The authors would like to thank Dr. George Gittes for advice and expertise throughout this study. SSL was supported by an American Heart Association fellowship (11POST7330002). Further to this SSL and this study was supported by an NIDDK Mentored Research Scientist Development Award (DK096996) and by the Children&#8217;s Hospital of Pittsburgh.

NOTA: L&#39;Università di Pittsburgh Istituzionale Animal Care and Use Committee ha approvato tutti gli esperimenti. 1. Preparazione degli strumenti Ultrasound-microiniezione e embrioni <ol><li> Impostare palco, monte, e sonda (Figura 1), così come gli strumenti chirurgici (Figura 2). Luogo soluzione tampone fosfato salino (PBS) (pH7.4) a 37 ° C il riscaldamento bagno. Riempire microiniezione ago completamente con olio minerale, con siringa da 1 ml collegato a una seconda flessibile 25 ago G, attraverso la sua base. </li><li> Fissare ago sulla rotazione del braccio di montaggio, e vuota ago della soluzione di olio minerale. Re-riempire con 2,5 ml di soluzione TL. Assicurarsi che non bolle d&#39;aria sono presenti all&#39;interno l&#39;ago iniezione. Ruotare il braccio l&#39;ago verso la parete, lontano dal palcoscenico. </li><li> Anestetizzare la madre incinta in camera di anestesia via infusione continua di isoflurano. Quando la madre è uno stato di incoscienza, trasferire l&#39;anestesia per tubo naso posizionato sul clato audal del palco, e posto la madre in posizione supina con il muso in tubo naso per consentire la continuazione di uno stato completamente anestetizzato. </li><li> Arti nastro in angoli di 45 °, o con le mani ei piedi riposati e posizionati sovrastano schede / monitor temperatura ECG. È importante che la diga incinta è costantemente monitorata per garantire che l&#39;anestesia è sufficiente e che in pomata applicata agli occhi per ridurre l&#39;essiccazione. </li><li> Applicare il prodotto di rimozione dei capelli attraverso basso addome della madre, pulire delicatamente con tamponi di cotone asciutto, e poi di nuovo con un 70% di tamponi di cotone etanolo-saturi per rimuovere qualsiasi prodotto in eccesso e capelli. Assicurarsi di pulire la pelle addominale fuori di tutti i capelli nel sito di incisione (Figura 3). </li><li> Eseguire una laparotomia sulla madre incinta con pinze chirurgiche fini e forbici. Fare attenzione a non tagliare le navi grandi o organi viscerali. Fate prima incisione diritta dell&#39;epidermide 1,5-2 cm sopra la vagina e continuare tagliare verso costole per approximately 2-3 cm. Esporre la membrana sottocutanea, individuare la linea alba (&quot;linea bianca&quot;) (Figura 3), e tagliare parallelo incisione iniziale, lungo la stessa lunghezza, per esporre organi interni viscerali e sacculi uterini. </li></ol> 2. Estrazione di embrioni <ol><li> Utilizzare applicatori di cotone con punta da 6 pollici di manovra madre ed embrioni. Premere delicatamente (non forzare) sulla pelle con applicatore di manipolare primo embrione di apertura dell&#39;incisione. Dopo l&#39;estrazione del primo saccule dell&#39;embrione, delicatamente e lentamente tirare il resto del corno uterino attraverso e sulla parte esterna della madre. Evitare di tirare intestino o altri organi attraverso un&#39;incisione in questa fase. </li><li> Quantificare embrioni e inserire delicatamente corno uterino posteriore sinistra in madre. Poi iniziare mettendo il corno uterino destra nuovamente dentro la madre a partire dal lontano embrione sacculo dalla vagina sul corno e in movimento verso il basso. Continuare questo fino a soli due embrioni rimangono esposti (Fifigura 4). Infine, gli embrioni di posizione in una colonna sopra e parallela alla linea di incisione, essendo consapevoli di non tagliare la circolazione uterina. </li><li> Posizionare i blocchi di argilla e la posizione tra le braccia e il corpo, così come le gambe e la coda. Assicurarsi che le superfici in terra battuta sono circa livello con incisione laparotomica. Bagnare la piastra Petri finestrato con 37 ° C PBS. </li><li> Afferrare forcipe estendono con la mano destra e piatto fenestrato Petri con la mano sinistra (finestratura parallelo embrioni) e portare chiuso pinze ~ 5 cm attraverso fenestrazione, dalla parte superiore della scatola di Petri. Pinze aperte completamente senza strappi maglia finestratura. </li><li> Manovra mani sopra embrioni e concentrarsi vista sulle due sacculi embrione. Senza (o leggermente) toccando sacculi con finestratura meshing o pinze, farle scorrere attraverso fessura e impostare piastra di Petri sul ventre della madre. Con pinze ancora estese, manipolare maglia fenestrata a sedere su entrambi i lati e alla base di ogni embrione (Figura 5 </strong&gt;) e tirare pinze di apertura a fessura. </li><li> Quindi, posto di gomma blu contenente muro in capsula di Petri, senza pizzicare o ferire embrioni (Figura 6). Assicurarsi che i blocchi di argilla sono saldamente equilibrando capsula di Petri, embrione, e la parete contenenti gomma. Infine, riempire piastra di Petri