The authors thank Colleen Van Kirk for mouse retina and cerebellum samples, and Peter Gregory for figure generation. The authors also thank Dr. Allison Gillaspy and the Laboratory for Molecular Biology and Cytometry Research core for access to the MiSeq. This work was supported by NIH grants DA029405, EY021716, and AG026607 and the Donald W. Reynolds Foundation.

Doku 1. Nükleik Asit İzolasyon NOT: Aynı doku örneğinden DNA ve RNA&#39;nın Eş-izolasyon gen ekspresyon analizi için epigenetik analiz için DNA ve RNA eşleştirilmiş toplamak için bir fırsat sunuyor. Burada verilen örnek kullanılabilecektir deneysel doku ancak farklı örnek tipleri veya başka bir izolasyon yöntemleri için alternatif yaklaşımlar sütun saflaştırma bir şeklidir. temel gereklilik proteini ya da organik çözücüler kirletmeden yüksek düzeyde saflaştırılmış bir nükleik asittir. <ol><li> Mekanik homojenizasyon için taze dondurulmuş ya da taze doku parçası seçin ve buz üzerinde yerleştirin. 2.0 ml yuvarlak alt mikrosantrifüj tüp saklayın veya aktarım dokusu. </li><li> Doku içeren her bir tüpe, bir 5 mm paslanmaz çelik boncuk ekleyin. Hücre sayısı veya doku ağırlığı üreticinin önerileri doğrultusunda lizis tamponu uygun bir miktarda, ekleyin. </li><li> Bir boncuk değirmeni mekanik homojenizasyon de kullanarak doku homojenize30 saniye için 30 Hz. Not: frekans ve mekanik homojenleştirme süresi doku türüne bağımlıdır. Daha yumuşak dokular tamamen sert dokular optimizasyonu ayarlarken gerektiren ederken, önerilen ayarları kullanarak homojenize edecek. </li><li> Üreticinin protokolü takip edilerek, oda sıcaklığında, silika spin sütunları kullanılarak, DNA ve RNA izolasyonu yapınız. <ol><li> Buz üzerinde RNaz içermeyen su ve yerine 50 ul Zehir RNA. QPCR mRNA ifadesi analizi için RNA kullanın. </li><li> TE tamponu, 100 | il DNA Zehir. DNA konsantrasyonu ve verimi artırmak için yıkama sıvısı kullanılarak DNA kolonu kapalı tekrarlayın elüsyon. Hedeflenen metilasyon miktar tayini için DNA kullanın. </li></ol></li><li> 230 nm, 260 nm, 280 nm ve 320 nm&#39;deki soğurma gücü için standart bir spektrofotometre kullanılarak DNA ve RNA kalitesini değerlendirmek. NOT: A260 / A280 oranı yüksek kalitede DNA ~ 1,8-2 olmalıdır. A260 / A280 oranı ~ 2 yüksek kaliteli RNA için olmalıdır. 230 mil Hint fazlalığı absorbans varlığıizolasyon prosedürü gelen ates kirleticiler. </li><li> Kalite, üreticinin talimatlarına uygun olarak bir kılcal elektroforez fiş kullanılarak daha da RNA edin. NOT: Yüksek kaliteli RNA RNA bütünlüğü numarası (RIN)&gt; 8 olacak. rRNA zirveleri yanı sıra Elektroforegramda ekstra piklerin varlığı örnek kirlenmesini gösterir. </li><li> Üreticinin protokolüne uygun olarak floresan deneyi ile, DNA ve RNA ölçmek. NOT: Bir florometrik testi kullanılarak tek başına spektrofotometre daha nükleik asitlerin miktarlarının daha duyarlı ve özgül olduğunu. </li><li> Mağaza -80 ° C &#39;de DNA ve RNA izole edilmiştir. </li></ol> 2. Hedef Belirleme ve Astar Tasarım <ol><li> Ilgili genomik bölge (ler) i belirlemek uygun referans genom sekansı üzerine oturtulmuş BSAS ile analiz edilmesi. Farklı şekilde ifade genlerin gen yükselticiler metilasyon kantitatif ortak hedefleridir. </li><li> Siliko bisülfit-dönüştürmek bir hazırlayındizileme sonraki uyum için ed referans genom bir metin editörü .fasta dizisi dosyasını değiştirerek okur. 5&#39;-3 &#39;yönde, timin en (Şekil 2) ile CpG olmayan sitozin yer değiştirir. </li><li> Tasarım astar bisülfit dönüştürülmüş DNA&#39;dan ilgi bölgeleri yükseltmek için ayarlar. <ol><li> Seçin ve bir bisülfit spesifik PCR astar tasarım programı (Şekil 3) içine, 5&#39;-3 &#39;yönünde, ilgi dönüştürülmemiş bölgeyi kopyalayın. Not: Optimal bisülfit-PCR amplikonu uzunluğu bisülfit ile muamele edilmesi fragmanları DNA olarak amplikon başına 250-400 bp ve 400&gt; büyük bp bölgelerin yükseltilmesi için zordur. Örneğin, 1 kb&#39;lik bir bölge ilgilenilen ise, birden fazla primer çiftleri bu bölgeyi kapsayacak şekilde tasarlanabilir. Tasarım amplikonlar kolay havuzu için eşit bp boyutta olması. Bu kitaplık üretimi için yeterli uzunluğa sahip olabilir, çünkü amplikon uzunlukları &lt;250 bp kaçının. BSAS için optimal astar uzunluğu&gt; olduğuAstar başına 20 bp. </li><li> İleri arasında, 55-65 ° C arasında bir Tm aralığı ve maksimum Tm farkını seçin ve 1-2 ° C arasında ters primerleri. </li><li> En iyi ilgi bölgeyi kapsayacak primer çiftleri seçin. Bu PCR reaksiyonlarında önyargı neden olacağından, CpG siteleri içeren veya CpG sitelere doğrudan bitişik olan primerler seçmeyin. Akademik veya ticari herhangi bir sağlayıcıdan sipariş edilebilir standart PCR primerleri kullanın. </li><li> 100 uM&#39;lik bir çalışma stok RNas / DNase içermeyen su içinde liyofilize primerler sulandırın. </li></ol></li><li> -20 ° C&#39;de saklayın PCR primerlerini gösterir. PCR reaksiyonları için stok çalışan 10 uM ila 100 uM primer stokunu. </li></ol> 3. bisülfit Özgül PCR Optimizasyonu NOT: Genomik DNA&#39;nın bisülfit dönüşümü için, bisülfit dönüşümü için farklı ticari kitler bir dizi mevcuttur. En iyi planlanmış deney uygun kiti veya protokolü seçin. &lt;ol&gt; <li> Genomik DNA ug 2 ng 200 arasında kullanın. Optimizasyon deneyleri için, birden fazla BS PCR reaksiyonları için dönüştürülmüş DNA yeterli bisülfit elde etmek için birden çok dönüşüm reaksiyonları çalıştırın. </li><li> Yüksek DNA konsantrasyonlarını korumak için bisülfitle dönüştürülmüş DNA&#39;nın küçük (örneğin, 10 ul) elüsyon hacimleri kullanın. Not: 1 ug genomik DNA, dönüşüm girişi için kullanılıyorsa, bisülfitle dönüştürülmüş DNA&#39;nın 1-2 ul optimizasyonu PCR reaksiyonları için yeterlidir. </li><li> Bisülfit spesifik PCR ile bisülfit dönüştürülmüş DNA yükseltin. BS-PCR reaksiyonları, bisülfitle dönüştürülmüş DNA büyütme yeteneğine sahip bir Taq polimerazı kullanılarak gerektirir. <ol><li> Tek bir amplikon hedef amplıfıkasyon optimizasyonu için aşağıdaki reaksiyon bir araya getirin. Birden çok numune için, bir 96-yuvalı PCR plaka reaksiyonları