Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health subvenções HL44485 e HL28607.

Declaração de Ética: Todos os procedimentos foram revistos e aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional. 1. Fabricação preliminar de Micropipetas, contenção e bloqueadores <ol><li> Puxar vários tubos capilares de vidro de borosilicato limpas ao meio usando um extractor de electrónica ajustada de modo que, quando puxado, a parte alongada do tubo é de cerca de 1 cm de comprimento e as duas metades são um tanto simétrica. Certifique-se de que a vela é coerente com as dimensões em Figura 1. Use as duas metades para micropipetas, limitadores e bloqueadores. <ol><li> Bevel as micropipetas usando um rebolo ar impulsionado 30 com 0,5 um papel abrasivo banhado com água. Definir o ângulo do suporte de micropipeta de modo que é cerca de 30 graus a partir da horizontal. </li><li> Lave e seque as micropipetas usando sucção para puxar acetona limpa através da ponta e até o eixo. Inspecionar as micropipetas (Figura 1A), utilizando um pequeno microscópio vertical com 4 × 40 × objectivos e equipados com um titular micropipeta jacaré e um retículo ocular. </li><li> Seleccione micropipetas com abertura da ponta cerca de 50 um longo com um chanfro cuja relação comprimento / largura é de entre 3,1 e 3,5 e com um ponto agudamente afilada o que ajuda a penetrar nas fibras de colágeno difíceis no mesentério. </li><li> Armazenar 15-20 micropipetas de tamanhos ligeiramente diferentes em uma caixa livre de poeira. </li></ol></li><li> Faça limitadores utilizando tubos capilares puxados preparados no passo 1.1). Segurar um tubo capilar de vidro removido brevemente perto de uma microflame para formar uma extremidade romba (Figura 1B). Armazenar vários em uma caixa livre de poeira. </li><li> Faça microoccluders utilizando tubos capilares puxados preparados no passo 1.1). Segure um tubo capilar puxado sob uma microflame e dobre (usando um adaptador de tubulação, por exemplo., 23G), a ponta fina (cerca de 4 mm a partir da ponta) para fazer um ângulo de cerca de 120 graus para o eixo ( <sTrong&gt; Figura 1C). Fazer e armazenar vários. </li></ol> 2. Preparação animal e Cirurgia <ol><li> Anestesiar ratos fêmea Sprague-Dawley macho (350-450 g) ou (200-300 g) com pentobarbital de sódio (80-100 mg / kg, Sigma-Aldrich, P3761), por injecção subcutânea; proteger o mesentério, não utilizando injecção intraperitoneal. </li><li> Ao longo de procedimentos cirúrgicos e protocolos experimentais, manter a anestesia por injecções suplementares (30 mg / kg), conforme necessário. Determinar a profundidade da anestesia por pitada dedo do pé ou reflexo da córnea. Após a conclusão do procedimento experimental, a eutanásia através de sobredosagem de pentobarbital de rato ou injecção intra-cardíaca de cloreto de potássio saturado, sob anestesia. </li></ol> 3. Prepare Soluções e Erythrocytes para uso como marcadores de fluxo <ol><li> Preparar a solução de Ringer de mamífero para a solução de controlo e superfusate perfusato (solução de Ringer contendo 10 mg / ml de ácido gordo de mamífero normalmentealbumina livre de soro bovino, BSA). <ol><li> Perfusato filtro através de 0.2 mm filtros de seringa para remover partículas minúsculas que podem bloquear a ponta micropipeta; filtrar para pequeno recipiente limpo. </li></ol></li><li> Prepare eritrócitos por tiragem de cerca de 0,2 ml de sangue a partir da veia da cauda do rato anestesiado em uma agulha 20G num pequeno seringa contendo 0,05 ml de heparina (1000 U / ml) e transferir para um tubo de centrífuga de 15 ml contendo cerca de 14 ml de mamífero solução de solução de Ringer . <ol><li> Centrifugar para embalar suavemente as células vermelhas (cerca max 200 x g durante 7 min). Empate fora o sobrenadante e re-suspender as células vermelhas em solução de Ringer. </li><li> Após centrifugação e remoção do sobrenadante, três vezes deixar os glóbulos vermelhos no fundo do tubo para uso posterior. Note-se que este processo reduz as plaquetas em perfusatos finais para menos do que 0,1% dos níveis normais de 31. </li></ol></li></ol> 4. Organizar o tecido no animalBandeja <ol><li> Raspar o abdome do rato anestesiado abaixo do umbigo ao apêndice xifóide. Assegure-se que a área raspada se estende em torno do lado direito (para o rato colocado no lado direito), de modo que o cabelo não se forma um pavio para desenhar o superfusate fora do tecido bem. Remover cabelos cortados com uma