Name: development of inhibitors of protein-protein interactions through replace: application to the design and development non-atp competitive cdk inhibitors
Uploaded: 2015-10-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
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We thank Dr&#8217;s. Douglas Pittman and Michael Wyatt for their assistance with cell culture and Dr Wyatt and Ms. Erin Anderson for help in development of the binding assays. We acknowledge Mike Walla and Bill Cotham in the Department of Chemistry and Biochemistry at the University of South Carolina for assistance with Mass Spectrometry, Helga Cohen and Dr. Perry Pellechia for NMR spectrometry. This work was funded by the National Institutes of Health through the research project grant, 5R01CA131368.

1. Computational Identifizierung potenzieller Kleinmolekül Verkappungsgruppen Hinweis: Im Prinzip kann eine Vielzahl von Docken oder Pharmakophor Suchverfahren verwendet werden, um potentielle Verkappungsgruppen vorherzusagen. Der Hauptzweck der theoretischen Studien in REPLACE ist es, kleine Moleküle, die die Eigenschaften und Wechselwirkungen der Aminosäuren, die substituiert sind, behalten zu identifizieren. <ol><li> Validierung des LigandFit Docking-Protokoll 14 </li></ol> Hinweis: In früheren Studien, die Docking-Verfahren (LigandFit 15, ein Modul in der Molecular Modelling-Programm-Suite, Entdeckung Studio 3.0) wurde überprüft, um sicherzustellen, dass dieser Algorithmus ist ausreichend, um die Bindungsarten bekannt Ncaps zu reproduzieren und zu zeigen, dass die Ergebnisse für die erhaltenen unbekannte Verbindungen sind vorausschauende 14. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Mit den folgenden Schritten (1,2 bis 1,5), zu identifizieren optimalen Parameter für LigandFit wie folgt: PLP1 enEnergiegitter für Pose Generation, Minimierung der erzeugten Posen und der PLP1-Bewertungsfunktion für die Analyse von Posen. </li><li> Um die erhaltenen Konformationen zu beschränken und Liganden in geeigneter Weise zur Bildung einer kovalenten Bindung in dem verkappten Peptid Position befindet, die Indol-Stickstoff und Amid-Stickstoffatome von Trp217 und Gln254 jeweils als Wechselwirkung Filter für Wasserstoffbrückenbindung. </li><li> Design und Dock eine Bibliothek von Fragment Alternativen in die CDK2 / Cyclin A-Rezeptor (2UUE). Priorisieren Potenzial Capping-Gruppen zur Synthese und kommerzielle Sourcing auf Basis von Scoring-PLP1, Interaktionen mit Interaktionsfilter und Komplementarität mit der CBG. Die verschiedenen Schritte für LigandFit Docking erforderlich sind wie folgt. </li></ol><ol start="2"><li> Herstellung der Rezeptorbindungsstelle 14 <ol><li> Importieren Sie die CDK2 / Cyclin eine Kristallstruktur (PDB ID: 2UUE) in eine Visualisierungsfenster in der Software. Diese Struktur enthält die zuvor identifizierten FLIP 5-methyl-1-phenyl-1H-1, 2,4-triazol-3-carboxamido (3,5-DCPT) RLIF den Cyclin Nut gebunden (Figur 3). </li><li> Löschen oder halten Sie an Ort und Stelle die Reste RLIF (C-Terminus). Wenn die Peptidsequenz beibehalten wird, verwenden die N-terminale Aminogruppe des Peptids als Interaktionsfilter für den Liganden. Von den &quot;Rezeptor-Ligand-Interaktionen&quot; Werkzeuge, erstellen Sie eine Kugel um den N-Kappe 3,5-DCPT von Show / site ausblenden Kugel. Die Kugel wird erstellt, um den aktiven Bereich in der Bindungsstelle in dem die Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen dürfen während der Bindung auftreten definieren. </li><li> Definieren Sie die Bindungsstelle weiter von der &quot;zu finden Website als Volumen von ausgewählten Liganden&quot;, und löschen Sie den Liganden 3,5-DCPT aus dem Protein. Führen Sie diesen Schritt, um die Lautstärke der Bindung innerhalb der Sphäre geschaffen definieren. </li><li> Eingestellt Indolstickstoff und Amid-Stickstoffatome der Reste Trp217 und Gln254 als Interaktionsfilter zur Wasserstoffbrückenbindung. Stellen Sie die Interaktion Filter, so dass nur die Posen, die interact mit den Atomen des Satzes Rückstände während des Docking-Prozess daher die Erhaltung wichtigen Wechselwirkungen in den angedockten Posen gefiltert werden. </li></ol></li><li> Herstellung von Liganden 14 <ol><li> Design eine Bibliothek von 100 Potential Verkappungsgruppen anhand von Kriterien, einschließlich Molekulargewicht von weniger als 500, das Vorhandensein einer Carboxylatgruppe zur Ligation mit dem trunkierten Peptids und Aufnahme geeigneter hydrophober Gruppen (substituierte Phenylgruppe) Van der Waals-Wechselwirkung im Sekundärfach als in Tabelle 1 gezeigt. </li><li> Wählen heterocyclische Ringe zum Nachahmen Peptid Wasserstoffbindungswechsel mit Trp217 und Substituenten enthalten zum Ersetzen Ionenpaar-Wechselwirkungen zwischen basischen Seitenketten des HAKRRLIF. Dock und die Liganden als jeweilige Aldehydmolekülen so daß der Carbonylsauerstoff mit dem Amid-Stickstoffatom Gln254 ähnlichen Peptid-Rückgrat in der Stammpeptids (Tabelle 1) zu interagieren. </li><li> Vor docKönig, zu minimieren, entwickelt Liganden auf einen niedrigen Energie Konformation und bereiten in geeigneter Ionisationszustand mit der &quot;Prepare-Liganden&quot; Protokoll. Zu ziehen und in die Software importiert exportieren diese potenziellen N-Kappen in der SDF-Datei-Format in ChemDraw für ein Spreadsheet vor. Hinweis: Bereiten Liganden-Protokoll wird verwendet, um alle Liganden zu minimieren, um auf den niedrigsten Energiezustände angedockt werden und die Ionisation Kosten wurden den geltenden Atomen angewandt. Default-Parameter für diesen Schritt verwendet. </li></ol></li><li> Docking der Liganden in die Cyclin A Groove 14 <ol><li> Wählen Sie das LigandFit Routine von Rezeptor-Ligand-Interaktionen Protokollsatz der Software. Verwenden