Bisülfit dönüşüm protokolü Genomik DNA 2 mikrogram dönüşüm için standart bir protokol aşağıda açıklanmıştır. Genomik DNA (100 pg-200 mg) daha küçük veya büyük miktarda, aynı zamanda başarılı bir şekilde tedavi bisülfit olabilir. Bu tepkime koşulları hemen hemen her hedef DNA dizisi 3 tam dönüşüm (% 99,5-99,7) sonuçlanır. 1. DNA hazırlığı 37 ° C Not 1 saat için 18 ul toplam hacim bisülfit DNA Lizis Buffer (2 mg t RNA 280 ng / ul Proteinaz K,% 1 SDS) ile genomik DNA kuluçka örnekleri hazırlayın: Bunu başarmak için önemlidir. özellikle hala DNA ile ilişkili protein olabilir klinik örneklerden izole edilen DNA ile maksimal bisülfit dönüşüm . 2. DNA denatürasyonu <ol><li> Son c taze hazırlanmış 3M NaOH 2 ul ekleyerek 20 ul bir ses doğasını 2 mg DNA0.3M, oncentration. </li><li> 37 ° örnekleri inkübe ° C su banyosunda 15 dakika süreyle bir ısı bloğu içinde 2 dakika süreyle 90 ° C&#39;de inkübasyon izledi. Hemen 5 dakika boyunca buz üzerinde tüplerin yerleştirin. </li><li> 4 ° C, 10 s 10.000 g sağlamak için DNA tüpün dibinde tüplerin santrifüjleyin. </li></ol> 3. Bisülfit Deaminasyon Sülfonasyon &amp; Hidrolitik Deaminasyon <ol><li> 10 mM Quinol ve doymuş sodyum metabisülfit pH 5.0 (464 ul 10 M NaOH ile 7.6 g Na 2 S 2 O 5, 15 ml su ile yapılmış) taze çözümler hazırlayın. Doymuş sodyum bisülfit çözüm asgari karıştırma ve havalandırma ile, yavaşça tersine reaktif / H 2 O karışımı ile elde edilir. Gerekirse, metabisülfit Not tam olarak kapatılması için 10 M NaOH ile pH ayarı: doymuş bir çözüm olduğu için, küçük topaklar hala çözünmeden kalır . </li><li> 208 ekle2.31M bisulphite/0.5mM Quinol, pH 5.0 nihai konsantrasyonu 240 ul nihai hacmi doymuş metabisülfit ve denatüre DNA (20 ul) 10mM Quinol 12 ul ul. Damlacıkları tüpün alt kısmında sağlamak için 10 sn için tüm reaktifler ve santrifüj yavaşça karıştırın. </li><li> 200 ul madeni yağ numuneleri Overlay. Numuneler 55 ° C su banyosu, 4-16 saat inkübe edin. Bisülfit tedavi süresini dönüştürülecek DNA miktarı ve kalitesi bağlıdır. Kalitesiz ya da bozulmuş DNA DNA, 4 saat inkübasyon süresi sınırı Not: inkübasyondan önce folyo tüpler mümkün şal değildir eğer öyleyse, bu bisülfit dönüşüm oksidasyon önlemek için karanlık yer aldığı önemlidir. . </li><li> Uygun inkübasyon süresi sonunda, tüm sıvı tüpün dibinde olduğundan emin olmak için bir mikrosantrifüj kısaca tüpler döndürmek. </li><li> Bisülfit tedavi DNA Kurtardikkatle herhangi bir mineral yağ almadan, tüpün dibinden DNA çözüm pipetleme yağ tabakasının altında. </li></ol> Tuzsuzlaştırma <ol start="5"><li> Tuzsuzlaştırma sütun geçerek, 50 mili-Q suyu (MQH 2 O) ul salınımlı herhangi bir ücretsiz bisülfit iyonlarının çıkarın . Genomik DNA&#39;nın miktarı ve kalitesi üzerinde ve nasıl hazırlanır bağlı olarak, farklı tuzsuzlaştırma sütun kullanılabilir. Biz rutin olarak bu sütunların SDS dönüşüm için önce DNA hazırlanmasında kullanılan kaldırmak için uygun Promega Sihirbazı, sütunlar temizleyin kullanın. </li></ol> Alkali Desulphonation <ol start="6"><li> Bisülfit adduct desulphonation urasil halka çıkarılır. Desulphonate 0.3M bir son konsantrasyonu 5.5 ul taze hazırlanmış 3M NaOH ekleyerek, örnekleri daha sonra 37 ° C&#39;de 15 dakika süreyle kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Kısaca Santrifüj ve t RNA (10 mg / ml) 1 ul ekleyin. </li> &lt;li&gt; amonyum asetat 33 ul (NH 4 O Ac), 3M nihai konsantrasyonu pH 7.0 ilavesi ile çözüm nötralize. </li><li> Buz gibi% 100 etanol 330 ul ekleyerek Etanol çökelti DNA tersine çevirerek iyice karıştırın. -20μC gecede 1 saat bırakın. 