monte edin. 25 ul 2x reaksiyon tamponu 0.5 ul dNTP karışımı 5 ul 10 mcM İleri Astar (Final 1 uM) 5 ul 10 uM Ters Primer(Final 1 uM) 2 ul şablon bisülfit dönüştürülmüş DNA 0.4 ul (5 U / ul), DNA polimeraz 12.1 ul DNaz ücretsiz su (Final reaksiyon hacmi 50 ul) </li><li> Uygun bir yapışkan ya da ısı ile sızdırmaz bir film ile, PCR plakası kapatın. </li><li> Uygun bir termal döngü reaksiyonu yerleştirin ve ısıtılmış kapak ile, aşağıdaki döngü koşulları kullanacaktır: <ol><li> 10 dakika boyunca 95 ° C&#39;de bir ilk denatürasyon yapın. </li><li> 30 saniye için 95 ° C&#39;de denatüre. </li><li> Primerlerin spesifik T m, 30 saniye boyunca tavlama kullanılır. Bir tav sıcaklığında optimizasyon reaksiyonları için primerin Tm&#39;den birkaç ° C başlatın. NOT: En tavlama sıcaklıkları, ayrıca bir sıcaklık aralığında test etmek için bir kademeli termal devir cihazı aracılığıyla belirlenebilir. </li><li> 30 saniye için 72 ° C &#39;de bir uzantı yapın. Uzun amplikonlarının için uzatma süresini uzatır. </li><li> Tekrar 3.3.3.2-3.3.3.4 35 döngüleri adımlarıİlk optimizasyonu için tal. Yüksek devir sayıları gerekli olabilir ama genellikle reaksiyon eserler yaratacak klonal amplifikasyonlar önlemek için kaçınılmalıdır. </li><li> 7 dakika boyunca 72 ° C&#39;de son uzatma yapın. </li><li> 4 ° C &#39;de reaksiyonlar tutun. </li></ol></li><li> PAGE elektroforezi ile amplikonları gözünüzde canlandırın. Seçenek olarak ise, üreticinin protokolüne uygun olarak bir kılcal elektroforez, DNA çipi kullanın. <ol><li> Buz ve girdap 5x yükleme boyası 6 ul PCR reaksiyonu, 24 ul karıştırın. </li><li> O. GKD 2 tampon ve 800 ml 5x TBE 200 ml karıştırma çalıştırarak 1x TBE tampon çalışan 1 L olun GKD 2 O ve yükleme boyası olarak oyuk başına 0.5 ug bir son konsantrasyonda DNA merdiveni seyreltin. </li><li> PCR reaksiyonları veya merdivenin 30 ul yük kuyu. </li><li> 45 dakika ~ 200 V jel çalıştırın. İlk boya ön jel sonuna ulaştığında jel akışını durdurur. </li><li> 5 ug / ml jel lekeGKD 2 O 100 ml, 10 mg / ml, 5 ul karıştırılarak etidyum bromid Tüm jel Kapak ve ~ 5 dakika inkübe izin. </li><li> Görüntü 482 nm&#39;lik bir uyarma dalga boyunda bir UV ışık kutusu ya da çok modlu görüntüleyici yoluyla jeli. </li><li> , Boyut PCR amplikonlar merdiveni referans ve beklenen amplikon boyutundan diğer çoklu bant (Şekil 4A ve C) bakarak reaksiyonun özgünlüğünü belirler. </li></ol></li><li> Bir kez BS-PCR için uygun koşullar, deney numuneleri üzerinde BS-PCR işlemi gerçekleştirmek, tespit edilmiştir. <ol><li> Kalan primerler ve diğer reaksiyon bileşenlerinin amplıkonları arındırın. Silika kolon arıtma, SPRI boncuk ya da jel bazlı temizlik ve ölçümü gerçekleştirmek. </li><li> 30 ul TE tampon maddesi içinde Elute amplikonlar. </li><li> Üreticinin protokolleri kullanarak flüorometrik testi kullanılarak amplikonları sayısal olmalıdır. </li><li> Numune başına birden fazla amplikonlar varsa, hacim başına eşit ağırlıkta onları havuz-20 ° C&#39;de miktarları saklayın. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. NGS Kütüphane Hazırlama ve Kütüphane QC NOT: BSAS NGS kütüphane hazırlık çift indekslemesi ile basitleştirilmiş transposome-aracılı protokolünü kullanır (kütüphane hazırlık seti seçimi ile ilgili detaylar için malzemeler listesi bakınız). Bu yöntem, bisülfit dizileme uygulamaları 16,19 hiçbir sapma küçük geçerli ve gösterir edilmiş kitaplık oluşumu için son derece hızlı ve yüksek verimli bir yol sağlar. Çift indeksleme tek indeksleme daha numunelerin daha yüksek bir çoğullama sağlar. Diğer kütüphane hazırlık stilleri mümkün olabilir ancak test edilmemiştir. <ol><li> Bir 96-yuvalı PCR plaka BS PCR amplikonlarının gelen NGS kütüphaneleri hazırlayın. / 0.2 ng amplikonları seyreltilir 1 ng veya 0.2 ng / ml bir seyreltinin 5 ul bir son giriş kütlesi için ul. SPRI boncuklar kullanılarak oluşturulan kütüphanelerin temiz-up gerçekleştirin. W kitaplıkları izole edilmesi için 50-90 ul SPRI boncuk kullanınBu protokol i. SPRI tanelerin hacim kütüphanesinin hedef boyutu ve istenen dizilim reaksiyonları, döngü sayısına bağlıdır. NOT: boncuk tekrar süspansiyon bir mikroplate çalkalayıcı ya da plaka vortexer kullanın. <ol><li> Boncuklar kütüphanelerin Zehir ve yeni bir 96 oyuklu plakaya transfer ve -20 ° C&#39;de muhafaza edilmek üzere ısı yalıtımlı bir film ile kapatın. </li></ol></li><li> Kitaplıkları (Şekil 4B ve D) büyüklüğü ve konsantrasyonunun belirlenmesi. <ol><li> Üreticinin protokollerine göre çip boyutunda bir kapiler elektroforez DNA Run kütüphaneleri. <ol><li> Tespit edilen kütüphane tepe ortalama büyüklüğü ve üretici protokollerine göre molaritede bir tahmin belirlemek için bir yüksek hassasiyet kılcal elektroforez, DNA deneyi kullanın. </li></ol></li><li> Bilinen konsantrasyonda oluşturulacak kütüphaneler ve kullanımı standartlarında adaptör dizisiyle göre tasarlanmış primerler kullanılarak, qPCR kütüphaneleri ölçmek. <ol><li> Çalışma qPCR yenidenüreticinin protokollerine göre saf niceleme ayarlarını kullanarak gerçek zamanlı aletindeki eylemler. </li><li> Kütüphanelerin molar konsantrasyonları hesaplamak için qPCR gelen kütüphanelerin boyutunu ve molar kantitatif kullanın. </li></ol></li></ol></li><li> PH 8.5&#39;da% 0.1 Tween-20 ile, 10 mM Tris-Cl kullanılarak 4 nM&#39;ye kütüphaneleri seyreltin. -20 ° C de ısı ile sızdırmaz bir film ile sızdırmaz bir 96 gözlü PCR plaka saklayın kütüphaneleri. </li></ol> Bir Masaüstü Sequencer kullanma 5. Ardışık Kütüphaneler <ol><li> Çözülme ve üreticinin talimatlarına göre reaktifler hazırlamak. </li><li> Buz üzerinde 4nM kütüphaneleri çözülme. </li><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde 0.2 N NaOH 1 ml olun. </li><li> Eşit hacimli miktarda Havuz 4nM kütüphaneler, çoklu kütüphaneler ise kullanılacak. </li><li> Seyreltin ve arzu edilen son molar konsantrasyonunda üreticinin talimatlarına göre bir araya toplanmış kütüphaneleri denatüre. <ol><li> Seyreltilmiş tutun ve denatürehazır olana kadar buz üzerinde toplanmış kütüphane reaktif