Name: development of inhibitors of protein-protein interactions through replace: application to the design and development non-atp competitive cdk inhibitors
Uploaded: 2015-10-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors at JoV

We thank Dr&#8217;s. Douglas Pittman and Michael Wyatt for their assistance with cell culture and Dr Wyatt and Ms. Erin Anderson for help in development of the binding assays. We acknowledge Mike Walla and Bill Cotham in the Department of Chemistry and Biochemistry at the University of South Carolina for assistance with Mass Spectrometry, Helga Cohen and Dr. Perry Pellechia for NMR spectrometry. This work was funded by the National Institutes of Health through the research project grant, 5R01CA131368.

Potansiyel Küçük Molekül Kapak Kapatma Gruplarının 1. Hesaplamalı Tanıtımı Not: Prensip olarak, yerleştirme veya farmakofor ara çeşitli yöntemler potansiyel kapatma gruplarını tahmin etmek için de kullanılabilir. DEĞİŞTİRME hesaplama çalışmaların amacı, ikame edilmiş amino asitlerin özelliklerini ve etkileşimlerini muhafaza eden küçük moleküllerin tespit etmektir. <ol><li> LigandFit yerleştirme protokolünün 14 Doğrulama </li></ol> Not: Daha önceki çalışmalarda, yerleştirme yöntemi (LigandFit 15, moleküler modelleme programı takımında bir modül, Discovery Studio 3.0) bu algoritma bilinen Ncaps bağlayıcı modlarını çoğaltmak ve sonuçlar elde göstermek için yeterli olduğundan emin olmak için doğrulandı bilinmeyen bileşikler 14 tahmini vardır. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Aşağıdaki adımları (1,2-1,5) kullanılarak aşağıdaki gibi LigandFit için optimal parametreleri tespit: PLP1 enPoz nesil, oluşturulan pozlar azaltılması ve pozlar analizi için PLP1 puanlama fonksiyonu için ji ızgara. </li><li> Elde edilen konformasyonlar sınırlamak ve kaplanmış peptidin kovalent bağ oluşumu için uygun ligandlar konumlandırmak amacıyla, hidrojen bağları için etkileşim filtre sırasıyla Trp217 ve Gln254 indol azot ve amid nitrojen atomu ayarlayın. </li><li> Tasarım ve A reseptörü (2UUE) siklin / CDK2&#39;nin içine fragmanı alternatifleri bir kütüphane rıhtım. Sentez ve PLP1 puanlama, CBG ile etkileşim filtreleri ve tamamlayıcılık ile etkileşim dayalı ticari kaynak potansiyeli kapak kapatma gruplara öncelik. Aşağıdaki gibi LigandFit yerleştirme için gereken çeşitli adımlar vardır. </li></ol><ol start="2"><li> Reseptör bağlanma sitesi 14 Hazırlanması <ol><li> Yazılımda bir görselleştirme penceresine: CDK2 / siklin A kristal yapısı (2UUE pdb id) İthalat. Bu yapı, daha önce tanımlanmış olan FLIP ihtiva 5-metil-1-fenil-1 H-1, 2,4-triazol-3-karboksamido (3,5-DCPT) RLIF siklin yivine bağlıdır (Şekil 3). </li><li> Sil veya yerinde kalıntıları RLIF (C-terminali) tutmak. Peptit sekansı muhafaza edildiğinde, ligand için etkileşim filtresi olarak peptidin N-terminal amino grubu kullanılır. &quot;Reseptör-ligand etkileşimleri&quot; araçlardan, N-cap Göster / Gizle sitesi alandan 3,5-DCPT etrafında bir küre oluşturun. Küre ligand-reseptör etkileşimleri bağlanması esnasında oluşmasına izin verilir bağlanma yeri aktif bölgeyi tanımlamak için oluşturulur. </li><li> &quot;Seçilen ligand hacmi olarak bulabilirsiniz sitesinden&quot; dan daha bağlanma bölgesini tanımlar ve proteinden Ligandı 3,5-DCPT silin. Oluşturulan alanı içinde bağlayıcı hacmini tanımlamak için bu adımı uygulayın. </li><li> Hidrojen bağlanması için etkileşim filtreleri olarak artıkları Trp217 ve Gln254 indol azot ve amid nitrojen atomu ayarlayın. Etkileşimi filtreleri ayarlama böylece bütünleşmesini yalnızca pozlarset kalıntılarının atomları ile ract nedenle demirledi pozlar önemli etkileşimleri koruyarak yerleştirme sürecinde filtre edilecektir. </li></ol></li><li> Ligandlar 14 Hazırlanması <ol><li> Molekül ağırlığı 500&#39;den daha az ikincil cebinde kesik peptit ve van der Waals etkileşimleri için uygun hidrofobik grupların (ikame edilmiş fenil grubu) dahil edilmesi ile ligasyon için bir karboksilat grubun varlığı da dahil olmak üzere ölçütlere göre 100 potansiyel kapaklama gruba kütüphane Tasarım Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir. </li><li> Trp217 ve ikame edici ile peptid, hidrojen bağı etkileşimlerini almışlardır heterosiklik halkalar seçin HAKRRLIF arasında bazik yan zincirler, iyon-çiftlenmesi etkileşimlerini değiştirmek için dahil. Karbonil oksijen ile bir kaynak peptidin (Tablo 1) &#39;de peptit omurgasına benzeyen Gln254 amid azot atomu ile etkileşime girebilir, böylece ilgili aldehid moleküller olarak ligandları bağlantı istasyonu. </li><li> Önce docKral, düşük enerjili konformasyon için tasarlanmış ligandların en aza indirmek ve &quot;ligandlar hazırlayın&quot; protokolünü kullanarak uygun bir iyonizasyon devlet hazırlar. Beraberlik ve yazılım içine ithal edilen bir tablo için ChemDraw&#39;a içinde .sdf dosyası biçiminde bu potansiyel N kapaklar ihracattan önce. Not: ligandlar protokolünü hazırlayın tüm ligandlar en aza indirmek için kullanılan en düşük enerji durumlarına demirledi edilecek ve iyonizasyon ücrete atomların uygulanmıştır. Varsayılan parametreler bu aşama için kullanılır. </li></ol></li><li> Siklin A Groove 14 ligandlann Yerleştirme <ol><li> Yazılımın reseptör-ligand etkileşimleri protokolü setinden LigandFit rutin seçin. Reseptörü ve bu protokol için girdi olarak hazırlanmış ligandlar kullanın. </li><li> Enerji şebekesine olarak bu çalışır