Sie den Rezeptor und die vorbereiteten Liganden als Eingabe für dieses Protokoll. </li><li> Für diese Läufe wählen PLP1 als Energienetz, stellt fest, dass Energie minimiert werden, und dass die Anzahl der erzeugten Posen als 10. Lassen Sie alle anderen Parameter auf die Standardwerte. Hinweis: LigandFit isteine Docking-Verfahren, das mit der aktiven Stelle eines Proteins unter Verwendung einer Form basiert Vergleichsfilter, die mit einer Monte Carlo Konformationssuche Algorithmus kombiniert wird, zu erkennen und erzeugen kann Posen des hohen Grad an Komplementarität und potentielle Affinität. Das Energienetz von der Docking-Programm verwendet wird, ist das Kraftfeld zur Erzeugung von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen und mögliche Posen. PLP1 stückweise linear Potential der spezifisch priorisiert Wasserstoffbindungswechsel und wobei die PLP Atomtyp wird für jeden Nicht-Wasserstoffligandenatom oder Nicht-Wasserstoff-Rezeptor Atom zugewiesen. </li></ol></li><li> Analyse der Ergebnisse <ol><li> In der ersten Instanz, stellt Anzeige im Visualizer Programm und dann sortieren nach absteigenden Werten der PLP1-Score. Verwenden Bewertungsfunktionen wie PLP1 abzuschätzen die Bindungsaffinität eines verankerten Liganden, der einen Ligandenkandidaten darstellen Geometrie und nicht-kovalente Wechselwirkung mit der Zielrezeptorstruktur. Hinweis: Hier wird das PLP1 Bewertungsfunktion zu g gefunden wurdeive die besten Ergebnisse, da es eine Abschätzung der Wasserstoffbrückenbindungen enthält. </li><li> Analysieren Sie visuell den oberen 25% der erzielte Posen für 1) superimposability mit dem bekannten Capping-Gruppe (mit einer relativen mittlere quadratische Abweichung (RMSD) Wert von weniger als 2 a), 2) erfüllt Interaktion Filter und 3) visuelle Komplementarität mit dem Cyclin Nut . Es wird angenommen, daß ein korrekt angedockt darstellen (im Vergleich zu einem experimentellen Aufbau) eine RMSD-Wert von &lt;2 A. </li><li> Untersuchen Posen für visuelle Komplementarität, die als mit effizienten Füllung der Bindungstasche in einer Weise, die mit bekannten Struktur-Wirkungsbeziehungen ist definiert ist. Interaktion Filter sind so eingestellt, Atom Beschränkungen, die intermolekularen Kontakte bekannt kritisch für die Bindung und / oder sind erforderlich, um das Potenzial Capping-Gruppe in die richtige Geometrie für Amidbindungsbildung positionieren zu sein erfordern. Drei Beispiele für angedockt Posen der potentielle N-Verkappungsgruppen machen Wasserstoffbrücken mit Zusan Filter werden in 4 gezeigt. </li></ol></li></ol> 2. Synthese und Charakterisierung von potentiellen N -capping Gruppen <ol start="1"><li> Synthese von N-Verkappungsgruppen. </li><li> Für die Synthese, verwenden alle kommerziellen Ausgangsmaterialien, Lösungsmittel und Reagenzien, wie erhalten. Synthetisieren potentielle N-Verkappungsgruppen mit herkömmlichen organischen Synthesechemie (Figur 5 12,13 für ein Beispiel). </li><li> Zuführen Dünnschichtchromatographie (TLC) auf Kieselgel zum Überwachen Reaktionen. <ol><li> Löse das Ausgangsmaterial und die Reaktionsmischung (1 mg) in der mobilen Phase und vor Ort sie auf der DC-Platte unter Verwendung von Kapillaren. </li><li> Legen Sie die DC-Platte in der Kammer enthält, mobile Phase (Ethylacetat und Hexan in einem 35:65 Verhältnis). Sobald die mobile Phase 90% der DC-Platte erreicht, zu entfernen und an der Luft trocknen Sie die Platte. </li><li> Verwenden Sie UV-Licht auf das Ausgangsmaterial und Reaktionsmischungen als sichtbare Flecken zu erkennen. Calculate die R f aller Punkte (Verhältnis der Entfernung von der Stelle und der mobilen Phase gereist). Anmerkung: Die Reaktion ist beendet, wenn kein Punkt an der R f des Ausgangsmaterials gesehen. </li></ol></li><li> Nach der Vollendung der Reaktion Aufarbeitung des Reaktionsgemisches, indem in einem Scheidetrichter und Waschen mit wässrigen Säure- oder Basenlösung entsprechend. Sammeln des organischen Lösungsmittels verdampft es in einem Rotationsverdampfer und Trocknen des Rohproduktes im Vakuum erhalten. </li><li> Man löst 500 mg Rohprodukt in 3-5 ml geeigneten Lösungsmittel, und fügen Sie zu einer 1 g Kieselsäure oder RP18 Samplet und unter Luft trocknen. Legen Sie die Samplet enthält das rohe Produkt in den Silica / RP SNAP Flash-Kartuschen und das rohe Material mit automatisierten Hochleistungs Flash-Chromatographie (nach Herstellerprotokoll) unter Verwendung eines SNAP 100 g Säule mit einem Gradienten Lauf ausgehend von 6% Ethylacetat: 94 % Hexan bis 50% Ethylacetat und 50% Hexan als15 Säulenvolumina. </li><li> Trocknen des gereinigten Produkts mit einem Rotationsverdampfer in einem Lösungsmittel aus dem Flash-Chromatographie gesammelten durch Verdampfen das gesamte Lösungsmittel zur Trockene und das Produkt weiter unter Vakuum getrocknet, um alle Restlösungsmittel zu entfernen. Zuführen Charakterisierung des gereinigten Produkts durch NMR, MS und analytische HPLC. <ol><li> 1 H-NMR und 13 C-NMR, ein Gewicht von etwa 10 mg des gereinigten Probe, löst ihn in einer entsprechenden deuterierten Lösungsmittel und der Inhalt in einem trockenen NMR-Röhrchen für die Aufnahme der NMR-Spektren 2,14. </li><li> Notieren Sie die 1 H-NMR und 13 C-NMR-Spektren mit hoher Feld NMR-Spektrometer (mindestens 300 MHz). Erwerben Massenspektren mit einer QTOF (Tandem Vierfach-1-Flugzeit-Massenspektrometer), Elektrospray-Ionisation (ESI) oder einem VG-70S (Doppelfokus-Magnetsektor-Massenspektrometer, EI) 2,14. </li><li> Analyse der Reinheit der Produkte durch HPLC mit Diodenarray-Detektor und ausgestattet mitein C18 (2) 100 A, 250 × 4,6 mm, 5 &amp; mgr; m-Säule für die Analyse. Verwenden Sie einen Farbverlauf Lauf ausgehend von 100% Wasser (0,1% Trifluoressigsäure) auf 60% Acetonitril (0,1% Trifluoressigsäure) über 30 Minuten und halten Sie den Farbverlauf für 4 min. Extrahieren Sie die Chromatogramme bei 226 und 254 nm 2,14. Anmerkung: Analytical Reinheiten ausgewertet Verbindungen waren&gt; 95%. </li></ol></li></ol> 3. Festphasensynthese zur Erzeugung von FLIPs 2 <ol start="1"><li> Synthese von N-capped FLIPs <ol><li> Montieren N bedeckten Peptidverbindungen durch Standard-Festphasen-Syntheseverfahren mit den folgenden Schritten. <ol><li> Aktivieren 5 Äquivalente der C-terminalen Aminosäure (Fmoc-Phe) in 4,4 Äquivalenten O -Benzotriazole- N, N, N &#39;, N&#39; N&#39;-tetramethyluroniumhexafluorphosphat-Hexafluor-phosphat (HBTU, 221.93 mg) in 2 ml DMF für 5 min. Laden Sie die Fmoc-Phe HBTU Mischung auf die Rink-Harz mit 6 Äquivalenten Diisopropylethylamin (DIPEA, 103,13mg) für 1 h bei RT. </li><li> Entfernen der Fmoc-Schutzgruppe von der C-terminalen Rest mit 20% Piperidin in 3 ml DMF für 10 min. Paar nachfolgenden Aminosäuren (beispielsweise Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Arg-PMC) Schritt für Schritt. Bei jedem Schritt Paar 5 Äquiv der nächsten Aminosäure mit 6 Äquivalenten DIPEA (103,13 mg) und 4.4 Äquivalenten HBTU (221.93 mg) in 2 ml DMF 1 Stunde bei RT. </li><li> Gelten Waschzyklen (5 x 10 ml DMF + 5 x 10 ml DCM) Nach der oben beschriebenen Aminosäure-Kupplung und Fmoc Entschützungsschritte. Nach der Peptidanordnung Paar N-Verkappungsgruppen mit 6 Äquivalenten DIPEA (103,13 mg) und 4.4 Äquivalenten HBTU (221.93 mg) in 2 ml DMF 1 Stunde bei RT. </li><li> Nach Abschluss der Peptidsynthese, Behandlung des Reaktionsgemisches mit 2 ml der Abspaltungsmischung (90: 5: 5 TFA / H 2 O / TIPS) O / N Seitenkettenschutzgruppen zu entfernen, und spalten Flips von dem Harz. Verreiben des resultierenden Produkts mit kaltem Diethylether ausgefällt und if erforderlichen Konzentrat in einem Rotationsverdampfer. </li></ol></li></ol></li><li> Synthese von N-capped-C bedeckten FLIPs <ol><li> Wiegen und lösen Sie die N-terminal verschlossen und geschützt Arg-Leu-Peptid (16,1 mg, 0,02 mmol) in Dichlormethan, und fügen Sie [4- (3-Chlorphenoxy) pyridin-2-yl] methan (C-Cap) zusammen mit O - Benzotriazol-N, N, N &#39;, N&#39; N&#39;-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU; 16,7 mg, 0,02 mmol) und N, N-Diisopropylethylamin (DIPEA, 6,5 mg, 0,02 mmol). </li><li> Rühren und Überwachung der Reaktion bei RT, bis die TLC / HPLC zeigt den vollständigen Verbrauch des Ausgangsmaterials. Nach der Beendigung der Reaktion konzentriert man das rohe Reaktionsgemisch mit einem Rotationsverdampfer und dann zwischen Ethylacetat und Wasser. </li><li> Trenne die wässrige und organische Schicht; die organische Phase wird mit 1 N NaOH, 1 N HCl und Kochsalzlösung. Trocknen der organischen Schicht mit etwa 1 g Natriumsulfat und konzentriert, um ein Produkt in einem Rotationsverdampfer. Finally Das Produkt O / N mit dem Spaltungsgemisch (95: 2,5: 2,5 Trifluoressigsäure / H 2 O / TIPS) zur Entfernung der Schutzgruppe. </li><li> Verreiben des resultierenden Produkts mit kaltem Diethylether und gegebenenfalls Konzentrat in Rotationsverdampfer zur Trockene, um das gesamte Lösungsmittel zu entfernen abzuschließen. Das Produkt weiter zu trocknen unter Vakuum, um alle Restlösemittel zu entfernen. </li></ol></li><li> Reinigung und Charakterisierung von FLIPs <ol><li> Reinige rohe FLIPs mit halb präparative Umkehrphasen-HPLC-Verfahren. Lyophilisieren die gereinigten Flips und charakterisieren ihre Molekülmasse unter Verwendung von Massenspektrometrie 2,14. </li><li> Bestimmung der analytischen Reinheit der FLIPs durch HPLC mit einem Diodenarray-Detektor und mit einem C18 (2) 100 A ausgestattet ist, 250 x 4,6 mm, 5 &amp; mgr; m-Säule. Verwenden ein Gradientenverfahren hend von 95% H 2 O (0,1% Trifluoressigsäure) / 5% Acetonitril (0,1% Trifluoressigsäure) auf 35% H 2 O (0,1% Trifluoressigsäure) / 65% Acetonitril (0,1% trifluoroacetic Säure) über 30 Minuten und halten Sie den Farbverlauf für 4 min. Extract Chromatogramme bei 226 und 254 nm. </li></ol></li></ol> 4. Fluoreszenzpolarisation Binding Assay zur Bestimmung der kompetitiven Bindung 2,14 <ol start="1"><li> Führen Sie den Test in schwarzen 384-Loch (138 ul) Platten mit dem folgenden Verfahren. </li><li> Verdünnen der Proben Tracer Peptide (4 nM) und Kinasekomplexe (CDK2 / Cyclin-A - 18 &amp; mgr; g / ml, CDK4 / Cyclin D - 37 ug / ml) zur erforderlichen Konzentrationen in Testpuffer (25 mM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0,01% Nonidet P-40, 1 mM Dithiothreitol (DTT). </li><li> Zu jeder Vertiefung der 384-Well-Platte, hinzuzufügen: 5 ul CDK4D1 oder CDK2CA (0,3 ug / Vertiefung gereinigten rekombinanten humanen Kinase-Komplex), 5 ul Verbindungslösung, 5 ul 30 nM Tracer-Peptid (Fluoresceinyl-Ahx-Pro-Val -Lys-Arg-Arg-Leu- (3ClPhe) -Gly oder Fluoresceinyl-Ahx-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Leu-Phe-Gly-Tracer-Peptid). Verwenden 5 ul jeder DMSO (6%), buffer, Tracer und 5 ul DMSO (6%), Kinase-Komplex, Tracer als Kontrollvertiefungen </li><li> Nach der Zugabe der alle Komponenten, zentrifugieren Sie die Platte bei 500 UpM für 1 Minute (41,16 · g) bei RT und dann inkubieren Sie die Platte unter Rühren für 45 min bei RT. Mit Hilfe eines Multimode-Plattenlesegerät und Detektor mit 485 nm / 535 nm Anregungs- / Emissionsfilter und einem dichroitischen Spiegel ausgestattet lesen Sie die Fluorescein Intensität jeder Vertiefung in der Platte. </li><li> Berechnung der relativen mittleren Polarisation (mp) für alle Testproben unter Verwendung der unten stehenden Gleichung zeigt. Bestimmen Sie IC 50 -Werte durch logarithmische Regression durch Korrelation gegen mps und Testkonzentrationen. </li></ol><img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/52441/52441eq1.jpg" />