kartuş üzerinde yüklemek için. </li></ol></li><li> Bir örnek levha örnek adlarını içeren ve ilgili indeks bilgi üretmek ve sadece dosyaları .fastq oluşturmak için belirtin. <ol><li> Sequencer karşılık gelen örnek levha klasöründe yükleyin örnek levha. </li></ol></li><li> Iyi gelen reaktif kartuşu 600 seyreltilmiş ul ve denatüre kütüphanede toplam ekleyin. </li><li> Tamamlanması için sıralama reaksiyonları çalıştırın. </li></ol> 6. Metilasyon miktar tayini Veri Analizi NOT: hem ticari hem de açık kaynak dahil NGS veri analizi için mevcut birden çok program vardır. Çalışan programlarda Detayları her özel paketi ile bulunabilir. Genel talimatlar Bu yazılım paketi için özel komutlar ile birlikte her adımda verilir. (Bu protokolde kullanılan yazılımlar ile ilgili ayrıntılar için malzemeler listesi bakınız). <ol><li> Uygun se içine Aktar .fastq.gz dosyalarıkırpma okuma kullanılmak üzere kalite puanları (Qscores) istinat analiz boru hattı quencing. (Bu örnek program için &#39;Import&#39; seçin ve okur oluşturmak için kullanılan sıralama yöntemini seçin. Içe dosyaları okumak .fastq.gz seçin ve okuma &#39;Genel altında&#39; Sil kalite puanları &#39;seçimini kaldırarak uygulamaları düzeltmek için .fastq dosyaları Qscores korumak Finish &#39;Seçenekler&#39; ithal okur ve seçin için. Bir yer seçin &#39;.) <ol><li> Trim ve bir NGS veri analizi boru hattı aşağıdaki ayarları kullanarak okur korumak. (Bu program için &#39;NGS Çekirdek Araçlar&#39; başlığı altında &#39;Trim Dizileri&#39; seçin ve kesileceği okur seçin.) <ol><li> Sadece ≥ Q30 puanları içeren okur saklayın. (Bu program için &#39;kalite puanları kullanarak Trim&#39; seçin ve 0.001 sınırını ayarlamak.) </li><li> Koru sadece ≤ 1 belirsiz nükleotid içeren okur. (Bu program için &#39;Trim belirsiz nükleotidleri&#39; seçin ve ayarlayın1. &#39;belirsizlikler sayısı&#39; okur kesilmiş kaydetmek için bir konum seçin ve &#39;Son&#39;u seçin.) </li></ol></li><li> Harita 2.2 dan siliko bisülfit dönüştürülen gen referans okur kesilmiş. (Örnek yazılım için &#39;NGS Çekirdek Araçlar&#39; başlığı altında &#39;Harita Referans okur&#39; seçeneğini seçin. Kesilmiş seçin haritalanmış ve &#39;sonraki&#39; seçiniz. Dönüştürülen referans dizisi seçin ve &#39;referans maskeleme&#39; başlığı altında &#39;hayır maskeleme&#39; seçeneğini belirleyin okur. Seç &#39; sonraki &#39;.) <ol><li> Uyumsuzluklara, eklemeler, çıkarmalar ve bir maksimum ceza atayın. İlgili parametreler okuma uzunluğunun% 100% 90 sekans özdeşliğine sahip bir haritada için gerekli olan şekilde gerçekleştirilir. Örnek yazılımı için, uyumsuzlukları, yerleştirmeler, ve silme işlemleri için 3 puan atayın. Referans eşlenen okuma uzunluğu minimum kısmı için 1 puan atama, okuma ve referans haritalanmıştır arasındaki kimlik minimum kısmı için 0.9 puan atayın. </li><li&gt; Atın veya non-spesifik referans eşleştirilmiş okur görmezden. Bu çoklu bölgelere eşit derecede iyi eşleyebilirler okur. Örnek yazılım için &#39;Non-spesifik maç işleme&#39; altında &#39;Yoksay&#39; seçin ve &#39;sonraki&#39; seçeneğini seçin. </li><li> Hizalama çıkışı için bağımsız bir dosya olarak her bir örnek oluşturur. Örnek yazılımı için seçin &#39;tek başına Oluştur eşlemelerini okumak&#39; &#39;Çıktı seçenekleri&#39; ve &#39;Sonuç taşıma&#39; altında &#39;Kaydet&#39; başlığı altında. Okuma haritalama kaydetmek ve &#39;Finish&#39; seçmek için bir konum seçin. </li></ol></li><li> Eşleştirilmiş okur bir varyant arayarak iş akışı çalıştırın. Örnek yazılımı için, &#39;resequencing Analizi&#39; başlığı altında &#39;Probabilistik Varyant Algılama&#39; seçeneğini analiz edilecek okuma haritalama seçin ve &#39;sonraki&#39; seçeneğini seçin. Seç &#39;filtreleri Oku&#39; altında &#39;non-spesifik maçları Yoksay&#39; ve &#39;gelecek&#39; seçeneğini seçin. <ol><li> Dizisi dep de olduğundan emin olun1.000 &#39;Önemi&#39; altında &#39;asgari kapsama&#39; ayarlayarak ≥ 1000 X inci. </li><li> Varyant çağrısı hem ileri hem de mevcut olduğundan emin olun ve okur ters. Örnek yazılımı için, seçeneğini &#39;ileri hem de varlığını gerektir ve standları ters&#39; &#39;Varyant filtreleri&#39; başlığı altında ve &#39;sonraki&#39; seçeneğini seçin. </li><li> İhracat hizalanmış, varyant açıklamalı tablo olarak veri çağırdı. Örnek yazılımı için, &#39;Çıktı seçenekleri&#39; başlığı altında &#39;açıklamalı tablo oluşturun&#39; seçin ve varyant tablo dosyasını kaydetmek için bir konum seçin. &#39;Finish&#39; seçin. </li></ol></li></ol></li><li> Varyant tablo dosyasından ilgi bölgesinde açıklamalı CpG siteleri varyant frekansları kullanılarak 5-mC yüzdesini hesaplayın. CG referans C&#39;de sitozinin frekansı 5-mC yüzdesidir. NOT: Çok metillenmiş CpG yıllardan için algoritmaları çağrılarak varyantı kullanırken, timinler ile CpG sitosinler değiştirin. Bu olduklarını gösteren edecekCpG evinde sitozin frekansı sonuçlanan, varyantları gibi fy sitozin en haritası çizilmiştir. </li><li> İlk C yüzdesi referans (C) CpG sitelerinde değil hesaplayarak bisülfit dönüşüm verimliliği (bsc) belirleyin. Referans T&#39;nin (C MPT) eşlenen toplam C en toplam T&#39;nin eşlenen (T mp) sayısına göre olmayan CpG C en yüzdesini ve bölme çarpın. 100 eksi hesaplanan frekans o kütüphanede (Denklem 1) bisülfit dönüşüm verimliliği (bsc) &#39;dir. </li></ol><img alt="Denklem 1" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52488/52488eq1.jpg" /> Denklem 1. bisülfit dönüşüm verimliliği. NOT: memeli genomları (kök hücre 20 potansiyel hariç), CpG olmayan sitosin metilasyon çok düşük miktarlarda içeren, bitki genomu önemli miktarda içerir. Bu Referenc bisülfit dönüşüm verimi belirlemek içinE genomları, bir uygun yol 21 genomu ve yukarıda tarif edildiği gibi dönüştürme verimliliğini hesaplama bitkide mevcut mitokondriyal genom ya da kloroplast genomuna veya bilinen metillenmemiş genlerin bir kısmını sırası etmektir. Bisülfit dönüşümü verimliliği dönüştürülmemiş Cı potansiyel olarak sigara CpG metilasyon kaynaklanan, çoğu durumda ≥98% olmalıdır.