con 37 ° C PBS fino embrioni sono completamente sommersi (Figura 6), controllando eventuali perdite a meshing fenestrata. </li></ol> Procedura 3. Iniezione <ol><li> Stadio inferiore iniezione con la madre e gli embrioni verso il basso con manopola di regolazione del livello Z (figura 1) e quindi ruotare ago per l&#39;iniezione e il braccio di montaggio e allineare direttamente con sonda ecografica, con ½ ago cm a sinistra e sotto la punta della sonda (Figura 7) . Spingere l&#39;ago-braccio (non l&#39;ago) a 45 ° di distanza dalla sonda. Fare attenzione a non colpire la punta dell&#39;ago con la sonda piatto o ad ultrasuoni. </li><li> Sollevare fase di iniezione di nuovo all&#39;altezza originale, con gli ultrasuoni probe direttamente sopra Probe embrioni deve essere un po &#39;sommerso e entro 3-4 mm del tessuto embrionale. Usa X &amp; Y manopole di regolazione fase (Figura 8) per modificare la posizione dell&#39;embrione / madre / stage per individuare sistematicamente cuore embrionale battere. </li><li> Direttamente Centro di schermo ultrasuoni osservare un pennarello nero bersaglio centro disegnato (*). Individuare ventricolo sinistro (preferibile) o Atrium con le manopole di regolazione fase X &amp; Y (Figura 8) e poi alzare o abbassare il palco con la manopola girevole sul palco per posizionare obiettivo iniezione esattamente sopra il marker nero sullo schermo ultrasuoni. </li><li> Utilizzare X manopola di regolazione fase embrionale per spostare a destra, fuori dello schermo ultrasuoni. Riposizionare microiniezione ago e il braccio in posizione, ½ cm di distanza dal e 90 ° rispetto alla sonda ecografica (Figura 7). </li><li> Utilizzando microiniezione montaggio manopole di regolazione (figura 9C-G), la posizione dell&#39;ago con la punta chiaramente aligned con il marcatore centrale. Regolare l&#39;angolo di iniezione (con manopole in Figura 9C &amp; EG), e X, Y, Z e vettori di micro-aghi per garantire punta dell&#39;ago è focalizzata nel piano corretto. Ritrarre microiniezione ago utilizzando esclusivamente la manopola &quot;iniezione&quot; (Figura 9F), attenzione a non modificare altre dimensioni. </li><li> Ancora una volta, utilizzando esclusivamente l&#39;X regolazione fine manopola fase embrionale mossa di nuovo sotto la sonda, con l&#39;obiettivo esattamente sul segno centrale sullo schermo ultrasuoni. Assicurarsi che il ventricolo sinistro è ora esattamente nella stessa X, Y, e Z aereo. </li><li> Successivamente, con la sola manopola &quot;iniezione&quot; sul supporto microiniezione, lentamente forare embrione con l&#39;ago microiniezione e gradualmente portare punta nel ventricolo sinistro. Iniettare il pieno di 2,5 ml di soluzione di TL in ventricolo sinistro o fino a quando i segnali acustici di allarme vuote, tenendo &quot;vuoto&quot; e toccando &quot;riempire&quot; una volta (figure 2A &amp; B). In questo momentodell&#39;iniezione osservare un&#39;ombra proveniente dalla punta dell&#39;ago che è la TL entrare nella camera cardiaca (Figura 10). In contrario, ritirare rapidamente microiniezione ago ruotando la manopola &quot;iniezione&quot; (Figura 9F) sulla microiniezione monte quando l&#39;iniezione è completa. </li><li> Proseguimento per il prossimo dell&#39;embrione e ripetere la procedura per embrioni rimanenti seguito questa serie di passaggi e, infine, mettere gli embrioni finali nuovamente dentro l&#39;addome della diga. Passare anestesia a scatola da camera e spostare delicatamente la madre qui per 15 minuti dal momento dell&#39;ultima iniezione. </li></ol> 4. raccolta embrioni e analisi <ol><li> Sacrifica diga via dislocazione cervicale. Espandere l&#39;incisione laparotomica per rimuovere facilmente le corna uterine dalla madre. Mantenere gli embrioni all&#39;interno dell&#39;utero sac. Mettere embrioni in raffreddato PBS. </li><li> Sezionare embrioni da uterino sac (se il tessuto necessario per raccogliere genotipizzazione) e porre il tutto embrione in 4% paraformaldeide (PFA) durante la notte, poi in 30% di saccarosio durante la notte, congelare in criostato sezionamento di media. Poi tagliare il cryosection e posizionarlo su vetrini per l&#39;analisi immunoistochimica. Facoltativamente, utilizzare tessuti di tutto il montaggio da disidratazione in 100% di metanolo, dopo fissazione in 4% PFA. </li><li> Per l&#39;analisi immunoistochimica mettere le criosezioni in PBS per rimuovere Office. Poi bloccare le sezioni con siero normale asino 10% per 30 min. Quindi aggiungere anticorpo primario PECAM a 1: 100 diluizione notte a 4 ° C. Il giorno dopo, lavare i vetrini in PBT 3 volte per 10 minuti ciascuno e aggiungere asino contro ratto 594 secondaria e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. NOTA: Questa è una tecnica molto esigente che richiede l&#39;ottimizzazione e il coordinamento di ultrasuoni e microiniezione. C&#39;è una curva di apprendimento molto ripida legati a questa tecnica e richiede 4-6 settimane di iniezioni mentore prima si diventa abili. </li></ol>