gaze molhada ou tecido. <ol><li> Segurar a pele com uma pinça sem corte serrilhada e fazer uma incisão no centro da linha (2-3 cm de comprimento) através da pele utilizando uma tesoura resistentes. Usando uma multa (íris) tesoura fazer uma incisão semelhante através da linha alba, levantando a parede abdominal com uma pinça serrilhada para evitar danos ao intestino. </li><li> Com o animal em seu lado na bandeja do animal, puxe cuidadosamente o intestino a partir da cavidade abdominal utilizando aplicadores com ponta de algodão (vara de madeira) embebidos em solução de Ringer e uma pinça sem corte serrilhadas. Organizar o intestino no tecido bem para que o mesentério é estendida sobre o pilar para visualização através do microscópio tendo o cuidado de evitar tocar o mesentério (potentially danificar microvasos), quer com fórceps ou algodão. Nota: O tabuleiro do animal (Figura 2A) pode ser construído a partir de Plexiglas e requer um tecido bem (aproximadamente 3 mm de profundidade), uma coluna opticamente transparente (por exemplo, quartzo polido cerca de 2 cm de diâmetro e 5 mm de altura.), E uma almofada de aquecimento ajustada para manter a temperatura do animal. A espessura do pilar não deve exceder a distância de trabalho do objectivo. </li></ol></li><li> Posição da bandeja do animal sobre a platina do microscópio de modo que o mesentério é visível através das oculares. </li><li> Posicione uma linha de gotejamento alimentado por gravidade para superfuse continuamente o mesentério com solução de Ringer de mamífero mantida a 35-37 ° C. Use compressas de gaze para manter o intestino no lugar, ajudar a reter a umidade, e pavio excesso de solução de Ringer fora da superfície. Ajustar o fluxo e aspirar o efluente para manter uma espessura superfusate consistente. </li><li> Identificar alvo microvasos venulares, que sãonão ramificados segmentos a jusante do fluxo convergente, um ou dois ramos distais aos verdadeiros capilares. Encontrar um vaso não ramificada (de preferência, 600 a 1000 um de comprimento) com o fluxo de sangue livre e rápida de células brancas que furam na parede do vaso. </li><li> Posicionar o teste de microvasos no centro do campo do microscópio e mover o limitador para a posição perto do sítio de canulação escolhido. </li></ol> 5. Preencha Micropipeta e Monte em Detentor <ol><li> Pouco antes da canulação, suspender as células vermelhas no perfusato. Adicionar 7 ul de eritrócitos a 0,5 ml de perfusato em um tubo de ensaio limpo borosilicato. Nota: hematócritos de 1-3% pode ser usado, mas hematócrito consistente levará a concentrações de perfusão consistente de qualquer substâncias libertadas a partir das células vermelhas. </li><li> Caber numa seringa de 1 ml com um adaptador de tubulação de 23G e PE 50 tubos (5-15 cm de comprimento). Desenha-se a mistura de células do perfusato / vermelho para dentro da seringa. Inverta a seringa para misturar e expulsar todas as bolhas de tubulação eadaptador. Para maior eficiência, ajuste tubulação para várias seringas antes do experimento começa e mantê-los em uma caixa livre de poeira ou saco plástico. </li><li> Encher a micropipeta com o avanço do tubo na extremidade mais larga da micropipeta até a mesma se encostar a região cónica. Aplicar um empurrão rápido suave sobre o êmbolo da seringa para encher a ponta da micropipeta. Nota: Um pequeno córrego ou uma gota deve ser visível na ponta para comprovar o preenchimento completo. </li><li> Retirar o tubo enquanto empurrando suavemente o êmbolo para preencher a parte mais larga do eixo micropipeta. Remover pequenas bolhas no grande eixo sacudindo cuidadosamente o eixo micropipeta. Nota: Um procedimento semelhante foi ilustrado 32. </li><li> Coloque a micropipeta em um suporte da pipeta com uma porta lateral que permite uma ligação de fluido contínuo a um manómetro de água. Assegure-se que o suporte, o qual está ligado a um accionamento hidráulico usado para controlar o avanço muito fina da micropipeta, é com um ligeiro ângulo (15-25 °)com a horizontal, de modo que a aresta do cone micropipeta não atingiu o intestino ou o tabuleiro. </li><li> Montar a unidade hidráulica de um micromanipulador móvel, que tem x, y, z e unidades para permitir alinhamento próximo ao recipiente de ensaio (Figura 2). </li><li> Ajustar a pressão hidrostática aplicada ao fluido na micropipeta com uma seringa ou ampola de borracha cheio de água, para alterar a altura do fluido na coluna de água