<ol>
	<li>Hotchkiss, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantitative+separation+of+purines,+pyrimidines,+and+nucleosides+by+paper+chromatography.">The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography.</a> The Journal of Biological Chemistry. 175 (1), 315-332 (1948).</li><li>Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+patterns+and+epigenetic+memory.">DNA methylation patterns and epigenetic memory.</a> Genes &amp; Development. 16 (1), 6-21 (2002).</li><li>Smith, Z. D., Meissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation:+roles+in+mammalian+development.">DNA methylation: roles in mammalian development.</a> Nature reviews. Genetics. 14 (3), 204-220 (2013).</li><li>Heard, E., Martienssen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenerational+epigenetic+inheritance:+myths+and+mechanisms.">Transgenerational epigenetic inheritance: myths and mechanisms.</a> Cell. 157 (1), 95-109 (2014).</li><li>Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+gene+silencing+in+cancer.">DNA methylation and gene silencing in cancer.</a> Nature Clinical Practice. Oncology. 2, S4-S11 (2005).</li><li>Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+epigenome:+its+origins,+contributions+to+tumorigenesis,+and+translational+implications.">The cancer epigenome: its origins, contributions to tumorigenesis, and translational implications.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 9 (2), 64-65 (2012).</li><li>Beck, S., Rakyan, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methylome:+approaches+for+global+DNA+methylation+profiling.">The methylome: approaches for global DNA methylation profiling.</a> Trends in Genetics : TIG. 24 (5), 231-237 (2008).</li><li>Laird, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+challenges+of+genomewide+DNA+methylation+analysis.">Principles and challenges of genomewide DNA methylation analysis.</a> Nature reviews. Genetics. 11 (3), 191-203 (2010).</li><li>Mikeska, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+quantitative+MGMT+promoter+methylation+analysis+using+pyrosequencing+and+combined+bisulfite+restriction+analysis.">Optimization of quantitative MGMT promoter methylation analysis using pyrosequencing and combined bisulfite restriction analysis.</a> The Journal of Molecular Diagnostics : JMD. 9 (3), 368-381 (2007).</li><li>Kreutz, M., Hochstein, N., Kaiser, J., Narz, F., Peist, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+powerful+and+quantitative+sequencing+technology.+Current+Protocols+In.">Pyrosequencing: powerful and quantitative sequencing technology. Current Protocols In.</a> Molecular Biology / edited by Frederick M. Ausubel ... [et al.]. 104 (Unit 7 15), (2013).</li><li>Dikow, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+methylation+status+of+the+PWS/AS+imprinted+region:+comparison+of+two+approaches+based+on+bisulfite+sequencing+and+methylation-sensitive+MLPA.">Quantification of the methylation status of the PWS/AS imprinted region: comparison of two approaches based on bisulfite sequencing and methylation-sensitive MLPA.</a> Molecular And Cellular Probes. 21 (3), 208-215 (2007).</li><li>Parrish, R. R., Day, J. J., Lubin, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+bisulfite+sequencing+for+examination+of+DNA+methylation+with+gene+and+nucleotide+resolution+from+brain+tissues.">Direct bisulfite sequencing for examination of DNA methylation with gene and nucleotide resolution from brain tissues.</a> Current Protocols In Neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley ... [et al.]. 7 (Unit 7 24), (2012).</li><li>Shapiro, R., Servis, R. E., Welcher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactions+of+uracil+and+cytosine+derivatives+with+sodium+bisulfite.+A+specific+deamination+method.">Reactions of uracil and cytosine derivatives with sodium bisulfite. A specific deamination method.</a> Journal of the American Chemical Society. 92, 422-424 (1970).</li><li>Hayatsu, H., Wataya, Y., Kazushige, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+addition+of+sodium+bisulfite+to+uracil+and+to+cytosine.">The addition of sodium bisulfite to uracil and to cytosine.</a> Journal of the American Chemical Society. 92 (3), 724-726 (1970).</li><li>Wang, R. Y., Gehrke, C. W., Ehrlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+bisulfite+modification+of+5-methyldeoxycytidine+and+deoxycytidine+residues.">Comparison of bisulfite modification of 5-methyldeoxycytidine and deoxycytidine residues.</a> Nucleic Acids Research. 8 (20), 4777-4790 (1980).</li><li>Masser, D. R., Berg, A. S., Focused Freeman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high+accuracy+5-methylcytosine+quantitation+with+base+resolution+by+benchtop+next-generation+sequencing.">high accuracy 5-methylcytosine quantitation with base resolution by benchtop next-generation sequencing.</a> Epigenetics &amp; Chromatin. 6 (1), 33 (2013).</li><li>Caruccio, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+next-generation+sequencing+libraries+using+Nextera+technology:+simultaneous+DNA+fragmentation+and+adaptor+tagging+by+in+vitro+transposition.">Preparation of next-generation sequencing libraries using Nextera technology: simultaneous DNA fragmentation and adaptor tagging by in vitro transposition.</a> Methods in Molecular Biology. 733, 241-255 (2011).</li><li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms:+comparison+of+Ion+Torrent,+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers.">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13, 341 (2012).</li><li>Adey, A., Shendure, J. U. l. t. r. a. -. l. o. w. -. i. n. p. u. t. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tagmentation-based+whole-genome+bisulfite+sequencing.">tagmentation-based whole-genome bisulfite sequencing.</a> Genome Research. 22 (6), 1139-1143 (2012).</li><li>Smallwood, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome-wide+bisulfite+sequencing+for+assessing+epigenetic+heterogeneity.">Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity.</a> Nature Methods. 11 (8), 817-820 (2014).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+endogenous+gene+controls+for+bisulphite+conversion+in+analysis+of+plant+DNA+methylation.">Universal endogenous gene controls for bisulphite conversion in analysis of plant DNA methylation.</a> Plant Methods. 7, 39 (2011).</li><li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences.">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).</li><li>Ivanov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-solution+hybrid+capture+of+bisulfite-converted+DNA+for+targeted+bisulfite+sequencing+of+174+ADME+genes.">In-solution hybrid capture of bisulfite-converted DNA for targeted bisulfite sequencing of 174 ADME genes.</a> Nucleic Acids Research. 41 (6), e72 (2013).</li><li>Booth, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+bisulfite+sequencing+of+5-methylcytosine+and+5-hydroxymethylcytosine.">Oxidative bisulfite sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Protocols. 8 (10), 1841-1851 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

