Name: in utero intra-cardiac tomato-lectin injections on mouse embryos to gauge renal blood flow
Uploaded: 2015-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow at JoVE.com

The authors would like to thank Dr. George Gittes for advice and expertise throughout this study. SSL was supported by an American Heart Association fellowship (11POST7330002). Further to this SSL and this study was supported by an NIDDK Mentored Research Scientist Development Award (DK096996) and by the Children&#8217;s Hospital of Pittsburgh.

NOT: Pittsburgh Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Üniversitesi tüm deneyleri onaylamıştır. Ultrason-mikroenjeksiyon Cihazları ve Embriyolar 1. Hazırlık <ol><li> Sahne, montaj ve prob (Şekil 1) yanı sıra cerrahi aletler (Şekil 2) ayarlayın. 37 ° C&#39;lik bir ısıtma banyosu içinde yer fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi (pH 7.4). Tabanı yoluyla bir ikinci esnek 25 G iğne takılı 1 ml şırınga kullanılarak, mineral yağ ile tamamen mikroenjeksiyon iğne doldurun. </li><li> Dönme üzerine iğne Fix kolunu monte ve madeni yağ çözeltisi boş iğne. TL çözeltisi 2,5 ul yeniden doldurun. Hava kabarcığı enjeksiyon iğnesi içinde mevcut olduğundan emin olun. Uzakta aşamasından, duvara doğru iğne kolunu döndürün. </li><li> Izofluran sürekli infüzyon yoluyla anestezi odasına hamile anne anestezisi. Anne bilinçsiz hale olduğunda, c konumlandırılmış burun tüp anestezi transferiburun tüp içinde burnu ile yatar pozisyonda audal aşamada yan ve yer annesi tam anestezi devletin bir devamı sağlamak için. </li><li> 45 ° açıları, ya da elleri ve ayakları ile Bant bacaklarda dinlenmiş ve üstünlük EKG / Sıcaklık monitör sekmelerini konumlandırılmış. Hamile baraj sürekli o anestezi sağlamak için izlenmesi önemlidir yeterlidir ve gözlere uygulanan bu merhem kurutma azaltmak için. </li><li> Yavaşça herhangi bir aşırı bir ürün ve saç kaldırmak için% 70 etanol-doymuş pamuklu sonra tekrar kuru pamuklu silin, ve, anne karnın alt genelinde epilasyon ürünü uygulayın. Kesi yerinde (Şekil 3) tüm saç kapalı karın cildi temizlemek için emin olun. </li><li> Ince cerrahi forseps ve makas kullanılarak gebe anne üzerinde bir laparotomi gerçekleştirin. Herhangi bir büyük damarları ya da visseral organları kesme önlemek için dikkat edin. 1.5-2 cm vajina üzerinde, ilk epidermis düz kesi yapmak ve approximat için kaburga doğru kesilmiş devamely 2-3 cm. Viseral organlar ve rahim saccules iç göstermek, aynı uzunluğu boyunca, deri altı membran Açığa linea alba (&quot;beyaz çizgi&quot;) (Şekil 3) bulmak, ve ilk kesi paralel kesilmiş. </li></ol> Embriyolar 2. Ekstraksiyon <ol><li> Anne ve embriyolar manevra 6-inç pamuk uçlu aplikatör kullanın. Yavaşça kesi açılması dışında ilk embriyo işlemek için aplikatör ile cilt üzerinde (zorlamayın) itin. İlk embriyo Keseciklerin çıkarılmasından sonra, yavaşça ve yavaş yavaş yoluyla ve annenin dış üzerine uterin boynuz kalanını çekin. Bu aşamada kesikten bağırsak ya da diğer organlara çekerek kaçının. </li><li> Embriyoların ölçmek ve yavaşça anne geri sol uterin boynuz yerleştirin. Sonra boynuz vajinadan embriyo saccule sağdaki ile başlayan ve aşağı hareket geri anne içine doğru uterin boynuz yerleştirerek başlar. (Sadece iki embriyo maruz kalması kadar Fi, bu devamGüre gösterir 4). Son olarak, bir yukarıda sütun ve paralel pozisyon embriyolar rahim dolaşımını kesmek için değil haberdar olmak, çizgi insizyon. </li><li> Kollar ve gövde, aynı zamanda bacak ve kuyruk arasında kil blokları ve pozisyon yerleştirin. Kil yüzeyleri laparotomi insizyon ile yaklaşık seviyede olduğundan emin olun. 37 ° C PBS ile fenestre Petri kabı ıslatın. </li><li> Sol el (embriyolar fenestrasyonu paralel) ile sağ el ve fenestre Petri kabı ile uzanan forseps kavrayın ve Petri kabı üst, fenestrasyonu aracılığıyla kapalı forseps ~ 5-cm getirmek. Tamamen fenestrasyonu örgü yırtmadan açın forseps. </li><li> Embriyolar üzerinde ellerini Manevra ve iki embriyo saccules üzerinde görüş odaklanmak. Olmadan (ya da hafifçe) yarıktan kaydırın ve annenin karın üzerine Petri kabı set, fenestrasyonu meshing veya forseps ile saccules dokunmadan. Forseps hala uzatılmış, (her iki tarafta ve her embriyonun üssünde oturması için Şekil 5 Fenestralı örgü manipüle </stRong&gt;) ve yarık açılması dışarı forseps çekin. </li><li> Sonraki, (Şekil 6) kısma veya embriyolar zarar vermeden, Petri kabındaki duvar içeren mavi lastik yerleştirin. Emin kil bloklar sıkıca Petri kabı, embriyo ve kauçuk içeren duvar dengeleme emin olun. Fenestralı geçmelerine sızıntıları kontrol ederken embriyolar tamamen (Şekil 6) batık kadar Son olarak, 37 ° C PBS ile Petri kabı doldurun. </li></ol> 3. Enjeksiyon Yöntemi <ol><li> Sonra alt enjeksiyon anne ve embriyoların aşağı Z-seviye ayar düğmesini (Şekil 1) kullanarak sahne ve prob ucu sola ve altında iğne ½ cm, enjeksiyon iğnesi döndürmek ve kol monte ve ultrason probu ile doğrudan hizaya (Şekil 7) . 