seçkin PLP1 için, bu enerji minimize olacak pozlar ve 10 olarak oluşturulan pozlar sayısı varsayılan değerlerine tüm diğer parametreleri bırakın belirtin. Not: LigandFit olduğuMonte Carlo yapısal arama algoritması ile kombine bir şekil tabanlı karşılaştırma filtre kullanarak bir proteinin aktif site ile yüksek tamamlayıcılık ve potansiyel yakınlık pozlar tanımlamak ve üretebilir bir yerleştirme yöntemi. Yerleştirme programı tarafından kullanılan enerji ızgara ligand-reseptör etkileşimleri ve potansiyel pozlar üretmek için güç alanıdır. PLP1 özellikle hidrojen bağlayıcı etkileşimleri önceleyen ve parçalı lineer potansiyeli PLP atom türü her hidrojen olmayan ligand atom veya hidrojen olmayan reseptör atomu için tahsis nerede. </li></ol></li><li> Sonuçların analizi <ol><li> İlk etapta, ekran PLP1 puanı değerlerini azalan göre sıralama sonra visualizer programında pozlar ve. Aday ligand göre yerleştirilmiş bir ligandın bağlanma afinitesi, hedef reseptör yapısı ile geometrisi ve kovalent olmayan bir etkileşim teşkil tahmin etmek için örneğin PLP1 skorlama fonksiyonlarını kullanın. Not: Burada PLP1 puanlama fonksiyonu g bulunduhidrojen bağının tahmini içerdiğinden en iyi sonuçları ive. </li><li> Bilinen kapama grubuna değerini en az 2 Å (göreceli ortalama kare sapma (RMSD sahip)) ile görsel 1 için attı pozlar üst% 25 analiz) ile üst üste, 2) siklin yivli etkileşim filtreleri ve 3) görsel tamamlayıcılık yerine . O kabul edilen bir doğru (bir deneysel yapıya kıyasla) poz demirledi &lt;2 Å bir RMSD değerine sahiptir. </li><li> Bilinen yapı-aktivite ilişkileri ile tutarlı bir şekilde, bağlama cebinin etkin dolgu maddesine sahip olarak tanımlanır, görsel tamamlayıcılığı için pozlar inceleyin. Etkileşim filtreleri bağlanması ve / veya amid bağı oluşumu için uygun geometride bir potansiyel kapama grubunu yerleştirmek için gerekli olan kritik olduğu bilinen, moleküller arası temas gerektiren atomu kısıtlamaları dahil etmek için ayarlanır. Interactio ile hidrojen bağı oluşturur potansiyel N-kapatma grupları yerleştirilmiş pozlar üç örnekn adet filtre, Şekil 4&#39;te gösterilmiştir. </li></ol></li></ol> 2. Sentezi ve Potansiyel N -capping Gruplar Karakterizasyonu <ol start="1"><li> N-kapatma grupların sentezi. </li><li> Elde edilen sentezi için, ticari başlangıç ​​materyalleri, solvent ve reaktifler kullanılır. Geleneksel sentetik organik kimya (bir örnek için Şekil 5, 12,13) ​​ile potansiyel N-kapatma gruplarını sentezleme. </li><li> Reaksiyonları izlemek için, silika jel üzerinde ince tabaka kromatografisi (TLC) uygulayın. <ol><li> Mobil faz olarak bir başlangıç ​​materyali reaksiyon karışımı (1 mg) çözündürün ve kılcal borular kullanılarak TLC plakası üzerinde nokta onları. </li><li> (A 35:65 oranında etil asetat ve heksan), mobil faz içeren bölmeye TLC plaka koyun. Mobil faz TLC plakası% 90 ulaştığında, kaldırmak ve hava plakasını kurulayın. </li><li> Görünür noktalar olarak başlangıç ​​malzemesi ve reaksiyon karışımları tespit etmek için UV ışığı kullanın. CalBütün noktalar R f (nokta ve mobil faz mesafenin oranı) hesaplanmalıdır. Not: başlangıç ​​malzemesinin Rf görülen hiçbir yerinde olduğu zaman, reaksiyon tamamlanmıştır. </li></ol></li><li> Reaksiyonun tamamlanmasından sonra, sulu bir asit veya baz çözeltisi ile bir ayırma hunisi ve yıkamada yerleştirerek reaksiyon karışımı kadar çalışır. Vakum altında elde edilen ham ürün, organik çözücü madde döner bir buharlaştırıcı içinde toplamak buharlaştırılmak ve kurutun. </li><li> Uygun bir çözücü, 3-5 ml ham ürün, 500 mg çözülür ve silika ya da RP 18 Samplet bir 1 g eklemek ve hava altında kurutulur. Silis / RP SNAP flaş kartuşlarında ham ürün ihtiva eden Samplet yerleştirin ve% 6 etil asetat ile başlayarak gradyanı çalışma ile SNAP 100 g kolonu kullanılarak (üreticinin protokolüne göre) otomatik yüksek performanslı flaş kromatografisi kullanılarak ham materyal saflaştırılması: 94 % 50% etil asetat heksan ve tekrar% 50 hekzan15 kolon hacmi. </li><li> Kuruyana kadar tüm çözücüyü buharlaştırarak bir döner buharlaştırıcı kullanılarak hızlı kromatografi ile ilgili çözücü içinde toplanan saflaştırılmış ürün kurutulur ve daha fazla kalan tüm çözücüleri uzaklaştırmak için vakum altında ürün kurutulur. NMR, MS ve analitik HPLC ile arıtılmış ürünün karakterizasyonu gerçekleştirin. <ol><li> 1H NMR ve 13C NMR için, saflaştınlmış numuneye yaklaşık 10 mg ağırlığında uygun bir deuteratlanmış çözücü içinde çözünmesi, ve NMR spektrumları 2,14 kayıt için kuru bir NMR tüpü içeriği aktarın. </li><li> 1 H NMR ve yüksek alan NMR Spektrometresi (en az 300 MHz) ile 13 ° C NMR spektrumları kaydedin. Bir QTOF (uçuş kütle spektrometresi Tandem dört-1 defa) kullanarak kütle spektrumları, elektrosprey iyonizasyonu (ESI) veya VG 70S Edinme (Çift odaklama manyetik sektör kütle spektrometresi, EI) 2,14. </li><li> Bir diod düzenek detektörü ile HPLC ile ürünlerin saflığını analiz ile donatılmışBir C18 (2) 100 A, 250 x 4.6 mm, 5 um analiz sütunu. 30 dakika boyunca% 60 asetonitril (% 0.1 trifloroasetik asit)% 100 su (% 0.1 trifloroasetik asit) başlanarak gradyanı çalıştırmak kullanarak ve 4 dk için gradyanı tutun. 