15 dakika 14.000 g Santrifüj 4 ° C Süpernatant ve hava tüm izlerini ~ 20 min çöktürülmüş DNA kuru çıkarın. </li><li> 0.1 TE (10mM Tris-HCL, 0.1mm EDTA, pH 8.0) veya H 2 O 50 ul / mg DNA pelet yeniden askıya Yaklaşık 2 saat oda sıcaklığında bekletin. DNA sağlamak Bazen vorteks tüpleri, ardından hızlı bir santrifüj, çözünmüş. </li><li> DNA miktar ve kalitesine bağlı olarak 1-10 yıl boyunca -20 ° C&#39;de PCR veya mağaza için hemen kullanın. </li></ol> 4. PCR Amplifikasyon Primer Tasarım <ol><li> PCR bisülfit dönüşüm spesifik primerler Etkin tasarım crucial DNA&#39;nın tamamen dönüştürülen bu verimli, tarafsız amplifikasyon sağlamak için oluşur. Aşağıdaki yönergeler, astar tasarım yardım için kullanılacak. </li></ol> Primer Tasarım Kuralları <img src="files/ftp_upload/3170/3170list1.jpg" /> Thermocyling <ol start="2"><li> Orantılı metillenmiş ve unmethylated DNA PCR testi için, bir metil 50:50 / Unmethylated tam bisülfit dönüştürülür kontrol örneği kullanın ve optimize edilmiş PCR reaksiyon koşulları (Şekil 3) altında bisülfit dönüşüm spesifik primerler ile amplifiye. 50:50 metil: Unmethylated kontrolü, in vitro SssI metillenmiş DNA ve ya tüm genom (WGA) amplifiye DNA veya tam kan DNA kullanın. Bazı genlerin doğal kan metil ve bu nedenle bu gibi durumlarda sadece &quot;Unmethylated&quot; kontrol WGA DNA kullanmak en iyisi olacaktır ki farkında olun. </li><li> 100 &amp; m PCR reaksiyon karışımları hazırlayınu; l 2 ul dönüştürülür bisülfit genomik DNA, 200 mcM dNTP, 1 mcM primerler, 1.5 mM MgCl 2, 50 mM KCl, 10mM Tris-HCL, pH 8.3 ve 0.15 ul Taq polimeraz içeren alikotları. </li><li> 3 ° C üzerinden astar tahmin Tm 10 tüp, bir sıcaklık degrade PCR degrade çalıştırmak reaksiyon + / </li></ol><img alt="Tablo 1" src="/files/ftp_upload/3170/3170table1.jpg" /><ol start="5"><li> Metillenmiş ve unmethylated amplikonlarının orantılı olarak amplifiye olduğunu test etmek için, Amplikon metillenmiş DNA sindirimi Taq 1 (TCGA) gibi bilgilendirici bir restriksiyon enzimi, sindirilmiş, ancak kısıtlama enzim sitesi unmethylated DNA sindirimi olmaz TTGA için bisülfit dönüşüm sonra değiştirdi. Sindirim ölçüde agaroz jel elektroforezi (Şekil 3A) tarafından görüntülenmiştir. Alternatif olarak, PCR reaksiyonu SYBRGreen (0.2 1:1000 dilüsyon ul) eklenir ve olabilirmetilasyon ölçüde bir real-time PCR PCR (Şekil 3B) ısı disosiasyon araziler yaparak değerlendirilebilir. </li><li> MgCl 2 konsantrasyonu ve thermocycling koşulları da dahil olmak üzere PCR Reaksiyon karışımı PCR verimliliğini artırmak veya metil ve unmethylated PCR parçaları orantılı PCR sağlamak için ayarlanması gerekebilir. </li><li> PCR koşulları optimize sonra, PCR bisülfit dönüştürülen numuneler üzerinde yapılacaktır Not: Bir kez Tm sıcaklık degrade PCR kullanılabilir gerekmez optimize edilmiştir . </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Bisülfit PCR optimizasyonu bir örnek Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. Optimal PCR amplifikasyon koşulları oran ve önyargısız, metil ve unmethylated amplikonlarının yükseltilmesi gerekir. Şekil 3A% 50 metil ve unmethylated DNA karışımı bir sıcaklık gradyanı PCR profili ile bir agaroz jel gösterir. The PCR amplikonlarının metillenmiş sindirimi bir kısıtlama enzim, Taq 1 (TCGA), (M) DNA ile tedavi edilmiştir ancak TTGA için bisülfit dönüşüm restriksiyon enzimi sitesi tarafından değiştirilmiş olarak (U) DNA unmethylated sindiremez. Kesilmiş ve kesilmemiş PCR ürünü eşit miktarda metil ve unmethylated DNA orantılı olarak yükseltilir bekleniyor. -Önyargı olmayan amplifikasyonu için optimal thermocyling koşulları 56.1 olduğunu, bu jel üzerinde görülebileceği ° C (T). Bisülfit DNA komple dönüşüm sitozin-sitesi hpa III (CCGG) gibi spesifik bir enzim ile sindirime de analiz edilebilir. Dönüştürme başarısız oldu hpa III sadece kısıtlama sitesi muhafaza edilecektir sindirir. Dönüştürme işlemi tamamlandığında ise kısıtlama site TCGG veya DNA metilasyon durumu bağlı TTGG dönüştürülmüş olacak. Komple bisülfit DNA dönüşüm Şekil 3A (H) görülebilir. Şekil 3B gerçek zamanlı bir ayrılma arsa