45 ° uzakta prob iğne-kol (değil iğne) itin. Çanak veya ultrason probu ile iğne ucu vurmak için dikkatli olun. </li><li> Ultrason p, geri orijinal yüksekliği enjeksiyon sahne kaldırındoğrudan embriyolar Probe üzerinde elbise biraz batık ve embriyonik doku 3-4 mm&#39;lik içinde olmalıdır. Kullanım X &amp; Y sahne ayar düğmeleri (Şekil 8) sistematik dayak embriyonik kalp bulmak için embriyo / anne / sahne konumunu değiştirme. </li><li> Doğrudan ultrason ekranının Merkezi çizilmiş siyah bir merkez hedef işaretleyici (*) gözlemlemek. X &amp; Y sahne ayar düğmeleri kullanarak sol ventrikül (tercih) veya atrium (Şekil 8) bulun ve ardından yükseltmek veya ultrason ekranında siyah merkez işaretleyici üzerinde tam enjeksiyon hedef konumlandırmak için sahneye döner düğmesini kullanarak sahne indirin. </li><li> Ultrason ekranında kapalı, sağ embriyo hareket X sahne ayar düğmesini kullanın. ½ uzak cm ve ultrason probu 90 ° (Şekil 7), mikroenjeksiyon iğne yeniden konumlandırmak ve tekrar yerine kol. </li><li> Mikroenjeksiyon açıkça ucu al ayar düğmeleri (Şekil 9C-G), pozisyon iğne monte kullanmamerkez işaretleyici ile igned. İğne ucu doğru düzlemde odaklı sağlamak için, ve X, Y, ve mikro-iğne Z vektörleri (Şekil 9C&#39;de &amp; EG düğmeleri kullanarak) enjeksiyon açısını ayarlayın. Sadece &quot;enjeksiyon&quot; düğmesini (Şekil 9F) kullanarak mikroenjeksiyon iğne geri çekin, dikkatli değil, diğer boyutlarını ayarlamak için. </li><li> Yine, tam ultrason ekranında merkez işareti hedef geri prob altında sadece X ince ayar aşaması topuzu hareket embriyo kullanarak. Sol ventrikül aynı X, Y ve Z düzleminde şimdi olduğundan emin olun. </li><li> Mikroenjeksiyon sadece &quot;enjeksiyon&quot; düğmesi monte ile Sonraki, yavaş yavaş mikroenjeksiyon iğne ile embriyo delinme ve yavaş yavaş sol ventrikül içine ucu getir. Kez (Şekil 2A &amp; B) &quot;boş&quot; tutan ve &quot;dolgu&quot; dokunarak, boş uyarı bip sesleri sol ventrikül içine kadar veya TL çözümünün tam 2.5 ul enjekte edilir. Şu andaenjeksiyon kalp odasına giren TL (Şekil 10) iğne ucu kaynaklanan bir gölge gözlemlemek. Tersinde, hızlı enjeksiyon tamamlandığında mikroenjeksiyon üzerinde &quot;enjeksiyon&quot; düğmesi (Şekil 9F) monte dönen mikroenjeksiyon iğne geri çekin. </li><li> Bir sonraki embriyo Devam ve Bu adımlarda sonra, kalan embriyolar için bu yordamı yineleyin ve nihayet geri baraj karın içine son embriyolar yerleştirin. Odacık kutusuna anestezi geçin ve hafifçe son enjeksiyon zamanı 15 dakika burada anneyi taşıyın. </li></ol> 4. Hasat Embriyolar ve Analiz <ol><li> Servikal dislokasyon yoluyla baraj Kurban. Kolayca anneden rahim boynuzları kaldırmak için laparotomi kesi genişletin. Uterus kesesi içinde embriyolar tutun. Soğutulmuş PBS embriyolar yerleştirin. </li><li> (Eğer genotiplemede için gerekli toplamak doku) uterus kesesinin embriyolar incelemek ve tüm embriyo yerleştirmek in,% 4 paraformaldehit (PFA), gece boyunca, daha sonra içine% 30 sukroz, gece boyunca, orta kesit kriyostat dondurma. Sonra cryosection kesmek ve immünohistokimyasal analiz için slaytlar üzerine yerleştirin. İsteğe bağlı olarak, dokuların kullanımı,% 100 metanol dehidrasyon% 4 PFA içinde tespit izleyerek tüm montaj. </li><li> Immünohistokimyasal analiz için OCT kaldırmak için PBS içine cryosections yerleştirin. Daha sonra, 30 dakika boyunca,% 10 normal eşek serumu ile bölümleri bloke eder. Daha sonra 1 ile PECAM birinci antikor ekleyin: 100 seyreltme, gece boyunca 4 ° C&#39;de ilave edildi. Bir sonraki gün, 10 dakika her biri için PBT 3 kez slaytlar yıkama ve ikinci eşek anti-fare 594 ekleyebilir ve oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. NOT: Bu ultrason ve mikroenjeksiyon optimizasyonu ve koordinasyonu gerektiren son derece zorlu bir tekniktir. Orada bu teknikle ilgili bir çok dik bir öğrenme eğrisi ve bir uzman olmadan önce mentorluk enjeksiyonların 4-6 hafta gerektirir. </li></ol>