do manómetro de cerca de 40 cm H 2 O acima do mesentério. </li><li> Canular o de microvasos, logo que possível depois de encher a pipeta; células vermelhas assentar no fundo da pipeta, de modo que após cerca de 40 min muito poucas células vermelhas irá fluir para o vaso. </li></ol> 6. Microcannulation e microvasculares Medição Pressão <ol><li> Antes de posicionar a micropipeta preenchido sob o microscópio, pressione suavemente a restrição sobre o tecido perto do microvasos aplicar força suficiente para segurar o tecido. Desenhe olimitador de volta, que se estende ligeiramente o tecido de acordo com o de microvasos, de modo que as tensões nas fibras de colagénio mesentéricos são alinhados com o navio. <ol><li> Alinhe a micropipeta com a embarcação e abaixe-o na vista através das oculares. Colocar a ponta imediatamente a montante do sítio de canulação escolhido e colocá-la sobre o tecido, de modo que possa obstruir parcialmente o fluxo no interior do recipiente, mas isso não ocluir. </li></ol></li><li> Canular o navio dirigindo a ponta da pipeta lentamente para o lúmen do vaso usando a unidade hidráulica. Ter cuidado para não apertar através do lado inferior do recipiente. Observação: Como a micropipeta entra no lúmen, o perfusato lava-se rapidamente o sangue no vaso para fora do lúmen e flui livremente perfusato em circulação distal do animal ao teste de microvasos, deslocando algumas das perfusão normal do sangue nos vasos jusante. </li><li> Diminuir a pressão de perfusão, ajustando o manómetro até que o sangue (conforme indicadopelas células vermelhas do animal) é atraído de volta para o segmento de perfusão; esta determina a pressão de equilíbrio onde os glóbulos vermelhos oscilar suavemente no lúmen do vaso e mede a pressão hidrostática de microvasos (P C) na extremidade distai do segmento de microvasos. Manter a perfusão navio em todas as pressões acima essa pressão equilíbrio. </li></ol> 7. Microocclusion e Coleta de Dados <ol><li> Passo opcional: Antes de usar o micro-oclusor para bloquear o recipiente, que pressiona para o tecido numa zona não utilizada de mesentério longe de qualquer recipiente de modo que a ponta se acumula uma fina camada de tecido que protege o recipiente experimental durante micro repetido oclusões. </li><li> Colocar o bloqueador de cima do vaso perfundido perto da borda inferior do campo do microscópio. </li><li> Grave o seguinte com vídeo e áudio. <ol><li> Verbalmente registar a localização do sítio de bloqueio e o bordo inferior da tela, como visto no retículo ocular. </li><li> Com a pontado bloqueador colocado imediatamente acima do de microvasos, utilizar o controlo Z fina do micromanipulador para diminuir suavemente o bloqueador até que o fluxo no vaso está ocluso. Observe a pressão do manômetro (P c) em áudio. Aplicar oclusão normalmente para 3-10 segundos e solte, restaurando a perfusão livre. Mover o site quadra até o navio em direção à ponta da pipeta em 5-10 mm etapas com base no tempo (&gt; 5 min após o bloco inicial em um site), número de oclusões (3-5), para evitar danos da parede do vaso no local bloco . </li></ol></li></ol> 8. Análise de Dados e Medição da L p (de água) <ol><li> Durante a reprodução de vídeo, determinar a distância inicial (ℓ 0) a partir de um marcador de células vermelhas para o local de oclusão através da utilização de uma imagem de um micrómetro de plataforma e as posições conhecidas sobre as imagens. Determinar a velocidade inicial (dl / dt) da célula de marcador a partir da sua posição em vários quadros durante a 3-10 segundos de imagens gravadas. Dissuadirmina o raio do vaso (r) a partir das imagens captadas durante a oclusão (Figura 3). </li><li> Calcular J v / S para cada oclusão como (dl / dt) x (1 / ℓ 0) x (r / 2). Calcular G P a uma pressão constante como (J v / S) dividida pela pressão de condução (microvasos pressão - a pressão osmótica colóide eficaz; ver discussão). </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Detalhes dos cálculos de L p. Embora o movimento fluido transvascular ocorre enquanto o navio é perfundido livremente, essa troca é pequena demais para ser medido durante a perfusão livre porque é tipicamente menor do que 0,01% da taxa de perfusão navio. No entanto, quando a perfusão é transitoriamente interrompido por oclusão da micro-vasos, o fluxo transvascular (isto é, por filtração) é medido a partir do movimento das células marcador vermelho no lúmen que a coluna de líq...

