Name: correlative confocal and 3d electron microscopy of a specific sensory cell
Uploaded: 2015-07-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell at JoVE.com

Our sincere appreciation is expressed to the following people: Drs. Sam Johnson and Benjamin Carlson of the Duke Light Microscopy Core Facility for their assistance with data visualization software, and Ms. Valerie Lapham and Dr. John M. Mackenzie, Jr. of the Center for Electron Microscopy at North Carolina State University for their advice on electron microscopy. We thank Dr. Elaine B. Boh&#243;rquez for her editorial assistance. Authors contributed in the following manner: DVB, SM, and RAL designed experiments and analyzed data. DVB performed experiments and FH performed manual rendering of data. SM is director of Renovo Neural, where SBEM data was acquired. DVB wrote the manuscript and all authors reviewed and edited the final manuscript. This work was supported by NIH grants R01DK091946 and Veterans Affairs grant I01BX002230 to RAL, and F32DK094704, to DVB.

Tüm hayvan bakımı ve deneyler Duke Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış bir protokol uyarınca yapılmıştır. Cocem3D daha önce yayınlanmış protokollere 10,11 bir kombinasyonundan kaynaklanmıştır ve PyyGFP raportör fare 12 kullanarak belli bir enteroendokrin hücre çalışma için uygulanmıştır. Bu yöntem, hali hazırda ticari olarak temin edilebilen transgenik raportör fareler kullanılarak ilgi diğer hücrelere de uygulanabilir. Korelatif konfokal mikroskopi, seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu (SBEM) ve 3D rendering veriler: yöntem üç bölümlerde açıklanmıştır. Korelatif Konfokal Mikroskop Bu bölümün amacı, karşılıklı konfokal ve SBEM görüntüleme sağlayan boyutları distal kolonda bir doku segmenti hasat etmektir. aşağıdaki gibi protokol: 1. Hasat Doku <ol><li> HazırlamakPBS içinde 50 ug / ml heparin solüsyonu 10 mi. </li><li> 10 ml ketamin (100 mg / ml) ve xylazine 1 ml (20 mg / ml) karıştırarak ksilazin / ketamin anestezi stok hazırlayın. <ol><li> 0.1M PBS 4: ksilazin / ketamin Stokta 1 seyreltin. </li></ol></li><li> PBS içinde% 4 paraformaldehit ve% 0.1 glutar aldehit içinde sabitleyici çözeltisi bir 100 ml hazırlayın. </li><li> Ksilazin / ketamin anestezik öldürücü bir dozu ile, 6-10 haftalık bir PyyGFP fare anestezisi. Fare ağırlığı 20 g başına 0.15 ml intraperitoneal anestezik enjekte edilir. </li><li> Kuyruk veya ayak kısma doğru fare anesthetization onaylayın ve kuruluğunu önlemek için gözleri merhem kullanın. </li><li> Fiksatif intrakardiyak 10 serpmek için bir değişken akış peristaltik pompa kullanın. Cerrahi makas kullanarak (13 cm uzunluğunda) kesim bağırsak, kalp, akciğerler ve ortaya çıkarmak için karın boşluğuna açın. Dar kalıp kavisli bir forseps (12 cm uzunluğunda) ile kalbi tutun ve peristaltik pompa gelen kelebek iğne (19 G) takın iNto sol ventrikül. Hemen, bahar düz makas (uzunluğu 4 mm) sağ atrium kesti. 2 ml&#39;lik bir oranda serpmek / dk, ilk fare kuyruk kadar 15 dakika boyunca buz soğukluğunda sabitleyici çözeltisi ile daha sonra heparin 1 dakika için çözelti ve tamamen katıdır. Not: Bu, bağırsak mukozasında küçük damarların patlamasını önlemek için yavaş bir hızda perfüze edilmesi için çok önemlidir. Gemilerin Patlama dokusunun ultrastrüktür uzlaşma olacak. Perfüzyon yeterli ise, karaciğer 3-5 dakika içinde renk soluk açmalısınız. </li><li> Kullanımı küçük makas karın boşluğu açın ve distal rektumun için çekum ile kavşağından tüm kolon tüketim. Buz soğukluğunda PBS doku yerleştirin. PBS batmış olsa da, küçük yaylı makas ile mezenter boyunca kolon açık kesti. </li></ol> 2. Doku Bölümleri Kesme ve Sabitleme <ol><li> Bir bisturi kullanılarak, distal kolon ila yaklaşık 6 Küçük doku bölümleri (2 mm2) kesti. Bir yaprak o bu yapınf diş mum ve PBS birkaç damla gömülmüş. </li><li> 4 ° C &#39;de 3 saat süre ile sabitleştirici çözelti içinde doku bölümleri sonrası sabitleyin. </li></ol> 3. Mikro-diseksiyon Doku Blokları <ol><li> Agaroz PBS içinde% 5 düşük erime hazırlamak ve 45 ° C&#39;de bir su banyosu içinde muhafaza edin. </li><li> % 5 agaroz düşük erime standart boyutta Tissue-Tek cryomold gibi, küçük bir plastik kap kullanarak doku segmentleri gömün. </li><li> Titreşimli bıçak mikrotomda gömülü bölümler monte ve buz gibi soğuk PBS ile tampon tepsisini doldurun. </li><li> 0.8 genlik ve 0.04 mm / sn hızında 300 mikron doku şeritlerini kesin. Not: Bu noktada, kağıt şeritleri agaroz yerinden edilecektir. </li><li> Yeniden embed agaroz 300 mikron doku şeritleri ve vibratome en bıçak dik mikrotomda takar. </li><li> Bir vibratome kullanarak, 50 um kadar bir kalınlıkta doku şeritler kesilir. Not: Nihai doku blokları yaklaşık 300 um genişliğinde x 50 mikron kalınlığında olacaktır. Bunlar dimensions enteroendokrin hücrenin kalınlığı 15-20 mikron ve neuropod uzunluğu 30-70 nm arasında olduğunu göstermiştir Pilot konfokal deneylerden optimize edilmiştir. Hücrenin oryantasyon doku bloğun yüzüne paralel, bu nedenle, bütün bir hücre 50 mikron kalınlığında tarafından dokuya 300 mikron genişliğinde bir blok içinde yer olabilir. Ilgi konusu doku ve hücre tipine bağlı olarak, bu boyutlar değişir. </li><li> 4 ° C de PBS içinde doku blokları saklayın. </li></ol> 4. Konfokal Görüntüleme <ol><li> 4000: 1 PBS içinde DAPI seyrelterek nükleer leke çözüm hazırlayın. </li><li> 5 dakika boyunca DAPI Nükleer soya doku blokları inkübe edin. Not: DAPI boyama konfokal ve SBEM görüntüleri ilişkilendirilmesi için yararlı onların çekirdekleri tarafından ayırt tek tek hücrelerin kolaylaştırır. </li><li> Tahsil cam slayt Mount doku blokları, PBS birkaç damla ekleyin ve bir lamel ile bunları kapatın. </li><li> Konfokal mikroskop kullanılarak, blok tespitbozulmamış villus ve ilgi PyyGFP hücreleri ile s ve z-process optik bölümleri elde etmek için onları görüntülenmiş. <ol><li> 1 mikron optik bölümleri z-yığınları elde etmek için bir 20X / 0.8 Zeiss Plan Apochromat hedefini kullanın. </li><li> Z yığın için, başka hücrelere ilişkiyi belirlemek için 405 nm&#39;de (DAPI) kanalları kullanarak 488 nm endojen GFP ilgi hücre lokalize etmek ve diferansiyel girişim kontrast (DIC) hücre göre konumunu belirlemek için lümen. </li><li> 1.024 piksel veya daha yüksek görüntü çözünürlüğü kullanın. </li></ol></li></ol> Agaroz 5. Gömme bloklar <ol><li> PBS içinde% 4 paraformaldehit ve% 2.5 glutar aldehit içinde sabitleyici 10 ml hazırlayın. </li><li> Dikkatlice doku bloğu zarar vermeden uzak cam slayt lamel slayt kapak kayma kenarları PBS eklenerek cam slayt doku blokları kaldırmak. Sonra, bir 1 slayt doku bloğu aktarmak için bir sanat fırça kullanın.5 Ml% 4 paraformaldehid ve% 2.5 glutaraldehit fiksatif içeren mikrosantrifüj tüp. </li><li> Sonrası düzeltme doku blokları O / N 4 ° C&#39;de. </li><li> PBS doku blokları aktarın. Sonra,% 5, iki cam slaytlar arasında onları sandviç agaroz düşük erime düz blokları embed. Not: agaroz ince bir tabaka halinde bloklar gömülmesi boyama esnasında arka manipülasyon kolaylaştırır. </li><li> Bir meydanda agaroz kesin ve üst tarafta bir çentik yapmak. Not: Bu adım, daha