gösterirfarklı moleküller ayrıştırmaları hangi sıcaklık dayalı herhangi bir amplifikasyon önyargı var olup olmadığını belirlemek için bir araç olarak da kullanılabilir. Bu şekilde PCR 82.1μC az ayrıştırmaları tamamen metillenmiş ve unmethylated DNA amplifikasyon kontrol ile karşılaştırıldığında,% 50 metillenmiş ve unmethylated DNA karışımı oranında metil amplifiye (M) ve (U) unmethylated DNA olduğunu görülebileceği sırasıyla 78.9μC. Thermocyling ve reaksiyon koşullarının optimizasyonu sonra bisülfit tedavi örnekleri tek bir ya da yarı nested PCR reaksiyon ya iplikçik bisülfit özel ve spesifik primerler ile amplifiye edilebilir. Çıkan PCR parçaları agaroz jel elektroforezi ile görüntülenir (Şekil 4A) ya doğrudan ya da klonlama ve sıralama sıralı olabilir. Klonlama ve bireysel moleküllerinin metilasyon devlet sıralama heterojen görselleştirmek için bisülfit bir harita (Şekil 4B), cetvel sonrametilasyon. Yüksek verim kantitatif metilasyon analizi gibi Sequenom EpiTYPER yöntemi tarafından kullanılan teknoloji kullanılarak preformed olabilir. Bu yöntemi kullanarak, bisülfit dönüştürülür DNA bisülfit spesifik PCR primerleri ile amplifiye ve bir proprietry bölünme süreci izledi. Çıkan parçaları metil cytosines (Şekil 5A) varlığına bağlı özel spektrum MALDI-TOF kütle spektrometresi tarafından quantitated. Metilasyon oranları örnek bir özetini sonra bir özdeyişinin (Şekil 5B) veya metilasyon arsa (Şekil 5C) şeklinde çıkarım olabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig1.jpg" /> Şekil 1. (Gri) gen bedenlerinizde CpG siteleri seyrek ve genellikle metil (kırmızı) ise normal hücre, organizatörü ile ilişkili CpG adalar ağırlıklı metil CpG şematik. Unmethylated. Sağdaki panel, moleküler yapısı genişletirbireysel bir CpG yerinde DNA ure ve sitozin 5 karbon CH3 molekülü ile metilasyon gösterir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig2.jpg" /> Şekil 2. Denatürasyon, bisülfit dönüşüm, PCR ve analizi; Kimyasal dönüşüm şematik analizi, DNA metilasyon gösterildiği gibi dört ana aşama içerir . Sağ panelde, sitozin molekülünün bisülfit dönüşüm sırasında meydana gelen değişiklikler tasvir edilmektedir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig3.jpg" /> Şekil 3. PCR A. Optimizasyonu % 50 metil ve unmethylated DNA karışımı bir sıcaklık gradyanı PCR profili agaroz jel elektroforez. Fragments sırasıyla metillenmiş DNA ve olmayan bisülfit dönüştürülür DNA sindirimi Taq1 (T) veya HpaIII (H) ya da sindirilmiş edilmiştir. B. Isı dissosiyasyon eğrisi analizi denklemleri gösterirmetillenmiş ve unmethylated DNA (kırmızı çizgi 50/50 mix) l oranı kontrolü tamamen metillenmiş amplifikasyon (pembe çizgi, M) ve ° C ve 78.9 ° C sırasıyla 82.1 ayrıştırmaları unmethylated DNA (yeşil hat, U). <img alt="Şekil 4a" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig4a.jpg" /> <img alt="Şekil 4b" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig4b.jpg" /> Şekil 4. Doğrudan sıralama örneği ve bisülfit haritası A. Sıra iz sarı vurgulanır CpG siteleri ile üç farklı hücre hatları. Hücre hattı X hücre hatları Y ve Z G / A sinyaller üst üste görüldüğü gibi metilasyon değişik derecelerde ise her üç CpG siteleri% 100 metilasyon gösterir. B., bireysel klonların doğrudan sıralama belirlenir, bireysel CpG siteleri metilasyon (kırmızı noktalar) yoğunluğu gösteren Temsilcisi bisülfit harita. <img alt="Şekil 5a" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig5a.jpg" /> Şekil 5. Sequenom A. kullanarak yüksek verim DNA metilasyon analizi Sequenom epiTYPER teknolojisini kullanarak Spektrum görünümü. DNA parçalarının DNA metilasyon mevcut miktarına bağlı olarak, belirli spektrumları gösterir. B. DNA metilasyon yüzde CpG dört farklı hücre hatları için her yerinde özdeyişinin özeti. C. Metilasyon arsa özeti Sequenom özdeyişinin türetilmiştir.