226 ve 254 nm 2,14 olarak kromatogramlar ayıklayın. Not: değerlendirildi bileşiklerin analitik saflık&gt;% 95 idi. </li></ol></li></ol> Döndürür 2 Üretimi için 3. Katı Faz Sentezi <ol start="1"><li> N-kapaklı çevirir sentezi <ol><li> Aşağıdaki adımları kullanılarak standart katı faz sentez yöntemleri ile N-uçlu peptidik bileşikler bir araya getirin. <ol><li> 2 ml O -Benzotriazole- N, N, N &#39;, N-tetrametil-uronyum-heksafluoro-fosfat (HBTU, 221,93 mg) 4,4 eşdeğer olarak C-terminal amino asit (Fmoc-Phe) 5 eşdeğer etkinleştirme 5 dakika boyunca, DMF. Diizopropiletil amin 6 eşdeğer kullanılarak Rink reçine üzerine Fmoc-Phe HBTU karıştırılmalıdır (DIPEA, 103,13oda sıcaklığında 1 saat için mg) eklenmiştir. </li><li> 10 dakika boyunca 3 ml DMF içinde% 20 piperidin kullanılarak C-terminal tortusu Fmoc koruma grubunun çıkarılması. Çift sonraki amino asitler (örneğin, Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Arg-pmc) adım adım. Her bir adımda, DIPEA (103,13 mg) ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca 2 ml DMF içinde HBTU (221,93 mg) 4,4 eşdeğer 6 eşdeğer kullanarak bir sonraki amino asidin çift 5 eşd. </li><li> Yıkama döngüleri, yukarıda tarif edilen bir amino asit birleştirme ve koruma giderme adımları sonra Fmoc DMF (DCM + 5 x 10 ml 5 x 10 mi) uygulanır. Peptit montajı kurulduktan sonra, çift, oda sıcaklığında 1 saat boyunca 2 ml DMF içinde DIPEA (103,13 mg) ve HBTU (221,93 mg) 4,4 eşdeğer 6 eşdeğer kullanılarak gruplar N-kapatma. </li><li> Peptidin montajının tamamlanmasından sonra, bölme karışımı 2 ml reaksiyon karışımı tedavi (: 5: 90 5 TFA / H2O / TIPS) O / N yan zincir koruyucu gruplar çıkarmak ve ayırmak reçineden çevirir. Soğuk dietil çökeltilmesi için eter ve I &#39;ile elde edilen ürünün toz haline getirinBir döner buharlaştırıcı içinde f gerekli konsantresi. </li></ol></li></ol></li><li> N-başlıklı-C-başlıklı çevirir sentezi <ol><li> O ile birlikte (16.1 mg, 0.02 mmol) diklorometan içinde ve ek [4- (3-klorofenoksi) piridin-2-il] metanamin (Cı-kapak) tartılır ve N-terminal olarak kapatılmış ve korunan Arg-Leu peptidi eritmek - benzotriazol-, N, N, N &#39;, N&#39; -tetrametiluronyum heksaflorofosfat (HBTU; 16.7 mg, 0.02 mmol) ve N, N-diizopropiletilamin (DIPEA, 6.5 mg, 0.02 mmol) eklenmiştir. </li><li> Karıştırın ve TLC / HPLC, başlangıç ​​materyalinin tamamen tükendiğini gösterene kadar oda sıcaklığında reaksiyonu izleyin. Reaksiyonun tamamlanmasından sonra, etil asetat ve su arasında döner bir buharlaştırıcı ve daha sonra bir bölüm ile ham tepkime karışımı konsantre hale getirin. </li><li> Sulu ve organik tabaka ayrılır; 1 N NaOH, 1 N HCI ve tuzlu su ile organik tabaka yıkayın. Sodyum sülfat ile yaklaşık 1 g organik katman kurutulur ve döner bir buharlaştırıcı içinde ürün konsantre edilir. Fina(: 2.5: 2.5 trifluoroasetik asit / H 2 O / İPUÇLARI 95) korumanın kaldırılması için Lly bölünme karışımı ile ürün O / N davranın. </li><li> Soğuk dietil eter ile ve döner bir buharlaştırıcı içinde gerekli olan tüm çözücünün konsantre çıkarılması için tamamen kuruluk derecesinde şekilde elde edilen ürün toz haline getirin. Bundan başka, tüm çözücü kalıntısını uzaklaştırmak üzere, vakum altında ürün kurutulur. </li></ol></li><li> Arıtma ve döndürür karakterizasyonu <ol><li> Yarı preparatif ters-faz HPLC yöntemleri kullanılarak ham olarak döndürür arındırın. Arıtılmış döndürür liyofilize ve kütle spektrometresi 2,14 kullanarak molekül kütlesi karakterize eder. </li><li> Bir diod düzenek detektörü ile HPLC ile döndürür ve analitik saflıkta belirlemek 250 x 4.6 mm, 5 um kolonu, bir C 18 (2), 100 A ile donatılmıştır. % 95 H2O (% 0.1 trifloroasetik asit) /% 5 asetonitril (% 0.1 trifloroasetik asit)% 35 H2O (% 0.1 trifloroasetik asit) /% 65 asetonitril (% 0.1 trifluoroace başlayarak gradyanı yöntemi kullanın-asetik asit), 30 dakika boyunca, 4 dakika boyunca gradyanı tutun. Özü 226 ve 254 nm &#39;de kromatogra-. </li></ol></li></ol> Rekabetçi 2,14 Bağlama Tayini İçin Bağlanma Tahlili 4. Floresan Polarizasyon <ol start="1"><li> Siyah 384-kuyu (138 ul) aşağıdaki prosedürü kullanarak plakalarda tahlil gerçekleştirin. </li><li> Örnekleri, izleyici peptidleri (4 nM), ve kinaz kompleksleri seyreltin (CDK2 / siklin A - 18 ug / ml, CDK4 / siklin D - 37 ug / ml), deney tamponu (25 mM HEPES pH 7, 10 mM gerekli olan konsantrasyonlara NaCl,% 0.01 Nonidet P-40, 1 mM ditiotreitol (DTT). </li><li> 384 oyuklu plakanın her bir oyuğuna, eklemek: CDK4D1 ya CDK2CA (0,3 ug / kuyu saflaştırılmış rekombinan insan kinaz kompleks), 5 ul bileşik çözeltisi, 30 nM izleyici peptid (fluoresceinyl-Ahx, Pro-Val 5 ul 5 ul -Lys-Arg-Arg-Leu- (3ClPhe) -Gly ya fluoresceinyl-Ahx, Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Leu-Phe-Gly tracer peptid). Her bir DMSO (% 6), Buffe 5 ul kullanınr, radyoaktif izotop ve 5 ul DMSO (% 6), kinaz kompleksi, kontrol çukurları olarak izleyici </li><li> Tüm bileşenler ilave edildikten sonra, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca (41,16 xg) 500 rpm&#39;de plaka santrifüj ve daha sonra oda sıcaklığında 45 dakika boyunca çalkalama ile plaka kuluçkalayın. 485 nm / 535 nm eksitasyon / emisyon filtresi ve dikroik ayna ile donatılmış bir çok modlu bir plaka okuyucusu ve detektörü kullanılarak kuyulu bir levhadaki her Floresein yoğunluğu okuyun. </li><li> Aşağıda gösterilen eşitlik kullanılarak tüm test örnekleri için göreceli ortalama kutuplaşma (mp) hesaplayın. Göreceli milletvekillerini ilişkilendirilmesi ve konsantrasyonları test ederek Yatırım Ortamı logaritmik regresyon ile 50 değerleri belirlemek. </li></ol><img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/52441/52441eq1.jpg" />

