akımlarının ölçümü aynı zamanda, çözünmüş madde geçirgenliği, sitoplazmik kalsiyum ya da diğer hücresel mekanizmaları ve konfokal görüntüleme 6,12,13 floresan oranı izleme ölçümleri için kullanılan donanımları olarak uygun filtreler ile gelişmiş bir floresans mikroskobu kullanılarak daha ayrıntılı inceleme ile birleştirilebilir 27. Tüm Şekilde, mikro yaklaşımların önemli bir avantajı, aynı gemide tekrarlanan tedbirleri yapabilme yeteneği olduğunuGibi hidrostatik ve onkotik basınçları, ya da iltihabi durumların damar yanıtlarında kaynaklı değişim olarak itici güç kontrollü değişim altında. En yaygın tasarım, ikinci bir pipet ile, daha sonra bir taban çizgisi geçirgenliği durumunu tesis eden ilk bir kontrol perfüzat ve eritrosit süspansiyonu ile doldurulmuş bir mikropipet ile perfüze gemi ile aynı kap üzerinde ölçülen hidrolik iletkenliği (L p), bir çift karşılaştırmasıdır Test maddesi ile perfüzat ilave edildi. Birden kanülasyonlar kontrol pipet ile reperfüzyon sonra tekrar çevrimi ile mümkündür. Bu protokol, mikrodamar duvarı boyunca su akıları kayıt ve damar duvarının L p, sağlam boyunca su ve çözünen maddelerin ortak yolunun geçirgenliği yararlı bir kırılma indeksinin ölçülmesi için sıçan mezenter bir venüler kabın kanül ve Şekilde, mikro göstermektedir endotel bariyer. Prosedür modifiye Landis techniq adlandırılırue, çünkü 28 korunur bloke perfüzyona başlanmasından transvasküler sıvı alışverişi bir ölçüsü olarak, kırmızı hücrelerin göreceli hareketlerini kullanarak orijinal Landis prensibi ancak deneysel koşullar aralığı (örneğin, mikro-damar duvarı boyunca hidrostatik albumin onkotik basınç farkları) Şekilde, mikro sonra kullanılabilir uncannulated kan perfüze mikrodamarlar 8,29 oranla çok daha fazladır.

<table><tbody><tr><td>MICROSCOPE, TABLE AND STAGE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example</td><td>Olympus</td><td>CK-40</td><td>try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators</td></tr><tr><td>inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example</td><td>Leica</td><td>DMIL</td><td>try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators</td></tr><tr><td>narrow diameter, long working distance objective: example</td><td>Nikon</td><td>Nikon E Plan 10&amp;times;/0.25 LWD</td><td></td></tr><tr><td>stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel</td><td>welding shop</td><td></td><td>this should be heavy to reduce vibration</td></tr><tr><td>Unislide x-y table: dove tail slides</td><td>Velmex</td><td>AXY4006W1</td><td></td></tr><tr><td>VIDEO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD video camera: example</td><td>Pulnix</td><td>TM-7CN (no longer available)</td><td>no color needed</td></tr><tr><td>video capture system with audio--generic</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>video playback system (completely still frame, single frame motion)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>small microphone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICROMANIPULATORS, HOLDERS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator, XYZ (3)</td><td>Prior/Stoelting (no longer available)</td><td></td><td>look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning</td></tr><tr><td>hydraulic probe drive, one way</td><td>FHC</td><td>50-12-1C</td><td>need to buy either manual drive or electronic drive</td></tr><tr><td>manual drum drive&amp;nbsp;</td><td>FHC</td><td>50-12-9-02</td><td></td></tr><tr><td>or hydraulic drive, 3 way</td><td>Siskiyou Corporation</td><td>MX610 (1-way) or MX630 (3-way)</td><td>great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years</td></tr><tr><td>connectors/rods/holders</td><td>Siskiyou Corporation</td><td>MXC-2.5, MXB etc.</td><td></td></tr><tr><td>pin vise</td><td>Starrett</td><td>162C</td><td>to hold restrainer</td></tr><tr><td>pipette holder</td><td>World Prescision Instruments</td><td>MPH3</td><td></td></tr><tr><td>water manometer ~120 cm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICROSCOPE TRAY</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>clear Plexiglas for microscope tray for animal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall</td><td>Quartz Scientific Inc.</td><td>custom</td><td>&amp;nbsp;(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective</td></tr><tr><td>Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>medical adhesive for tissue well</td><td>NuSil</td><td>MED-1037</td><td></td></tr><tr><td>All-purpose silicone rubber heat mat, 5&quot; L x 2&quot; W</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-03125-20</td><td>heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available</td></tr><tr><td>Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-03122-75</td><td></td></tr><tr><td>STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-01575-00</td><td></td></tr><tr><td>PIPET MANUFACTURE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vertical pipette puller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-30 with nichrome filament</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mm OD thin wall capillary tubing</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>B150-110-10</td><td></td></tr><tr><td>pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text</td><td></td><td></td><td>or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments</td></tr><tr><td>RX Honing Machine, System II</td><td>RX Honing Machine Corporation</td><td>MAC-10700 Rx System II Machine</td><td>alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp; with ceramic sharpening disc</td><td>RX Honing Machine Corporation</td><td></td><td>use &quot;as is&quot; or attach lapping film</td></tr><tr><td>lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um</td><td>3M</td><td>part no. 051144 80827</td><td>268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon</td></tr></tbody></table>