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	<li>Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+formation+of+microvasculature+in+the+developing+kidney.">Origins and formation of microvasculature in the developing kidney.</a> Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).</li><li>Sims-Lucas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Progenitors+Exist+within+the+Kidney+and+Lung+Mesenchyme.">Endothelial Progenitors Exist within the Kidney and Lung Mesenchyme.</a> PloS one. 8 (6), e65993 (2013).</li><li>Dressler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+early+kidney+specification,+development+and+patterning.">Advances in early kidney specification, development and patterning.</a> Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).</li><li>Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+controls+and+cellular+behaviors+in+branching+morphogenesis+of+the+renal+collecting+system.">Genetic controls and cellular behaviors in branching morphogenesis of the renal collecting system.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (5), 693-713 (2012).</li><li>Costantini, F., Kopan , R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+a+complex+organ:+branching+morphogenesis+and+nephron+segmentation+in+kidney+development.">Patterning a complex organ: branching morphogenesis and nephron segmentation in kidney development.</a> Dev Cell. 18 (5), 698-712 (2010).</li><li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+crosstalk+regulates+kidney+progenitor+cell+differentiation.">Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation.</a> Nat Cell Biol. 15 (9), 1035-1044 (2013).</li><li>Rymer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+blood+flow+and+oxygenation+drive+nephron+progenitor+differentiation.">Renal blood flow and oxygenation drive nephron progenitor differentiation.</a> Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).</li><li>Shah, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+mouse+blood+flow+and+oxygen+correlate+with+early+pancreatic+differentiation.">Embryonic mouse blood flow and oxygen correlate with early pancreatic differentiation.</a> Developmental biology. 349 (2), 342-349 (2011).</li><li>Andres, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphB4+receptor+tyrosine+kinase+transgenic+mice+develop+glomerulopathies+reminiscent+of+aglomerular+vascular+shunts.">EphB4 receptor tyrosine kinase transgenic mice develop glomerulopathies reminiscent of aglomerular vascular shunts.</a> Mech Dev. 120 (4), 511-516 (2003).</li><li>Wagner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+kidney+vascular+corrosion+casts+with+Nano-CT.">High-resolution imaging of kidney vascular corrosion casts with Nano-CT.</a> Microsc Microanal. 17 (2), 215-219 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Microiniezione anestesia e tempi Per quanto riguarda anesthetization della madre, è essenziale per mantenere costante il flusso d&#39;aria (2-3 L / min) e la bassa PSI. Il flusso del sedativo deve essere tenuto a circa 1,75-2 L / min. Contemporaneamente, tempi in cui le iniezioni hanno luogo devono essere attentamente monitorati e controllati per con ogni cucciolata. Per ogni cucciolata la procedura di iniezione deve essere tenuto sotto 45 min. L&#39;importanza di tale termine è fondamenta...