<ol>
	<li>Andrews, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REPLACE:+a+strategy+for+iterative+design+of+cyclin-binding+groove+inhibitors.">REPLACE: a strategy for iterative design of cyclin-binding groove inhibitors.</a> Chembiochem. 7, 1909-1915 (2006).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Non-ATP+Competitive+CDK/Cyclin+Groove+Inhibitors+through+REPLACE-Mediated+Fragment+Assembly.">Optimization of Non-ATP Competitive CDK/Cyclin Groove Inhibitors through REPLACE-Mediated Fragment Assembly.</a> J Med Chem. 56, 1573-1582 (2013).</li><li>McInnes, C., Bernstein, M., Desai, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+29.">Chapter 29.</a> Annual Reports in Medicinal Chemistry. 47, 459-474 (2012).</li><li>Bower, J. F., Pannifer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fragment-based+technologies+to+target+protein-protein+interactions.">Using fragment-based technologies to target protein-protein interactions.</a> Curr Pharm Des. 18, 4685-4696 (2012).</li><li>Makley, L. N., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+number+of+'druggable'+targets:+non-enzymes+and+protein-protein+interactions.">Expanding the number of 'druggable' targets: non-enzymes and protein-protein interactions.</a> Chemical biology, and drug design. 81, 22-32 (2013).</li><li>Walensky, L. D., Bird, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrocarbon-Stapled+Peptides:+Principles,+Practice,+and+Progress.">Hydrocarbon-Stapled Peptides: Principles, Practice, and Progress.</a> J Med Chem. , (2014).</li><li>Shapiro, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin-dependent+kinase+pathways+as+targets+for+cancer+treatment.">Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment.</a> J Clin Oncol. 24, 1770-1783 (2006).</li><li>Thais, M., Sielecki, J. F. B., Enfield, P. A., Trainor, G. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+dependant+kinase+inhibitors:+Useful+targets+in+cell+cycle+regulation.">Cyclin dependant kinase inhibitors: Useful targets in cell cycle regulation.</a> Journal of medicinal chemistry. 43, 1-18 (2000).</li><li>Morphy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectively+nonselective+kinase+inhibition:+striking+the+right+balance.">Selectively nonselective kinase inhibition: striking the right balance.</a> J Med Chem. 53, 1413-1437 (2010).</li><li>Chen, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+killing+of+transformed+cells+by+cyclin/cyclin-dependent+kinase+2+antagonists.">Selective killing of transformed cells by cyclin/cyclin-dependent kinase 2 antagonists.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4325-4329 (1999).</li><li>Orzaez, M., Gortat, A., Mondragon, L., Bachs, O., Perez-Paya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-noncompetitive+inhibitors+of+CDK-cyclin+complexes.">ATP-noncompetitive inhibitors of CDK-cyclin complexes.</a> ChemMedChem. 4, 19-24 (2009).</li><li>Kontopidis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+cyclin+groove+recognition:+complex+crystal+structures+and+inhibitor+design+through+ligand+exchange.">Insights into cyclin groove recognition: complex crystal structures and inhibitor design through ligand exchange.</a> Structure. 11, 1537-1546 (2003).</li><li>McInnes, C., Andrews, M. J., Zheleva, D. I., Lane, D. P., Fischer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidomimetic+design+of+CDK+inhibitors+targeting+the+recruitment+site+of+the+cyclin+subunit.">Peptidomimetic design of CDK inhibitors targeting the recruitment site of the cyclin subunit.</a> Current medicinal chemistry. Anti-cancer agents. 3, 57-69 (2003).</li><li>Premnath, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragment+based+discovery+of+arginine+isosteres+through+REPLACE:+towards+non-ATP+competitive+CDK+inhibitors.">Fragment based discovery of arginine isosteres through REPLACE: towards non-ATP competitive CDK inhibitors.</a> Bioorganic, and medicinal. 22, 616-622 (2014).</li><li>Venkatachalam, C. M., Jiang, X., Oldfield, T., Waldman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LigandFit:+a+novel+method+for+the+shape-directed+rapid+docking+of+ligands+to+protein+active+sites.">LigandFit: a novel method for the shape-directed rapid docking of ligands to protein active sites.</a> J Mol Graph Model. 21, 289-307 (2003).</li><li>Mendoza, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+cyclin-dependent+kinase+2/cyclin+A+antagonists+that+differ+from+ATP+site+inhibitors+block+tumor+growth.">Selective cyclin-dependent kinase 2/cyclin A antagonists that differ from ATP site inhibitors block tumor growth.</a> Cancer Res. 63, 1020-1024 (2003).</li><li>Denizot, F., Lang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+colorimetric+assay+for+cell+growth+and+survival.+Modifications+to+the+tetrazolium+dye+procedure+giving+improved+sensitivity+and+reliability.">Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability.</a> J Immunol Methods. 89, 271-277 (1986).</li><li>Zheleva, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+potent+p21(WAF1)-derived+peptide+inhibitors+of+CDK-mediated+pRb+phosphorylation:+delineation+and+structural+insight+into+their+interactions+with+cyclin+A.">Highly potent p21(WAF1)-derived peptide inhibitors of CDK-mediated pRb phosphorylation: delineation and structural insight into their interactions with cyclin A.</a> The journal of peptide research : official journal of the American Peptide Society. 60, 257-270 (2002).</li><li>Ivanov, A. A., Khuri, K. F. R., Fu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+protein-protein+interactions+as+an+anticancer+strategy.">Targeting protein-protein interactions as an anticancer strategy.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 34, (2013).</li><li>Thayer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+peptides.">Improving peptides.</a> Chemical and Engineering News. 89, 13-20 (2011).</li><li>Yin, H., Hamilton, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+targeting+protein-protein+interactions+with+synthetic+agents.">Strategies for targeting protein-protein interactions with synthetic agents.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 44, 4130-4163 (2005).</li><li>Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+and+drug+discovery+for+protein-protein+interactions.">Structural biology and drug discovery for protein-protein interactions.</a> Trends Pharmacol Sci. 33, 241-248 (2012).</li><li>Cannon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmaceutics+and+drug+delivery+aspects+of+heme+and+porphyrin+therapy.">Pharmaceutics and drug delivery aspects of heme and porphyrin therapy.</a> J Pharm Sci. 82, 435-446 (1993).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Targeting protein-protein interactions (PPI) in drug discovery is highly challenging as these typically involve a large shallow contact interface comprised of numerous and diffuse contacts19. Furthermore, peptidic compounds which inhibit PPI&#8217;s that are amenable to drug discovery are problematic due to their higher molecular mass, metabolic instability and poor bioavailability20. Current strategies that have been applied for the development of PPI inhibitors include design of proteomimetics and...