microperfusion technique to investigate regulation of microvessel permeability in rat mesentery

Bireysel perfüze mikrodamarlar geçirgenlik özelliklerini ölçmek için deneyler kültürlü endotel hücre mono tabakaları ve tüm mikrovasküler yatak fonksiyonel değişim özelliklerinde damar geçirgenliğini düzenleyen moleküler ve hücresel mekanizmaların araştırılması arasında bir köprü oluştururlar. Kanül ve sıçan mezenter venüler mikrodamarlar serpmek mikrodamar duvarının hidrolik iletkenliği ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Gerekli temel ekipmanları üç farklı microtools konumlandırmak için mikromanipülatörler destekleyen büyük bir modifiye sahne ile bir intravital mikroskop içerir: (1) bir eğimli cam mikropipet cannulate ve mikrodamar serpmek için; (2) bir cam mikro-tıkayıcı geçici perfüzyon blok ve ölçülü bir hidrostatik basınçta transvasküler su akış hareketinin ölçülmesine olanak tanıyan, ve (3) kör bir cam çubuk kanül yerinde mezenterik doku dengelenmesi için. Modifiye Landis mikro oklüzyon technique mikrodamarlar karşısında bu kadar deneysel koşullar değiştiğinde akımları ve hidrostatik ve kolloid osmotik basınç farkı tekrarlanan ölçümler titizlikle kontrol edilir kılar da transvasküler sıvı hareketinin belirteçleri olarak yapay perfüzat içinde asılı kırmızı hücreleri kullanır ve. Sonra ilk deneme Perfüzatlar aynı mikro damarın yeniden kanülasyondan sonra, bir kontrol perfüzyon kullanarak hidrolik iletkenlik ölçümleri bu iyi kontrollü koşullar altında mikrovasküler yanıt karşılaştırmalar eşleştirilmiş etkinleştirin. Vasküler geçirgenliği değiştirmek için beklenen genetik değişiklikler ile farelerin mezenterinde mikrodamarlar yöntemi genişletmek için girişimleri nedeniyle fare mezenterinde uzun düz ve dalsız mikrodamarlar yokluğu ciddi sınırlı, ama benzer genetik değişikliklerle sıçanların son durumu kullanarak CRISPR / Cas9 teknolojisi burada tarif edilen yöntemler uygulanabilir soruşturmanın yeni alanlar açılması bekleniyor. </p&gt;

Şekil 4, dört Perfüzatlar art arda kanüle mikro damarın venüler bir sıçan L p değişikliklerin zaman sürecini ölçmek sonuçlarını gösterir. 33 sabit bir basınçta hesaplanan L p büyüklüğü mikrodamar duvarı geçirgenliği değişikliklerin bir ölçüsü olarak kullanılmıştır, ilk olarak gemi 10 nM Bk içeren ikinci bir mikropipet kullanılarak enflamatuar ajan bradikinin (Bk) maruz kalmıştır sonra% 1 sığır serum albümini ihtiva eden bir p...

Watch this Scientific Journal Video about Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery at JoVE.com

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Şekilde, mikro Tekniği Sıçan mezenter mikrodamar geçirgenliği Yönetmelik Araştırma

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

microperfusion-technique-to-investigate-regulation-microvessel

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K Görüntüleme.  University of California Davis. The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions. 

Video: Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune cells, and the coordination with lymphatic vessels and nerves. The multi-cell, multi-system interactions necessitate the investigation of angiogenesis in a physiologically relevant environment. Thus, while the use of in vitro cell-culture models have provided mechanistic insights, a common critique is that they do not recapitulate the complexity associated with a microvascular network. The objective of this protocol is to demonstrate the ability to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks before and after angiogenesis stimulation in cultured rat mesentery tissues. Cultured tissues contain microvascular networks that maintain their hierarchy. Immunohistochemical labeling confirms the presence of endothelial cells, smooth muscle cells, pericytes, blood vessels and lymphatic vessels. In addition, labeling tissues with BSI-lectin enables time-lapse comparison of local network regions before and after serum or growth factor stimulation characterized by increased capillary sprouting and vessel density. In comparison to common cell culture models, this method provides a tool for endothelial cell lineage studies and tissue specific angiogenic drug evaluation in physiologically relevant microvascular networks.