BSAS örnekler ve hedeflerin sayısı, her iki dizi, yüksek ölçüde yetenekleri ile odaklanmış doğru DNA metilasyonu kantitatif sağlar. Ayrıca, transposome-aracılı tagmentation kullanarak bu kütüphane nesil hızlı, daha az girdi DNA olduğunu gerektirir ve geleneksel kesme ve sonraki adaptör ligasyonu teknikleri daha az adımları içerir. Mevcut yöntemlere göre bu gelişmeler söz konusu herhangi bir hedef alanının taban düzeyinde bir DNA metilasyon analizi için izin verir. Ayrıca, BSAS tüm genom bisülfit 22 veya yakalamak 23 yaklaşımlar kullanılarak tespit edilmiştir ilgi alanlarının (farklı olarak metilasyon bölgeleri (DMRs), CpG adaları, düzenleyici bölgeler) teyidi için yeni bir yöntem sağlamaktadır. Ortogonal onay yaklaşımları ve daha nicel yöntemler kullanarak kesin Epigenomic çalışmaların analitik titizlik geliştirir. BSAS ile elde edilen yüksek okuma derinliği yeniden, dar bir güven aralığı doğru kantitatif için izin verirhassas kantitatif 16 engellenmesi hususundaki. Ayrıca, tek bir deneyde birçok örnekleri çalıştırmak için yeteneği istatistiksel gücünü artıracak tüm genom yöntemleri teyitleri, örnek boyutunu artırabilirsiniz; Birçok akım epigenetik çalışmalar zayıflık. Önemli olarak, BSAS epigenetik araştırmalar için test edilebilir hipotez oluşumu için izin veren bir baza spesifik CpG metilasyon nicelendirilmesine içerir. Örneğin, belirli bir tepki elemanı artış metillenmesi hipotezler azalmış bir transkripsiyon faktörü bağlanma neden olur. Eşleştirilmiş mRNA ekspresyon verileri ile kombine BSAS, doku ya da hücre popülasyonunda tek bir parça içinde epigenetik düzenleme ve mRNA hem elde edilmesi için bir yöntem temin etmektedir. Düzenleme ve ifade Eşli ölçümleri de bilimsel titizlik ve bulguların etkisini artırmak. BSAS protokolü içinde kritik adımlar astar tasarım, amplikon optimizasyonu, ve kütüphane nesil / includeQC. Primerler uygun şekilde tasarlanmış ve farklı verimlilik 8&#39;de yükseltmek değilse PCR önyargı tanıtıldı. Bu tür enzimatik olarak% 100 ve% 0 sitosin metile standart olarak metilasyon standartlarının kullanımı, eğer varsa metilasyon niceleme önyargı, derecesini belirlemek için kullanılır ve metilasyon 16 hesaplarken uygun bir yöntem olup, kontrol edilebilir. Tek bir yüksek-kaliteli amplikonu üretmek için PCR reaksiyonları optimize Benzer şekilde, dikkatli olunmalıdır. Herhangi bir amplikon protokolü detaylı önerilen edilen kılavuzları kullanarak, mevcut ise, optimizasyon adımları artan PCR devir sayıları ya da bsDNA giriş miktarını içerir. Astar-dimer dahil olmak üzere birden PCR ürünleri, varsa, optimizasyon adımları, bsDNA giriş miktarını azaltarak PCR primer molar giriş konsantrasyonları azalan, tavlama sıcaklıkları artan ya da PCR döngüsü sayısının azaltılması sayılabilir. Bu optimizasyon prosedürleri biri ya da bir kombinasyonu tek bir HIG oluşturmak için yeterli sonucu verirh-kalite amplikonu. Alternatif olarak, astar yeniden tasarlama tek amplikon veren yok primer setleri için iyi bir yaklaşımdır. Yeniden tasarımı uygun veya mümkün değildir, bu bölgeler için, hem ters primerler CpG siteleri CpG ileri primerler sitelerde ve adenin en ve guanin en az sitozin ve timin en en çalışabilir olmak üzere primer setleri dejenere. Ancak, bu primer setleri önyargı oluştuğunu hiçbir PCR bu protokol kapsamı dışında bir işlem sağlamak için daha fazla optimizasyon gerekiyor. Kalite kütüphaneleri başarı için son derece önemlidir. QC tedbirler sıralama önce kütüphanelerin boyutu, kalitesi ve miktarını belirlemek için yapılır emin olun. Dizileme reaksiyonları, düşük kaliteli kütüphanelerinin girişi ile başarısızlığa eğilimlidir. Metilasyon kantitatif olarak Önyargı metilasyon frekansları hem ileri hem de mevcut ve sıralama okur ters olması sağlanarak azaltılabilir. Ayrıca, CpG sitelerine hizalama üsleri kalite puanları yüksek işbirliği için ≥Q30 olmalıdırölçümde nfidence. Diğerleri, yukarıda açıklanan ölçümleri sağlanması, bisülfit dönüştürülmüş DNA 19 tagmentation reaksiyonlarında hiçbir önyargı önceden az göstermiş olsa da, düşük önyargı metilasyon kantitatif onay verir. BSAS anda, ancak bu yöntemin, gelecekteki açılımı bu bisülfit dönüşümü 24 önce potasyum perrutenat sokulması 5-MC ve 5-HMC ayırt deneysel adımlar ayrıca CpG 5-HMC eşleştirilmiş ölçümleri sağlayacak, CpG bölgelerinin metilasyon ile ölçer. Bu DNA metilasyonu gen ifadesi düzenleyici rolleri belirlemek amacıyla, eşleştirilmiş metilasyon için izin vererek 5-MC ve 5-HMC ve anlatım verilerini hem BSAS programı etkisini artıracaktır. PCR amplikonlarının Transposome aracılı kütüphane hazırlanması büyütülmüş bölgelerden uçlarında azalma dizileme derinliği neden yoktur. Bu nedenle, yüksek ölçüde ilgi çekici bölgelerinde amplikonların ortasında bulunması için dizayn edilmelidir. NasılBSAS üretir, çünkü şimdiye kadar, sıralama&gt; 1,000 X, güçlendirilmiş bölgelerin uçları yakın ölçümler yüksek kalır 5-Mc kantitatif doğruluk derinliklerinde okudum.