Durante lo sviluppo embrionale, due processi vascolari discreti, ma simultanei avvengono: angiogenesi, il processo mediante il quale una nave cresce da un vaso, e vasculogenesi pre-esistente, che è una formazione de novo di navi da residenziali progenitori endoteliali 1,2. Rispettivamente, il primo è sinonimo di flusso sanguigno, mentre il secondo è pensato avvenire sostanzialmente in assenza di esso. Simultanea di formazione dei vasi sanguigni, un processo ciclico e dinamico della sintesi progenitrici delle cellule renali, la proliferazione e la differenziazione comincia a svolgersi il giorno embrionale 9.5 (E9.5). A questo punto la gemma ureterale (UB) invade dorsale in circostante mesenchima metanefrico (MM), e continua fino alla nascita 3. Ripetuto ramificazione della UB in rapida condensazione metanefrico tappo mesenchima inizia la formazione delle unità funzionali del rene, nefrone. Con ogni nuova generazione di UB e nephron, le vecchie generazioni sono collocate in regioni corticali e midollari interni, dove poi subiscono ulteriore maturazione e differenziazione all&#39;interno di ambienti prevalentemente vascolare-densi. Come evidenziato da Dressler et al. 3, questo processo embrionale viene precipitato mediante segnalazione induttivo, come crosstalk tra UB e MM, e una miriade di fattori extracellulari 3-6. Due fattori extracellulari recentemente esaminato entro il pancreas e reni in via di sviluppo includono tensione di ossigeno e il flusso di sangue 7,8. Quest&#39;ultimo sarà discusso in maggior dettaglio nel seguito con riferimento allo sviluppo del rene. Per esporre il ruolo induttiva che il flusso di sangue potenzialmente gioca nella differenziazione delle cellule progenitrici nefrone, così come in altri processi organogenesi, metodi precise ed accurate di mappatura del flusso sanguigno embrionale è imperativo. Metodi alternativi di misurazione del flusso sanguigno includono la prescrizione di ultrasound immagini e resina calchi 9,10. Conclusivamente, queste modalità hanno dimostrato di essere intrinsecamente carente nella loro capacità di svelare contemporaneamente giustapposizioni temporali e spaziali tra il flusso di sangue e di differenziazione delle cellule staminali. Calchi in resina, per esempio, offrono un valido modello di patterning nave nei tessuti adulti, ma in vasi immaturi, come ad esempio con punti di tempo embrionali, le navi sono gravemente sottosviluppati e perde. Pertanto, la resina getta non riescono a tenere all&#39;interno dei vasi piccoli, spesso porosi,. Per questi ostacoli apparenti, tra gli altri, abbiamo scelto di integrare ecoguidata in vivo intra-cardiaca embrionale lectina pomodoro (TL) microiniezioni nelle nostre indagini di sviluppo del rene. In questa procedura utilizziamo una sonda ad ultrasuoni per guidare in modo sincrono una micropipetta ago montato riempita con 2,5 ml di soluzione TL nel ventricolo sinistro di embrioni di topo in punti E11.5, E13.5, E15.5 e E17.5 tempo. E17.5 È l&#39;ultima età evolutiva come gli aghi non sono abbastanza forti per penetrare l&#39;embrione più sviluppato. I vantaggi di questo metodo sono abbondanti microiniezione. Microiniezione Ultrasound-guida permette il posizionamento preciso di un ago per iniezione nel ventricolo embrionale di sinistra, espulsione passiva e controllata della soluzione nel cuore pulsante dell&#39;animale, il minimo danno al cuore e tessuti circostanti, e la prevenzione di improvvisa insufficienza cardiaca e morte embrione prima della perfusione tutto il corpo. Con l&#39;uso di un TL FITC-marcato, qualsiasi vascolarizzazione perfuso manterrà il marker lungo il suo endoteliale membrana apicale. In combinazione con l&#39;immunoistochimica, utilizzando pecam (CD31, Platelet endoteliale molecola di adesione delle cellule) e vari altri marker vascolari, siamo in grado di distinguere chiaramente tra navi perfuso e non-perfusione, nonché caratterizzare qualsiasi colorazione anomala dei tessuti circostanti.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>022M4004V</td><td>concentration 1:5,000</td></tr><tr><td>Pecam</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>concentration 1:100</td></tr><tr><td>FITC-Tomato Lectin</td><td>Vector Laboratories</td><td>FL-1321</td><td>concentration 2.5 &amp;micro;l / embryo</td></tr><tr><td>Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>712-585-150</td><td>concentration 1:200</td></tr><tr><td>Microinjection Needle</td><td>Origio Mid Atlantic Devices</td><td>C060609</td><td></td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26291</td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-377-20</td><td></td></tr><tr><td>Clay Blocks</td><td>Fisher Scientific</td><td>HR4-326</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Tape</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-999-380</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9763655</td><td></td></tr><tr><td>Hair Removal Product</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0132811</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>Fine Science tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11064-07</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Marking Pen</td><td>Fine Science tools</td><td>18000-30</td><td></td></tr><tr><td>Right angle forceps (for hysterectomy)</td><td>Fine Science tools</td><td>11151-10</td><td></td></tr></tbody></table>