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Targeting protein-protein interactions (PPI) in drug discovery is highly challenging as these typically involve a large shallow contact interface comprised of numerous and diffuse contacts19. Furthermore, peptidic compounds which inhibit PPI&#8217;s that are amenable to drug discovery are problematic due to their higher molecular mass, metabolic instability and poor bioavailability20. Current strategies that have been applied for the development of PPI inhibitors include design of proteomimetics and...

In diesem Artikel wird eine Fallstudie über die Anwendung des REPLACE (Replacement mit Teilliganden Alternativen mit Rechen Anreicherung) Strategie, peptidische Inhibitoren der Protein-Protein-Interaktionen in mehreren pharmazeutisch relevanter Moleküle umzuwandeln beschrieben 1-3. Während EPI stellen eine reiche, aber wenig genutzt Quelle potentieller Wirkstoff-Targets werden bestehende Methoden weitgehend unzureichenden diese allgemein zugänglich zu machen. Aktuelle Strategien einschließlich Fragment basierte Entwurf 4, Hochdurchsatzscreening 5 und 6 geheftet Peptide haben Fortschritte vorgesehen, aber diese sind in vielen Fällen unwirksam. Als Ergebnis werden mehr Fortschritte und effizienter Ansätze erforderlich. REPLACE ist vollständig in der Entwicklung von Kinase-Inhibitoren, die arzneimittelähnliche verbesserte Eigenschaften haben und Entwicklungspotential als Antitumortherapeutika validiert. Diese Strategie ist in der Entwicklung von nicht-ATP Inhibitoren der Zell exemplifiziertZyklus CDKs und umfasst: 1) Erhalten von 3D Strukturinformationen über die Wechselwirkungen HAKRRLIF / RRLIF mit Cyclin-Bindungsfurche; 2) Bestimmung der wichtigsten Bindungsdeterminanten für Peptid-Wechselwirkung; 3) Verkürzung des Peptids N-Terminus enthält, eine oder mehrere Bindungsfaktoren; 4) rechnerische Ermittlung potentieller kleines Molekül Alternativen (partielle Ligand Alternativen PLAs) für den kegelstumpfförmigen Teil des Peptids und dem Bindung wichtiger Wechselwirkungen des Stammpeptids; 5) Synthese oder gewerblichen Beschaffung von PLAs vorausgesagt, um eifrig mit dem Unter Website zuvor von der gelöscht Peptidrest (n) besetzt binden; 6) Synthese von blättert durch Ligation der besten PLAs, um das verkürzte Peptid unter Verwendung der Festphasensynthese; 7) Test des FLIPs in einem In-vitro-Bindung oder funktionelle Assays (Fluoreszenzpolarisation in der CDK / Cyclin-Kontext), gefolgt von weiteren Charakterisierung in einem Zelllebensfähigkeitstest. Eine schematische Darstellung strateg REPLACEy ist in Figur 1 dargestellt ist. In diesem Artikel werden die Iterationen des REPLACE-Strategie diskutiert und die Anwendung auf CDK2 / Cyclin A im Detail beschrieben. CDKs wird angenommen, dass in der Mehrzahl der Tumoren direkt oder indirekt dereguliert werden und sind daher geeignete Krebs-Medikament Ziele 7 betrachtet. CDKs erfordern Zusammenarbeit mit Cycline für die vollständige Aktivierung und anschließend phosphoryliert Schlüsselproteine ​​in der Zellzyklusregulation 8 beteiligt. Die zwei Hauptgruppen von CDKs sind die Isotypen, die Zellzyklus-Checkpoints kontrollieren [G1 / S (CDK4 / Cyclin D, CDK6 / Cyclin D und CDK4 / Cyclin E), S-Phase (CDK2 / Cyclin A) und G2 / M (CDK1 / Cyclin B)], und die Aufsichtsbehörden der RNA-Polymerase durch Phosphorylierung (CDK7 / Cyclin H, CDK8 / Cyclin C, CDK9 / Cyclin-T). Ein Schlüsselschritt in der S-Phase auftritt, wenn der Fort E2F1 Transkriptionsfaktor einen Komplex mit dem DP-Protein, das eine Bindung mit DNA und initiiert Gentranskription bildet. CDK2 / Cyclin A erforderlich ist, um E2F1 Transkriptions neutralisierenAktivität durch Phosphorylierung wodurch die zu der E2F1-DP-Komplex und dessen nachfolgenden Abbau freigeben. Die Hemmung von CDK2 / Cyclin A wird angenommen, dass E2F1 in seiner DNA-gebundenen Zustand anhaltender Aktivierung führt zu halten. Die sich ergebende Niveau von E2F-1-Aktivität wird die erforderlich ist, um p53 unabhängige Apoptose zu induzieren, damit was auf eine therapeutische Strategie Schwelle zu übertreffen. Aufgrund dereguliert p53 und pRb Wegen hohe E2F-1 häufig in Krebszellen und Inhibierung von CDK2 / Cyclin A auftreten sollten, um eine selektive Apoptose in Tumoren führen und kann als validiert Krebs-Target 7 betrachtet werden. Klinisch untersucht CDK-Inhibitoren zielen auf den hoch konservierten ATP-Bindungsstelle, die zu Reaktivität unter den mehr als 500 Proteinkinasen im menschlichen Kinoms überqueren und möglicherweise, die zu Wirkungen und Toxizität 9 Seite. Ein alternativer Ansatz ist nicht-ATP-kompetitive Hemmung durch gezielte Substrat Rekrutierung durch die CBGauf Cyclin positive regulatorische Untereinheit vorhanden ist und die daher unterschiedliche und weit entfernt von ATP-Bindungsstelle 10,11 ist. Das CBG ist hauptsächlich eine hydrophobe Rille in Cyclin A, Cyclin D und Cyclin E vorhanden und es wurde