<ol>
	<li>Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+formation+of+microvasculature+in+the+developing+kidney.">Origins and formation of microvasculature in the developing kidney.</a> Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).</li><li>Sims-Lucas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Progenitors+Exist+within+the+Kidney+and+Lung+Mesenchyme.">Endothelial Progenitors Exist within the Kidney and Lung Mesenchyme.</a> PloS one. 8 (6), e65993 (2013).</li><li>Dressler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+early+kidney+specification,+development+and+patterning.">Advances in early kidney specification, development and patterning.</a> Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).</li><li>Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+controls+and+cellular+behaviors+in+branching+morphogenesis+of+the+renal+collecting+system.">Genetic controls and cellular behaviors in branching morphogenesis of the renal collecting system.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (5), 693-713 (2012).</li><li>Costantini, F., Kopan , R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+a+complex+organ:+branching+morphogenesis+and+nephron+segmentation+in+kidney+development.">Patterning a complex organ: branching morphogenesis and nephron segmentation in kidney development.</a> Dev Cell. 18 (5), 698-712 (2010).</li><li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+crosstalk+regulates+kidney+progenitor+cell+differentiation.">Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation.</a> Nat Cell Biol. 15 (9), 1035-1044 (2013).</li><li>Rymer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+blood+flow+and+oxygenation+drive+nephron+progenitor+differentiation.">Renal blood flow and oxygenation drive nephron progenitor differentiation.</a> Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).</li><li>Shah, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+mouse+blood+flow+and+oxygen+correlate+with+early+pancreatic+differentiation.">Embryonic mouse blood flow and oxygen correlate with early pancreatic differentiation.</a> Developmental biology. 349 (2), 342-349 (2011).</li><li>Andres, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphB4+receptor+tyrosine+kinase+transgenic+mice+develop+glomerulopathies+reminiscent+of+aglomerular+vascular+shunts.">EphB4 receptor tyrosine kinase transgenic mice develop glomerulopathies reminiscent of aglomerular vascular shunts.</a> Mech Dev. 120 (4), 511-516 (2003).</li><li>Wagner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+kidney+vascular+corrosion+casts+with+Nano-CT.">High-resolution imaging of kidney vascular corrosion casts with Nano-CT.</a> Microsc Microanal. 17 (2), 215-219 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Mikroenjeksiyon anestezi ve zaman çerçevesi Annenin anesthetization ile ilgili olarak, bu hava akımı sabit (2-3 L / dk) ve düşük PSI&#39;de tutmak esastır. sedatif akışı / dak yaklaşık 1,75-2 L tutulmalıdır. Aynı anda, enjeksiyonlar yer aldığı zaman dilimleri yakından takip ve her çöp için kontrol edilmelidir. Her çöp için enjeksiyon prosedürü 45 dakika altında tutulmalıdır. Her embriyo gövdesi ve ilgi organı boyunca kontrollü ve değişmez perfüzyon kolayl...