Bu doğal sitozin metilasyonu 1 şeklinde DNA değişiklikleri meydana gelen ilk rapordan bu yana yarım yüzyıl boyunca olmuştur. Sitozin metilasyonu taban halkası üzerinde 5 inci karbon bir metil grubu (5-mC), en sık memeli genomları CpG dinükleotid motifi meydana sahip bir modifiye sitozin nükleotid temelidir. yokluğu transkripsiyon aktivitesi 2 ile bağlantılı iken gen promoteri 5-Mc fonksiyonel mevcudiyeti genellikle, transkripsiyon baskı ile ilişkilidir. Muazzam gelişmeler geliştirme 3 DNA metilasyon, epigenetik profiller 4, kanser patogenezi 5,6, ve diğer araştırma alanlarında sayısı transgeneration yayılma rolü anlayışımız yapılmıştır. Yeni yöntemler, DNA metilasyonu 7 profile geliştirilmiştir gibi bu ilerlemelerin çoğu son birkaç yıl içinde gelmiş. Gelişine veYeni nesil sekanslama (NGS) teknikleri yaygınlaşması hemen tüm genom ya da genom 8 geniş kısımlarının karşı DNA metilasyonu profil için bir dizi yöntem mevcuttur. Bu yaklaşımlar, DNA metilasyon desen ve DNA metilasyonu farklılıkları ölçmek keşif çalışmalarının olasılığını açın. Bu hipotez üreten yaklaşımlara ek olarak, hedef / hipotez testi DNA metilasyonu niceleme yöntemleri için önemli bir ihtiyaç vardır. Pyrosequencing, metilasyon spesifik PCR ve bisülfit dönüştürülmüş DNA&#39;nın doğrudan Sanger sıralama hedeflenen bölgelerin analizi için en çok kullanılan yöntemler olmuştur (yani, tek bir genin bir promotör bölgesi veya CpG ada) 9-12. Metillenmiş sitozin bozulmamış 13,14 devam ederken, bu yöntemlerin tümü, bisülfit dönüşümü, metillenmemiş sitozin en urasil en dönüştürülür kimyasal deaminasyon reaksiyona dayanır. Bisulfite- PCR amplifikasyonudiferansiyel metilasyonu temel farkı olarak okumak için izin timin 15 urasil yılların yerine dönüştürülmüş DNA sonuçları. Yüksek ölçüde yararlı ise de, bu yöntemlere sınırlamalar düşük sayısal hassasiyeti, kısa okuma süresi ve düşük numune sayısını içerir. Bu sınırlamaları gidermek için biz (BSAS) 16 bisülfit Amplikon Sıralama adlandırdığımız bir yöntem geliştirdi. Bu yöntemin hedefi, yüksek sayısal hassasiyetle örneklerin çok sayıda ilgi konusu hedef genomik bölge analiz edebilmek için. BSAS mevcut metodların elemanları (bisülfit dönüşümü ve bölgeye özgü PCR) kullanan ve basit nesil kütüphane yapısı (transposome aracılı) 17 ve tezgah üstü NGS 18 (Şekil 1) ile bir araya getirmektedir. Bu yaklaşım, söz konusu herhangi bir bölgede sitozin metilasyonu incelemek için daha nicel ve daha yüksek verimli bir yöntem temin etmektedir. Burada sunduğumuzdetaylı yöntem ve sorun giderme ve kalite BSAS sürecini kontrol etmek için yaklaşımlar tarif.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="840">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:304px;">Name</td>
			<td style="width:255px;">Company</td>
			<td style="width:97px;">Cat #</td>
			<td style="width:185px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent 2100 Bioanlyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G29393AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent RNA 6000 Nano kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent High Sensitivity DNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Typhoon 9200</td>
			<td>Amersham/GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agencourt AMPure XP - PCR Purification</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>164-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">twin.tech PCR plate 96&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951020362</td>
			<td>semi-skirted</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heatsealing Film</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030127838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heatsealing Foil</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030127854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat Sealer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5390000.024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.1-10ul Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030073.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-200ul Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030073.045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50-1000ul Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030073.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MixMate&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5353000.014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030121.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424000.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2.0 mL Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nextera XT DNA Sample Preparation Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td>24 rxn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nextera XT Index Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1001</td>
			<td>24 indexes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MiSeq Desktop Sequencer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MiSeq Reagent Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-2002</td>
			<td>300cycle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK4824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ProFlex 96-well PCR system</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4484075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Novex 6% TBE DNA gel</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EC6261BOX</td>
			<td>10-well</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Novex TBE Running Buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC6675</td>
			<td>5X (1 L)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Novex Hi-Density TBE Sample Buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC6678</td>
			<td>5X (10 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10787-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xcell SureLock Mini-Cell</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UltraPure 10mg/mL Ethidium Bromide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15585-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">7900HT Fast Real-Time PCR system</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4329001</td>
			<td>384well block</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DynaMag-96 Side Skirted</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices/VWR</td>
			<td>89429-532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stainless Steel Beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td>5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CLC Genomics Workbench</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>Software for methylation pipeline</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAQuick PCR Purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>50 rxn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TissueLyser II</td>
			<td>Retsch/Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TRIS hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PHG0002-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">384-well Full-Skirted Plate, Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-1384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Absolute qPCR Seal</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EZ DNA Methylation-Lightning kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5030</td>
			<td>50 rxn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZymoTaq DNA Polymerase</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>E2001</td>
			<td>50 rxn</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted dna methylation analysis by next-generation sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