gezeigt, um eine Konsensus-Sequenz in Substraten und Tumorsuppressoren gefunden erkennen. Als ein isoliertes Peptid, das Cyclin-Bindungsmotiv (CBM) bindet an das CBG und wurde gezeigt, dass die Kinaseaktivität der Zellzyklus-CDKs inhibieren. Das CBM wurde Octapeptids optimiert (HAKRRLIF, CDK2 / Cyclin A IC 50 0,07 ± 0,02 uM, CDK4 / Cyclin D, IC 50 0,88 ± 0,34 uM) und außerdem an einen trunkierten Pentapeptid repräsentiert einen guten Kompromiss zwischen dem Molekulargewicht für Drogen- Gleichheit und Potenz (RRLIF, CDK2 / Cyclin A IC 50 1,01 ± 0,17 &amp; mgr; M, CDK4 / Cyclin D, IC 50 25,12 ± 2,97 uM) 12,13. Die CBGs bestehen aus einer großen primären und sekundären kleinere hydrophobe Tasche, die durch eine acidi überbrückt werdenc Bereich (beinhaltet Glu220, Glu224 und Asp283). Die wichtigsten Bindungsdeterminanten HAKRRLIF beinhalten die Wechselwirkung von Ala2 mit den sekundären hydrophoben Tasche, Ionenpaarung und Wasserstoffbrückenbindungen Lys3, Arg 4 und arg5 mit dem sauren Bereich und einem hohen Grad an Komplementarität Leu6 und Phe8 mit dem primären lipophilen Ort. Darüber hinaus werden zahlreiche Wasserstoff-Bindungen vom Peptid-Rückgrat beigetragen während Ile7 wirkt als ein Abstandshalter-Rest ermöglicht einen optimalen Kontakt mit dem primären Tasche. Das Bindungsmotiv und Wechselwirkungen HAKRRLIF mit CBG ist in Abbildung 2 dargestellt. Zur Förderung der CBM / CBG Protein-Protein-Wechselwirkung, wobei die Kinase-Aktivität von CDK2 / Cyclin A, CDK2 / Cyclin E &amp; CDK4 / Cyclin-D zu hemmen, und dies sollte E2F1 auslösen vermittelte Apoptose von Krebszellen, während nicht normale Zellen 7 zu beeinträchtigen. Obwohl CBM abgeleitete Peptide sind wirksame Inhibitoren der CDKs beeinflussen, ist es unwahrscheinlich, dass sie als Arzneimittel nützlich sein, die aufgrund ihrer StoffwechselInstabilität und allgemeiner Mangel an Zellpermeabilität. Zu diesem Zweck haben wir die REPLACE-Strategie, um diese potenten peptidischen Inhibitoren in mehrere wirkstoffähnlichen Verbindungen für die weitere Entwicklung der Anti-Tumor-Therapeutika Ausnutzung dereguliert E2F1 durch CDK2 / Cyclin-A-Hemmung zu konvertieren angewendet. Das folgende Protokoll fasst Arbeit, die bei der Anwendung ersetzen, um die Cyclin Nutfertigung. Im ersten Fall wurden arzneimittelähnliche Cappinggruppe Ersatz für die N-terminale Tetrapeptid der HAKRRLIF identifiziert. Darüber hinaus Verbesserungen in diesen Gruppen wurden in einem zusätzlichen Validierungsstudie für REPLACE sucht. Repräsentative Ergebnisse aus diesen Studien werden ebenfalls vorgestellt.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Computational Chemistry&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Accelyrs Discovery studio 3.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dell Optiplex Workstations</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Synthetic Organic Chemistry&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6&amp;nbsp;mm, 5&amp;nbsp;&amp;mu;m column (Phenomenox Luna) for purity determination, &lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;H NMR and &lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI).</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Flourescence Polarization Assay&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>384 micro well plates, Micro pipets</td><td>Grenier Bio-one</td><td>110256602</td><td></td></tr><tr><td>CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex)</td><td>BPS Bio Sciences</td><td>40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A)</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1&amp;nbsp;mM dithiothretiol (DTT))</td></tr><tr><td>25 nM HEPES</td><td>CALBIOCHEM</td><td>375368</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>127838</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>US Biological</td><td>N3500</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>-70 &amp;#176;C freezer</td><td>Revco (Ultima II)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DTX880 multimode detector fitted with 485&amp;nbsp;nm/535&amp;nbsp;nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein</td><td>Beckman Coulter, Brea, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Cell Culture&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>96 well plates</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP, MTT reagent</td><td>Fisher, Life technology, Alfa Aesar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heamocytometer</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>-70 &amp;#176;C freezer</td><td>Revco (Ultima II)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo electron corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerator 4-8 &amp;#176;C</td><td>Isotemp Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DTX880 multimode detector fitted with 595&amp;nbsp;nm filter</td><td>Beckman Coulter, Brea, CA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