Embriyonik gelişimi sırasında iki ayrı, ama aynı anda, vasküler işlemler gerçekleşir: anjiogenezisi, süreci bir gemi konut endotel atalarıdır 1,2 den gemilerin de novo oluşumu büyük bir önceden var olan damar, ve vaskülogenez, yetişen bu sayede. Ikinci büyük ölçüde o olmadan gerçekleşmesi düşünülmektedir ise sırasıyla, eski, kan akımı ile eş anlamlıdır. Kan damarı oluşumu eş zamanlı, böbrek progenitör hücre sentezi, çoğalması ve farklılaşması bir döngüsel ve dinamik bir süreç embriyonik gün 9.5 (E9.5) açılmak başlar. Bu noktada üreter tomurcuğu (UB) metanefrik mezenşimi (MM) çevredeki içine dorsal işgal ve Doğum 3 kadar devam eder. Hızla metanefrik kap mezenşimi yoğuşmalı içine UB dallanma tekrarlanan böbrek fonksiyonel birimleri, nefron oluşumunu başlar. UB ve nef her yeni nesilron, eski kuşaklar daha sonra öncelikle damar-yoğun ortamlarda daha olgunlaşmasını ve farklılaşmasını geçiren iç kortikal ve medüller bölgeler, içine yerinden edilir. Dressler ve ark. 3 ile kanıtlandığı gibi, bu embriyolojik işlemi, UB ve MM, ve hücre dışı faktörler 3-6 sayısız arasında çapraz olarak, endüktif sinyal çökeltilir. İki yakın zamanda incelenen dışı gelişen pankreas içindeki faktörler ve böbrekler oksijen gerilimi ve kan akışını 7,8 bulunur. ikinci böbrek gelişimi ile ilişkili olarak aşağıda daha ayrıntılı olarak tarif edilecektir. Kan akışı, potansiyel nefron progenitör hücre farklılaşması, hem de diğer organogenez süreçleri, embriyonik kan akımı haritalama hassas ve doğru bir yöntem oynadığı endüktif rolü ortaya koymak için de çok önemlidir. Kan akışını ölçme alternatif yöntemler ul reçete dahiltrasound görüntüleme ve reçine 9,10 atmalarını. Sonuç, bu modlar doğal eş kan akımı arasındaki zamansal ve mekansal juxtapositions açıklayacak ve hücre farklılaşmasını kök onların kapasite eksik gösterilmiştir. Reçine kalıplar, örneğin, ancak bu tür oluşum safhasındaki zaman noktalarında olduğu gibi olgun olmayan kaplar, içinde, yetişkin doku içindeki damar desenli geçerli bir model sağlayan, kaplar büyük ölçüde az gelişmiş ve sızan bulunmaktadır. Bu nedenle, reçine, çoğu zaman gözenekli, küçük damarlarda içinde tutmak için başarısız atmalarını. Bu belirgin engeller için, diğerleri arasında, biz ultrason rehberliğinde böbrek gelişimi bizim soruşturma içine in vivo içi kardiyak embriyonik domates lektin (TL) mikroenjeksiyon dahil etmek seçti. Bu prosedürde, biz zaman uyumlu E11.5, 13.5, E15.5 ve E17.5 zaman noktalarında fare embriyoları sol ventrikül içine TP çözeltisi 2.5 ul ile dolu bir monte mikropipet iğne kılavuz için, bir ultrason probu kullanmaktadır. E17Iğneler daha gelişmiş embriyo nüfuz için yeterince güçlü değil gibi .5 son gelişimsel yaş. Bu mikroenjeksiyon yönteminin avantajları bol miktarda bulunmaktadır. Ultrason eşliğinde mikroenjeksiyon kesin embriyonik sol ventrikül içinde bir enjeksiyon iğnesinin konumlandırma, hayvan, kalp minimal hasar ve çevreleyen dokuların atan kalbine çözümün pasif ve kontrollü atılmasına, ve ani kalp yetmezliği kaçınma ve ölüm veriyor embriyo tam vücut perfüzyon önce. FITC-işaretli TL kullanımı ile, herhangi bir perfüze damar da endotel apikal zar boyunca işaretleyici koruyacaktır. Immunohistokimyasal ile birlikte, PECAM (CD31, Trombosit endotel hücre adezyon molekülü) ve diğer çeşitli vasküler belirteçleri kullanarak, açıkça edebiliyoruz perfüze ve un-perfüze gemilerin arasında ayrım yanı sıra çevre dokulara herhangi bir anormal boyama karakterize.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>022M4004V</td><td>concentration 1:5,000</td></tr><tr><td>Pecam</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>concentration 1:100</td></tr><tr><td>FITC-Tomato Lectin</td><td>Vector Laboratories</td><td>FL-1321</td><td>concentration 2.5 &amp;micro;l / embryo</td></tr><tr><td>Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>712-585-150</td><td>concentration 1:200</td></tr><tr><td>Microinjection Needle</td><td>Origio Mid Atlantic Devices</td><td>C060609</td><td></td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26291</td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-377-20</td><td></td></tr><tr><td>Clay Blocks</td><td>Fisher Scientific</td><td>HR4-326</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Tape</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-999-380</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9763655</td><td></td></tr><tr><td>Hair Removal Product</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0132811</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>Fine Science tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11064-07</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Marking Pen</td><td>Fine Science tools</td><td>18000-30</td><td></td></tr><tr><td>Right angle forceps (for hysterectomy)</td><td>Fine Science tools</td><td>11151-10</td><td></td></tr></tbody></table>

