Our sincere appreciation is expressed to the following people: Drs. Sam Johnson and Benjamin Carlson of the Duke Light Microscopy Core Facility for their assistance with data visualization software, and Ms. Valerie Lapham and Dr. John M. Mackenzie, Jr. of the Center for Electron Microscopy at North Carolina State University for their advice on electron microscopy. We thank Dr. Elaine B. Boh&#243;rquez for her editorial assistance. Authors contributed in the following manner: DVB, SM, and RAL designed experiments and analyzed data. DVB performed experiments and FH performed manual rendering of data. SM is director of Renovo Neural, where SBEM data was acquired. DVB wrote the manuscript and all authors reviewed and edited the final manuscript. This work was supported by NIH grants R01DK091946 and Veterans Affairs grant I01BX002230 to RAL, and F32DK094704, to DVB.

<ol>
	<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 314, 1-340 (1986).</li><li>Smith, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+types,+neurosecretory+cells,+and+body+plan+of+the+early-diverging+metazoan+Trichoplax+adhaerens.">Novel cell types, neurosecretory cells, and body plan of the early-diverging metazoan Trichoplax adhaerens.</a> Current biology : CB. 24, 1565-1572 (2014).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS biology. 2, e329 (2004).</li><li>Engelstoft, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+transmembrane+G+protein-coupled+receptor+repertoire+of+gastric+ghrelin+cells.">Seven transmembrane G protein-coupled receptor repertoire of gastric ghrelin cells.</a> Molecular metabolism. 2, 376-392 (2013).</li><li>Chandra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin-like+domain+containing+receptor+1+mediates+fat-stimulated+cholecystokinin+secretion.">Immunoglobulin-like domain containing receptor 1 mediates fat-stimulated cholecystokinin secretion.</a> The Journal of clinical investigation. 123, 3343-3352 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+stimulate+cholecystokinin+release+through+the+Ca2+-sensing+receptor.">Amino acids stimulate cholecystokinin release through the Ca2+-sensing receptor.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G528-G537 (2011).</li><li>Rogers, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+activity-triggered+glucagon-like+peptide-1+secretion+from+primary+murine+L-cells.">Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells.</a> The Journal of physiology. 589, 1081-1093 (2011).</li><li>Boh&#243;rquez, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enteroendocrine+cell-enteric+glia+connection+revealed+by+3D+electron+microscopy.">An enteroendocrine cell-enteric glia connection revealed by 3D electron microscopy.</a> PloS one. 9, e89881 (2014).</li><li>Boh&#243;rquez, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroepithelial+circuit+formed+by+innervation+of+sensory+enteroendocrine+cells.">Neuroepithelial circuit formed by innervation of sensory enteroendocrine cells.</a> The Journal of clinical investigation. , (2015).</li><li>Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+preparing+GFP-labeled+neurons+previously+imaged+in+vivo+and+in+slice+preparations+for+light+and+electron+microscopic+analysis.">A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis.</a> Nature protocols. 4, 1145-1156 (2009).</li><li>Deerinck, T., Bushong, E., Thor, A., Ellisman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , (2010).</li><li>Boh&#243;rquez, D. V., Chandra, R., Samsa, L. A., Vigna, S. R., Liddle, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+basal+pseudopod-like+processes+in+ileal+and+colonic+PYY+cells.">Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells.</a> Journal of molecular histology. 42, 3-13 (2011).</li><li>Nilsson, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+immunocytochemical+colocalization+of+peptide+YY+and+enteroglucagon+in+endocrine+cells+of+the+rabbit+colon.">Distribution and immunocytochemical colocalization of peptide YY and enteroglucagon in endocrine cells of the rabbit colon.</a> Endocrinology. 129, 139-148 (1991).</li><li>Mizuhira, V., Futaesaku, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+fixation+method+for+biological+membranes+using+tannic+acids.">New fixation method for biological membranes using tannic acids.</a> Acta Histochem Cytochem. 5, 233-236 (1972).</li><li>Reymond, O. L., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+routine+flat+embedding+method+for+electron+microscopy+of+microorganisms+allowing+selection+and+precisely+orientated+sectioning+of+single+cells+by+light+microscopy.">A routine flat embedding method for electron microscopy of microorganisms allowing selection and precisely orientated sectioning of single cells by light microscopy.</a> Journal of microscopy. 130, 79-84 (1983).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9, 676-682 (2012).</li><li>Boh&#243;rquez, D., Chandra, R., Samsa, L., Vigna, S., Liddle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+basal+pseudopod-like+processes+in+ileal+and+colonic+PYY+cells.">Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells.</a> J Mol Histol. 42, 3-13 (2011).</li><li>Jang, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut-expressed+gustducin+and+taste+receptors+regulate+secretion+of+glucagon-like+peptide-1.">Gut-expressed gustducin and taste receptors regulate secretion of glucagon-like peptide-1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 15069-15074 (2007).</li><li>Liou, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein-coupled+receptor+GPR40+directly+mediates+long-chain+fatty+acid-induced+secretion+of+cholecystokinin.">The G-protein-coupled receptor GPR40 directly mediates long-chain fatty acid-induced secretion of cholecystokinin.</a> Gastroenterology. 140, 903-912 (2011).</li><li>Reimann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+sensing+in+L+cells:+a+primary+cell+study.">Glucose sensing in L cells: a primary cell study.</a> Cell metabolism. 8, 532-539 (2008).</li><li>Bohorquez, D. V., Liddle, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon-like+basal+processes+in+enteroendocrine+cells:+characteristics+and+potential+targets.">Axon-like basal processes in enteroendocrine cells: characteristics and potential targets.</a> Clinical and translational science. 4, 387-391 (2011).</li><li>Batterham, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+hormone+PYY(3-36)+physiologically+inhibits+food+intake.">Gut hormone PYY(3-36) physiologically inhibits food intake.</a> Nature. 418, 650-654 (2002).</li><li>Flint, A., Raben, A., Astrup, A., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucagon-like+peptide+1+promotes+satiety+and+suppresses+energy+intake+in+humans.">Glucagon-like peptide 1 promotes satiety and suppresses energy intake in humans.</a> The Journal of clinical investigation. 101, 515-520 (1998).</li><li>Hayworth, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+ATUM+ultrathin+section+libraries+with+WaferMapper:+a+multi-scale+approach+to+EM+reconstruction+of+neural+circuits.">Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits.</a> Frontiers in neural circuits. 8, 68 (2014).</li></ol>