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.

bir<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Yöntem kültürlü Rat Mezenterik Mikrovasküler Ağları Time-Lapse Görüntüleme için

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Gelişim Biyolojisi

Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic response is a key regulator of local blood flow. In isobaric conditions small resistance arteries develop sustained constriction known as myogenic tone (MT), which is a major determinant of systemic vascular resistance (SVR). Hence, ex vivo&#160;pressurized preparations of small resistance arteries are major tools to study microvascular function in near-physiological states. To achieve this, a freshly isolated intact segment of a small resistance artery (diameter ~260 &#956;m) is mounted onto two small glass cannulas and pressurized. These arterial preparations retain most in vivo characteristics and permit assessment of vascular tone in real-time. Here we provide a detailed protocol for assessing vasoactivity in pressurized small resistance mesenteric arteries from rats; these arteries develop sustained vasoconstriction - approximately 25% of maximal diameter - when pressurized at 70 mmHg. These arterial preparations may be used to study the effect of investigational compounds on relationship between intra-arterial pressure and vasoactivity and determine changes in microvascular function in animal models of various diseases.

Pressure myography is used to assess vasoactivity of small arteries that develop sustained constriction when pressurized. This manuscript provides a detailed protocol to assess in isolated segments of small mesenteric arteries from rats, vasoactivity and the effect of intraluminal pressure on vascular diameter.

Basınç myography kullanma Direnç Mezenterik Arter ise andMyogenic Tepkisi ve vazoaktiviteye Değerlendirilmesi

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

Tıp

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

Farelerde mesenteriumda Damarlardaki intravital Mikroskopi Lökosit-endotelyal ve Trombosit-lökosit Etkileşimleri

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

Rat mezenter Anjiyogenez Testi

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

Biyoloji

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

Sıçan mezenter eksteriorizasyon: Anjiogenez ilgilendim Hücresel Dinamikler araştırılması için Bir Model

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other vessels), and describes techniques for evaluating tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry (LDF) and microvessel density utilizing fluorescently labeled Griffonia simplicifolia (GS1) lectin. Current methods for studying isolated resistance arteries at transmural pressures encountered in vivo and in the absence of parenchymal cell influences provide a critical link between in vivo studies and information gained from molecular reductionist approaches that provide limited insight into integrative responses at the whole animal level. LDF and techniques to selectively identify arterioles and capillaries with fluorescently-labeled GS1 lectin provide practical solutions to enable investigators to extend the knowledge gained from studies of isolated resistance arteries. This paper describes the application of these techniques to gain fundamental knowledge of vascular physiology and pathology in the rat as a general experimental model, and in a variety of specialized genetically engineered &#34;designer&#34; rat strains that can provide important insight into the influence of specific genes on important vascular phenotypes. Utilizing these valuable experimental approaches in rat strains developed by selective breeding strategies and new technologies for producing gene knockout models in the rat, will expand the rigor of scientific premises developed in knockout mouse models and extend that knowledge to a more relevant animal model, with a well understood physiological background and suitability for physiological studies because of its larger size.

This manuscript describes in vitro video microscopy protocols for evaluating vascular function in rat cerebral resistance arteries. The manuscript also describes techniques for evaluating microvessel density with fluorescently labeled lectin and tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry.

Sıçan izole direnç arter Video mikroskobu kullanan vasküler kontrol mekanizmalarının değerlendirilmesi

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

İzole Kan-perfüze Sıçan Akciğer Hazırlık Tek Mikrodamar Geçirgenliği miktarının

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion pressure. However, it is difficult to monitor the dynamic changes of the coronary arterioles and the capillaries in the whole heart, primarily due to its motion and non-stop beating. Here we describe a method that enables monitoring of arterial perfusion rate, pressure and the diameter changes of the arterioles and capillaries in mouse right ventricular papillary muscles. The mouse septal artery is cannulated and perfused at a constant flow or pressure with the other dynamically measured. After perfusion with a fluorescently labeled lectin (e.g., Alexa Fluor-488 or -633 labeled Wheat-Germ Agglutinin, WGA), the arterioles and capillaries (and other vessels) in right ventricle papillary muscle and septum could be readily imaged. The vessel-diameter changes could then be measured in the presence or absence of heart contractions. When genetically encoded fluorescent proteins were expressed, specific features could be monitored. For examples, pericytes were visualized in mouse hearts that expressed NG2-DsRed. This method has provided a useful platform to study the physiological functions of capillary pericytes in heart. It is also suitable for studying the effect of reagents on the blood flow in heart by measuring the vascular/capillary diameter and the arterial luminal pressure simultaneously. This preparation, combined with a state-of-the-art optic imaging system, allows one to study the blood flow and its control at cellular and molecular level in the heart under near-physiological conditions.