sonraki kademelerde yönünü sağlamak için gereklidir. </li><li> Daha sonra işlenene kadar 4 ° C &#39;de PBS ile 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü saklayın blok. </li></ol> Seri Blok-yüz Taramalı Elektron Mikroskobu (SBEM) Bu bölümde, doku bloğu hazırlanır ve düşük büyütmede SBEM ile görüntülendi. Blok yüz anket görüntü daha sonra ilgi hücreyi içeren bölgeyi tanımlamak için konfokal verilerle ilişkilidir. Bölgede keztanımlanır, doku 7 nm / piksel ve 70 nm dilim çözünürlükte görüntülü. Bu sorunu gidermek ve diğer organelleri büyük yoğun çekirdek salgı veziküller ayırt etmek için yeterli oldu. Enteroendokrin hücrelerde, veziküller, bu tür çapı 13 ila 100 nm ila 150 arasında değişir. aşağıdaki gibi protokol: 6. Boyama Doku Bölümler <ol><li> PBS doku çıkarın ve 0.1 M kakodilat tampon içinde üç kez, her biri 5 dakika durulayın. </li><li> 1 saat 0.1% tannik asit leke blok hücre zarları 14 kontrastı arttırmak için, 0.1 M kakodilat tampon maddesi içinde çözülmüştür. </li><li> Yayınlanan protokole göre 11 sonraki boyama ve doku dehidratasyon yürütmek. Deerinck et al izlenerek. Protokol, bu çözüm hazırlanması: 1)% 1 (ağırlık / hacim) thiocarbonhydrazide (THC); 2) aspartat çözüm kurşun; 3)% 1 uranil asetat ve 4) ozmiyum tetraoxyde / potasyum ferrosiyanür (OsO 4 / K ferrosiyanür). % 4 OsO 4 ve 2x karıştırın1 at [10 ml H 2 O K ferrosiyanür ve 0.86 g Na kakodilat ile 0.3] K ferrosiyanür stok: 1 oranında OsO 4 / K ferrosiyanür yapmak. Not: agaroz gömülü doku olması boyama esnasında kullanımını kolaylaştırır. Dikkatle takip eden reçine sızması için agaroz kaldırmak. </li><li> Durulama numuneler daha sonra, üç, 0.1 M kakodilat tampon içinde katı, her biri 5 dakika, 4 ° C &#39;de 2 saat süre ile OsO4 / K ferrosiyanür çözeltisi ile boyanır. </li><li> 60 ° C&#39;de 30 dakika boyunca TCH ultra saf su ile üç kez, her biri 5 dakika ve leke ile durulayın. </li><li> Oda sıcaklığında 60 dakika boyunca% 2 OsO 4 (Resim K ferrosiyanür) ultra saf suda üç defa, her biri 5 dakika ve leke durulayın. Ultra saf su içinde tekrar üç kere, her biri 5 dakika durulayın. </li><li> 4 ° C&#39;de /% 1 uranil asetat O ile N Leke. Ultra saf su içinde üç kez, her biri 5 dakika durulayın. </li><li> 60 ° C&#39;de 30 dakika boyunca talebi aspartat ile Leke. Ultra saf su içinde üç kez, her biri 5 dakika durulayın. </li><li> Solutio durulayarak dokuları dehydrateEtanol konsantrasyonları artan ns. % 50,% 75,% 85,% 95, ve mutlak% 100 etanol ile 2 defa, her biri 5 dakika durulayın. Sonunda, propilen oksit ile iki kez, 10 dakika her biri bölümleri yıkayın. </li></ol> Reçine 7. sızmakta ve katıştırma doku kesitleri <ol><li> Reçine, ticari olarak avaialble kiti kullanılarak bloklar sızmak. Bir EPON gömme kiti kullanılarak reçine gömün dokular. % 48 Epoksi,% 20 mi DDSA,% 30 mi NMA ve% 2 DMP30 bir reçine karışımı hazırlayın. 5 dakika boyunca kuvvetlice reçine karışımı karıştırın ve daha sonra kabarcıklar yüzeye gelmek için izin 30 dakika süreyle vakum karışımı yerleştirin. </li><li> 1 de propilen oksit ile reçine karıştırın: 1 oranını ve şiddetle çalkalanır. Dokulardan Nihai dehidrasyon durulama çıkarın ve propilen oksit ile karışık reçine ilave edin. Bir döndürücü O&#39;da örnekleri ile yerleştirin flakon / N ve flakon kapaksız bırakın. Ertesi gün, taze EPON Reçine ekleyebilir ve rotatör içinde 90 dakika boyunca karıştırın. </li><li> Onları sandviç mümkün olduğunca düz bir reçine gömün bloklarbirbirlerine 15 yapışmasını engellemek için, sıvı salma maddesi ile tedavi edilmiş cam slaytlar arasındadır. </li><li> Blok, düz gömülü sonra, 60 ° C&#39;de ilave bir 48 saat boyunca blok tedavi. </li><li> Blokları serbest bırakmak için birbirinden slaytları çekin. </li></ol> 8. Montaj ve Görüntüleme Doku Blok Kırpma <ol><li> Diseksiyon kapsamında, blok kesme önce ilgi hücreleri içeren bölgelerin belirlenmesi kolaylaştırmak için konfokal mikrograflar bununla reçine gömülü doku blokları yönünü maç. </li><li> Elle aşağı ~ 500 x 500 mm blok yüz reçine gömülü blok Trim. </li><li> 30 dakika boyunca iletken epoksi ve kuru içeren bir pim üzerine düz blok monte edin. Ardından, 60 ° C&#39;de bir yüzeye ve kuru O / N blok düz koymak. </li><li> Coat kolloidal gümüş sıvı ile blok. Co kolaylaştırmak için dik açıyla bloğun dilimleme sağlamak için doku kesitleri düz BakımSeri blok yüz ve konfokal mikrografikleri rrelating. </li></ol> 9. SBEM <ol><li> Görüntü SBEM sistemi ile donatılmış bir Taramalı Elektron Mikroskobu kullanılarak blok (e .g., 3View). </li><li> Set başlangıç ​​kalınlığı ~ 2 mikron artışlarla bölüm ve doku yüz blok çıkana kadar kesti. </li><li> Tüm blok yüzünün surver görüntü kazanır. </li><li> Fiji yazılımı kullanarak, sabitleme sırasında ve 16 boyama örnek çözgü için ortak bir payda ve hesap oluşturmak için seri blok yüz ve konfokal hem mikrograflar ölçümleri almak. </li><li> Konfokal görüntüler koordinatlarına paydayı çarpılarak blok yüzünde ilgi alanını bulun. Bir referans olarak, mikrovillus, goblet hücreleri, ya da lamina propria konumu gibi, aynı zamanda diğer yapısal özellikleri kullanın. </li><li> En ilgi Görüntü bölge 2.25 kV ve yüksek vakum modunda 7 nm / piksel (veya 15,147X büyütme). Dilim artışları ayarlanması gerekir70 nm ya da daha az. </li><li> Ham 16-bit .dm3 formatta SBEM verileri toplayın. </li></ol> Yüzey segmentasyonu 10. Optimizasyon SBEM Görüntüler <ol><li> 8-bit tiff ham .dm3 biçiminden SBEM görüntüleri dönüştürün. </li><li> Fiji 0.8 gaussian blur filtresi kullanarak görüntüleri .tiff Filtre. </li><li> Orijinal boyutunun% 25&#39;ine veri seti küçültün ve set işlemek için gerekli olan RAM belleği miktarını en aza indirmek için bir .tiff yığınının olarak kaydedin. </li><li> Çeviri modunda Fiji eklentisi &quot;SIFT lineer yığın uyum&quot; seçeneğini kullanarak SBEM görüntülerin yığınını hizalayın ve &quot;ekin 3D&quot; eklentisi kullanarak kırpılmış. Not: Kırpma daha segmentlere ve volume rendering için gerekli RAM belleği miktarı azalır yardımcı olur. </li></ol> 3D Veri Oluşturma 11. Konfokal Mikroskop <ol><li> Otomatik &quot;yüzeyler&quot; aracı modunu aşmak kullanarak z-yığınları yeniden yapılandırma. Şekil 1D, bir rec gösterirMutlak yoğunluk olarak 0.126 um de yüzeyler alan detay, pürüzsüz seçeneğini kullanarak her kanalın onstruction ve eşikleme. </li></ol> 12. Seri Blok-yüz SEM Not: Manuel veri segmentasyonu çok zaman alıcı prosedür ve birkaç hafta sürebilir prosedürü işlenecek özelliklere bağlı olarak olduğunu. Bohórquez ark sunulan videolar ve şekiller için Segmentasyon. 2014 8 elle yapılır ve emek yaklaşık 500 saat sürdü. Bu bölümleme işlemine başlamadan önce render gerek temel özellikleri öncelik önerilir. Prosedür aşağıdaki gibidir: <ol><li> Beraberlik modunda &quot;yüzeyler&quot; aracını ve ilgi hücreyi hale manuel segment ve hacmi 50 milisaniye modu çizim &quot;kontur&quot; seçeneğini kullanın. </li><li> Yumuşak render veya daha hızlı render için her 5 dilim için hücrenin her dilim üzerinde konturları Trace. </li><li> İhracat son im300 dpi veya daha fazla bir çözünürlükte &quot;anlık&quot; aracını kullanarak yaşları. </li></ol>