ד&quot;ר סאטיש Medicetty הוא עובד ומקבל שכר של 100% מRenovo העצבי Inc; עם זאת, זה אינו משנה את דבקותו של המחבר למדיניות יופיטר על שיתוף נתונים וחומרים. אין ניגוד האינטרסים מוצהר למחברים שנותרו.

<html> chemosensation עיכול מתגלה כתחום חדש ומלהיב במחקר הביו-רפואי. זה בחלק גדול בשל הגילוי של קולטני טעם תפקודי בתאי enteroendocrine 18. מחקרים מאוחרים יותר הראו כי תאי enteroendocrine לבטא קולטנים ספציפיים לחומרים מזינים, כולל פחמימות, שומנים, וaminoacids 5,6,19,20. גורם קטליטי לתגליות אלה היה הפיתוח של עכברי כתב, שבו תאי enteroendocrine מסומנים 20 fluorescently. פיתחנו אחד מעכברים אלה, עכבר PyyGFP, ללמוד תאי enteroendocrine של המעי הדק והמעי גס דיסטלי 17,21. תאים אלה הם עניין כי הם מפרישים PYY ופפטיד כמו גלוקגון -1, אשר שניהם מעוררי שובע 22,23. באותו הזמן, חשבון אולטרה-מבני מלא של תאים אלה היה חסרים, שהאמנו היה חיוני כדי להבין את מנגנוני האיתות שלהם. ontent &quot;&gt; כאן, שתארנו באופן חזותי שיטה לגשר מיקרוסקופיה confocal עם SBEM. השיטה נקראת כCocem3D, אשר אפשר לנו לתעד את ultrastructure של תאי enteroendocrine המלא. יש לנו דיווח שיש תאים אלה neuropod המכיל שלושה רבעים של כל שלפוחית ​​הפרשת 8. בתוך neuropod, יש neurofilaments והרבה כמו אקסונים עצביים, neuropods הם טיפחו על ידי תאי גליה מעיים 8. חשוב מכך, הוא אף neuropods אלה שenteroendocrine תאים להתחבר פיזי לתאי עצב innervating המעי ו מעי גס 9. אחת מנקודתי החוזק של cocem3D הוא בפשטותו. הפחתת דגימת הרקמה לגוש שניתן הדמיה על ידי confocal וSBEM מאפשר זיהוי של תאים ספציפיים בתוך רקמה. שלפוחית ​​הפרשה ואברונים אחרים ניתן לזהות בקלות ברזולוציה של 7 ננומטר / פיקסל. עיבוד בגלל הסעיפים בSBEM מבוטלים, נוסףלשיר של רקמות לזיהוי חלבונים ספציפיים הוא לא אופציה בשלב זה. עם זאת, הפיתוח של שיטות כגון 24 ATUM, שבחלקים מגוש הרקמה נשמרים, עשויים לאפשר זיהוי של חלבונים ספציפיים בתא. קביעת המיקום הספציפי של קולטנים chemosensory על תאי enteroendocrine היא מידע חיוני לפיתוח טיפולים התרופתיים להשמנת יתר, משום שתאי enteroendocrine הם ממשק חושי בין מזון במעיים והשובע במוח.

חיים בתוך תא מתרחשים בזמן ובמרחב. שינויים לאורך הזמן לעתים קרובות למדו באמצעות מיקרוסקופ הזמן לשגות בשילוב עם טכניקות הדמיה הקרינה, כמו מיקרוסקופ ברזולוציה סופר. שטח, בפרט ההסדר של האברונים בתוך תא או אינטראקציות תא אל התא, ניתן לגזור רק על ידי חשבון של המבנה העדין של התאים שלם. חשבון מקיף של המבנה העדין של תאים יכול גם להביא בהירות לפונקציה הגנומי במקרים בהם הגנום הוא זמין, כמו ג נמטודות elegans 1 או tricoplax placozoa השטוח adherens 