in utero intra-cardiac tomato-lectin injections on mouse embryos to gauge renal blood flow

oluşumu ve (dışında glomerüllerden) böbrek kan damarlarını geliştirme perfüzyon ölçüde understudied edilir. Damar gibi reçine atmalarını, in vivo ultrason görüntüleme ve mikro-diseksiyonu olarak perfüzyon haritalama teknikleri arasındaki yakın ilişkiyi gösteren sınırlı olan, (de novo damar oluşumu) ve vaskülogenez (büyük damarların kapalı dallanma olan) anjiyogenez yoluyla geliştikçe Embriyonun içinde bu iki süreç ve gelişmekte olan böbrek yapıları. Burada, biz böbrek perfüzyonunun ontogenezini ölçmek için fare embriyoları üzerinde utero içi kardiyak ultrason rehberliğinde FITC etiketli domates lektin mikroenjeksiyon içinde prosedürü tarif. Domates lektin (TL) hasat embriyo ve böbrekler boyunca perfüze edildi. Nefron atalarıdır, nefron yapıları, üreter epiteli ve damar: dokular dahil olmak üzere çeşitli böbrek yapılar için ortak boyandı. E13.5 büyük kalibreli damarları başlayan, ancak periferik perfüze edildigemi unperfused kalmıştır. E15.5 E17.5 ve tarafından, küçük periferik damarlar yanı sıra glomerüller perfüze hale başladı. Bu deneysel teknik, embriyonik gelişim sırasında damar kan akışının rolü üzerinde çalışılması için kritik önem taşır.