<ol>
	<li>Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands.">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 1827-1831 (1992).</li><li>Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines.">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic. Acids. Res. 22, 2990-2997 (1994).</li><li>Grunau, C., Clark, S. J., Rosenthal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisulfite+genomic+sequencing:+systematic+investigation+of+critical+experimental+parameters.">Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters.</a> Nucleic. Acids. Res. 29, E65-E65 (2001).</li><li>Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation:+bisulphite+modification+and+analysis.">DNA methylation: bisulphite modification and analysis.</a> Nat. Protoc. 1, 2353-2364 (2006).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

DNA metilasyon analizi bisülfit dönüştürülen DNA genom dizileri tek nükleotid çözünürlükte DNA metilasyon belirlenmesi ve miktar kolaylaştıran bir köklü ve çok yönlü bir yöntemdir. Ancak, bisülfit dönüşüm ve sonraki analiz DNA tam her unmethylated sitozin urasil deaminated ve sadece metil cytosines un-reaktif kalan dönüştürülmüş olduğunu önermesine dayanır. Dönüştürülmemiş unmethylated cytosines dönüşüm eksik ise yanlış metil cytosines olarak yorumlanabilir bu yana, sorunların analizi ile ortaya çıkabilir. Bisülfit dönüşüm dönüşüm oranını en üst düzeye çıkarmak için çeşitli aşamalarında optimize edilebilir. DNA tam olarak dönüştürülebilir için sitozin kalıntılarının bisülfit iyonlarının maruz böylece ilk telli tek olmalıdır. Ilk adım, DNA denatürasyon, kritik ve DNA tam denatüre değilse eksik dönüşüm kaynağı olabilir. Sağlamak içinDNA tam denatüre olduğunu, ilgili tüm protein kaldırılması, uygun tuz konsantrasyonu, inkübasyon sıcaklığı ve saati de dahil olmak üzere reaksiyon parametreleri, tek sarmallı konformasyon DNA korumak için uygun olması önemlidir. Taze 3M NaOH kullanmak ve uygun inkübasyon süresi izin için önemlidir. DNA denatürasyon direnen ise, inkübasyon süresi 30 dakikaya kadar uzanan veya denatürasyon için önce DNA parçalanan protokol de dahil olmak üzere bazı değişiklikler DNA&#39;nın denatürasyon kolaylaştırabilir. Buna ek olarak, tek sarmallı DNA (ssDNA) bisülfit dönüşüm reaksiyon sırasında çift sarmallı DNA (dsDNA) yeniden tavlama olabilir. Ya periyodik veya sürekli bisülfit reaksiyon sırasında daha yüksek bir sıcaklık (90-95 ° C) reaksiyonu Taşıma ssDNA bakım yardımcı olabilir. Ancak, DNA&#39;nın bozulması, bu yüksek sıcaklıklarda büyük ölçüde hızlandırılmış olduğunu farkında olmak önemlidir. Çeşitli reaktifler th yeniden tavlama bozabilir eklenebilire DNA ipliklerini, üre gibi. DNA ve kalitesini konsantrasyonu da bisülfit reaksiyon verimliliğini ve nihai PCR verimi etkileyebilir. DNA&#39;nın bozulması, bisülfit dönüşüm protokolü bir sınırlama yoktur. DNA&#39;nın kimyasal arıtma çeşitli iplikçik ssDNA sonları ve bazı yüksek bisülfit konsantrasyonu, uzun kuluçka süreleri DNA düşüşü hızlandırabilir de dahil