<ol>
	<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 314, 1-340 (1986).</li><li>Smith, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+types,+neurosecretory+cells,+and+body+plan+of+the+early-diverging+metazoan+Trichoplax+adhaerens.">Novel cell types, neurosecretory cells, and body plan of the early-diverging metazoan Trichoplax adhaerens.</a> Current biology : CB. 24, 1565-1572 (2014).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS biology. 2, e329 (2004).</li><li>Engelstoft, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+transmembrane+G+protein-coupled+receptor+repertoire+of+gastric+ghrelin+cells.">Seven transmembrane G protein-coupled receptor repertoire of gastric ghrelin cells.</a> Molecular metabolism. 2, 376-392 (2013).</li><li>Chandra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin-like+domain+containing+receptor+1+mediates+fat-stimulated+cholecystokinin+secretion.">Immunoglobulin-like domain containing receptor 1 mediates fat-stimulated cholecystokinin secretion.</a> The Journal of clinical investigation. 123, 3343-3352 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+stimulate+cholecystokinin+release+through+the+Ca2+-sensing+receptor.">Amino acids stimulate cholecystokinin release through the Ca2+-sensing receptor.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G528-G537 (2011).</li><li>Rogers, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+activity-triggered+glucagon-like+peptide-1+secretion+from+primary+murine+L-cells.">Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells.</a> The Journal of physiology. 589, 1081-1093 (2011).</li><li>Boh&#243;rquez, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enteroendocrine+cell-enteric+glia+connection+revealed+by+3D+electron+microscopy.">An enteroendocrine cell-enteric glia connection revealed by 3D electron microscopy.</a> PloS one. 9, e89881 (2014).</li><li>Boh&#243;rquez, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroepithelial+circuit+formed+by+innervation+of+sensory+enteroendocrine+cells.">Neuroepithelial circuit formed by innervation of sensory enteroendocrine cells.</a> The Journal of clinical investigation. , (2015).</li><li>Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+preparing+GFP-labeled+neurons+previously+imaged+in+vivo+and+in+slice+preparations+for+light+and+electron+microscopic+analysis.">A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis.</a> Nature protocols. 4, 1145-1156 (2009).</li><li>Deerinck, T., Bushong, E., Thor, A., Ellisman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , (2010).</li><li>Boh&#243;rquez, D. V., Chandra, R., Samsa, L. A., Vigna, S. R., Liddle, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+basal+pseudopod-like+processes+in+ileal+and+colonic+PYY+cells.">Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells.</a> Journal of molecular histology. 42, 3-13 (2011).</li><li>Nilsson, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+immunocytochemical+colocalization+of+peptide+YY+and+enteroglucagon+in+endocrine+cells+of+the+rabbit+colon.">Distribution and immunocytochemical colocalization of peptide YY and enteroglucagon in endocrine cells of the rabbit colon.</a> Endocrinology. 129, 139-148 (1991).</li><li>Mizuhira, V., Futaesaku, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+fixation+method+for+biological+membranes+using+tannic+acids.">New fixation method for biological membranes using tannic acids.</a> Acta Histochem Cytochem. 5, 233-236 (1972).</li><li>Reymond, O. L., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+routine+flat+embedding+method+for+electron+microscopy+of+microorganisms+allowing+selection+and+precisely+orientated+sectioning+of+single+cells+by+light+microscopy.">A routine flat embedding method for electron microscopy of microorganisms allowing selection and precisely orientated sectioning of single cells by light microscopy.</a> Journal of microscopy. 130, 79-84 (1983).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9, 676-682 (2012).</li><li>Boh&#243;rquez, D., Chandra, R., Samsa, L., Vigna, S., Liddle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+basal+pseudopod-like+processes+in+ileal+and+colonic+PYY+cells.">Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells.</a> J Mol Histol. 42, 3-13 (2011).</li><li>Jang, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut-expressed+gustducin+and+taste+receptors+regulate+secretion+of+glucagon-like+peptide-1.">Gut-expressed gustducin and taste receptors regulate secretion of glucagon-like peptide-1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 15069-15074 (2007).</li><li>Liou, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein-coupled+receptor+GPR40+directly+mediates+long-chain+fatty+acid-induced+secretion+of+cholecystokinin.">The G-protein-coupled receptor GPR40 directly mediates long-chain fatty acid-induced secretion of cholecystokinin.</a> Gastroenterology. 140, 903-912 (2011).</li><li>Reimann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+sensing+in+L+cells:+a+primary+cell+study.">Glucose sensing in L cells: a primary cell study.</a> Cell metabolism. 8, 532-539 (2008).</li><li>Bohorquez, D. V., Liddle, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon-like+basal+processes+in+enteroendocrine+cells:+characteristics+and+potential+targets.">Axon-like basal processes in enteroendocrine cells: characteristics and potential targets.</a> Clinical and translational science. 4, 387-391 (2011).</li><li>Batterham, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+hormone+PYY(3-36)+physiologically+inhibits+food+intake.">Gut hormone PYY(3-36) physiologically inhibits food intake.</a> Nature. 418, 650-654 (2002).</li><li>Flint, A., Raben, A., Astrup, A., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucagon-like+peptide+1+promotes+satiety+and+suppresses+energy+intake+in+humans.">Glucagon-like peptide 1 promotes satiety and suppresses energy intake in humans.</a> The Journal of clinical investigation. 101, 515-520 (1998).</li><li>Hayworth, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+ATUM+ultrathin+section+libraries+with+WaferMapper:+a+multi-scale+approach+to+EM+reconstruction+of+neural+circuits.">Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits.</a> Frontiers in neural circuits. 8, 68 (2014).</li></ol>