BSAS düzgün Şekil 5 benzeyecek dönüştürülen referans dizisine hizalanmış okur. CpG dinükleotidleri açıkça tespit edilebilir ve metilasyon devletler eşlenen okur CpG siteleri baz çağrıları gözlemleyerek tahmin edilebilir. Örneğin, metilasyon kontrolleri ile,% 0 metilasyonu tüm T&#39;nin (Şekil 5A) içeren CpG bölgelerinin eşleştirilmiş okur neden olur. % 100 metilasyon kontrolleri eşlenen okur tüm C&#39;nin (Şekil 5B) içeren CpG siteleri okur neden olur. CpG siteleri sitozin frekansı (C / C + T) kantitasyonu orijinal numunede metilasyon frekansını verir. Tüm genom metilasyon kontrol (n = 3 / metilasyon oranı) elde edilen temsili bir standart eğri, her metilasyon oranı (Şekil 6) ölçümde metilasyon kantitatif doğrusallığı olarak hassas gösterir. Toplam Bu yöntemin bir örneği olarak, RNA ve DNA birlikte-izo edildi<html> fare beyincik ve retina (n = 4 / grup) yonunun. Seçici olarak retinal doku içinde ifade rodopsin ifade, QPCR kullanılarak ölçüldü. İfade sadece retinanın (Şekil 7A) &#39;de tespit edilmiştir. Bsas kullanarak, CpG metilasyon düzeyi rodopsin promotör bölgenin ölçüldü. Promotör bölgenin genelinde kümülatif metilasyon düzeyi retina (p &lt;0.001, parametrik t-testi) (Şekil 7B) içinde &lt;% 15 oranla beyincik&gt;% 80 idi. Site-spesifik metilasyon kantitatif gelen BSAS metilasyon niceleme yararları ve metilasyon seviyesi herhangi bir genomik bölgenin karşısında bir CpG özgü olarak karşılaştırılabilir. Retina örneklerinde (p &lt;0.001, her CpG yerinde parametrik t-testi) (Şekil 7C) göre rodopsin promotör genelinde CpG metilasyon düzeyi serebellar örneklerde anlamlı derecede yüksek bulundu. 1highres.jpg &quot;/&gt; Şekil 1:. BSAS yöntemin şematik, bu yöntemde, genomik DNA, urasillere için unmethylation sitosinler değiştirmek için dönüştürülmüş bisülfıttir. Daha sonra, PCR sırasında bu urasiller timinler değiştirilir. PCR amplifikasyon ilgi bölgelerine yönelik ve yüksek sadece bu dizilerin için zenginleştirir edilir. Elde edilen PCR amplikonları, basit tagmentation süreci boyunca çift endeksli kitaplıkları yapılır. Daha sonra kütüphane bir tezgah üstü nesil dizisi üzerinde dizildi ve dizilim sitosin en temel özgü bir şekilde tespit edilir siliko dönüştürülen bir referans dizisi ile yüzde metilasyon eşleştirilir okunur. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52488/52488fig2highres.jpg" /> Şekil 2:. Ilgilenilen bölgenin silico bisülfit dönüşüm herhangi genomik referans ilgi Herhangi bir bölge SELEC olabilirsiliko bisülfit dönüşüm için ted. CpG olmayan sitosinler timin referans sekansı içinde değiştirilir. CpG sitosinler bisülfit olarak sitosinler referans dönüştürülür kalır. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52488/52488fig3highres.jpg" /> Şekil 3:. Primer yerleşim bisülfit PCR primerleri siliko bisülfit bir karşı tasarlanmış referans dizisi dönüştürülür. Primerler, bu CG dinükleotidleri üzerine binmeyecek şekilde tasarlanmış ya da CG dinükleotidleri bitişik dizayn edilmelidir. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52488/52488fig4highres.jpg" /> Şekil 4: yüksek ve kalitesiz PCR amplikonlarının ve sıralama kütüphaneleri örnekleri Temsilcisi Elektroferogram izleri ve jel gösterisi (A) tek bir yüksek olan transposome-aracılı kütüphane nesil için ideal bir amplikon.konsantrasyon ürünü. Bu amplikonundan oluşturulan (B) Kütüphane (C) Kalitesiz PCR amplikonlar boyutu, konsantrasyon düşük olabilir. Yüksek konsantrasyon ve hatta boyut dağılımı gösterir ve birden fazla ürün ve / veya astar dimerleri içerirler. Bu kalitesiz amplikonlar (D) neden düşük konsantrasyonda ve düşük boyut dağılımı ile kütüphane nesil başarısız olacaktır. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52488/52488fig5highres.jpg" /> Şekil 5: metilasyon kontrollerden dizileme çıkışlarının örnekler. Silico (A) CpG siteleri ile başvuru sıralama kırmızı vurgulanan dönüştürülmüş. Eşlenen 0% metilasyon kontrolü CpG siteleri seçilen bölge gösteren timinler (açgözlülük vurgulamak) haritalama için okur. Eşlenen (B)% 100 metilasyon kontrolü CpG siteleri sitozin en (mavi vurgulamak) eşleme gösterir okur. Şekil 6:. Metilasyon bir kontrol aralığı boyunca Metilasyon kantitasyonu, 100,% 0 ile% metilasyon oranlarının (N = 3 / oranı) karıştırılan tüm genom metilasyon kontrol bsas kullanılarak ölçüldü. Nicel karşı beklenen kantitatif çiziliyor metilasyon kontrol kantitatif lineerliğini göstermektedir. Tüm kontroller karşısında, metilasyon kantitatif yüksek hassasiyetli oldu. <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/52488/52488fig7highres.jpg" /> Şekil 7: doku örneklerinden eşleştirilmiş DNA metilasyonu ve gen ekspresyon analizi örneği. (A), fare serebellar ve retina dokusu rodopsin nispi mRNA ifadesi. (B), serebellar ve retina DNA (*** p &lt;0.001, parametre t-testi) arasında BSAS ile miktarı rodopsin ortalama promotör metilasyonu. &lt;fare beyincik ve retina DNA kopyalama başlangıç ​​sitesine [TSS]) göre rodopsin promotörünün (+ 6&#39;ya -244 karşısında güçlü bir&gt; C), CpG site-spesifik metilasyon seviyesi.