olmak üzere tam bisülfit dönüşüm için gerekli olan sert koşullar tanıtır. Açıklanan standart reaksiyon şartları altında, protokol değişiklikler tanıtıldı, DNA&#39;nın bozulması, bozulmuş ya da FFPE örnekleri gibi kalitesiz DNA şablonları için, bu tür dönüşüm dirençli dizileri için, ancak DNA bozulması ortak bir sorun değildir önemli bir sınırlama olabilir. Formalin sabit, parafin (FFPE) ve bozulmuş DNA örnekleri, bu protokolü etkin kullanılarak dönüştürülür ve amplifiye bisülfit olabilirAncak DNA daha da bozulmuş olmadığından emin olun değişiklikler tavsiye edilir. T RNA gibi bir taşıyıcı RNA kullanılması tavsiye edilir. DNA konsantrasyonu düşük (&lt;200 ng) Ayrıca glikojen bir taşıyıcı olarak eklenebilir. FFPE dokulardan izole DNA zaten parçalanmış ve daha fazla parçalanma deaminasyon sırasında yer aldığından daha fazla bozulmasını en aza indirmek için, bakım alınmalıdır. Parçası DNA denatürasyon önce başka etmeyin ve bisülfit reaksiyon için 4 saat inkübasyon süresi sınırı. Tasarım parçalanmış DNA nedeniyle 300 bp daha büyük amplikonlarının. PCR, unmethylated cytosines bisülfit dönüşüm DNA örneğinin karmaşıklığı azaltır etkileyebilecek bir diğer faktördür. Bölüm 4.1, artan astar uzunluğu ve nested PCR ana hatlarıyla aşağıdaki astar tasarım protokolü özgüllük ve PCR verimi artırmak için yardımcı olabilir. Son olarak, DNA örneğinin beri bisulph sırasında değişmişite dönüşüm, amplifikasyon yanlılık bir sorun olabilir. Bkz. Şekil 3, metil ve unmethylated şablonları bu orantılı PCR protokolde belirtildiği gibi, bir kontrol 50/50 M / U DNA karışımı ile işaretli olduğundan emin olun. Ayrıca sadece dönüştürülen şablonları bu amplifikasyon sağlamak HpaIII kısıtlama enzim ve jel elektroforezi (Şekil 3) ile meydana geliyor. PCR koşulları, sıcaklık ve / veya magnezyum konsantrasyonu farklı veya uzatma süresi uzatma optimize edilmesi gerekebilir. Bazı şablonlar, özellikle problemli gibi görünen ve astar konumu ayarlanması gerekebilir veya primerler dejenere kullanılmak üzere gerekebilir. Yeni nesil sıralama teknikleri genomik sıralama bisülfit benzer bir çözünürlük elde etmek için hızla gelişmektedir ve üçüncü nesil tek molekül sıralama bisülfit sıralaması için gerek kalmadan hem de birincil DNA ve metilasyon analizi için izin potansiyeline sahiptir. Ancak, yaygın kullanılabilirliği ve specbu tekniklerin ificity uzakta bir süre kalır. Bisülfit genomik sıralama metilasyon analizi altın standarttır ve sağlam bir protokoldür. Bu yöntem, sık karşılaşılan sorunlar ve sınırlamalar çözüldü noktasına kadar ilerledi ve uygulamaları, yüksek verimlilik ve Clark ve ark tarafından tanımlanan tüm genom analizi, bireysel gen analizleri genişlettik. 2006 4. Sorun Giderme kılavuzlar ve ek öneriler Tablo 1&#39;de özetlenmiştir. Başlangıçta standart bir protokol takip ve sadece eğer modifikasyon ve ne zaman bir problem ortaya tanıtmak için en uygun yaklaşım olduğu ileri sürülmektedir. <img src="/files/ftp_upload/3170/3170table2.jpg" alt="Tablo 2" /> Tablo 1 Sorun Giderme Rehberi