Dr. Satish Medicetty çalışanı ve Renovo Sinir Inc% 100 maaş alır; Ancak, bu veri paylaşımı ve malzemelerde vallahi politikalarına yazarın bağlılığını değiştirmez. Çıkar çatışması kalan yazarlar için ilan edilir.

<html> Gastrointestinal chemosensation biyomedikal araştırmalarda heyecan verici yeni bir alan olarak ortaya çıkmaktadır. Bunun nedeni enteroendokrin hücrelerinde 18 fonksiyonel tat reseptörlerinin keşfine büyük bir parçası olduğunu. Daha sonraki çalışmalar, enteroendokrin hücreler karbonhidratlar, yağlar, amino asitler ve 5,6,19,20 içeren besin, özel reseptörlerini ifade olduğunu göstermiştir. Bu keşiflerin katalitik etken enteroendokrin hücreler, flüoresan 20 etiketli olan raportör farelerin geliştirilmesi olmuştur. Distal ince bağırsak ve kolon 17,21 enteroendokrin hücreleri incelemek için, bu farelerde biri PyyGFP fare geliştirdi. Tokluk 22,23 indükleyicileri, her ikisi de PYY ve glukagon-benzeri peptid 1, salgılayan çünkü bu hücreler, ilgi çekicidir. Anda, bu hücrelerin tam bir ultra-yapısal hesap biz onların sinyal mekanizmaları anlamak için gerekli olduğuna inanıyordu ki, eksik oldu. &quot;ontent&gt; Burada SBEM ile konfokal mikroskopi köprü görsel bir yöntem tarif. yöntem bize enteroendokrin hücrelerinin tam ultrastrüktürünü belgelemek için. Biz bu hücrelerin üç içeren bir neuropod sahip olduğunu bildirmiştir izin Cocem3D olarak adlandırılır Hücreleri enteroendokrin bu neuropods fiziksel olarak nöronlara bağlanmak olsa salgı veziküllerin 8 tüm dörtte. neuropod içinde nörofilament ve nöronal akson gibi çok var, neuropods enterik glial hücreler 8 ile beslenir. Daha da önemlisi, o bağırsak innerve ve Kolon 9. Cocem3D güçlerinden biri sadeliği olduğunu. Konfokal tarafından görüntülenmiş ve SBEM bir doku içinde belirli bir hücre belirlenmesini kolaylaştırır edilebilir bir bloğa doku örneği azaltılması. Salgı keseleri ve diğer organeller 7 nm / piksel çözünürlükte kolaylıkla tespit edilebilir. SBEM bölümler atılır için, başka süreçproteinlerin belirli dokuların şarkı, bu noktada bir seçenek değildir. Bununla birlikte, bu doku bloğu kesitleri muhafaza edildiği atum 24 gibi yöntemlerinin geliştirilmesi, hücre spesifik proteinlerin tanımlanmasını sağlamak olasıdır. Enteroendokrin hücreleri beyinde bağırsak ve tokluk gıda arasında duyusal bir arayüz olduğundan enteroendokrin hücreleri üzerinde kimyasal-duyusal reseptörleri belirli bir konuma belirlenmesi, obezite için ilaç tedavilerinin geliştirilmesi için gerekli bilgilerdir.