Presented here is a protocol to study the coronary microcirculation in living murine heart tissue by ex vivo monitoring of the arterial perfusion pressure and flow that maintains the pressure, as well as vascular tree components including the capillary beds and pericytes, as the septal artery is cannulated and pressurized.

Fare Kalbinde Kılcal Damarlar, Arterioles ve Perisitlerin Dinamik Ölçümü ve Görüntülenmesi

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion ...

A Fluorescence Assay for Evaluating the Permeability of a Cardiac Microvascular Endothelial Barrier in a Rat Model of Ischemia/reperfusion

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the best strategy for improving the clinical prognosis of patients with acute coronary syndrome (ACS). Nonetheless, myocardial reperfusion following effective revascularization can trigger significant cardiomyocyte death and coronary endothelial collapse, known as myocardial ischemia/reperfusion injury (MIRI). Usually, endothelial cells and their intercellular tight junctions cooperatively maintain the microvascular endothelial barrier and its relatively low permeability but fail in reperfusion areas. 
Microvascular endothelial hyperpermeability induced by ischemia/reperfusion (IR) contributes to myocardial edema, increased infiltration of pro-inflammatory cells, and aggravated intramyocardial hemorrhage, which may worsen the prognosis of ACS. The tracer used in this study-70,000 Da FITC-dextran, a branched glucose molecule labeled by fluorescein isothiocyanate (FITC)-appears too large to infiltrate the cardiac microvascular endothelium in normal conditions. However, it is capable of infiltrating a broken barrier after MIRI. Thus, the higher the endothelial permeability is, the more FITC-dextran accumulates in the extravascular intercellular space. Thus, the intensity of fluorescence from FITC can indicate the permeability of the microvascular endothelial barrier. This protocol takes advantage of FITC-dextran to evaluate the cardiac microvascular endothelial barrier functionally, which is detected by an automated quantitative pathology imaging system.

Here, we describe a method to functionally assess the endothelial barrier of cardiac microvessels after ischemia/reperfusion injury via the measurement of the mean fluorescence intensity of extravasated 70,000 Da FITC-dextran in comparison with Evans Blue.

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the ...

<meta charset="utf8"></head><body>I/R Hasarı Sırasında Lökosit Yapışması ve NET Oluşumunda Endotelyal PAR1 Rolü

Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Mesenteric Venules After Mesenteric Ischemia-Reperfusion Injury via Intravital Microscopy

Intestinal ischemia-reperfusion (I/R) injury is an acute condition characterized by tissue damage resulting from restricted blood flow to the mesenteric vessels, leading to both local and systemic pathologies with a poor prognosis. Both ischemia and reperfusion trigger a series of cellular and molecular responses, with inflammatory cells serving as key regulators of the pathology. These interactions with the ischemic endothelium are mediated by multiple adhesion receptors. Several animal models have been established to mimic this pathology and investigate the involved molecular pathways. In this study, a microsurgical model of I/R injury is combined with intravital microscopy to visualize leukocyte rolling, adhesion, and neutrophil extracellular trap (NET) formation. This model is applied to transgenic mice deficient in endothelial PAR1 (F2r) to assess the impact of PAR1 on leukocyte rolling and NET formation 1 h after ischemia and immediately following reperfusion. In vivo, Acridine Orange leukocyte staining was employed, and NETs were visualized using a nucleic acid stain. Interestingly, reduced leukocyte adhesion and NET formation were observed in mice lacking the endothelial PAR1 receptor. This model enables the in vivo analysis of key regulators involved in I/R injury.

<meta charset="utf8"></head><body>Mezenterik İskemi-Reperfüzyon Yaralanması Sonrası Mezenterik Venüllerde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İntravital Mikroskopi ile Görüntülenmesi

This protocol presents a method for inducing mesenteric ischemia-reperfusion injury and visualizing neutrophil extracellular traps (NETs) in mesenteric venules using intravital microscopy. Blood flow in the superior mesenteric artery was restricted for 1 h, followed by reperfusion, allowing direct quantification of leukocyte adhesion and NETosis.

Mezenterik İskemi-Reperfüzyon Yaralanması Sonrası Mezenterik Venüllerde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İntravital Mikroskopi ile Görüntülenmesi

Intestinal ischemia-reperfusion (I/R) injury is an acute condition characterized by tissue damage resulting from restricted blood flow to the mesenteric ...