Microperfusão na vasculatura inclui estabelecer um fluxo de perfusato artificial de composição conhecida controlada através de uma micropipeta em um vaso sanguíneo geralmente menos de 40 um de diâmetro. O recipiente continua a ser perfundido no seu ambiente de tecido normal e é perfundido com sangue do animal até ao momento da punção. Quando usado em conjunto com uma série de imagens de vídeo ou técnicas fluorométricos, em microperfusão situ permite a medição de fluxos de água e de solutos através das paredes de microvasos em condições onde as forças de condução para estes fluxos são conhecidos e as propriedades de permeabilidade da parede vascular podem ser avaliada diretamente. Além disso, por controlo da composição do líquido que rodeia o de microvasos no tecido (perfusado e superfusate), a regulação da permeabilidade microvascular e podem ser investigadas de câmbio, permitindo que as células endoteliais que formam a parede de microvasos para ser exposta a uma variedade de econdições Xperimental (agonistas, condições de perfusão modificados, indicadores fluorescentes para medir a composição e sinalização intracelular) por períodos precisamente medidas de tempo (seg a hr). Além disso, as avaliações ultra-estruturais ou citoquímicos de estruturas moleculares celulares chave que regulam a barreira pode ser investigadas no mesmo microvasos em que a permeabilidade está diretamente medidos. A abordagem assim, forma uma ponte entre a investigação dos mecanismos celulares e moleculares para modificar a função de barreira endotelial em monocamadas de células endoteliais cultivadas e investigação em microvasos intactas. Consulte os seguintes comentários para uma avaliação mais aprofundada 1-6. Uma limitação de microperfusão é que ela só pode ser utilizada em leitos microvasculares que são finas, transparentes e possuem integridade estrutural suficiente para permitir a canulação com uma micropipeta de vidro. Enquanto as primeiras investigações usado microvasos rã no mesentério e fino cutânea pectoris muscle 7,8, de longe, a preparação mais utilizada em modelos de mamíferos é o mesentério de rato 9-15. A maioria das investigações concentraram-se em alterações agudas na permeabilidade vascular estudado ao longo de períodos de 1-4 horas, mas as investigações mais recentes foram estendidos para medições em navios individuais 24-72 horas após uma perfusão inicial 12,16. A tecnologia CRISPR recentemente desenvolvido, que promete tornar mais modelos de ratos geneticamente modificados disponível para estudar regulação da permeabilidade vascular 17 deverá permitir que os métodos descritos na presente comunicação a ser aplicado em microvasos venulares do mesentério nestes novos modelos importantes de ratos. O método requer um microscópio invertido equipado com um estágio de microscópio construído sob encomenda suficientemente grande para conter tanto a preparação dos animais e, pelo menos, três micromanipuladores usadas para microferramentas posição próxima do vaso e perfundidos para alinhar uma micropipeta de perfusão com o naviolúmen. Por exemplo, uma plataforma personalizada para um estágio de microscópio XY (cerca de 90 × 60 cm) pode ser fabricada a partir de uma chapa de aço de 1 cm de espessura com um revestimento à prova de ferrugem. O palco está ligado a uma tabela de índice de engenharia ou duas lâminas de cauda de andorinha montados em ângulos retos e apoiados em pilares de teflon ou transferências bola para o movimento no plano horizontal. Um equipamento típico (ver Figura 2) tem muito em comum com o microscópio e microposicionamento equipamento utilizado para uma série de experimentos microcirculação intravital tais como aqueles para medir o fluxo único dos vasos sanguíneos e hematócrito, entrega local de oxigênio pelo sangue perfusão microvasos, regulação da liso vascular tônus ​​muscular, eo acúmulo microvascular local dos marcadores fluorescentes injetadas em toda a circulação 18-26. O aspecto fundamental da técnica é a medição do volume do caudal (J v) através de uma área de superfície definido (S) da parede de microvasos. Cumpriresta via a técnica Landis modificado aqui descrito um microscópio invertido simples é adequada. Uma pequena câmara de vídeo está montado na porta e o sinal de imagem de vídeo, com uma base de tempo adicional, é apresentada num monitor de video e registadas na forma digital num computador ou como um sinal digital ou analógico de um gravador de vídeo. Uma vez que a microvasculatura é canulada a porção do microvasos visível para a câmara pode ser alterado movendo o palco e manipuladores como uma unidade, sem perturbar a canulação. Medição dos fluxos transvascular pode também ser combinado com investigações mais detalhadas, utilizando um microscópio de fluorescência com filtros adequados sofisticados, tais como sondas utilizadas para as medições de permeabilidade soluto, fluorescente monitorização relação de cálcio citoplasmático ou outros mecanismos celulares, e imagiologia confocal 6,12,13, 27. Uma das principais vantagens de todas as abordagens microperfusão é a capacidade de fazer medidas repetidas, no mesmo navio, Sob a mudança controlada de força motriz, tais como pressões hidrostática e oncótica, ou mudança induzida em respostas dos vasos para condições inflamatórias. O design mais comum é uma comparação pareada da condutividade hidráulica medida (L p) no mesmo navio com o primeiro recipiente de perfusão através de uma micropipeta preenchido com um perfusato controle e suspensão de eritrócitos para estabelecer um estado permeabilidade da linha de base, em seguida, com uma segunda pipeta com o agente de teste adicionado ao perfusado. Várias cânulas são possíveis com o ciclo repetido após reperfusão, com a pipeta de controle. O presente protocolo demonstra a canulação e microperfusão de um navio venular em mesentério de rato para gravar fluxos de água através da parede de microvasos e medir a G P da parede do vaso, um índice útil da permeabilidade da via comum para a água e os solutos através da intacta barreira endotelial. O procedimento é chamado de techniq Landis modificadoue porque o princípio original Landis de utilizar o movimento relativo de células vermelhas como uma medida de troca de fluido transvascular após perfusão é bloqueado é preservada 28, mas a gama de condições experimentais (por exemplo, as diferenças de pressão oncótica hidrostáticas e albumina através da parede de microvasos) disponível depois de microperfusão é muito maior do que no sangue perfusão microvasos canulados 8,29.