Vasküler oluşumu böbrek gelişmekte akışı öncesinde (Böbrek de dahil olmak üzere), embriyonik dokunun büyük bir kısmı daha erken dönemde embriyo zaman noktalarında, yoğun damar (unperfused ve perfüze her ikisi) içerir. Gelişmekte olan böbrek içinde iyi göstergesi ve analiz kan akımı biz utero embriyonik intrakardiyak mikroenjeksiyon içinde bir yöntem kullanılmıştır. Bir laparotomi yoluyla çıkarılması ve bir tek uterus Keseciklerin maruz kaldıktan sonra E17....

Watch this Scientific Journal Video about In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow at JoVE.com

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

Fare Embryolarının üzerinde Utero içi kardiyak Domates-lektin Enjeksiyonlar Renal Kan Akışı Ölçer için

The formation and perfusion of developing renal blood vessels (apart from glomeruli) are greatly understudied. As vasculature develops via angiogenesis ...

in-utero-intra-cardiac-tomato-lectin-injections-on-mouse-embryos-to

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

9.7K Görüntüleme.  Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC. This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

Video: In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or &#945;v&#946;3) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.

Here, we present a protocol to inject ultrasound microbubble contrast agents into living, isolated late-gestation stage murine embryos. This method enables the study of perfusion parameters and of vascular molecular markers within the embryo using contrast-enhanced high-frequency ultrasound imaging.

Yüksek frekanslı Ultrason Kullanımı Fare Embriyolar Kontrast Görüntüleme

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Gelişim Biyolojisi

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in the thymus proper vasculature formation and patterning is essential for thymocyte entry into the organ and mature T-cell exit to the periphery. The spatial arrangement of blood vessels in the thymus is dependent upon signals from the local microenvironment, namely thymic epithelial cells (TEC). Several recent reports suggest that disruption of these signals results in thymus blood vessel defects 1,2. Previous studies have described techniques used to label the neonatal and adult thymus vasculature 1,2. We demonstrate here a technique for labeling blood vessels in the embryonic thymus. This method combines the use of FITC-dextran or Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I (GSL 1 - isolectin B4) facial vein injections and CD31 antibody staining to identify thymus vascular structures and PDGFR-&beta; to label thymic perivascular mesenchyme 3-5. The option of using cryosections or vibratome sections is also provided. This protocol can be used to identify thymus vascular defects, which is critical for defining the roles of TEC-derived molecules in thymus blood vessel formation. As the method labels the entire vasculature, it can also be used to analyze the vascular networks in multiple organs and tissues throughout the embryo including skin and heart 6-10.

This article describes a method for labeling embryonic skin and thymus blood vessels.

Embriyonik Farelerde damarları Etiketleme Bir Yöntem

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and acquired diseases. Apart from congenital or inherited abnormalities with the requirement for long-term expression of the delivered gene, several non-inherited perinatal conditions, where short-term gene expression or pharmacological intervention is sufficient to achieve therapeutic effects, are considered as potential future indications for this kind of approach. Candidate diseases for the application of short-term prenatal therapy could be the transient neonatal deficiency of surfactant protein B causing neonatal respiratory distress syndrome1,2 or hyperoxic injuries of the neonatal lung3. Candidate diseases for permanent therapeutic correction are Cystic Fibrosis (CF)4, genetic variants of surfactant deficiencies5 and &alpha;1-antitrypsin deficiency6.
Generally, an important advantage of prenatal gene therapy is the ability to start therapeutic intervention early in development, at or even prior to clinical manifestations in the patient, thus preventing irreparable damage to the individual. In addition, fetal organs have an increased cell proliferation rate as compared to adult organs, which could allow a more efficient gene or stem cell transfer into the fetus. Furthermore, in utero gene delivery is performed when the individual's immune system is not completely mature. Therefore, transplantation of heterologous cells or supplementation of a non-functional or absent protein with a correct version should not cause immune sensitization to the cell, vector or transgene product, which has recently been proven to be the case with both cellular and genetic therapies7.
In the present study, we investigated the potential to directly target the fetal trachea in a mouse model. This procedure is in use in larger animal models such as rabbits and sheep8, and even in a clinical setting9, but has to date not been performed before in a mouse model. When studying the potential of fetal gene therapy for genetic diseases such as CF, the mouse model is very useful as a first proof-of-concept because of the wide availability of different transgenic mouse strains, the well documented embryogenesis and fetal development, less stringent ethical regulations, short gestation and the large litter size.
Different access routes have been described to target the fetal rodent lung, including intra-amniotic injection10-12, (ultrasound-guided) intrapulmonary injection13,14 and intravenous administration into the yolk sac vessels15,16 or umbilical vein17. Our novel surgical procedure enables researchers to inject the agent of choice directly into the fetal mouse trachea which allows for a more efficient delivery to the airways than existing techniques18.