development of inhibitors of protein-protein interactions through replace: application to the design and development non-atp competitive cdk inhibitors

REPLACE ist eine einzigartige Strategie entwickelt, um zielgerichteter Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI). Es zielt auf verfügbare Medikament Zielraum durch eine verbesserte Methode für die Identifizierung von Inhibitoren für solche Bindungsstellen und die sich ausdehnen stellen die Mehrheit potentieller Arzneimittelziele. Das Hauptziel dieser Arbeit ist es, einen methodischen Überblick über die Nutzung und Anwendung des REPLACE-Strategie, die Rechen- und Synthesechemie Ansätze beinhaltet bereitzustellen. REPLACE ist durch seine Anwendung auf die Entwicklung von nicht-ATP Wettbewerbs Cyclin-abhängigen Kinasen (CDK) Inhibitoren als anti-Tumor Therapeutika, beispielhaft dargestellt. CDKs werden häufig in der Krebs dereguliert und damit als wichtige Ziele für die Medikamentenentwicklung berücksichtigt. Inhibition von CDK2 / Cyclin A in der S-Phase ist berichtet worden, um eine selektive Apoptose von Krebszellen in einem p53-unabhängigen Weise durch die E2F1 Wegs zu fördern. Targeting die Protein-Protein-Wechselwirkung an der Cyclin Binding Nut (CBG) ist ein Ansatz, der die spezifische Hemmung des Zellzyklus über Transkriptions CDKs ermöglichen wird. Die CBG wird durch eine Konsensus-Sequenz von CDK Substrate und Tumor-Suppressor-Proteine ​​abgeleitet anerkannt bezeichnet das Cyclin-Bindungsmotiv (CBM). Die CBM hat bereits zu einem Octapeptid aus p21Waf (HAKRRIF) und dann weiter auf ein Pentapeptid Beibehaltung ausreichender Aktivität (RRLIF) abgeschnitten optimiert. Peptide sind im allgemeinen nicht zelldurchlässig ist, metabolisch instabil und damit die REPLACE (Ersetzen mit seitlichem Ligand Alternativen durch Computational Enrichment) Strategie, um mehr arzneimittelähnliche Inhibitoren erzeugen angewendet. Die Strategie beginnt mit der Konstruktion Fragment ligiert inhibitorischen Peptide (FLIPs), die selektiv Zellzyklus CDK / Cyclin-Komplexe hemmen. FLIPs wurden durch iterative Ersetzen von Resten von HAKRRLIF / RRLIF mit Fragment wie kleine Moleküle (Verkappungsgruppen), ausgehend vom N-Terminus (Ncaps) erzeugt, gefolgt von Ersatz fürder C-Terminus. Diese Verbindungen sind Ausgangspunkt für die Erzeugung von nicht-ATP Wettbewerbs CDK-Inhibitoren als anti-Tumor Therapeutika.