Bir hücrenin içinde hayat zaman ve mekan yer alır. Zamanla değişiklikler genellikle süper çözünürlük mikroskobu gibi floresan görüntüleme teknikleri ile kombine time-lapse mikroskopi kullanılarak incelenmiştir. Uzay, bir hücre ya da hücre-hücre etkileşimleri içindeki organellerin düzenlemesi, özellikle, sadece hücre ince yapısı tam bir hesabı ile elde edilebilir. Bir hücrenin ince yapısı kapsamlı bir hesabı da C gibi, genom mevcut olduğu durumlarda genomik işlevine açıklık getirebilir elegans nematod 1 veya düz placozoa tricoplax 2. adherens. Seri kesit elektron mikroskopisi artık verimli tekrarlanabilir, zaman ve seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu 3 (SBEM) gibi otomatik 3D elektron mikroskopisi teknolojilerin geliştirilmesi, daha ucuz bir görev sayesinde. fonksiyonu aydınlatmak için yapısal bilgiye ihtiyaç belli cel çok açıktırnöronlar, glia ya da duyu epitel hücreleri gibi işlevi fiziksel hücre-hücre etkileşimlerine bağlıdır l türleri. Biz bağırsak lümeninde besin duyusal sinyaller sonuçta appetitive davranışları modüle bir elektrik sinyaline dönüştürür transdük nasıl durulaştırmada özellikle ilgilendi. Devre karmaşıktır, ancak besin duyu epitel hücreleri, adı enteroendokrin hücreleri ile temas haline geldiği bağırsak duvarından başlar. Mesela lezzet hücreleri gibi diğer duyusal epitel hücreleri, farklı olarak, enteroendokrin hücreler bin 4-7 arası bir oranda bağırsak epiteli boyunca dağılmıştır. Sonuç olarak, onlar tanımlamak ve incelemek için zor olmuştur, ve uzun bir süre için sadece bağırsak hormonları kaynağı olarak görüldü. Ama hücre özel floresan muhabiri farelerin gelişmesiyle birlikte, bu hücrelerin karmaşık duyusal işlevi ortaya çıkmaktadır. Bu muhabir farelerin birini bir peptid YY-GFP (PyyGFP) Fareyi kullanarak, biz o enteroendocr bulunduine hücreleri biz neuropod adında ünlü bir sitoplazmik kuyruk var. neuropods görünümü, hücre-hücre bağlantılı bir korunmuş işlevi önerdi. Böylece, bir enteroendokrin hücresinin ultrastrüktürünü belgeleyerek, neuropods fonksiyonu elde edilebilir ki gerekçeli. tespit edilmesi zor bir dağınık hücrede bir uzantısı yapısını anlamak için ihtiyaç konfokal mikroskopi ve SBEM birleştirmek için bir yöntem geliştirmek için ana gerekçe oldu. İlgili hücre PyyGFP enteroendokrin hücreye spesifik raportör fareler kullanılarak belirlenmiştir. yöntem bize bir enteroendokrin hücre ve onun neuropod tüm ultrastrüktürünü belgelemek için izin verdi. Neuropods içinde, nöronal akson yapısal özelliklerini bulundu ve neuropods dışında, biz enterik glia 8 fiziksel bir ilişki bulundu. Gerçekten de, neuropods bu hücrelerin sekretuar işlevde önemli bir rolü olduğunu düşündürmektedir Tüm salgı vezikülleri yaklaşık% 70 içerir. Binayapısal veriler, daha yakın zamanda, bu neuropods yoluyla enteroendokrin hücreleri ve nöronların bağırsak dil 8,9 tat hücreleri benzer bir nöroepitelyal devresini oluşturur innerve bulundu. Yapısal verilere kaynaklanmıştır gastrointestinal kimyasal-duyusal mekanizmaların bu özellikleri ortaya çıkararak, bu bağlaşık mikroskopi yöntemi kullanılarak toplanmıştır. Bu yöntem, hücrelerin, çok düşük oranda dokular içinde dağılmış olan, özellikle hücre biyolojisi diğer alanlarda faydalı olabilir inanıyoruz. Biz 3D (Cocem3D) &#39;de bağlaşık konfokal ve seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu yönteme başvurdu. yöntem aşağıdaki ana adımlardan oluşur: doku diseksiyonu, konfokal mikroskopi, SBEM görüntüleme, SBEM ve konfokal görüntü korelasyon ve manuel segmentasyon. Korelasyon fiziksel ziyade kimyasal olduğundan diğer bağıntılı yöntemlerle karşılaştırıldığında, kavram oldukça basittir.

<table><tbody><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Life technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>4%, freshly made in PBS, final pH 7.4</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Dental wax</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72660</td><td></td></tr><tr><td>Low-melting agarose</td><td>Life technologies</td><td>16520-100</td><td>5%, freshly made in PBS</td></tr><tr><td>Standard Tissue-Tek Cryomold</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62534-25</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&amp;nbsp; nuclear stain</td><td>Life technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Postively charged glass slides and coverslips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine art paintbrush #1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cacodylate buffer</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>11650</td><td></td></tr><tr><td>Tannic acid</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>EMbed 812 kit&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Liquid releasing agent&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70880</td><td></td></tr><tr><td>Liquid silver colloidal&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12630</td><td></td></tr><tr><td>CircuitWorks conductive epoxy&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>ITW Chemtronics</td><td>CW2400</td><td></td></tr><tr><td>Variable flow peristaltic pump</td><td>VWR</td><td>70730-064</td><td></td></tr><tr><td>VT1200S Vibrating blade microtome</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 780i confocal microscope</td><td>Carl Zeiss&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma VP Scanning Electron Microscope&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3view system</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Renovo Neural Inc (Cleveland, OH)</td><td></td><td>http://www.renovoneural.com</td><td>Renovo provides 3d EM services</td></tr><tr><td>Fiji software</td><td>Open access software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer station with 16 GB of RAM or more</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Data visualization software Imaris 7.5&amp;nbsp;</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

correlative confocal and 3d electron microscopy of a specific sensory cell

Bir hücrenin ultrastrüktürü tarif işlevini anlamak için önemlidir. Bu, bağırsak epiteli enteroendokrin hücreleri gibi çeşitli hücre tiplerinde, yapılmış dokular boyunca yayılan nadir hücre tipleri için zor bir proje olabilir. 1000: Şekiller 1 oranında diğer epitelyal hücreleri arasında dağılmış nedeniyle gıda ve bakteri bu mide-bağırsak sensörler çalışma zor olmuştur. Son zamanlarda, transjenik farenin raportör flöresan ile enteroendokrin hücreleri tanımlamak için üretilmiştir. Bunlardan biri peptid YY-GFP faredir. Bu Fareyi kullanarak, biz konfokal ve seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu ilişkilendirmek için bir yöntem geliştirdi. Biz yöntem cocem3D adında ve doku belirli bir enteroendokrin hücresini tanımlamak ve 3D hücrenin ultrastrüktür açıklayacak uygulamıştır. cocem3D çözünürlüğü hacmi yeniden hücre zarlarını salgı veziküllerinde gibi küçük organellere tanımlamak ve ayırt yeterlindering. Cocem3D kolayca doğal doku Diğer özel hücre tiplerinin 3D ultra yapısını incelemek için adapte edilebilir.