We developed a novel surgical approach for intratracheal administration of bioactive agents into the mouse fetus. The delivery route is more efficient in targeting the fetal mouse lungs than the commonly used intra-amniotic injection. This procedure has to date not been described in a mouse model.

Bir Fetal Fare Modelinde Biyoaktif Ajan intratrakeal Yönetimi İçin Yeni Bir Cerrahi Yaklaşım

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Tıp

Murine Fetal Echocardiography

Transgenic mice displaying abnormalities in cardiac development and function represent a powerful tool for the understanding the molecular mechanisms underlying both normal cardiovascular function and the pathophysiological basis of human cardiovascular disease. Fetal and perinatal death is a common feature when studying genetic alterations affecting cardiac development 1-3. In order to study the role of genetic or pharmacologic alterations in the early development of cardiac function, ultrasound imaging of the live fetus has become an important tool for early recognition of abnormalities and longitudinal follow-up. Noninvasive ultrasound imaging is an ideal method for detecting and studying congenital malformations and the impact on cardiac function prior to death 4. It allows early recognition of abnormalities in the living fetus and the progression of disease can be followed in utero with longitudinal studies 5,6. Until recently, imaging of fetal mouse hearts frequently involved invasive methods. The fetus had to be sacrificed to perform magnetic resonance microscopy and electron microscopy or surgically delivered for transillumination microscopy. An application of high-frequency probes with conventional 2-D and pulsed-wave Doppler imaging has been shown to provide measurements of cardiac contraction and heart rates during embryonic development with databases of normal developmental changes now available 6-10. M-mode imaging further provides important functional data, although, the proper imaging planes are often difficult to obtain. High-frequency ultrasound imaging of the fetus has improved 2-D resolution and can provide excellent information on the early development of cardiac structures 11.

Fetal and perinatal death is a common feature when studying genetic alterations affecting cardiac development. High-frequency ultrasound imaging has improved 2-D resolution and can provide excellent information on early cardiac development and is an ideal method to detect the impact on cardiac structure and function prior to death.

Mürin Fetal Ekokardiyografi

Transgenic mice displaying abnormalities in  cardiac development and function represent a powerful tool for the understanding  the molecular mechanisms ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular mechanisms of CHDs is&#160;crucial for inventing new preventive and therapeutic strategies. Mutant mouse models are powerful tools to discover new&#160;mechanisms&#160;and environmental stress modifiers that drive cardiac development and their potential&#160;alteration in CHDs. However, efforts to establish the causality of these putative contributors have been limited to histological&#160;and molecular studies&#160;in non-survival animal experiments, in which&#160;monitoring the key physiological and hemodynamic parameters is&#160;often absent. Live imaging technology has become an essential tool to establish the&#160;etiology of CHDs. In particular,&#160;ultrasound imaging can be used prenatally without surgically exposing the fetuses,&#160;allowing maintaining&#160;their baseline physiology while monitoring the impact of environmental stress&#160;on the hemodynamic and structural aspects of cardiac chamber development. Herein, we use the High-Frequency Ultrasound (30/45)&#160;system to examine the cardiovascular system in fetal mice at E18.5 in utero at the baseline and in response to prenatal hypoxia exposure. We demonstrate the feasibility of the system to measure cardiac chamber size, morphology, ventricular function, fetal heart rate, and umbilical artery flow indices, and their alterations in fetal mice exposed to systemic chronic hypoxia in utero in real time.

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

High-frequency ultrasound imaging of the fetal mouse has improved imaging resolution and can provide precise non-invasive characterization of cardiac development and structural defects. The protocol outlined herein is designed to perform real-time fetal mice echocardiography in vivo.