Bu yazıda, daha fazla farmasötik ilgili moleküllerin içine protein-protein etkileşimleri peptidik inhibitörlerinin dönüştürmek için strateji DEĞİŞTİRİN (hesaplama zenginleştirme kullanarak kısmi ligand alternatifleri ile değiştirilmesi) uygulayarak bir vaka çalışması 1-3 tarif edilmiştir. PPİ potansiyel ilaç hedefleri zengin ama yeterince faydalanılmayan kaynağı temsil ederken, mevcut metodolojiler bu yaygın erişilebilir hale getirmek, büyük ölçüde yetersiz kalmaktadır. Fragmanı göre dizayn 4, yüksek verimli tarama 5 ve 6 ilerlemeler sağlamıştır zımbalanmış peptidler dahil olmak üzere mevcut stratejiler, ancak, bu bir çok durumda etkisizdir. Sonuç olarak, daha fazla ilerleme ve daha verimli yaklaşımlar gereklidir. Tam ilaç gibi iyileştirilmiş özelliklere ve anti-tümör terapötik maddeler olarak daha da geliştirilmesi için bir potansiyele sahip olan kinaz inhibitörlerinin geliştirilmesinde doğrulanmıştır DEĞİŞTİRME. Bu strateji, hücre dışı ATP inhibitörlerinin geliştirilmesinde örneklenmiştirdöngüsü CDK&#39;ler ve aşağıda içerir: 1) siklin oluğu bağlayıcı HAKRRLIF / RRLIF etkileşimleri ile ilgili 3 boyutlu yapısal bilgileri elde edilmesi; 2) peptid etkileşimi için önemli bir bağlama determinantları olarak belirlenmesi; Bir veya daha fazla bağlama determinantları içeren peptit N-terminal bölgesinin 3) kesme; Peptid ve hangi kesik kısmı için potansiyel küçük molekül alternatiflerinin 4) hesaplama kimlik (kısmi ligand alternatifler PLA&#39;lar) ana peptid önemli etkileşimleri korumak; 5) sentez veya PLA&#39;lerin ticari kaynak önceden silinmiş peptid kalıntı (lar) tarafından işgal alt site ile heyecanla bağlamak için öngörülen; 6) katı faz sentezi kullanılarak kesilmiş peptid için en iyi PLA&#39;lerin ligasyonu yoluyla döndürür ve sentezi; Bağlanma, bir in vitro çevirir ya da bir hücre canlılığı deneyinde daha fazla karakterizasyon ve ardından fonksiyonel deneyi (CDK / siklin bağlamında floresan polarizasyon), 7) test edilmesi. Strateg DEĞİŞTİRME şematik bir temsiliy. Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir, bu yazıda, DEĞİŞTİRME strateji iterasyon tartışılmış ve CDK2 / siklin A uygulama detaylı olarak tarif. CDK&#39;lar, doğrudan veya dolaylı tümörlerinin çoğunluğunda deregüle olduğuna inanılmaktadır ve bu nedenle uygun kanser ilaç hedefleri 7 kabul edilir. CDK&#39;lar tam aktivasyon için siklinler ile ilişki gerektiren ve daha sonra hücre döngüsü düzenlenmesinde 8 kilit rol oynayan proteinleri fosforile. CDK&#39;ların iki ana grup, hücre döngüsü kontrol noktalarına kontrol izotipleri [G1 / S (CDK4 / Siklin D, CDK6 / siklin D ve CDK4 / siklin E), S fazı (CDK2 / siklin A) ve G2 / M (CDK1 / vardır siklin B)] ve fosforilasyon ile RNA polimerazın regülatörleri (CDK7 / siklin H, CDK8 / siklin C, CDK9 / siklin T). E2F1 transkripsiyon faktörü daha sonra DNA&#39;ya bağlanır ve gen transkripsiyonunu başlatır DP proteini ile bir kompleks oluşturduğunda, S fazındaki ilerlemeden bir anahtar aşama, meydana gelir. CDK2 / siklin A E2F1 transkripsiyonel nötralize etmek için gerekli olanfosforilasyon yoluyla aktivite bu şekilde E2F1-DP kompleksi ve daha sonraki bozulma serbest yol açar. CDK2 / siklin A inhibisyonu DNA&#39;sı bağlı durum, kalıcı aktivasyonuna yol içinde E2F1 muhafaza inanılmaktadır. E2F-1 aktivitesi elde edilen seviye, bir terapötik strateji öne p53 bağımsız apoptoz indüklemek için gereken eşik aşacak. Nedeniyle E2F-1 deregüle p53 ve pRb yolları, yüksek düzeyde çoğu zaman tümörler içinde seçici apoptosise yol açacaktır kanser hücreleri ve CDK2 / siklin A inhibisyonu ortaya çıkar ve geçerli bir kanser hedef 7 olarak kabul edilebilir. Klinik olarak incelenmiştir CDK inhibitörleri, insan kinome den büyük 500 protein kinazlar arasındaki reaktivite çapraz gelen, yüksek düzeyde korunan ATP bağlama bölgeleri hedeflemek ve potansiyel etkileri ve toksisiteyi 9 yan yol açan. Alternatif bir yaklaşım CBG aracılığıyla substrat işe hedefleyerek olmayan ATP rekabetçi inhibisyonusiklin pozitif düzenleyici alt birimi mevcut ve bu nedenle farklı ve site 10,11 ATP bağlama uzak olan. CBG esas siklin A, siklin D ve siklin E içinde bulunması, bir hidrofobik oyuk olup substratlar ve tümör baskılayıcı bulunan bir konsensüs sekansı tanımak için gösterilmiştir. Izole edilmiş bir peptit olarak, siklin bağlanma motifinin (MBP) CBG bağlanır ve hücre döngüsü CDK kinaz aktivitesini inhibe ettiği gösterilmiştir. MBP İlaçla için molekül ağırlığının arasında iyi bir denge gösteren bir pentapeptid için ayrıca kesik (HAKRRLIF, CDK2 / siklin A IC 50 0,07 ± 0,02 uM, CDK4 / siklin D IC50 0,88 ± 0,34 uM) bir oktapeptit ve optimize edilmiştir benzerlik ve gücü (RRLIF, CDK2 / siklin A IC 50 1.01 ± 0.17 uM, CDK4 / siklin D, IC50 25,12 ± 2,97 uM) 12,13. CBGs bir acidi tarafından köprülü büyük bir birincil ve ikincil küçük hidrofobik cebine oluşurc bölgesi (Glu220, Glu224 ve Asp283 içerir). HAKRRLIF anahtar bağlayıcı belirleyicileri asidik bölge ve primer lipofilik site Leu6 ve Phe8 tamamlayıcılık bir yüksek derecesi ile Lys3, Arg 4 ve Arg5 ikincil hidrofobik cep, iyon eşleştirme ve hidrojen bağları ile Ala2 etkileşimini içerir. Ile7 primer cebine en uygun temas sağlayan bir ara tortu olarak hareket Buna ek olarak, çok sayıda hidrojen bağları peptit omurgasından katkıda bulunmaktadır. Bağlanma modu ve CBG ile HAKRRLIF etkileşimleri, Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. MBP / CBG, protein-protein etkileşimi hedefleyen CDK2 / siklin A, CDK2 / siklin E ve CDK4 / siklin D kinaz aktivitesini inhibe eden ve normal hücreleri 7 etkilemeyen bu E2F1 kanser hücrelerinin apoptozu tetiklemesi. MBP türetilmiş peptitler hücre döngüsü CDK etkili inhibitörleri olan, ancak, bunların nedeniyle metabolik ilaç olarak faydalı olması muhtemel değildiristikrarsızlık ve hücre geçirgenliğini genel eksikliği. Bu amaçla, CDK2 / siklin üzerinden bir inhibisyon deregüle E2F1 istismar anti-tümör tedavilerin geliştirilmesi için daha fazla ilaç benzeri bileşikler içine bu güçlü peptidik inhibitörlerinin dönüştürmek için DEĞİŞTİR strateji uyguladık. Aşağıdaki protokol siklin oluğuna REPLACE uygulamasında tamamlanmıştır çalışmalarını özetlemektedir. İlk olarak, HAKRRLIF N-terminal tetrapeptid ilaç-benzeri başlık grubu değiştirmeleri tespit edilmiştir. Bundan başka, bu grupta gelişmeler DEĞİŞTİRME için ek bir doğrulama araştırıldı. Bu çalışmalardan elde edilen sonuçlar Örnek sunulmaktadır.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Computational Chemistry&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Accelyrs Discovery studio 3.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dell Optiplex Workstations</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Synthetic Organic Chemistry&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6&amp;nbsp;mm, 5&amp;nbsp;&amp;mu;m column (Phenomenox Luna) for purity determination, &lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;H NMR and &lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI).</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Flourescence Polarization Assay&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>384 micro well plates, Micro pipets</td><td>Grenier Bio-one</td><td>110256602</td><td></td></tr><tr><td>CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex)</td><td>BPS Bio Sciences</td><td>40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A)</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1&amp;nbsp;mM dithiothretiol (DTT))</td></tr><tr><td>25 nM HEPES</td><td>CALBIOCHEM</td><td>375368</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>127838</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>US Biological</td><td>N3500</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>-70 &amp;#176;C freezer</td><td>Revco (Ultima II)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DTX880 multimode detector fitted with 485&amp;nbsp;nm/535&amp;nbsp;nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein</td><td>Beckman Coulter, Brea, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Cell Culture&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>96 well plates</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP, MTT reagent</td><td>Fisher, Life technology, Alfa Aesar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heamocytometer</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>-70 &amp;#176;C freezer</td><td>Revco (Ultima II)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo electron corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerator 4-8 &amp;#176;C</td><td>Isotemp Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DTX880 multimode detector fitted with 595&amp;nbsp;nm filter</td><td>Beckman Coulter, Brea, CA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