2. מיקרוסקופ אלקטרונים חתך סידורי הוא החברה לשחזור, זמן יעיל, ומשימה הודות פחות יקרה לפיתוח טכנולוגיות במיקרוסקופ האלקטרונים 3D האוטומטי, כמו מיקרוסקופ בלוק פנים סידוריים אלקטרונים הסורקים 3 (SBEM). הצורך במידע מבני על מנת להבהיר פונקציה הוא מאוד ברור בcel מסויםסוגי l בי פונקציה תלויה באינטראקציות תא אל התא פיזיים, כגון תאי עצב, גליה, או תאי אפיתל חושיים. אנחנו מעוניינים בעיקר בהבהרה כיצד אותות חושיים מחומרים מזינים בלומן של המעיים transduced לאות חשמלי שסופו של הדבר מודולציה התנהגויות תיאבון. המעגל הוא מורכב, אך מתחיל בקיר של המעי בי חומרים מזינים באים במגע עם תאי אפיתל חושיים, תאי enteroendocrine נקראים. שלא כמו תאים אחרים חושיים אפיתל, כגון תאי טעם, תאי enteroendocrine פזורים ברחבי אפיתל מעי ביחס של 1-1000 4-7. כתוצאה מכך, הם היו קשים לזהות וללמוד, ובמשך זמן רב הם נתפסו רק כמקור של הורמוני בטן. אבל עם ההתפתחות של עכברי כתב הקרינה תא ספציפי, התפקוד החושי המורכב של תאים אלה מתפתח. באמצעות אחת מהעכברים כתב אלה, YY-GFP עכבר פפטיד (PyyGFP), מצאנו enteroendocr שיש תאי ine זנב cytoplasmic בולט ששם neuropod. המראה של neuropods הציע פונקצית שימור בתקשורת תא אל התא. לפיכך, אנו מנומקים שעל ידי המתעדים את ultrastructure של תא enteroendocrine, הפונקציה של neuropods יכולה לנבוע. הצורך להבין את המבנה של תוספת בתא מפוזר שקשה לזהות היה הרציונל העיקרי לפיתוח שיטה לשלב מיקרוסקופיה confocal וSBEM. התא של העניין זוהה באמצעות עכברי כתב התא ספציפי enteroendocrine PyyGFP. השיטה מאפשרת לנו לתעד את כל ultrastructure של תא enteroendocrine וneuropod. בתוך neuropods, מצאנו תכונות מבניות של אקסונים עצביים, ומחוץ neuropods, מצאנו קשר פיזי לגליה מעיים 8. ואכן, neuropods מכיל כ -70% מכלל המצביעה על שלפוחית ​​הפרשת תפקיד חיוני בתפקוד ההפרשה של תאים אלה. בנייה בנתונים מבניים, ולאחרונה מצאנו כי באמצעות neuropods אלה, תאי enteroendocrine והנוירונים innervating הבטן יוצרת מעגל neuroepithelial, דומה לזו של תאי טעם בלשון 8,9. חשיפת תכונות כגון מנגנוני chemosensory עיכול נבעו מנתונים שנאספה מבניים בשיטה מיקרוסקופית מתאם זה. אנו מאמינים בשיטה זו יכולה להיות שימושית בתחומים אחרים של ביולוגיה של תא, במיוחד שבו תאים מפוזרים בתוך הרקמות ביחס נמוך מאוד. אנחנו התייחסנו לשיטה כconfocal הגומל ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק פנים בלוק סידורי ב3D (Cocem3D). השיטה מורכבת מהשלבים העיקריים הבאים: נתיחת רקמה, מיקרוסקופיה confocal, הדמיה SBEM, SBEM ומתאם תמונת confocal, ופילוח ידני. בהשוואה לשיטות אחרות גומלות, הרעיון הוא פשוט למדי, כי המתאם הוא פיזי ולא כימי.