Die Wechselwirkungen von HAKRRLIF mit Cyclin Nut sind in Abbildung 2 dargestellt. Die Peptid-Reste, die die wichtigsten Bindungsdeterminanten dar umfassen Ala2, Arg4, Leu6 und Phe8 mit anderen Resten Bereitstellen kleinere Beiträge 12,13,18. In dieser Fallstudie die REPLACE-Strategie hat, um Fragment Alternativen für Rückstände in der N-terminalen Tetrapeptid der HAKRRLIF, in erster Linie imitiert die Wechselwirkungen von Ala2 und Arg4 finden verwendet worden. Eine Bibliothek potentieller...

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Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

Entwicklung von Inhibitoren von Protein-Protein-Wechselwirkungen durch REPLACE: Anwendung auf die Konzeption und Entwicklung Nicht ATP Competitive CDK-Inhibitoren

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by ...

development-inhibitors-protein-protein-interactions-through-replace

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K Aufrufe.  University of South Carolina. We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

Serie: Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

Identifizierung von Cyclin-abhängige Kinase 1 spezifische Phosphorylierung Websites durch eine In-vitro- Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Forschung

Biochemie

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

Identifizierung von neuartigen CK2 Kinase Substrate mit einem vielseitigen biochemischen Ansatz

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

Kinase-Inhibitor-Screening in selbstmontierten humanen Protein-Mikroarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines

Targeted protein degradation compounds, including molecular glues or proteolysis targeting chimeras, are an exciting new therapeutic modality in small molecule drug discovery. This class of compounds induces protein degradation by bringing into proximity the target protein and the E3 ligase machinery proteins required to ubiquitinate and ultimately degrade the target protein through the ubiquitin-proteasomal pathway (UPP). Profiling of target protein degradation in a high-throughput fashion, however, remains highly challenging given the complexity of cellular pathways required to achieve degradation. Here we present a protocol and screening strategy based on the use of CRISPR/Cas9 endogenous tagging of target proteins with the 11 amino acid HiBiT tag which complements with high affinity to the LgBiT protein, to produce a luminescent protein. These CRISPR targeted cell lines with endogenous tags can be used to measure compound induced degradation in either real-time, kinetic live cell or endpoint lytic modes by monitoring luminescent signal using a luminescent plate-based reader. Here we outline the recommended screening protocols for the different formats, and&#160;also describe the calculation of key degradation parameters of rate, Dmax, DC50, Dmax50, as well as multiplexing with cell viability assays. These approaches enable rapid discovery and triaging of early stage compounds while maintaining endogenous expression and regulation of target proteins in relevant cellular backgrounds, allowing for efficient optimization of lead therapeutic compounds.

This protocol describes the quantitative luminescent detection of protein degradation kinetics in living cells that have been engineered using CRISPR/Cas9 to express antibody free endogenous protein detection tag fused to a target protein. Detailed instructions for calculating and obtaining quantitative degradation parameters, rate, Dmax, DC50, and Dmax50 are included.

Hochdurchsatz-Zellprofilierung gezielter Proteinabbauverbindungen mit HiBiT-CRISPR-Zelllinien

Targeted protein degradation compounds, including molecular glues or proteolysis targeting chimeras, are an exciting new therapeutic modality in small ...

Krebsforschung

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies have been proposed and implemented for the identification of new mediators of TCR signaling, which would improve the understanding of T-cell processes, including activation and thymic selection. We describe a screening assay that enables the identification of molecules that influence TCR signaling based on the activation of developing thymocytes. Strong TCR signals cause developing thymocytes to activate apoptotic machinery in a process known as negative selection. Through the application of kinase inhibitors, those with targets that affect TCR signaling are able to override the process of negative selection. The method detailed in this paper can be used to identify inhibitors of canonical kinases with established roles in the TCR signaling pathways and also inhibitors of new kinases yet to be established in the TCR signaling pathways. The screening strategy here can be applied to screens of higher throughput for the identification of novel druggable targets in TCR signaling.

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

This paper uses a flow-cytometry-based assay to screen libraries of chemical inhibitors for the identification of inhibitors and their targets that influence T-cell receptor signaling. The methods described here can also be expanded for high-throughput screenings.

Identifikation von Mediatoren der T-Zell-Rezeptor Signalgebung über das Screening von chemischen Inhibitors Bibliotheken

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

Immunologie und Infektion

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific properties, such as binding affinity, agonist or antagonist behavior, or stability, relative to the native sequence. Protein design lies at the center of current advances drug design and discovery. Not only does protein design provide predictions for potentially useful drug targets, but it also enhances our understanding of the protein folding process and protein-protein interactions. Experimental methods such as directed evolution have shown success in protein design. However, such methods are restricted by the limited sequence space that can be searched tractably. In contrast, computational design strategies allow for the screening of a much larger set of sequences covering a wide variety of properties and functionality. We have developed a range of computational de novo protein design methods capable of tackling several important areas of protein design. These include the design of monomeric proteins for increased stability and complexes for increased binding affinity.
To disseminate these methods for broader use we present Protein WISDOM (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>), a tool that provides automated methods for a variety of protein design problems. Structural templates are submitted to initialize the design process. The first stage of design is an optimization sequence selection stage that aims at improving stability through minimization of potential energy in the sequence space. Selected sequences are then run through a fold specificity stage and a binding affinity stage. A rank-ordered list of the sequences for each step of the process, along with relevant designed structures, provides the user with a comprehensive quantitative assessment of the design. Here we provide the details of each design method, as well as several notable experimental successes attained through the use of the methods.