<table><tbody><tr><td>MICROSCOPE, TABLE AND STAGE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example</td><td>Olympus</td><td>CK-40</td><td>try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators</td></tr><tr><td>inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example</td><td>Leica</td><td>DMIL</td><td>try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators</td></tr><tr><td>narrow diameter, long working distance objective: example</td><td>Nikon</td><td>Nikon E Plan 10&amp;times;/0.25 LWD</td><td></td></tr><tr><td>stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel</td><td>welding shop</td><td></td><td>this should be heavy to reduce vibration</td></tr><tr><td>Unislide x-y table: dove tail slides</td><td>Velmex</td><td>AXY4006W1</td><td></td></tr><tr><td>VIDEO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD video camera: example</td><td>Pulnix</td><td>TM-7CN (no longer available)</td><td>no color needed</td></tr><tr><td>video capture system with audio--generic</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>video playback system (completely still frame, single frame motion)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>small microphone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICROMANIPULATORS, HOLDERS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator, XYZ (3)</td><td>Prior/Stoelting (no longer available)</td><td></td><td>look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning</td></tr><tr><td>hydraulic probe drive, one way</td><td>FHC</td><td>50-12-1C</td><td>need to buy either manual drive or electronic drive</td></tr><tr><td>manual drum drive&amp;nbsp;</td><td>FHC</td><td>50-12-9-02</td><td></td></tr><tr><td>or hydraulic drive, 3 way</td><td>Siskiyou Corporation</td><td>MX610 (1-way) or MX630 (3-way)</td><td>great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years</td></tr><tr><td>connectors/rods/holders</td><td>Siskiyou Corporation</td><td>MXC-2.5, MXB etc.</td><td></td></tr><tr><td>pin vise</td><td>Starrett</td><td>162C</td><td>to hold restrainer</td></tr><tr><td>pipette holder</td><td>World Prescision Instruments</td><td>MPH3</td><td></td></tr><tr><td>water manometer ~120 cm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICROSCOPE TRAY</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>clear Plexiglas for microscope tray for animal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall</td><td>Quartz Scientific Inc.</td><td>custom</td><td>&amp;nbsp;(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective</td></tr><tr><td>Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>medical adhesive for tissue well</td><td>NuSil</td><td>MED-1037</td><td></td></tr><tr><td>All-purpose silicone rubber heat mat, 5&quot; L x 2&quot; W</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-03125-20</td><td>heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available</td></tr><tr><td>Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-03122-75</td><td></td></tr><tr><td>STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-01575-00</td><td></td></tr><tr><td>PIPET MANUFACTURE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vertical pipette puller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-30 with nichrome filament</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mm OD thin wall capillary tubing</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>B150-110-10</td><td></td></tr><tr><td>pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text</td><td></td><td></td><td>or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments</td></tr><tr><td>RX Honing Machine, System II</td><td>RX Honing Machine Corporation</td><td>MAC-10700 Rx System II Machine</td><td>alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp; with ceramic sharpening disc</td><td>RX Honing Machine Corporation</td><td></td><td>use &quot;as is&quot; or attach lapping film</td></tr><tr><td>lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um</td><td>3M</td><td>part no. 051144 80827</td><td>268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon</td></tr></tbody></table>