<table><tbody><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Life technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>4%, freshly made in PBS, final pH 7.4</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Dental wax</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72660</td><td></td></tr><tr><td>Low-melting agarose</td><td>Life technologies</td><td>16520-100</td><td>5%, freshly made in PBS</td></tr><tr><td>Standard Tissue-Tek Cryomold</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62534-25</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&amp;nbsp; nuclear stain</td><td>Life technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Postively charged glass slides and coverslips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine art paintbrush #1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cacodylate buffer</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>11650</td><td></td></tr><tr><td>Tannic acid</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>EMbed 812 kit&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Liquid releasing agent&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70880</td><td></td></tr><tr><td>Liquid silver colloidal&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12630</td><td></td></tr><tr><td>CircuitWorks conductive epoxy&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>ITW Chemtronics</td><td>CW2400</td><td></td></tr><tr><td>Variable flow peristaltic pump</td><td>VWR</td><td>70730-064</td><td></td></tr><tr><td>VT1200S Vibrating blade microtome</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 780i confocal microscope</td><td>Carl Zeiss&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma VP Scanning Electron Microscope&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3view system</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Renovo Neural Inc (Cleveland, OH)</td><td></td><td>http://www.renovoneural.com</td><td>Renovo provides 3d EM services</td></tr><tr><td>Fiji software</td><td>Open access software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer station with 16 GB of RAM or more</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Data visualization software Imaris 7.5&amp;nbsp;</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