in utero intra-cardiac tomato-lectin injections on mouse embryos to gauge renal blood flow

La formazione e la perfusione di sviluppare vasi sanguigni renali (a parte glomeruli) sono molto poco studiato. Come vascolare si sviluppa attraverso l&#39;angiogenesi (che è la diramazione dei vasi) e vasculogenesi (de novo formazione dei vasi), tecniche di mappatura di perfusione, come calchi in resina, in vivo imaging ad ultrasuoni, e micro-dissezione sono stati limitati a dimostrare le relazioni intime tra questi due processi e le strutture renali in via di sviluppo all&#39;interno dell&#39;embrione. Qui, descriviamo la procedura di in utero intra-cardiaca ecoguidata FITC-etichettati pomodoro microiniezioni lectine su embrioni di topo per valutare l&#39;ontogenesi della perfusione renale. Pomodoro lectina (TL) è stato perfuso tutta l&#39;embrione e reni raccolto. I tessuti sono stati co-colorate per varie strutture renali, tra cui: i progenitori nefrone, strutture nefrone, ureterale epitelio, e vascolare. A partire da E13.5 grandi vasi di grosso calibro sono stati perfusi, tuttavia periferichenavi rimaste unperfused. Con E15.5 e E17.5, piccoli vasi periferici e glomeruli iniziato a diventare perfusione. Questa tecnica sperimentale è critico per studiare il ruolo della vascolarizzazione e del flusso sanguigno durante lo sviluppo embrionale.

Formazione vascolare precede flusso in via di sviluppo del rene La maggioranza di tessuto embrionale (compreso il rene) contiene un sistema vascolare denso (sia unperfused e perfuso), anche a primi punti temporali embrionali. Per meglio calibro e analizzare il flusso di sangue all&#39;interno del rene sviluppo abbiamo utilizzato un metodo di In Utero microiniezioni intracardiache embrionali. Con l&#39;uso di un ultrasuoni ad alta risoluzione per identificare cuore embrionale E11.5 E17.5 attr...