Burada sunulan yöntem epitel bir katman içinde belirli bir hücrenin ultra yapısını incelemek için kullanılmıştır. bu durumda ilgi hücre zor enteroendokrin hücresidir. Yerinde Onların kimlik sadece hücre spesifik floresan muhabiri farelerin gelişmesi ile son yıllarda mümkün olmuştur. 2011 yılında, hormon PYY&#39;nin promotörü yeşil floresan protein 17 ekspresyonunu tahrik eden bir fare geliştirdi. Bu PyyGFP farede, ince bağırsak ve kolon distal kısmının enteroendokrin hücreleri kolayca UV ışığı altında ayrılır. Bu fare modeli, enteroendokrin hücre ihtiva eden bir doku bloğu tanımlamak ve SBEM için işlemek için bir olanak sağlamıştır. korelasyon yöntemi cocem3D burada adlandırılır ve daha önce yayınlanmış protokolleri 10,11 üzerine inşa edilmiştir. Doku bloğu boyutlarını en iyi duruma getirme korelasyon için önemlidir. Ön deneylerde,Bu ilgi, hücrenin tüm vücudu kaplayan sırasında doku bloğu 300 um uzunluğunda ve 50 um kalınlığında SBEM görüntü sayısı en aza indirilmiş olduğu tespit edilmiştir. Şekil 1A, bir titreşimli bıçak microtrome kullanarak diseksiyon Bir Bakış göstermektedir Doğru boyutlara sahip doku bloğu edinin. En az 100 blok ilgi bozulmamış hücrelere sahip olanlar almak için içlerinden sıralamadan önce elde edilir. Seçilen bloklar konfokal mikroskopi ve görüntü z-yığınları tarafından görüntülü optik her 1 mikron (Şekil 1B ve C) aralıklı. Şekil 1D fare ileumda bir enteroendokrin hücresinin hacmi render görünümünü göstermektedir. Bu tanınmış neuropod ~ 60 um için epitel hücreleri altında uzanır. ilgi hücre tüm blok yüz bir SBEM görüntüsü ile konfokal z-yığınları ilişkilendirilerek bulunur. Sözgelimi, bir PyyGFP distal kolon bir blok burada sunulmuşturfare. Konfokal z yığınları (Şekil 2A) elde edildikten sonra, blok düşük erime agaroz ince bir tabaka (Şekil 2B) gömülüdür. Bu blok sonraki manipülasyon için gereklidir. Bu SBEM dilimleri ile optik dilim uygun olmaları için mümkün olduğu kadar düz bir blok yönünü muhafaza etmek önemlidir. Şekil 2C, bir temsili görüntüsü doku bloğu tüm yüzü gösterilir. Bu rakamın parçaları önceden Bohorquez ark yayınlandı. 2014 8. Bu sonradan hesap doku yerlerinden ve boyutları dikkate alınarak konfokal görüntü korelasyon. Şekil 2B açığa blok konfokal ve SBEM görüntünün bir kaplamasını göstermektedir ilgi, bizim hücrenin hassas konum. Hücre tespit edildikten sonra, SBEM görüntüleme salgı vezikülleri ve diğer hücre organelleri tespit için yeterince yüksek bir çözünürlükte yapılır. veri seti diye sunulanblok görüntüleri her 70 nm çekildiği gibi yeniden piksel başına 7 nm&#39;de görüntülendi. veri seti doku derinliği 45 mikron yayılan 643 fotoğraf içeriyordu. Birkaç mikron düşük büyütmede tüm blok yüzü ilk görüntüleme sırasında traş edilir. Ham SBEM veri seti .dm3 formatında edinilen ve sonraki kullanım için tiff dönüştürülmüştür. SBEM yığını ilgi sadece bölgeyi içeren Fiji yazılımı eklentisi &quot;ekin (3D)&quot; blok kullanılarak kırpılmış edildi. Bu volume rendering için gerekli RAM belleği miktarını azaltır. Hücre konumu ve salgı veziküller tarafından belirlenen ve Imaris yazılımı kullanılarak segmente edildi. 3 enteroendokrin hücre 3D render bir içeriyor Şekil. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig1.jpg" /> Şekil 1:. Korelatif konfokal mikroskopi (A) İş Akışı bir parça incelemekBir doku içine bağırsak dokusu 300 x 50 mikron kalınlığında blok. (B) doğru boyutlarda bir temsilci doku bloğu. Fare küçük bağırsak ile ilgili bu boyutların doku bloğu kolon 8 kript durumunda, yaklaşık 3 villi yayılan ya da dikkat edin. Ilgi konusu bir hücreyi ihtiva eden küçük bağırsak (C) bir tüy. Imaris yazılımını kullanarak 3D render (D) A konfokal z-yığın önemli bir neuropod bağırsak epiteli altında çalışan bir enteroendokrin hücre gösterir. Mavi = DAPI nükleer leke. Barlar = 10 mikron. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52918/52918fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52918/52918fig2.jpg" /> Şekil 2: Seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu (A) sele Konfokal görüntü.Çevrede PyyGFP enteroendokrin hücreleri (yeşil) içeren kolondan CTED doku bloğu. Blok konfokal mikroskobu ile görüntülenmiş sonra (B), daha sonra agaroz cam slaytlar kullanarak düşük erime düz gömülür. Agaroz doku bloğu gömülmesi sonraki manipülasyon kolaylaştırır ve sol köşede çentik sağ yönde SBEM içinde blok monte yardımcı olur. Bloğun yüzeyinin (C) SBEM görüntüsü. SBEM ile confocal verilerin (D) Korelasyon faiz (beyaz ok) hücreyi tespit etmek. C ve bu rakamın d görüntüleri Bohorquez ark. Değiştirilmiş olan 2014 8. Mavi DAPI nükleer leke =. Barlar = 10 mikron. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52918/52918fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52918/52918fig3.jpg" /> Şekil 3:. Imaris yazılımını kullanarak enteroendokrin hücresinin Veri 3D render (A) Ses render. Hücre salgı veziküller ile dolu bir neuropod içeriyor. Bir enteroendokrin hücresinin ultrastrüktürü tam bir açıklaması için, Bohorquez ve diğ., 2014 8 başvurun. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52918/52918fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell at JoVE.com

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

Belirli Duyu Hücre bağıntılı Konfokal ve 3D Elektron Mikroskobu

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

correlative-confocal-3d-electron-microscopy-specific-sensory

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

11.4K Görüntüleme.  Duke University Medical Center. Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy. 

Video: Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

Dinamik Etkileşimler 3D Yapısal Analiz için karşılıklı Mikroskopi

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Biyomühendislik

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy. The sub-diffraction limit resolution capabilities of super-resolution light microscopes allow improving the accuracy of the correlated data. Briefly, 110 nanometer thick cryo-sections are transferred to a silicon wafer and, after immunofluorescence staining, are imaged by super-resolution light microscopy. Subsequently, the sections are preserved in methylcellulose and platinum shadowed prior to imaging in a scanning electron microscope (SEM). The images from these two microscopy modalities are easily merged using tissue landmarks with open source software. Here we describe the adapted method for the larval zebrafish retina. However, this method is also applicable to other types of tissues and organisms. We demonstrate that the complementary information obtained by this correlation is able to resolve the expression of mitochondrial proteins in relation with the membranes and cristae of mitochondria as well as to other compartments of the cell.

This protocol describes the necessary steps to obtain subcellular protein localization results on zebrafish retina by correlating super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy images.