<ol><li> Sodyum metabisülfit (Ajax Finechem) </li><li> Hidrokinon (Merck) </li><li> Sihirbazı DNA-clean-up sistemi (Promega) </li></ol>

dna methylation: bisulphite modification and analysis

Epigenetik DNA dizisi bağımsız olarak meydana gelen kalıtsal gen fonksiyonunda değişiklikler açıklanmaktadır. Epigenetik gen düzenlemenin moleküler temeli karmaşık, ama aslında yapılan değişiklikler DNA kendisi veya DNA iştirakçi proteinler içerir. Memeli genomların DNA baskın epigenetik modifikasyon sitozin nükleotidler metilasyon (5-MEC). DNA metilasyon nerede ve gen ifade edilmelidir gen ekspresyonu makine talimat sağlar. Memeliler DNA metilasyon için birincil hedef dizisi 5&#39;-CpG-3 &#39;dinükleotidleri (Şekil 1). CpG dinükleotidleri genom boyunca eşit dağıtılmış değil, ancak tekrarlayan genomik dizileri ve gen rehberleri (Şekil 1) ile ilgili CpG &quot;adalar&quot; bölgelerinde yoğunlaşmıştır. DNA metilasyon desen doku belirli bir farklılaşma sırasında modülasyonlu, erken gelişim kurulan ve kanser de dahil olmak üzere birçok hastalık durumlarında bozulması. Understand hassas insan hastalığı, yöntemleri, verimli ve tekrarlanabilir DNA metilasyon ve rolünü biyolojik rolü 5-MeCs bireysel saptamak ve ölçmek için gereklidir. Bu protokol, bisülfit dönüşüm için DNA metilasyon analizi için &quot;altın standart&quot; ve tek nükleotid çözünürlükte DNA metilasyon tanımlanması ve ölçülmesi kolaylaştırır. Sodyum bisülfit sitozin deaminasyon kimya, üç adım (Şekil 2) içerir. (1) sülfonasyon: urasil-bisülfit türevi (3) Alkali Desulphonation vermek için ortaya çıkan sitozin-bisülfit türev hidrolitik deaminasyon:: sitozin (2) Hidrolik Deaminasyon 5-6 çift bağ için bisülfit Ayrıca sülfonat Kaldırma alkali uygulaması ile grup, urasil vermek. Bisülfit tercihen, 5-MEC ise, tek sarmallı DNA urasil sitozin deaminates bisülfit-aracılı deaminasyon dirençli. PCR üzerine, urasil yükseltilir5-MEC artıkları cytosines olarak kalırken, metil CpG&#39;ler sıralama sırasında bir sitozin &quot;C&quot; karşı timin &quot;T&quot; kalıntı varlığı unmethylated CpG&#39;ler ayırt edilmesi için izin timin gibi. Bisülfit dönüşüm tarafından DNA modifikasyonu, DNA metilasyon analizi pek çok yöntem için istismar edilebilir köklü bir protokoldür. Bisülfit dönüşüm 5-MEC algılama ilk Frommer et al 1 ve Clark ve ark. 2, DNA metilasyon yeni veri çoğunluğu için genomik DNA hesap bisülfit dönüşüm etrafında dayalı yöntemler gösterildi. Özgüllük ve gerekli metilasyon çözünürlük derecesine bağlı olarak, yazılan PCR analizi için farklı yöntemler kullanılabilir. Klonlama ve DNA molekülü üzerinde metilasyon için tek nükleotid çözünürlük verebileceğiniz en hazır yöntem.

Watch this Scientific Journal Video about DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis at JoVE.com

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

DNA metilasyon analizi için altın standart bisülfit dönüştürülen DNA genom dizileri. Bu yöntem, asidik koşullar altında deaminasyon bisülfit 5-methylcytosine (5-MEC) ile karşılaştırıldığında sitozin artan duyarlılık yararlanır. Unmethylated cytosines hedef genomik DNA PCR sonra metil cytosines ayırt edilebilir.

DNA Metilasyonu: bisülfit modifikasyonu ve Analiz

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

dna-methylation-bisulphite-modification-and-analysis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

104.4K Görüntüleme.  Garvan Institute of Medical Research. DNA metilasyon analizi için altın standart bisülfit dönüştürülen DNA genom dizileri. Bu yöntem, asidik koşullar altında deaminasyon bisülfit 5-methylcytosine (5-MEC) ile karşılaştırıldığında sitozin artan duyarlılık yararlanır. Unmethylated cytosines hedef genomik DNA PCR sonra metil cytosines ayırt edilebilir.