correlative confocal and 3d electron microscopy of a specific sensory cell

תיחום של ultrastructure של תאים חשוב להבנת תפקודו. זה יכול להיות פרויקט מרתיע לסוגי תאים נדירים מתפזרים בכל רקמות עשויות סוגי תאים שונים, כגון תאי enteroendocrine של האפיתל המעיים. חיישנים אלה במערכת העיכול של מזון וחיידקים היו קשים ללמוד כי הם התפזרו בין תאי האפיתל אחרים ביחס של 1: 1,000. לאחרונה, עכברים מהונדסים כתב כבר נוצר כדי לזהות תאי enteroendocrine באמצעות הקרינה. אחד מאלה הוא עכבר YY-GFP פפטיד. שימוש בעכבר זה, פיתחנו שיטה כדי לתאם confocal ומיקרוסקופ אלקטרונים סורקים בלוק פנים סידורי. אנחנו בשם השיטה cocem3D ומיושמים בו כדי לזהות תאי enteroendocrine ספציפיים ברקמות ולחשוף ultrastructure של התא ב3D. הרזולוציה של cocem3D מספיק כדי לזהות אברונים קטנים כמו שלפוחית ​​הפרשה ולהבחין קרום תא לאחסון מחדשndering. Cocem3D ניתן להתאים בקלות ללמוד את ultrastructure 3D של סוגי תאים אחרים ספציפיים ברקמות האם שלהם.

השיטה המוצגת כאן שימשה ללמוד ultrastructure של תאים ספציפיים בתוך שכבה של האפיתל. התא של עניין במקרה זה הוא תא enteroendocrine החמקמק. זיהוי שלהם באתר היה אפשרי רק בשנים האחרונות עם ההתפתחות של עכברי כתב הקרינה סלולריים ספציפית. בשנת 2011, פיתחנו עכבר שבי האמרגן של PYY ההורמון מניע את הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק 17. בPyyGFP עכבר זה, תאי enteroendocrine של החלק הדיסטלי של המעי דק ומעי גס נבדלים בקלות תחת אור UV. מודל עכבר זה היה בסיס לזהות גוש רקמה המכיל תאי enteroendocrine ולעבד אותו לSBEM. שיטת המתאם נקראת כאן כcocem3D ונבנתה על פרוטוקולים שפורסמו בעבר 10,11. אופטימיזציה של הממדים של גוש הרקמה היא קריטית למתאם. בניסויים ראשוניים,נקבע כי בגוש רקמה 300 מיקרומטר x הארוך 50 מיקרומטר עבים מספר תמונות SBEM מצטמצם למינימום ואילו המכסים את כל הגוף של התא של עניין. איור 1 א מציג תצפית על הנתיחה באמצעות microtrome להב רוטט ל להשיג בלוק הרקמה עם הממדים הנכונים. לפחות 100 בלוקים מתקבלים לפני המיון דרכם לאסוף אותם עם תאים שלמים של עניין. בלוקים נבחרים הם צילמו על ידי מיקרוסקופ ותמונת confocal Z- ערימות הם אופטיים במרווחים כל מיקרומטר (איור 1 ו- C) 1. 1D איור מציג תצוגה שניתנו נפח תא enteroendocrine במעי של העכבר. neuropod הבולט שלה משתרע מתחת לתאי האפיתל ל~ 60 מיקרומטר. התא של עניין נמצא על ידי מקשר Z- ערימות confocal עם תמונת SBEM של כל הפנים הבלוק. דוגמא מוצגת כאן של בלוק מהמעי גס דיסטלי של PyyGFPעכבר. לאחר קבלת Z- ערימות confocal (איור 2 א), הבלוק משובץ בשכבה דקה של agarose התכה נמוכה (איור 2). זה הכרחי למניפולציה הבאה של הבלוק. זה חשוב לשמור על הכיוון של הבלוק השטוח ככל האפשר כדי להתאים את הפרוסות אופטיות עם פרוסות SBEM. באיור 2 ג, תמונת נציג מוצגת בכל הפנים של בלוק הרקמה. חלקים של נתון זה פורסמו בעבר באל Bohorquez