development of inhibitors of protein-protein interactions through replace: application to the design and development non-atp competitive cdk inhibitors

Daha etkili protein-protein etkileşimleri (PPİ) hedef alınarak geliştirilmiş benzersiz bir strateji DEĞİŞTİRİN olduğunu. Bu potansiyel ilaç hedefleri çoğunluğunu temsil eden bu tür bağlayıcı siteler için inhibitörlerinin belirlenmesi ve hangi gelişmiş metodoloji sağlayarak mevcut ilaç hedef alanını genişletmeyi hedeflemektedir. Bu çalışmanın temel amacı, hesaplamalı ve sentetik kimya yaklaşımlarını içeren REPLACE strateji kullanımı ve uygulama metodolojik bakış sağlamaktır. Olmayan ATP rekabetçi sikline bağlı kinazlar (CDK) anti-tümör terapötik olarak inhibitörlerinin geliştirilmesi için uygulanması ile tarif edilmektedir değiştirin. CDKler sıklıkla kanser deregüle ve dolayısıyla ilaç gelişimi için önemli bir hedef olarak kabul edilir. S fazında CDK2 / siklin A inhibisyonu E2F1 yolu boyunca p53, bağımsız bir şekilde, kanser hücrelerinin seçici apoptosisi teşvik ettiği rapor edilmiştir. Siklin-bağlanma protein-protein etkileşimi hedefleyeng yiv (CBG) transkripsiyonel CDK&#39;lar fazla hücre döngüsünün spesifik önlenmesini sağlayacak bir yaklaşımdır. CBG CDK alt tabakalar ve tümör baskılayıcı proteinlerin türetilen bir uyuşum sekansı tarafından tanınan motifi (MBP) bağlanma siklin olarak adlandırılan. MBP önce ayrıca yeterli aktiviteyi (RRLIF) koruyarak bir pentapeptid kesiliyor sonra p21Waf (HAKRRIF) ve bir oktapeptidin için optimize edilmiştir. Geçirgen hücre değil, genel olarak peptitler, metabolik kararsız ve dolayısıyla strateji DEĞİŞTİR (Hesaplamalı Zenginleştirme aracılığıyla Kısmi Ligand Alternatifleri ile yedek) Daha fazla ilaç gibi inhibitörleri üretmek amacıyla uygulanmaktadır vardır. Strateji seçici hücre döngüsü CDK / siklin kompleksleri inhibe Fragment bağlandı inhibitör peptidler (çevirme) tasarımıyla başlar. Döndürür, tekrarlı N-ucuna (Ncaps) başlanarak küçük moleküller (başlık oluşturma grupları ile) gibi fragmanı ile HAKRRLIF / RRLIF kalıntılarını değiştirerek oluşturulan ilgili değiştirilmesi yoluyla elde edildiC-terminali. Bu bileşikler, anti-tümör terapötik olmayan ATP rekabetçi CDK inhibitörleri üretimi için başlangıç ​​noktası vardır.