Video: DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during cancer development and progression. Despite this, the global epigenetic regulation of lncRNAs and repetitive sequences in cancer has not been well investigated, particularly in chronic lymphocytic leukemia (CLL). This study focuses on a unique approach: the immunoprecipitation-based capture of double-stranded, methylated DNA fragments using methyl-binding domain (MBD) proteins, followed by next-generation sequencing (MBD-seq). CLL patient samples belonging to two prognostic subgroups (5 IGVH mutated samples + 5 IGVH unmutated samples) were used in this study. Analysis revealed 5,800 hypermethylated and 12,570 hypomethylated CLL-specific differentially methylated genes (cllDMGs) compared to normal healthy controls. Importantly, these results identified several CLL-specific, differentially methylated lncRNAs, repetitive elements, and protein-coding genes with potential prognostic value. This work outlines a detailed protocol for an MBD-seq and bioinformatics pipeline developed for the comprehensive analysis of global methylation profiles in highly CpG-rich regions using CLL patient samples. Finally, a protein-coding gene and an lncRNA were validated using pyrosequencing, which is a highly quantitative method to analyze CpG methylation levels to further corroborate the findings from the MBD-seq protocol.

This work describes an optimized methyl-CpG-binding domain (MBD) sequencing protocol and a computational pipeline to identify differentially methylated CpG-rich regions in chronic lymphocytic leukemia (CLL) patients.

Kronik Lenfositik Lösemi Hastalarında Metil-CpG-Bağlayıcı Alan Yakalamaya Dayalı Bir Yöntem Kullanarak Kapsamlı DNA Metilasyon Analizi

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Genetik

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

DNA değişiklikler için Immunostaining: Confocal görüntülerin sayısal analiz

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

Mitokondrial DNA metilasyonu doğru algılanması için metodoloji

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to the display of physiological and behavioural phenotypes. Such environmental programming is likely to increase the susceptibility to metabolic, cardiovascular and mental diseases 3,4.
DNA methylation and histone modifications are considered key processes in the mediation of the gene-environment dialogue and appear also to underlay environmental programming 5. In mammals, DNA methylation typically comprises the covalent addition of a methyl group at the 5-position of cytosine within the context of CpG dinucleotides.
CpG methylation occurs in a highly tissue- and cell-specific manner making it a challenge to study discrete, small regions of the brain where cellular heterogeneity is high and tissue quantity limited. Moreover, because gene expression and methylation are closely linked events, increased value can be gained by comparing both parameters in the same sample.
Here, a step-by-step protocol (Figure 1) for the investigation of epigenetic programming in the brain is presented using the 'maternal separation' paradigm of early life adversity for illustrative purposes. The protocol describes the preparation of micropunches from differentially-aged mouse brains from which DNA and RNA can be simultaneously isolated, thus allowing DNA methylation and gene expression analyses in the same sample.

A streamlined workflow to study DNA methylation and gene expression changes upon early-life stress is shown. Starting from maternal separation of newborn mice and isolation of discrete brain tissues, we represent a protocol to simultaneously isolate DNA and RNA from brain tissue punches for subsequent bisulfite sequencing and RT-PCR analysis.

Beyin Küçük, Anatomik tanımlı alanları DNA metilasyon ve Gen İfade Optimize Analizi

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Nörobilim

Genome-Wide Analysis of DNA Methylation in Gastrointestinal Cancer

DNA methylation is an important epigenetic change that is biologically meaningful and a frequent focus of cancer research. Genome-wide DNA methylation is a useful measure to provide an accurate analysis of the methylation status of gastrointestinal (GI) malignancies. Given the multiple potential translational uses of DNA methylation analysis, practicing clinicians and others new to DNA methylation studies need to be able to understand step by step how these genome-wide analyses are performed. The goal of this protocol is to provide a detailed description of how this method is used for the biomarker identification in GI malignancies. Importantly, we describe three critical steps that are needed to obtain accurate results during genome-wide analysis. Clearly and concisely written, these three methods are often lacking and not noticeable to those new to epigenetic studies. We used 48 samples of a GI malignancy (gastric cancer) to highlight practically how genome-wide DNA methylation analysis can be performed for GI malignancies.

Herein, we describe a procedure for genome-wide analysis of DNA methylation in gastrointestinal cancers. The procedure is of relevance to studies that investigate relationships between methylation patterns of genes and factors contributing to carcinogenesis in gastrointestinal cancers.

Gastrointestinal Kanserde DNA Metilasyonunun Genom Çapında Analizi

DNA methylation is an important epigenetic change that is biologically meaningful and a frequent focus of cancer research. Genome-wide DNA methylation is ...