et. 2014 8. זה היה מתואם לאחר מכן עם תמונת confocal על ידי לקיחה בחשבון ציוני דרך רקמה וממדים. איור 2 ד מציג כיסוי של confocal ותמונת SBEM של הבלוק, חושף מיקום מדויק של התא של עניין שלנו. ברגע שהתא זוהה, ההדמיה SBEM נעשה ברזולוציה גבוהה מספיק כדי לזהות שלפוחית ​​הפרשה ואברונים תאים אחרים. סט הנתונים שהוצג לומחדש היה צילם בשעה 7 ננומטר לכל פיקסל כתמונות של הבלוק נלקחו כל ננומטר 70. נתונים להגדיר הכילו 643 תמונות שמשתרעות על פני 45 מיקרומטר לעומק הרקמה. כמה מיקרונים מגולחים במהלך הדמיה ראשונית של כל הפנים הבלוק בהגדלה נמוכה. סט נתונים SBEM הגלם נרכש ב.dm3 פורמט והפך ל.tiff לטיפול שלאחר מכן. ערימת SBEM הייתה קצוצה באמצעות תוכנת פיג&#39;י תוסף &quot;יבול (3D)&quot; בלוק להכיל רק את האזור של עניין. פעולה זו מפחיתה את כמות זיכרון RAM הדרוש לנפח טיוח. התא זוהה על ידי עמדתה ושלפוחית ​​הפרשה, ומפולח באמצעות תוכנת Imaris. איור 3 מכיל טיוח ב3D של תא enteroendocrine. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig1.jpg" /> איור 1:. מיקרוסקופיה confocal מתאם () Workflow לנתח פיסתרקמת מעי לרקמה לחסום 300 x 50 מיקרומטר עבה. בלוק רקמת נציג הממדים הנכונים (B). שים לב שגוש רקמה של ממדים אלה מהמעי דק העכבר משתרע villi על 3 או, במקרה של המעי הגס על 8 מאורות. סיסי (ג) במעי הדק המכיל תא של עניין. (ד) Z- מחסנית confocal שניתנו ב3D באמצעות תוכנת Imaris תערוכות תא enteroendocrine עם neuropod בולט פועל מתחת לאפיתל במעי. כחול = DAPI כתם גרעיני. ברים = 10 מיקרומטר. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52918/52918fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig2.jpg" /> איור 2: מיקרוסקופ אלקטרונים סורק בלוק פנים סידורי (א) תמונת Confocal של Sele גודל.בלוק רקמת cted מהמעי הגס המכיל תאי enteroendocrine PyyGFP (ירוק) של עניין. (ב) ברגע שהבלוק הוא הדמיה על ידי מיקרוסקופ confocal, זה מוטבע אז שטוח בהתכה נמוכה agarose באמצעות שקופיות זכוכית. הטבעת גוש הרקמה בagarose מאפשרת מניפולציה שלאחר מכן, ואת החריץ בפינה השמאלית עוזר לעלות הבלוק בתוך SBEM בכיוון הנכון. (ג) SBEM תמונה של הפנים של הבלוק. מתאם (D) של נתוני confocal עם SBEM לזהות תא של העניין (חץ לבן). תמונות בC ו- D של נתון זה משתנות מBohorquez et al., 2014 8. כחול = גרעיני כתם DAPI. ברים = 10 מיקרומטר. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52918/52918fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig3.jpg" /> איור 3:. נתונים טיוח ב3D () טיוח נפח של תא enteroendocrine באמצעות תוכנת Imaris. התא מכיל neuropod ארוז עם שלפוחית ​​הפרשה. לתיאור ultrastructure של תא enteroendocrine מלא, עיין Bohórquez et al., 2014 8. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52918/52918fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell at JoVE.com