Siklin yivli HAKRRLIF etkileşimleri, Şekil 2 de gösterilmiştir. Temel bağlama determinantları olarak temsil peptit tortuları başka kalıntılar küçük katkılar 12,13,18 sağlayan Ala2, ARG4, Leu6 ve Phe8 bulunmaktadır. Bu vaka çalışmasında DEĞİŞTİRİN strateji öncelikle Ala2 ve ARG4 etkileşimlerini taklit HAKRRLIF N-terminal tetrapeptidde kalıntılar için fragman alternatifler bulmak amacıyla kullanılmıştır. Potansiyel UKEP parçalarının (Tablo 1)</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors at JoV

Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

Aracılığıyla DEĞİŞTİR Protein-protein etkileşimleri İnhibitörlerinin Geliştirilmesi: Tasarım ve Geliştirme Olmayan ATP Rekabetçi CDK inhibitörleri Uygulama

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by ...

development-inhibitors-protein-protein-interactions-through-replace

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K Görüntüleme.  University of South Carolina. We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

Video: Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Biyokimya

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

Kimliği roman CK2 kinaz yüzeylerde çok yönlü bir biyokimyasal yaklaşım kullanarak

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

Kendi kendine monte Edilen İnsan Protein Mikrodizilerinde Kiaz Inhibitörü Taraması

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines

Targeted protein degradation compounds, including molecular glues or proteolysis targeting chimeras, are an exciting new therapeutic modality in small molecule drug discovery. This class of compounds induces protein degradation by bringing into proximity the target protein and the E3 ligase machinery proteins required to ubiquitinate and ultimately degrade the target protein through the ubiquitin-proteasomal pathway (UPP). Profiling of target protein degradation in a high-throughput fashion, however, remains highly challenging given the complexity of cellular pathways required to achieve degradation. Here we present a protocol and screening strategy based on the use of CRISPR/Cas9 endogenous tagging of target proteins with the 11 amino acid HiBiT tag which complements with high affinity to the LgBiT protein, to produce a luminescent protein. These CRISPR targeted cell lines with endogenous tags can be used to measure compound induced degradation in either real-time, kinetic live cell or endpoint lytic modes by monitoring luminescent signal using a luminescent plate-based reader. Here we outline the recommended screening protocols for the different formats, and&#160;also describe the calculation of key degradation parameters of rate, Dmax, DC50, Dmax50, as well as multiplexing with cell viability assays. These approaches enable rapid discovery and triaging of early stage compounds while maintaining endogenous expression and regulation of target proteins in relevant cellular backgrounds, allowing for efficient optimization of lead therapeutic compounds.

This protocol describes the quantitative luminescent detection of protein degradation kinetics in living cells that have been engineered using CRISPR/Cas9 to express antibody free endogenous protein detection tag fused to a target protein. Detailed instructions for calculating and obtaining quantitative degradation parameters, rate, Dmax, DC50, and Dmax50 are included.

HiBiT CRISPR Hücre Hatları Kullanılarak Hedeflenen Protein Bozunma Bileşiklerinin Yüksek Verimli Hücresel Profillemesi

Targeted protein degradation compounds, including molecular glues or proteolysis targeting chimeras, are an exciting new therapeutic modality in small ...

Kanser Araştırmaları

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies have been proposed and implemented for the identification of new mediators of TCR signaling, which would improve the understanding of T-cell processes, including activation and thymic selection. We describe a screening assay that enables the identification of molecules that influence TCR signaling based on the activation of developing thymocytes. Strong TCR signals cause developing thymocytes to activate apoptotic machinery in a process known as negative selection. Through the application of kinase inhibitors, those with targets that affect TCR signaling are able to override the process of negative selection. The method detailed in this paper can be used to identify inhibitors of canonical kinases with established roles in the TCR signaling pathways and also inhibitors of new kinases yet to be established in the TCR signaling pathways. The screening strategy here can be applied to screens of higher throughput for the identification of novel druggable targets in TCR signaling.

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

This paper uses a flow-cytometry-based assay to screen libraries of chemical inhibitors for the identification of inhibitors and their targets that influence T-cell receptor signaling. The methods described here can also be expanded for high-throughput screenings.