Fetal fare bir yüksek frekans ultrason (30/45 MHZ) sistemi kullanarak Imaging kardiyovasküler

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease and injury regional estimates, World Health Organization, 2004). Surgeries that often compromise the quality of life are required to correct heart defects, reminding us of the importance of finding the causes of CHD. Mutant mouse models and live imaging technology have become essential tools to study the etiology of this disease. Although advanced methods allow live imaging of abnormal hearts in embryos, the physiological and hemodynamic states of the latter are often compromised due to surgical and/or lengthy procedures. Noninvasive ultrasound imaging, however, can be used without surgically exposing the embryos, thereby maintaining their physiology. Herein, we use simple M-mode ultrasound to assess heart rates of embryos at E18.5 in utero. The detection of abnormal heart rates is indeed a good indicator of dysfunction of the heart and thus constitutes a first step in the identification of developmental defects that may lead to heart failure.

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Ultra-high frequency ultrasound is a powerful live imaging tool to examine cardiac abnormalities in small animals. Its noninvasiveness allows maintaining the physiologic state of embryos. Herein, we show the use of M-mode ultrasound to measure the heart rates of embryos at E18.5 in utero.

Noninvaziv M-mod ekokardiyografi ile Fare Kalp Puan utero Ölçümünde

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances early in the gestation. The rationale behind IUT for therapeutic purposes is based on the small size of the fetus, the fetal immunologic immaturity, the accessibility and proliferative nature of the fetal stem or progenitor cells, and the potential to treat a disease or the onset of symptoms prior to birth. Taking advantage of these normal developmental properties of the fetus, the delivery of hematopoietic stem cells (HSC) via an IUT has the potential to treat congenital hematologic disorders such as sickle cell disease, without the required myeloablative or immunosuppressive conditioning required for postnatal HSC transplants. Similarly, the accessibility of progenitor cells in multiple organs during development potentially allows for a more efficient targeting of stem/progenitor cells following an IUT of viral vectors for gene therapy or genome editing. Additionally, IUT can be used to study normal developmental processes including, but not limited to, the development of immunologic tolerance. The murine model provides a valuable and affordable means to understanding the potential and limitations of IUT prior to pre-clinical large animal studies and an eventual clinical application. Here, we describe a protocol for performing an IUT in the murine fetus through intravenous and intra-amniotic routes. This protocol has been used successfully to elucidate the necessary conditions and mechanisms behind in utero hematopoietic stem cell transplantation, tolerance induction, and in utero gene therapy.

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

We describe a protocol for performing an in utero transplantation (IUT) through intravenous and intra-amniotic routes of injection in the murine model. This protocol can be used to introduce cells, viral vectors, and other substances into the unique immune-tolerant fetal environment.

İntravenöz ve içi amniyotik rahim içinde nakli fare modeli

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

Bütün Mount Epifluorescence kullanarak fare embriyogenez sırasında kalp odası gelişimin analizi

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Quantitative Micro-CT Analysis of Aortopathy in a Mouse Model of &#946;-aminopropionitrile-induced Aortic Aneurysm and Dissection

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of aortic disease exist, in vivo imaging of the vasculature has been limited. In recent years, micro-computerized tomography (micro-CT) has emerged as a preferred modality for imaging both large and small vessels both in vivo and ex vivo. In conjunction with a method of vascular casting, we have successfully used micro-CT to characterize the frequency and distribution of aortic pathology in &#946;-aminopropionitrile-treated C57/Bl6 mice. Technical limitations of this method include variations in the quality of the perfusion introduced by poor animal preparation, the application of proper methodologies for vessel size quantification, and the non-survivability of this procedure. This article details a methodology for the intravascular perfusion of a lead-based radiopaque silicone rubber for the quantitative characterization of aortopathy in a mouse model of aneurysm and dissection. In addition to visualizing aortic pathology, this method may be used for examining other vascular beds in vivo or vascular beds removed post-mortem.

This article describes a detailed methodology of using a radiopaque lead-based silicone rubber to perfuse the murine vasculature for aortic diameter quantification in a mouse model of aortic aneurysm and dissection.

Aortopathy aort anevrizması β-aminopropionitrile-indüklenen ve diseksiyon, fare modeli nicel mikro-CT Analizi

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of ...

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

Embriyonik Fare Kalpler Gelişmekte Hücre Etiketleme ve Enjeksiyon

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...