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

מתאם Confocal ו3D מיקרוסקופית אלקטרונים של תא חושי ספציפי

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

correlative-confocal-3d-electron-microscopy-specific-sensory

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

11.4K Views.  Duke University Medical Center. Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy. 

Video: Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

מיקרוסקופית גומלת לניתוח מבני 3D של אינטראקציות דינמיות

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Bioengineering

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy. The sub-diffraction limit resolution capabilities of super-resolution light microscopes allow improving the accuracy of the correlated data. Briefly, 110 nanometer thick cryo-sections are transferred to a silicon wafer and, after immunofluorescence staining, are imaged by super-resolution light microscopy. Subsequently, the sections are preserved in methylcellulose and platinum shadowed prior to imaging in a scanning electron microscope (SEM). The images from these two microscopy modalities are easily merged using tissue landmarks with open source software. Here we describe the adapted method for the larval zebrafish retina. However, this method is also applicable to other types of tissues and organisms. We demonstrate that the complementary information obtained by this correlation is able to resolve the expression of mitochondrial proteins in relation with the membranes and cristae of mitochondria as well as to other compartments of the cell.

This protocol describes the necessary steps to obtain subcellular protein localization results on zebrafish retina by correlating super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy images.

רזולוציה סופר correlative ואלקטרון לפתרון חלבון לוקליזציה ברשתית דג זברה

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Developmental Biology

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

מיקרוסקופי אלקטרונים בהירי-עור גומל באמצעות חלקיקי נקודה קוונטית

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

ויזואליזציה של Endosome Dynamics בחי מסוף עצב עם דימות פלואורסצנטי ארבעה ממדים

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Neuroscience

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

Correlative אלקטרון מיקרוסקופ אור (קלם) עבור מעקב אחר והדמיה חלבון נגיפי הקשורים מבנים בתאים הקפאה. מרותק למיטה

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity necessary for proper cellular function. Understanding how the enzymes, proteins, and cytoskeletal components govern and maintain this biochemical segregation is therefore of paramount importance. The use of fluorescently tagged molecules to localize to and/or perturb subcellular compartments has yielded a wealth of knowledge and advanced our understanding of cellular regulation. Imaging techniques such as fluorescent and confocal microscopy make ascertaining the position of a fluorescently tagged small molecule relatively straightforward, however the resolution of very small structures is limited 1.
On the other hand, electron microscopy has revealed details of subcellular morphology at very high resolution, but its static nature makes it difficult to measure highly dynamic processes with precision 2,3. Thus, the combination of light microscopy with electron microscopy of the same sample, termed Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) 4,5, affords the dual advantages of ultrafast fluorescent imaging with the high-resolution of electron microscopy 6. This powerful technique has been implemented to study many aspects of cell biology 5,7. Since its inception, this procedure has increased our ability to distinguish subcellular architectures and morphologies at high resolution. 
Here, we present a streamlined method for performing rapid microinjection followed by CLEM (Fig. 1). The microinjection CLEM procedure can be used to introduce specific quantities of small molecules and/or proteins directly into the eukaryotic cell cytoplasm and study the effects from millimeter to multi-nanometer resolution (Fig. 2). The technique is based on microinjecting cells grown on laser etched glass gridded coverslips affixed to the bottom of live cell dishes and imaging with both confocal fluorescent and electron microscopy. Localization of the cell(s) of interest is facilitated by the grid pattern, which is easily transferred, along with the cells of interest, to the Epon resin used for immobilization of samples and sectioning prior to electron microscopy analysis (Fig. 3). Overlay of fluorescent and EM images allows the user to determine the subcellular localization as well as any morphological and/or ultrastructural changes induced by the microinjected molecule of interest (Fig. 4). This technique is amenable to time points ranging from &le;5 s up to several hours, depending on the nature of the microinjected sample.

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

The CLEM technique has been adapted to analyze ultrastructural morphology of membranes, organelles, and subcellular structures affected by microinjected molecules. This method combines the powerful techniques of micromanipulation/microinjection, confocal fluorescent microscopy, and electron microscopy to allow millimeter to multi-nanometer resolution. This technique is amenable to a wide variety of applications.

אור גומל ומיקרוסקופי אלקטרונים (קלם) ככלי למדמיינים מולקולות Microinjected והיעדים האיקריוטים תת סלולריים


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

הדמיה תלת מימדי בקנה מידה גדול של ארגון הסלולר קליפת העכבר

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-dimensional Imaging of Bacterial Cells for Accurate Cellular Representations and Precise Protein Localization