Watch this Scientific Journal Video about Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing at JoVE.com

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

DNA Metilasyon Analizi nesil Dizilimine tarafından hedef

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

targeted-dna-methylation-analysis-by-next-generation-sequencing

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

37.0K Görüntüleme.  University of Oklahoma College of Medicine. Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

Video: Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

Baskılı Genler DNA metilasyon Belirlenmesi Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

Biyoloji

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

DNA Metilasyonu: bisülfit modifikasyonu ve Analiz

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

Floresans-mikroskopi Tarama ve nesil Sekanslama: organel Bütünlüğü ile ilgilendim Genlerin belirlenmesi için Faydalı Araçlar

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

16S Ribozomal RNA Gen amplikonlarının nesil Sıralama

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine methylation patterns in cells. Reduced representation of whole genome bisulfite sequencing was developed to detect quantitative base pair resolution cytosine methylation patterns at GC-rich genomic loci. This is accomplished by combining the use of a restriction enzyme followed by bisulfite conversion. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing (ERRBS) increases the biologically relevant genomic loci covered and has been used to profile cytosine methylation in DNA from human, mouse and other organisms. ERRBS initiates with restriction enzyme digestion of DNA to generate low molecular weight fragments for use in library preparation. These fragments are subjected to standard library construction for next generation sequencing. Bisulfite conversion of unmethylated cytosines prior to the final amplification step allows for quantitative base resolution of cytosine methylation levels in covered genomic loci. The protocol can be completed within four days. Despite low complexity in the first three bases sequenced, ERRBS libraries yield high quality data when using a designated sequencing control lane. Mapping and bioinformatics analysis is then performed and yields data that can be easily integrated with a variety of genome-wide platforms. ERRBS can utilize small input material quantities making it feasible to process human clinical samples and applicable in a range of research applications. The video produced demonstrates critical steps of the ERRBS protocol.

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

Baz Çifti Çözünürlük DNA metilasyon Değerlendirme Temsil bisülfit sıralamayı İndirimli pekiştirilmiş

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fekal Glukokortikoid Analizi: Tek tırnaklılarda in Non-invaziv Adrenal İzleme

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DamID seq: Adenin-metillenmiş DNA Fragments Yüksek Verimli Dizileme tarafından Protein-DNA Etkileşimleri genom Haritalama

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

RNA Sıralama Deneyi Gen İfade ve Genomik değişiklikleri tanımlamak için hedeflenen

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to poorly folding proteins or random open reading frames. We have developed a strategy where, by using TEM-1 &#946;-lactamase (the enzyme conferring ampicillin resistance) on a genomic scale, we can select collections of correctly folded protein domains from the coding portion of the DNA of any intronless genome. The protein fragments obtained by this approach, the so called &#34;domainome&#34;, will be well expressed and soluble, making them suitable for structural/functional studies.
By cloning and displaying the &#34;domainome&#34; directly in a phage display system, we have showed that it is possible to select specific protein domains with the desired binding properties (e.g., to other proteins or to antibodies), thus providing essential experimental information for gene annotation or antigen identification.
The identification of the most enriched clones in a selected polyclonal population can be achieved by using novel next-generation sequencing technologies (NGS). For these reasons, we introduce deep sequencing analysis of the library itself and the selection outputs to provide complete information on diversity, abundance and precise mapping of each of the selected fragment. The protocols presented here show the key steps for library construction, characterization, and validation.

The protocols described allow the construction, characterization and selection (against the target of choice) of a &#34;domainome&#34; library made from any DNA source. This is achieved by a research pipeline that combines different technologies: phage display, a folding reporter and next generation sequencing with a web tool for data analysis.

Interactome-Seq: Domainome kitaplığı inşaat, doğrulama ve seçim fajının görüntü ve sonraki nesil sıralama için bir protokol

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...