Kanser Araştırmaları

Sample Preparation to Bioinformatics Analysis of DNA Methylation: Association Strategy for Obesity and Related Trait Studies

Obesity is directly connected to lifestyle and has been associated with DNA methylation changes that may cause alterations in the adipogenesis and lipid storage processes contributing to the development of the disease. We demonstrate a complete protocol from selection to epigenetic data analysis of patients with and without obesity. All steps from the protocol were tested and validated in a pilot study. 32 women participated in the study, in which 15 individuals were classified with obesity according to Body Mass Index (BMI) (45.1 &#177; 5.4 kg/m2); and 17 individuals were classified without obesity according to BMI (22.6 &#177; 1.8 kg/m2). In the group with obesity, 564 CpG sites related to fat mass were identified by linear regression analysis. The CpG sites were in the promoter regions. The differential analysis found 470 CpGs hypomethylated and 94 hypermethylated sites in individuals with obesity. The most hypomethylated enriched pathwayswere in the RUNX, WNT signaling, and response to hypoxia. The hypermethylated pathways were related to insulin secretion, glucagon signaling, and Ca2+. We conclude that the protocol effectively identified DNA methylation patterns and trait-related DNA methylation. These patterns could be associated with altered gene expression, affecting adipogenesis and lipid storage. Our results confirmed that an obesogenic lifestyle could promote epigenetic changes in human DNA.

The present study describes the workflow to manage DNA methylation data obtained by microarray technologies. The protocol demonstrates steps from sample preparation to data analysis. All procedures are described in detail, and the video shows the significant steps.

DNA Metilasyonunun Biyoinformatik Analizine Örnek Hazırlama: Obezite ve İlgili Özellik Çalışmaları için Dernek Stratejisi

Obesity is directly connected to lifestyle and has been associated with DNA methylation changes that may cause alterations in the adipogenesis and lipid ...

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine methylation patterns in cells. Reduced representation of whole genome bisulfite sequencing was developed to detect quantitative base pair resolution cytosine methylation patterns at GC-rich genomic loci. This is accomplished by combining the use of a restriction enzyme followed by bisulfite conversion. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing (ERRBS) increases the biologically relevant genomic loci covered and has been used to profile cytosine methylation in DNA from human, mouse and other organisms. ERRBS initiates with restriction enzyme digestion of DNA to generate low molecular weight fragments for use in library preparation. These fragments are subjected to standard library construction for next generation sequencing. Bisulfite conversion of unmethylated cytosines prior to the final amplification step allows for quantitative base resolution of cytosine methylation levels in covered genomic loci. The protocol can be completed within four days. Despite low complexity in the first three bases sequenced, ERRBS libraries yield high quality data when using a designated sequencing control lane. Mapping and bioinformatics analysis is then performed and yields data that can be easily integrated with a variety of genome-wide platforms. ERRBS can utilize small input material quantities making it feasible to process human clinical samples and applicable in a range of research applications. The video produced demonstrates critical steps of the ERRBS protocol.

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

Baz Çifti Çözünürlük DNA metilasyon Değerlendirme Temsil bisülfit sıralamayı İndirimli pekiştirilmiş

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

Biyoloji

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

DNA Metilasyon Analizi nesil Dizilimine tarafından hedef

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

DNA Methylation Analysis

Methylation at CpG dinucleotides is a chemical modification of DNA hypothesized to play important roles in regulating gene expression. In particular, the methylation of clusters of methylation sites, called &#8220;CpG islands&#8221;, near promoters and other gene regulatory elements may contribute to the stable silencing of genes, for example, during epigenetic processes such as genomic imprinting and X-chromosome inactivation. At the same time, aberrant CpG methylation has been shown to be associated with cancer.In this video, the biological functions and mechanisms of DNA methylation will be presented, along with various techniques used to identify methylation sites in the genome. We will then examine the steps of bisulfite analysis, one of the most commonly used methods for detecting DNA methylation, as well as several applications of this technique.

Methylation at CpG dinucleotides is a chemical modification of DNA hypothesized to play important roles in regulating gene expression. In particular, the ...

Education

JoVE Science Education

İleri Biyoloji

5-Methylcytosine Dot Blot to Determine the Extent of DNA Methylation

Source: Jia, Z. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/55565">A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2017)
This video describes the technique of dot-blot to determine the level of DNA methylation in human chondrocytes in vitro via the blotting of DNA samples on a nylon membrane and the subsequent visualization using monoclonal antibodies. This helps to determine the chondrocytes&#39; phenotype at various stages in culture.