microperfusion technique to investigate regulation of microvessel permeability in rat mesentery

As experiências para medir as propriedades de permeabilidade dos microvasos perfundidos individualmente fornecer uma ponte entre a investigação dos mecanismos moleculares e celulares que regulam a permeabilidade vascular em monocamadas de células endoteliais em cultura e as propriedades de leitos microvasculares inteiros câmbio funcionais. Um método para canular e perfundir microvasos venulares de mesentério de ratos e medir a condutividade hidráulica da parede de microvasos é descrito. O principal equipamento necessário inclui um microscópio intravital com um palco modificado grande que suporta micromanipuladores para posicionar três microtools diferentes: (1) uma micropipeta de vidro chanfrado de canulação e perfundem o microvasos; (2) um micro-vidro oclusor para bloquear temporariamente a perfusão e permitir a medição de transvascular movimento fluxo de água a uma pressão hidrostática medida, e (3) uma vareta de vidro fechado para estabilizar o tecido mesentérico ao sítio de canulação. A Landis micro-oclusão techniq modificadoue utiliza células vermelhas suspensas no perfusato artificial como marcadores de circulação de fluido transvascular, e também permite medições repetidas destes fluxos condições experimentais são alteradas e diferença de pressão osmótica e hidrostática colóide através dos microvasos são cuidadosamente controlados. As medições de condutividade hidráulica primeiro usando um perfusado de controlo, em seguida, após a re-canulação da mesma microvasos com os perfusatos teste permitir comparações de resposta de microvasos sob estas condições bem controladas emparelhado. As tentativas para alargar o método de microvasos no mesentério de ratos com modificações genéticas que se espera modificar a permeabilidade vascular foram severamente limitada, devido à ausência de microvasos compridas rectas e não ramificados no mesentério do rato, mas a recente disponibilidade dos ratos com modificações genéticas semelhantes usando CRISPR tecnologia / Cas9 deverá abrir novas áreas de investigação onde os métodos aqui descritos podem ser aplicados. </p&gt;

A Figura 4 mostra os resultados da medição do curso de tempo das alterações no G P num rato venular microvasos canulada sucessivamente com quatro perfusatos. 33 A magnitude de L p calculado a uma pressão constante foi usada como uma medida de mudanças na microvasos permeabilidade da parede, primeiro no estado de controlo com um perfusato contendo 1% de albumina de soro bovino, em seguida, quando o recipiente foi exposta ao agente inflamatório bradicinina (BK) atra...