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In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

In Utero iniezioni intra-cardiaca di pomodoro-lectine su embrioni di topo per valutare renale Blood Flow

The formation and perfusion of developing renal blood vessels (apart from glomeruli) are greatly understudied. As vasculature develops via angiogenesis ...

in-utero-intra-cardiac-tomato-lectin-injections-on-mouse-embryos-to

Universidad de Cartagena UDEC

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JoVE Journal

Developmental Biology

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

9.7K Views.  Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC. This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

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A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

Un modello murino di Nell&#39;utero Trapianto

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

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Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or &#945;v&#946;3) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.

Here, we present a protocol to inject ultrasound microbubble contrast agents into living, isolated late-gestation stage murine embryos. This method enables the study of perfusion parameters and of vascular molecular markers within the embryo using contrast-enhanced high-frequency ultrasound imaging.

Contrast Imaging in embrioni di topo Utilizzo ad alta frequenza Ultrasound

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Biologia dello sviluppo

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and acquired diseases. Apart from congenital or inherited abnormalities with the requirement for long-term expression of the delivered gene, several non-inherited perinatal conditions, where short-term gene expression or pharmacological intervention is sufficient to achieve therapeutic effects, are considered as potential future indications for this kind of approach. Candidate diseases for the application of short-term prenatal therapy could be the transient neonatal deficiency of surfactant protein B causing neonatal respiratory distress syndrome1,2 or hyperoxic injuries of the neonatal lung3. Candidate diseases for permanent therapeutic correction are Cystic Fibrosis (CF)4, genetic variants of surfactant deficiencies5 and &alpha;1-antitrypsin deficiency6.
Generally, an important advantage of prenatal gene therapy is the ability to start therapeutic intervention early in development, at or even prior to clinical manifestations in the patient, thus preventing irreparable damage to the individual. In addition, fetal organs have an increased cell proliferation rate as compared to adult organs, which could allow a more efficient gene or stem cell transfer into the fetus. Furthermore, in utero gene delivery is performed when the individual's immune system is not completely mature. Therefore, transplantation of heterologous cells or supplementation of a non-functional or absent protein with a correct version should not cause immune sensitization to the cell, vector or transgene product, which has recently been proven to be the case with both cellular and genetic therapies7.
In the present study, we investigated the potential to directly target the fetal trachea in a mouse model. This procedure is in use in larger animal models such as rabbits and sheep8, and even in a clinical setting9, but has to date not been performed before in a mouse model. When studying the potential of fetal gene therapy for genetic diseases such as CF, the mouse model is very useful as a first proof-of-concept because of the wide availability of different transgenic mouse strains, the well documented embryogenesis and fetal development, less stringent ethical regulations, short gestation and the large litter size.
Different access routes have been described to target the fetal rodent lung, including intra-amniotic injection10-12, (ultrasound-guided) intrapulmonary injection13,14 and intravenous administration into the yolk sac vessels15,16 or umbilical vein17. Our novel surgical procedure enables researchers to inject the agent of choice directly into the fetal mouse trachea which allows for a more efficient delivery to the airways than existing techniques18.

We developed a novel surgical approach for intratracheal administration of bioactive agents into the mouse fetus. The delivery route is more efficient in targeting the fetal mouse lungs than the commonly used intra-amniotic injection. This procedure has to date not been described in a mouse model.

Un nuovo approccio chirurgico per somministrazione endotracheale di agenti bioattivi in ​​un modello murino fetale

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Murine Fetal Echocardiography