T-hücre reseptör üzerinden tarama kimyasal inhibitörü kütüphanelerin sinyal arabulucu tanımlaması

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific properties, such as binding affinity, agonist or antagonist behavior, or stability, relative to the native sequence. Protein design lies at the center of current advances drug design and discovery. Not only does protein design provide predictions for potentially useful drug targets, but it also enhances our understanding of the protein folding process and protein-protein interactions. Experimental methods such as directed evolution have shown success in protein design. However, such methods are restricted by the limited sequence space that can be searched tractably. In contrast, computational design strategies allow for the screening of a much larger set of sequences covering a wide variety of properties and functionality. We have developed a range of computational de novo protein design methods capable of tackling several important areas of protein design. These include the design of monomeric proteins for increased stability and complexes for increased binding affinity.
To disseminate these methods for broader use we present Protein WISDOM (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>), a tool that provides automated methods for a variety of protein design problems. Structural templates are submitted to initialize the design process. The first stage of design is an optimization sequence selection stage that aims at improving stability through minimization of potential energy in the sequence space. Selected sequences are then run through a fold specificity stage and a binding affinity stage. A rank-ordered list of the sequences for each step of the process, along with relevant designed structures, provides the user with a comprehensive quantitative assessment of the design. Here we provide the details of each design method, as well as several notable experimental successes attained through the use of the methods.

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

We developed computational de novo protein design methods capable of tackling several important areas of protein design. To disseminate these methods we present Protein WISDOM, an online tool for protein design (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>). Starting from a structural template, design of monomeric proteins for increased stability and complexes for increased binding affinity can be performed.

Protein AKIL: A Tezgahı<em&gt; Siliko olarak</em&gt;<em&gt; De novo</emBiyomoleküllerin&gt; Tasarım

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Biyoloji

A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the potential of targeting the kinase in cancers by effectively treating the CML patients. This observation revolutionized drug development to target the oncogenic kinases implicated in various other malignancies, such as, EGFR, B-RAF, KIT and PDGFRs. However, one major drawback of anti-kinase therapies is the emergence of drug resistance mutations rendering the target to have reduced or lost affinity for the drug. Understanding the mechanisms employed by resistant variants not only helps in developing the next generation inhibitors but also gives impetus to clinical management using personalized medicine. We reported a retroviral vector based screening strategy to identify the spectrum of resistance conferring mutations in BCR/ABL, which has helped in developing the next generation BCR/ABL inhibitors. Using Ruxolitinib and JAK2 as a drug target pair, here we describe in vitro screening methods that utilizes the mouse BAF3 cells expressing the random mutation library of JAK2 kinase.

Emergence of genetic resistance against kinase inhibitor therapy poses significant challenge for effective cancer therapy. Identification and characterization of resistant mutations against a newly developed drug helps in better clinical management and next generation drug design. Here, we describe our protocol for in vitro screening and validation of resistant mutations.

Kinaz İnhibitörleri Karşı Dayanıklı Mutasyonlarının Tarama ve Doğrulama için Bir Yöntem

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Developing and Testing Methylated Nano-Structured Dipeptides that Inhibit Src Kinase Activity In Vitro for Anti-Cancer Applications

Here, with the aim of developing a novel anti-cancer treatment, seven dipeptides were designed that contained methylated tryptophan and/or methylated arginine and were produced using Fmoc solid-phase peptide synthesis. Overexpression of the Src tyrosine kinase enzyme has been implicated in the development of different cancers. Dipeptides containing unnatural amino acids such as methylated arginine (RCH3), dimethylated arginine (R(CH3)2), and/or methylated tryptophan (WCH3) residues have earlier been shown to inhibit Src kinase. In this study, three such dipeptides, W-RCH3, WCH3-RCH3, and W-R(CH3)2, were tested using acellular assays and were found to have IC50 values (the concentration at which 50% inhibition occurs) of 510 nM, 916 nM, and 1 &#181;M, respectively. These values were comparable to those obtained for cyclic penta- to nano-W-R peptides ([W-R]5-[W-R]9) synthesized in previous studies. However, the unmethylated versions of the dipeptides did not show any inhibitory activity against Src kinase. All of these dipeptides (50 &#181;M) did not show any cytotoxicity after incubation up to 72 h with three different cancer cell lines, including leukemia (CCRF-CEM), breast adenocarcinoma (MDA-MB-231), and ovarian adenocarcinoma (SK-OV-3) cell lines, indicating the limited permeability of the peptides through the cell membrane. Therefore, further study is needed to improve the permeability of these peptides for anticancer applications, such as by using a peptide carrier or additional peptide functionalization. In summary, this study provides a protocol to synthesize and test peptides that inhibit Src kinase activity, and thus possess promising anticancer ability, as demonstrated using acellular and cellular assays.

Developing and Testing Methylated Nano-Structured Dipeptides that Inhibit Src Kinase Activity In Vitro for Anti-Cancer Applications

Presented here is a protocol for designing and testing dipeptides that can inhibit Src kinase enzyme activity using acellular and cellular assays for anti-cancer applications. The peptides formulated here (W-RCH3, WCH3-RCH3, and W-R(CH3)2)&#160;inhibited Src kinase with IC50 values of 510 nM, 916 nM, and 1 &#181;M, respectively.

Here, with the aim of developing a novel anti-cancer treatment, seven dipeptides were designed that contained methylated tryptophan and/or methylated ...

Aracılığıyla DEĞİŞTİR Protein-protein etkileşimleri İnhibitörlerinin Geliştirilmesi: Tasarım ve Geliştirme Olmayan ATP Rekabetçi CDK inhibitörleri Uygulama

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Kimliği roman CK2 kinaz yüzeylerde çok yönlü bir biyokimyasal yaklaşım kullanarak

Kendi kendine monte Edilen İnsan Protein Mikrodizilerinde Kiaz Inhibitörü Taraması

HiBiT CRISPR Hücre Hatları Kullanılarak Hedeflenen Protein Bozunma Bileşiklerinin Yüksek Verimli Hücresel Profillemesi

T-hücre reseptör üzerinden tarama kimyasal inhibitörü kütüphanelerin sinyal arabulucu tanımlaması

Protein AKIL: A Tezgahı

Kinaz İnhibitörleri Karşı Dayanıklı Mutasyonlarının Tarama ve Doğrulama için Bir Yöntem

Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik

Developing and Testing Methylated Nano-Structured Dipeptides that Inhibit Src Kinase Activity In Vitro for Anti-Cancer Applications

CDK Aktivitesinin İnhibisyonu