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Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperf Técnica para Investigar Regulamento de microvasos Permeabilidade de Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

microperfusion-technique-to-investigate-regulation-microvessel

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K visualizações.  University of California Davis. The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions. 

Vídeo: Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune cells, and the coordination with lymphatic vessels and nerves. The multi-cell, multi-system interactions necessitate the investigation of angiogenesis in a physiologically relevant environment. Thus, while the use of in vitro cell-culture models have provided mechanistic insights, a common critique is that they do not recapitulate the complexity associated with a microvascular network. The objective of this protocol is to demonstrate the ability to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks before and after angiogenesis stimulation in cultured rat mesentery tissues. Cultured tissues contain microvascular networks that maintain their hierarchy. Immunohistochemical labeling confirms the presence of endothelial cells, smooth muscle cells, pericytes, blood vessels and lymphatic vessels. In addition, labeling tissues with BSI-lectin enables time-lapse comparison of local network regions before and after serum or growth factor stimulation characterized by increased capillary sprouting and vessel density. In comparison to common cell culture models, this method provides a tool for endothelial cell lineage studies and tissue specific angiogenic drug evaluation in physiologically relevant microvascular networks.

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.

A<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Método for Imaging Time-Lapse of cultivadas Rato Mesentéricas microvasculares Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Biologia do Desenvolvimento

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

Um<em&gt; In vivo</em&gt; Ensaio para ensaio de permeabilidade dos vasos sangüíneos

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Medicina

Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic response is a key regulator of local blood flow. In isobaric conditions small resistance arteries develop sustained constriction known as myogenic tone (MT), which is a major determinant of systemic vascular resistance (SVR). Hence, ex vivo&#160;pressurized preparations of small resistance arteries are major tools to study microvascular function in near-physiological states. To achieve this, a freshly isolated intact segment of a small resistance artery (diameter ~260 &#956;m) is mounted onto two small glass cannulas and pressurized. These arterial preparations retain most in vivo characteristics and permit assessment of vascular tone in real-time. Here we provide a detailed protocol for assessing vasoactivity in pressurized small resistance mesenteric arteries from rats; these arteries develop sustained vasoconstriction - approximately 25% of maximal diameter - when pressurized at 70 mmHg. These arterial preparations may be used to study the effect of investigational compounds on relationship between intra-arterial pressure and vasoactivity and determine changes in microvascular function in animal models of various diseases.

Pressure myography is used to assess vasoactivity of small arteries that develop sustained constriction when pressurized. This manuscript provides a detailed protocol to assess in isolated segments of small mesenteric arteries from rats, vasoactivity and the effect of intraluminal pressure on vascular diameter.

Avaliando Miogênica Resposta e vasoactividade em artérias mesentéricas de resistência Usando Miografia Pressão

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

Interações Intravital Microscopia de leucócito-endothelial e plaquetas-leucócitos em mesenterial Veias Ratos

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Imunologia e Infecção

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

Rat Assay Angiogenesis Mesentery

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

Biologia

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

Exteriorização Rat Mesentério: Um modelo para investigar a dinâmica celulares envolvidos na angiogênese

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other vessels), and describes techniques for evaluating tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry (LDF) and microvessel density utilizing fluorescently labeled Griffonia simplicifolia (GS1) lectin. Current methods for studying isolated resistance arteries at transmural pressures encountered in vivo and in the absence of parenchymal cell influences provide a critical link between in vivo studies and information gained from molecular reductionist approaches that provide limited insight into integrative responses at the whole animal level. LDF and techniques to selectively identify arterioles and capillaries with fluorescently-labeled GS1 lectin provide practical solutions to enable investigators to extend the knowledge gained from studies of isolated resistance arteries. This paper describes the application of these techniques to gain fundamental knowledge of vascular physiology and pathology in the rat as a general experimental model, and in a variety of specialized genetically engineered &#34;designer&#34; rat strains that can provide important insight into the influence of specific genes on important vascular phenotypes. Utilizing these valuable experimental approaches in rat strains developed by selective breeding strategies and new technologies for producing gene knockout models in the rat, will expand the rigor of scientific premises developed in knockout mouse models and extend that knowledge to a more relevant animal model, with a well understood physiological background and suitability for physiological studies because of its larger size.