Transgenic mice displaying abnormalities in cardiac development and function represent a powerful tool for the understanding the molecular mechanisms underlying both normal cardiovascular function and the pathophysiological basis of human cardiovascular disease. Fetal and perinatal death is a common feature when studying genetic alterations affecting cardiac development 1-3. In order to study the role of genetic or pharmacologic alterations in the early development of cardiac function, ultrasound imaging of the live fetus has become an important tool for early recognition of abnormalities and longitudinal follow-up. Noninvasive ultrasound imaging is an ideal method for detecting and studying congenital malformations and the impact on cardiac function prior to death 4. It allows early recognition of abnormalities in the living fetus and the progression of disease can be followed in utero with longitudinal studies 5,6. Until recently, imaging of fetal mouse hearts frequently involved invasive methods. The fetus had to be sacrificed to perform magnetic resonance microscopy and electron microscopy or surgically delivered for transillumination microscopy. An application of high-frequency probes with conventional 2-D and pulsed-wave Doppler imaging has been shown to provide measurements of cardiac contraction and heart rates during embryonic development with databases of normal developmental changes now available 6-10. M-mode imaging further provides important functional data, although, the proper imaging planes are often difficult to obtain. High-frequency ultrasound imaging of the fetus has improved 2-D resolution and can provide excellent information on the early development of cardiac structures 11.

Fetal and perinatal death is a common feature when studying genetic alterations affecting cardiac development. High-frequency ultrasound imaging has improved 2-D resolution and can provide excellent information on early cardiac development and is an ideal method to detect the impact on cardiac structure and function prior to death.

Murine ecocardiografia fetale

Transgenic mice displaying abnormalities in  cardiac development and function represent a powerful tool for the understanding  the molecular mechanisms ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease and injury regional estimates, World Health Organization, 2004). Surgeries that often compromise the quality of life are required to correct heart defects, reminding us of the importance of finding the causes of CHD. Mutant mouse models and live imaging technology have become essential tools to study the etiology of this disease. Although advanced methods allow live imaging of abnormal hearts in embryos, the physiological and hemodynamic states of the latter are often compromised due to surgical and/or lengthy procedures. Noninvasive ultrasound imaging, however, can be used without surgically exposing the embryos, thereby maintaining their physiology. Herein, we use simple M-mode ultrasound to assess heart rates of embryos at E18.5 in utero. The detection of abnormal heart rates is indeed a good indicator of dysfunction of the heart and thus constitutes a first step in the identification of developmental defects that may lead to heart failure.

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Ultra-high frequency ultrasound is a powerful live imaging tool to examine cardiac abnormalities in small animals. Its noninvasiveness allows maintaining the physiologic state of embryos. Herein, we show the use of M-mode ultrasound to measure the heart rates of embryos at E18.5 in utero.

In utero Misurazione della frequenza cardiaca in mouse da non invasiva ecocardiografia M-mode

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances early in the gestation. The rationale behind IUT for therapeutic purposes is based on the small size of the fetus, the fetal immunologic immaturity, the accessibility and proliferative nature of the fetal stem or progenitor cells, and the potential to treat a disease or the onset of symptoms prior to birth. Taking advantage of these normal developmental properties of the fetus, the delivery of hematopoietic stem cells (HSC) via an IUT has the potential to treat congenital hematologic disorders such as sickle cell disease, without the required myeloablative or immunosuppressive conditioning required for postnatal HSC transplants. Similarly, the accessibility of progenitor cells in multiple organs during development potentially allows for a more efficient targeting of stem/progenitor cells following an IUT of viral vectors for gene therapy or genome editing. Additionally, IUT can be used to study normal developmental processes including, but not limited to, the development of immunologic tolerance. The murine model provides a valuable and affordable means to understanding the potential and limitations of IUT prior to pre-clinical large animal studies and an eventual clinical application. Here, we describe a protocol for performing an IUT in the murine fetus through intravenous and intra-amniotic routes. This protocol has been used successfully to elucidate the necessary conditions and mechanisms behind in utero hematopoietic stem cell transplantation, tolerance induction, and in utero gene therapy.

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

We describe a protocol for performing an in utero transplantation (IUT) through intravenous and intra-amniotic routes of injection in the murine model. This protocol can be used to introduce cells, viral vectors, and other substances into the unique immune-tolerant fetal environment.