Bağdaşık süper çözünürlük ve elektron mikroskobu Zebra balığı Retina Protein yerelleşme gidermek için

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Gelişim Biyolojisi

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Kuantum Nokta Nanopartiküller kullanma Korelatif Işık- ve Elektron Mikroskobu

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

Dört boyutlu Floresans Görüntüleme ile Sinir Terminalleri Yaşayan endozom Dinamiği Görselleştirme

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Nörobilim

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

Cryo-immobilize hücreler yapılarda bağdaşık ışık elektron izleme ve Viral Protein Imaging mikroskobu (CLEM) ilişkili

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity necessary for proper cellular function. Understanding how the enzymes, proteins, and cytoskeletal components govern and maintain this biochemical segregation is therefore of paramount importance. The use of fluorescently tagged molecules to localize to and/or perturb subcellular compartments has yielded a wealth of knowledge and advanced our understanding of cellular regulation. Imaging techniques such as fluorescent and confocal microscopy make ascertaining the position of a fluorescently tagged small molecule relatively straightforward, however the resolution of very small structures is limited 1.
On the other hand, electron microscopy has revealed details of subcellular morphology at very high resolution, but its static nature makes it difficult to measure highly dynamic processes with precision 2,3. Thus, the combination of light microscopy with electron microscopy of the same sample, termed Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) 4,5, affords the dual advantages of ultrafast fluorescent imaging with the high-resolution of electron microscopy 6. This powerful technique has been implemented to study many aspects of cell biology 5,7. Since its inception, this procedure has increased our ability to distinguish subcellular architectures and morphologies at high resolution. 
Here, we present a streamlined method for performing rapid microinjection followed by CLEM (Fig. 1). The microinjection CLEM procedure can be used to introduce specific quantities of small molecules and/or proteins directly into the eukaryotic cell cytoplasm and study the effects from millimeter to multi-nanometer resolution (Fig. 2). The technique is based on microinjecting cells grown on laser etched glass gridded coverslips affixed to the bottom of live cell dishes and imaging with both confocal fluorescent and electron microscopy. Localization of the cell(s) of interest is facilitated by the grid pattern, which is easily transferred, along with the cells of interest, to the Epon resin used for immobilization of samples and sectioning prior to electron microscopy analysis (Fig. 3). Overlay of fluorescent and EM images allows the user to determine the subcellular localization as well as any morphological and/or ultrastructural changes induced by the microinjected molecule of interest (Fig. 4). This technique is amenable to time points ranging from &le;5 s up to several hours, depending on the nature of the microinjected sample.

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

The CLEM technique has been adapted to analyze ultrastructural morphology of membranes, organelles, and subcellular structures affected by microinjected molecules. This method combines the powerful techniques of micromanipulation/microinjection, confocal fluorescent microscopy, and electron microscopy to allow millimeter to multi-nanometer resolution. This technique is amenable to a wide variety of applications.

Bir Aracı Olarak Korelatif Işık ve Elektron Mikroskobu (CLEM) microinjected Moleküller ve Ökaryotik Alt hücresel Hedefler Visualize&#39;a


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Biyoloji

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Hücresel Örgütü fare yeni korteksimiz yılında büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-dimensional Imaging of Bacterial Cells for Accurate Cellular Representations and Precise Protein Localization

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be affected by cell shape. Bacterial cells are three-dimensional (3D) objects, although they are rarely treated as such. Most microscopy techniques result in two-dimensional (2D) images leading to the loss of data pertaining to the actual 3D cell shape and localization of proteins. Certain shape parameters, such as Gaussian curvature (the product of the two principal curvatures), can only be measured in 3D because 2D images do not measure both principal curvatures. Additionally, not all cells lie flat when mounting and 2D imaging of curved cells may not accurately represent the shapes of these cells. Accurately measuring protein localization in 3D can help determine the spatial regulation and function of proteins. A forward convolution technique has been developed that uses the blurring function of the microscope to reconstruct 3D cell shapes and to accurately localize proteins. Here, a protocol for preparing and mounting samples for live cell imaging of bacteria in 3D both to reconstruct an accurate cell shape and to localize proteins is described. The method is based on simple sample preparation, fluorescent image acquisition, and MATLAB-based image processing. Many high-quality fluorescent microscopes can be simply modified to take these measurements. These cell reconstructions are computationally intensive and access to high-throughput computational resources is recommended, although not necessary. This method has been successfully applied to multiple bacterial species and mutants, fluorescent imaging modalities, and microscope manufacturers.

This protocol explains how to prepare and mount bacterial samples for live three-dimensional imaging and how to reconstruct the three-dimensional shape of E. coli from those images.

Doğru Hücresel Temsiller ve Hassas Protein Lokalizasyonu için Bakteri Hücrelerinin Üç Boyutlu Görüntülemesi

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of pre-clinical agents labeled with fluorescent probes. With recent advancements in antibody based cytotoxic drug delivery systems, understanding the alterations induced by these agents within the realm of receptor aggregation and internalization is of critical importance. This protocol leverages the well-established methodology of fluorescent immunocytochemistry and the open source FIJI distribution of ImageJ, with its inbuilt autocorrelation and image mathematical functions, to perform spatial image correlation spectroscopy (ICS). This protocol quantitates the fluorescent intensity of labeled receptors as a function of the beam area of the confocal microscope. This provides a quantitative measure of the state of target molecule aggregation on the cell surface. This methodology is focused on the characterization of static cells with potential to expand into temporal investigations of receptor aggregation. This protocol presents an accessible methodology to provide quantification of clustering events occurring at the cell surface, utilizing well established techniques and non-specialized imaging apparatus.

Antibodies that bind to target receptors on the cell surface can confer conformation and clustering alterations. These dynamic changes have implications for characterizing drug development in target cells. This protocol utilizes confocal microscopy and image correlation spectroscopy through ImageJ/FIJI to quantify the extent of receptor clustering on the cell surface.

Confocal mikroskobu ortaya hücre yüzey reseptör toplama görüntü korelasyon spektroskopisi ile

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of ...

Confocal Fluorescence Microscopy: A Technique to Determine the Localization of Proteins in Mouse Fibroblasts