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

We developed computational de novo protein design methods capable of tackling several important areas of protein design. To disseminate these methods we present Protein WISDOM, an online tool for protein design (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>). Starting from a structural template, design of monomeric proteins for increased stability and complexes for increased binding affinity can be performed.

Protein WISDOM: A Workbench für<em&gt; In silico</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Aufbau von Biomolekülen

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Biologie

A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the potential of targeting the kinase in cancers by effectively treating the CML patients. This observation revolutionized drug development to target the oncogenic kinases implicated in various other malignancies, such as, EGFR, B-RAF, KIT and PDGFRs. However, one major drawback of anti-kinase therapies is the emergence of drug resistance mutations rendering the target to have reduced or lost affinity for the drug. Understanding the mechanisms employed by resistant variants not only helps in developing the next generation inhibitors but also gives impetus to clinical management using personalized medicine. We reported a retroviral vector based screening strategy to identify the spectrum of resistance conferring mutations in BCR/ABL, which has helped in developing the next generation BCR/ABL inhibitors. Using Ruxolitinib and JAK2 as a drug target pair, here we describe in vitro screening methods that utilizes the mouse BAF3 cells expressing the random mutation library of JAK2 kinase.

Emergence of genetic resistance against kinase inhibitor therapy poses significant challenge for effective cancer therapy. Identification and characterization of resistant mutations against a newly developed drug helps in better clinical management and next generation drug design. Here, we describe our protocol for in vitro screening and validation of resistant mutations.

Verfahren zum Screening und Validierung von Beständig Mutationen Vor-Inhibitoren

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identifikation von Kinase-Substrat-Pairs Mit High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Developing and Testing Methylated Nano-Structured Dipeptides that Inhibit Src Kinase Activity In Vitro for Anti-Cancer Applications

Here, with the aim of developing a novel anti-cancer treatment, seven dipeptides were designed that contained methylated tryptophan and/or methylated arginine and were produced using Fmoc solid-phase peptide synthesis. Overexpression of the Src tyrosine kinase enzyme has been implicated in the development of different cancers. Dipeptides containing unnatural amino acids such as methylated arginine (RCH3), dimethylated arginine (R(CH3)2), and/or methylated tryptophan (WCH3) residues have earlier been shown to inhibit Src kinase. In this study, three such dipeptides, W-RCH3, WCH3-RCH3, and W-R(CH3)2, were tested using acellular assays and were found to have IC50 values (the concentration at which 50% inhibition occurs) of 510 nM, 916 nM, and 1 &#181;M, respectively. These values were comparable to those obtained for cyclic penta- to nano-W-R peptides ([W-R]5-[W-R]9) synthesized in previous studies. However, the unmethylated versions of the dipeptides did not show any inhibitory activity against Src kinase. All of these dipeptides (50 &#181;M) did not show any cytotoxicity after incubation up to 72 h with three different cancer cell lines, including leukemia (CCRF-CEM), breast adenocarcinoma (MDA-MB-231), and ovarian adenocarcinoma (SK-OV-3) cell lines, indicating the limited permeability of the peptides through the cell membrane. Therefore, further study is needed to improve the permeability of these peptides for anticancer applications, such as by using a peptide carrier or additional peptide functionalization. In summary, this study provides a protocol to synthesize and test peptides that inhibit Src kinase activity, and thus possess promising anticancer ability, as demonstrated using acellular and cellular assays.

Developing and Testing Methylated Nano-Structured Dipeptides that Inhibit Src Kinase Activity In Vitro for Anti-Cancer Applications

Presented here is a protocol for designing and testing dipeptides that can inhibit Src kinase enzyme activity using acellular and cellular assays for anti-cancer applications. The peptides formulated here (W-RCH3, WCH3-RCH3, and W-R(CH3)2)&#160;inhibited Src kinase with IC50 values of 510 nM, 916 nM, and 1 &#181;M, respectively.

Here, with the aim of developing a novel anti-cancer treatment, seven dipeptides were designed that contained methylated tryptophan and/or methylated ...

Entwicklung von Inhibitoren von Protein-Protein-Wechselwirkungen durch REPLACE: Anwendung auf die Konzeption und Entwicklung Nicht ATP Competitive CDK-Inhibitoren

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Identifizierung von Cyclin-abhängige Kinase 1 spezifische Phosphorylierung Websites durch eine In-vitro- Kinase Assay

Identifizierung von neuartigen CK2 Kinase Substrate mit einem vielseitigen biochemischen Ansatz

Kinase-Inhibitor-Screening in selbstmontierten humanen Protein-Mikroarrays

Hochdurchsatz-Zellprofilierung gezielter Proteinabbauverbindungen mit HiBiT-CRISPR-Zelllinien

Identifikation von Mediatoren der T-Zell-Rezeptor Signalgebung über das Screening von chemischen Inhibitors Bibliotheken

Protein WISDOM: A Workbench für

Verfahren zum Screening und Validierung von Beständig Mutationen Vor-Inhibitoren

Identifikation von Kinase-Substrat-Pairs Mit High Throughput Screening

Developing and Testing Methylated Nano-Structured Dipeptides that Inhibit Src Kinase Activity In Vitro for Anti-Cancer Applications

Hemmung der CDK-Aktivität