Endovenosa e Intra-amniotic nell'Utero trapianto nel modello murino

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ultrastructural parameters in unambiguously identified topographical structures, affected by a protein of interest that is introduced into the organism via viral transfer. This combined approach allows for a smooth transition from macrostructural to ultrastructural identification by following topographical navigation maps in a tissue atlas. High-resolution electron microscopy of the in-utero-transduced tissue reveals the fine ultrastructure of the neuropil and its plasticity parameters, such as cross-sectioned synaptic bouton areas, the number of synaptic vesicles and mitochondria within a bouton profile, the length of synaptic contacts, cross-sectioned axonal areas, the thickness of myelin sheaths, the number of myelin lamellae, and cross-sectioned areas of mitochondria profiles. The analysis of these parameters reveals essential insights into changes of ultrastructural plasticity in the areas of the nervous system that are affected by the viral transfer of the genetic construct. This combined method can not only be used for studying the direct effect of genetically engineered biomolecules and/or drugs on neuronal plasticity but also opens the possibility to study the in utero rescue of neuronal plasticity (e.g., in the context of neurodegenerative diseases).

The combination of transmission electron microscopy and in utero transduction is a powerful approach for studying morphological changes in the fine ultrastructure of the nervous system during development. This combined method allows deep insights into changes in structural details underlying neuroplasticity with respect to their topographical representation.

Valutazione dei parametri di neuroplasticità ultrastrutturali dopo In Utero trasduzione del Mouse cervello e midollo spinale

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

Analisi della camera cardiaca sviluppo durante l'embriogenesi del Mouse utilizzando l'intero Monte epifluorescenza

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Quantitative Micro-CT Analysis of Aortopathy in a Mouse Model of &#946;-aminopropionitrile-induced Aortic Aneurysm and Dissection

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of aortic disease exist, in vivo imaging of the vasculature has been limited. In recent years, micro-computerized tomography (micro-CT) has emerged as a preferred modality for imaging both large and small vessels both in vivo and ex vivo. In conjunction with a method of vascular casting, we have successfully used micro-CT to characterize the frequency and distribution of aortic pathology in &#946;-aminopropionitrile-treated C57/Bl6 mice. Technical limitations of this method include variations in the quality of the perfusion introduced by poor animal preparation, the application of proper methodologies for vessel size quantification, and the non-survivability of this procedure. This article details a methodology for the intravascular perfusion of a lead-based radiopaque silicone rubber for the quantitative characterization of aortopathy in a mouse model of aneurysm and dissection. In addition to visualizing aortic pathology, this method may be used for examining other vascular beds in vivo or vascular beds removed post-mortem.

This article describes a detailed methodology of using a radiopaque lead-based silicone rubber to perfuse the murine vasculature for aortic diameter quantification in a mouse model of aortic aneurysm and dissection.

Analisi quantitativa di Micro-CT di Aortopathy in un modello murino di indotta da β-aminopropionitrile aneurisma e dissezione

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of ...

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

Etichettatura cellulare e iniezione nello sviluppo embrionali Cuori mouse

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

In Utero iniezioni intra-cardiaca di pomodoro-lectine su embrioni di topo per valutare renale Blood Flow

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Un modello murino di Nell'utero Trapianto

Contrast Imaging in embrioni di topo Utilizzo ad alta frequenza Ultrasound

Un nuovo approccio chirurgico per somministrazione endotracheale di agenti bioattivi in un modello murino fetale

Murine ecocardiografia fetale

In utero Misurazione della frequenza cardiaca in mouse da non invasiva ecocardiografia M-mode

Endovenosa e Intra-amniotic nell'Utero trapianto nel modello murino

Valutazione dei parametri di neuroplasticità ultrastrutturali dopo In Utero trasduzione del Mouse cervello e midollo spinale

Analisi della camera cardiaca sviluppo durante l'embriogenesi del Mouse utilizzando l'intero Monte epifluorescenza

Analisi quantitativa di Micro-CT di Aortopathy in un modello murino di indotta da β-aminopropionitrile aneurisma e dissezione

Etichettatura cellulare e iniezione nello sviluppo embrionali Cuori mouse

In Utero iniezioni intra-cardiaca di pomodoro-lectine su embrioni di topo per valutare renale Blood Flow

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Analisi della camera cardiaca sviluppo durante l'embriogenesi del Mouse utilizzando l'intero Monte epifluorescenza

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