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be affected by cell shape. Bacterial cells are three-dimensional (3D) objects, although they are rarely treated as such. Most microscopy techniques result in two-dimensional (2D) images leading to the loss of data pertaining to the actual 3D cell shape and localization of proteins. Certain shape parameters, such as Gaussian curvature (the product of the two principal curvatures), can only be measured in 3D because 2D images do not measure both principal curvatures. Additionally, not all cells lie flat when mounting and 2D imaging of curved cells may not accurately represent the shapes of these cells. Accurately measuring protein localization in 3D can help determine the spatial regulation and function of proteins. A forward convolution technique has been developed that uses the blurring function of the microscope to reconstruct 3D cell shapes and to accurately localize proteins. Here, a protocol for preparing and mounting samples for live cell imaging of bacteria in 3D both to reconstruct an accurate cell shape and to localize proteins is described. The method is based on simple sample preparation, fluorescent image acquisition, and MATLAB-based image processing. Many high-quality fluorescent microscopes can be simply modified to take these measurements. These cell reconstructions are computationally intensive and access to high-throughput computational resources is recommended, although not necessary. This method has been successfully applied to multiple bacterial species and mutants, fluorescent imaging modalities, and microscope manufacturers.

This protocol explains how to prepare and mount bacterial samples for live three-dimensional imaging and how to reconstruct the three-dimensional shape of E. coli from those images.

הדמיה תלת ממדית של תאים חיידקיים לייצוגים סלולריים מדויקים ולוקליזציה של חלבון מדויק

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be ...

Immunology and Infection

Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of pre-clinical agents labeled with fluorescent probes. With recent advancements in antibody based cytotoxic drug delivery systems, understanding the alterations induced by these agents within the realm of receptor aggregation and internalization is of critical importance. This protocol leverages the well-established methodology of fluorescent immunocytochemistry and the open source FIJI distribution of ImageJ, with its inbuilt autocorrelation and image mathematical functions, to perform spatial image correlation spectroscopy (ICS). This protocol quantitates the fluorescent intensity of labeled receptors as a function of the beam area of the confocal microscope. This provides a quantitative measure of the state of target molecule aggregation on the cell surface. This methodology is focused on the characterization of static cells with potential to expand into temporal investigations of receptor aggregation. This protocol presents an accessible methodology to provide quantification of clustering events occurring at the cell surface, utilizing well established techniques and non-specialized imaging apparatus.

Antibodies that bind to target receptors on the cell surface can confer conformation and clustering alterations. These dynamic changes have implications for characterizing drug development in target cells. This protocol utilizes confocal microscopy and image correlation spectroscopy through ImageJ/FIJI to quantify the extent of receptor clustering on the cell surface.

מיקרוסקופיה קונפוקלית מגלה התא קולטן משטח צבירת דרך התמונה המתאם ספקטרוסקופיה

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of ...

Correlative Microscopy Reveals Stress-Induced Mitochondria-Lysosome Interactions

Dual-color Correlative Light and Electron Microscopy for the Visualization of Interactions between Mitochondria and Lysosomes

Cellular organelles, such as mitochondria and lysosomes, display dynamic structures. Despite the higher resolution of transmission electron microscopy for structural analysis, light microscopy is essential for the visualization of dynamic organelles by target-specific labeling. The following protocol describes a method that combines dual-color correlative light and electron microscopy (CLEM) to observe the interactions between mitochondria and lysosomes. In this study, mitochondria were labeled with mEosEM (Mito-mEosEM) and lysosomes with TMEM192-V5-APEX2. The results obtained from CLEM images enable us to observe the changes in the interactions between mitochondria and lysosomes under external stress conditions. Treatment with bafilomycin (BFA), which inhibits lysosomal function, resulted in an increase in contact between mitochondria and lysosomes, leading to the formation of fragmented mitochondria trapped inside lysosomes. Conversely, treatment with U18666A, which inhibits cholesterol export from lysosomes, caused lysosomes to be surrounded by mitochondria, indicating a distinct form of interaction. This study presents an effective method for observing the interactions between mitochondria and lysosomes in fixed cells. Furthermore, CLEM imaging with dual-color probes offers a powerful tool for future investigations of organelle dynamics and their implications for cell function and pathology.

This protocol describes a mechanism for using correlative light and electron microscopy to visualize the interaction of mitochondria and lysosomes labeled with mEosEM and APEX2, respectively.

Cellular organelles, such as mitochondria and lysosomes, display dynamic structures. Despite the higher resolution of transmission electron microscopy for ...