Source: Dominique R. Bollino1, Eric A. Legenzov2, Tonya J. Webb1 
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland School of Medicine and the Marlene and Stewart Greenebaum Comprehensive Cancer Center, Baltimore, Maryland 21201 
2 Center for Biomedical Engineering and Technology, University of Maryland School of Medicine, Baltimore, Maryland 21201
Confocal fluorescence microscopy is an imaging technique that enables increased optical resolution as compared to conventional &#34;wide-field&#34; epifluorescence microscopy. Confocal microscopes are able to achieve improved x-y optical resolution through &#34;laser scanning&#34;- typically a set of voltage-controlled mirrors (galvanometer or &#34;galvo&#34; mirrors) that direct laser-illumination to each pixel of the specimen at a time. More importantly, confocal microscopes achieve superior z-axial resolution by using a pinhole to remove out of focus light originating from locations that are not in the z-plane being scanned, thus enabling the detector to collect data from a specified z-plane. Because of the high z-resolution achievable in confocal microscopy, it is possible to collect images from a series of z-planes (also-called z-stack) and construct a 3D image through software.
Before discussing the mechanism of a confocal microscope, it is important to consider how a sample interacts with light. Light is composed of photons, packets of electromagnetic energy. A photon impinging on a biological sample can interact with the molecules comprising the sample in one of four ways: 1) the photon does not interact and passes through the sample; 2) the photon is reflected/scattered; 3) the photon is absorbed by a molecule and the absorbed energy is released as heat through processes collectively known as nonradiative decay; and 4) the photon is absorbed and the energy is then rapidly reemitted as a secondary photon through the process known as fluorescence. A molecule whose structure permits fluorescence emission is called a fluorophore. Most biological samples contain negligible endogenous fluorophores; therefore exogenous fluorophores must be used to highlight features of interest in the sample. During fluorescence microscopy, the sample is illuminated with light of the appropriate wavelength for absorption by the fluorophore. Upon absorbing a photon, a fluorophore is said to be &#34;excited&#34; and the process of absorption is referred to as &#34;excitation&#34;. When a fluorophore gives up energy in the form of a photon, the process is known as &#34;emission&#34;, and the emitted photon is called fluorescence.
The light beam used to excite a fluorophore is focused by the objective lens of a microscope and converges at a &#34;focal point&#34; where it is maximally focused. Beyond the focal point the light again diverges. The entering and exiting beams may be visualized as a pair of cones touching at the focal point (see Figure 1, left panel). The phenomenon of diffraction imposes a limit on how tightly a beam of light can be focused - the beam actually focuses to a spot of finite size. Two factors determine the size of the focal spot: 1) the wavelength of the light, and 2) the light-gathering ability of the objective lens, which is characterized by its numerical aperture (NA). The focal &#34;spot&#34; extends not only in the x-y plane, but also in the z direction, and is in reality a focal volume. The dimensions of this focal volume define the maximum resolution achievable by optical imaging. Although the number of photons is greatest within the focal volume, the conical light paths above and below the focus also contain a lower density of photons. Any fluorophore in the light path can thus be excited. In conventional (wide-field) epifluorescence microscopy, emission from fluorophores above and below the focal plane contribute out-of-focus fluorescence (a &#34;hazy background&#34;), which reduces image resolution and contrast, as demonstrated in Figure 1, with the red cube representing fluorophore emission above the focal plane (red star) that results in out-of-focus fluorescence (top right). This problem is ameliorated in confocal microscopy, due to the utilization of a pinhole. (Figure 2, bottom right). As depicted in Figure 3, the pinhole allows emissions originating from the focal place to reach the detector (left), while blocking the out-of-focus fluorescence (right) from reaching the detector, thus improving both resolution and contrast.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig1.jpg" /> 
Figure 1. Optical resolution of epifluorescence versus confocal microscopy. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/10501/10501fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
The light beam used to excite a fluorophore is focused by the objective lens of a microscope and converges at a focal volume and then diverges (left). The red star represents the focal plane of a sample that is being imaged while the red square represents fluorophore emission above the focal plane. When capturing an image of this sample using an epifluorescent microscope, the emission from the out-of-focus red square will visible and contribute to a &#34;hazy background&#34; (top right). Confocal microscopes have a pinhole which prevents the detection of light emitted outside of the focal plane, eliminating the &#34;hazy background&#34; (bottom right).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig2.jpg" /> 
Figure 2. Pinhole effect in confocal microscopy. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/10501/10501fig2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Although the highest intensity of the excitation light is at the focal point of the lens (left, red oval), other parts of the sample not in the focal point (right, red star) will get light and fluoresce. To prevent light emitted from these out-of-focus regions to reach the detector, a screen with a pinhole is present in front of the detector. Only the in-focus light (left) emitting from the focal plane is able to travel through the pinhole and reach the detector. The out-of-focus light (right) is blocked with the pinhole and fails to reach the detector.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10501/10501fig3.jpg" /> 
Figure 3. Principal components of a confocal laser scanning microscope. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/10501/10501fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
For the sake of simplicity, the mechanistic description of a confocal microscope will be limited to that of the Nikon Eclipse Ti A1R. Although there may be minor technical differences between different confocal microscopes, the A1R serves well as a good model for describing confocal microscope function. The excitation light beam, produced by an array of diode lasers, is reflected by the primary dichroic mirror into the objective, which focuses the light onto the specimen being imaged. The primary dichroic mirror selectively reflects the excitation light while allowing light at other wavelengths to pass through. The light then encounters the scanning mirrors that sweep the light beam across the specimen in an x-y manner, illuminating a single (x,y) pixel at a time. Fluorescence emitted by fluorophores at the illuminated pixel is collected by the objective lens and passes through the primary dichroic mirror to reach an array of photomultiplier tubes (PMTs). Secondary dichroic mirrors direct the emission light to the appropriate PMT. Excitation light scattered by the sample back into the objective is reflected by the primary dichroic mirror back towards the specimen, and thus prevented from entering the detection light path and reaching the PMTs (see Figure 3). This allows the relatively feeble fluorescence to be quantified without contamination by light scattered from the excitation light beam, which is typically orders of magnitude more intense than the fluorescence. Because the pinhole blocks light from outside of the focal volume, the light arriving at the detector comes from a narrow, selected z-plane. Therefore, images can be collected from a series of adjacent z-planes; this series of images is often referred to as a &#39;z-stack&#39;. By using the appropriate software, a z-stack can be processed to generate a 3D image of the specimen. A particular advantage of confocal microscopy is the ability to distinguish the subcellular localization of staining. For example, the differentiation between membrane staining from intracellular staining, which is very challenging with conventional epifluorescence microscopy (1, 2, 3).
Sample preparation is an important facet of confocal imaging. A strength of optical microscopy techniques is the flexibility to image live or fixed cells. When attempting to produce 3D images, because of the number of images that must be acquired for a z-stack, the difficulty of maintaining cell health, and the movement of live cells and their organelles, the use of fixed cells is typical. The procedure for fixing and staining cells for confocal fluorescence is similar to that conventionally used in immunofluorescence. After culture in chamber slides or on coverslips, cells are fixed using paraformaldehyde to preserve cellular morphology. Non-specific antibody binding is blocked using bovine serum albumin, milk, or normal serum. In order to maintain the specificity of the secondary antibodies, the solution used should not originate from the same species in which the primary antibodies were generated. The cells are incubated with primary antibodies that bind the antigen of interest. When labeling several cellular targets, the primary antibodies must each be derived from a different species. Antibodies tagging an antigen are then bound by fluorophore-conjugated secondary antibodies. Fluorophore-conjugated secondary antibodies should be selected so that they are compatible with the wavelengths of laser excitation available in the confocal microscope. When visualizing multiple antigens, the excitation/emission spectra of the fluorophores should differ enough so that their signals can be discriminated by microscopic analysis. The stained specimen is then mounted on a slide for imaging. A mounting medium is used to prevent photobleaching and specimen dehydration. If desired, a mounting medium containing a nuclear counterstain (e.g. DAPI or Hoechst) can be used (4).
In the following protocol, mouse fibroblasts transfected to express CD1d (LCD1) were stained with antibodies recognizing CD1d and CD107a (LAMP-1). CD1d is a major histocompatibility complex 1 (MHC 1)-like receptor present on the surface of antigen presenting cells that presents lipid antigens. LAMP-1 (lysosomal associated membrane protein-1) is a transmembrane protein primarily present in lysosomal membranes. For proper antigen presentation, CD1d is trafficked through the low pH lysosomal compartment, so LAMP-1 is being used as a marker of the lysosomal compartment for this protocol. By probing the LCD1 cells with anti-CD1d and anti- LAMP-1 that were produced in different species, secondary antibodies with unique fluorophores can be used to determine the localization of each protein in the cell and whether CD1d is present in the LAMP-1 positive lysosomal compartments.

Confocal Fluorescence Microscopy and Localization of Proteins

Source: Dominique R. Bollino1, Eric A. Legenzov2, Tonya J. Webb1
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland School of Medicine ...