This manuscript describes in vitro video microscopy protocols for evaluating vascular function in rat cerebral resistance arteries. The manuscript also describes techniques for evaluating microvessel density with fluorescently labeled lectin and tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry.

Avaliação dos mecanismos de controlo Vascular utilizando a microscopia das artérias de resistência isolada de ratos

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantificar Único microvasos Permeabilidade em perfusão isolada-Sangue Rat Lung Preparação

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

A Fluorescence Assay for Evaluating the Permeability of a Cardiac Microvascular Endothelial Barrier in a Rat Model of Ischemia/reperfusion

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the best strategy for improving the clinical prognosis of patients with acute coronary syndrome (ACS). Nonetheless, myocardial reperfusion following effective revascularization can trigger significant cardiomyocyte death and coronary endothelial collapse, known as myocardial ischemia/reperfusion injury (MIRI). Usually, endothelial cells and their intercellular tight junctions cooperatively maintain the microvascular endothelial barrier and its relatively low permeability but fail in reperfusion areas. 
Microvascular endothelial hyperpermeability induced by ischemia/reperfusion (IR) contributes to myocardial edema, increased infiltration of pro-inflammatory cells, and aggravated intramyocardial hemorrhage, which may worsen the prognosis of ACS. The tracer used in this study-70,000 Da FITC-dextran, a branched glucose molecule labeled by fluorescein isothiocyanate (FITC)-appears too large to infiltrate the cardiac microvascular endothelium in normal conditions. However, it is capable of infiltrating a broken barrier after MIRI. Thus, the higher the endothelial permeability is, the more FITC-dextran accumulates in the extravascular intercellular space. Thus, the intensity of fluorescence from FITC can indicate the permeability of the microvascular endothelial barrier. This protocol takes advantage of FITC-dextran to evaluate the cardiac microvascular endothelial barrier functionally, which is detected by an automated quantitative pathology imaging system.

Here, we describe a method to functionally assess the endothelial barrier of cardiac microvessels after ischemia/reperfusion injury via the measurement of the mean fluorescence intensity of extravasated 70,000 Da FITC-dextran in comparison with Evans Blue.

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the ...

<meta charset="utf8"></head><body>Papel endotelial de PAR1 na adesão de leucócitos e formação de TNE durante lesão de I/R

Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Mesenteric Venules After Mesenteric Ischemia-Reperfusion Injury via Intravital Microscopy

Intestinal ischemia-reperfusion (I/R) injury is an acute condition characterized by tissue damage resulting from restricted blood flow to the mesenteric vessels, leading to both local and systemic pathologies with a poor prognosis. Both ischemia and reperfusion trigger a series of cellular and molecular responses, with inflammatory cells serving as key regulators of the pathology. These interactions with the ischemic endothelium are mediated by multiple adhesion receptors. Several animal models have been established to mimic this pathology and investigate the involved molecular pathways. In this study, a microsurgical model of I/R injury is combined with intravital microscopy to visualize leukocyte rolling, adhesion, and neutrophil extracellular trap (NET) formation. This model is applied to transgenic mice deficient in endothelial PAR1 (F2r) to assess the impact of PAR1 on leukocyte rolling and NET formation 1 h after ischemia and immediately following reperfusion. In vivo, Acridine Orange leukocyte staining was employed, and NETs were visualized using a nucleic acid stain. Interestingly, reduced leukocyte adhesion and NET formation were observed in mice lacking the endothelial PAR1 receptor. This model enables the in vivo analysis of key regulators involved in I/R injury.

<meta charset="utf8"></head><body>Visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos em vênulas mesentéricas após lesão de isquemia-reperfusão mesentérica por microscopia intravital

This protocol presents a method for inducing mesenteric ischemia-reperfusion injury and visualizing neutrophil extracellular traps (NETs) in mesenteric venules using intravital microscopy. Blood flow in the superior mesenteric artery was restricted for 1 h, followed by reperfusion, allowing direct quantification of leukocyte adhesion and NETosis.

Visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos em vênulas mesentéricas após lesão de isquemia-reperfusão mesentérica por microscopia intravital

Intestinal ischemia-reperfusion (I/R) injury is an acute condition characterized by tissue damage resulting from restricted blood flow to the mesenteric ...