This work has been supported by the DFG grant JE 252/7.

Peptit Dizilerinin 1. Hazırlık <ol><li> Peptit Dizilerin Programlama <ol><li> MultiPep gözcü yazılımı kullanılarak sentez için peptid sekansları sunabilirler. Tek harf kodları peptid dizileri girin. Peptid 1: TARKSTGGKA </li><li> Tanımlanmış bir tabakanın tanınması için gerekli önemli amino asitleri ekrana belirli bir komutla (.Kapağı, A) alanin veya arginin yürüyüş kütüphaneleri oluşturun. Aşağıdaki örnekte Örneğin birinci hat yabanıl tip sekans, ikinci hattan bir peptid içinde bulunan her bir amino asit alanin arda değiştirilir. , A yerine TARKSTG Bir -ARKSTG T A -RKSTG TA-A -KSTG TAR A -STG TARK- bir -TG TARKS- bir -G TARKST- A </li><li> Benzer komutları (.Kapağı R kullanın.Tüm doğal mevcut amino asit kalıntısının (sonunda sistein, metionin ve triptofan iptaliyle 1.1.2 tarif edildiği gibi, bu tortuları, oksitlenmeye eğilimlidir ve bazen daha düşük sentez verimi olduğu için), N, vs.) yerine konsensüs saptanması için bir peptit dizisini sentezleme Bir enzim için alt-tabaka dizisi motifi. NOT: Şekil 4A&#39;da gösterildiği gibi, yatay eksen verilen peptit dizisini temsil eder ve dikey eksen ise bir komut için, seçilen amino asitleri temsil eder. 1.1.2 gösterilen sekansına benzer bir şekilde, dikey bir eksen üzerinde bir Ala şekil l&#39;de ilk satırda verilmiştir dizisinin her pozisyonunu değiştirir anlamına gelir. 4A. Benzer şekilde arjinin sekans ve bu başka amino asitler ile ikinci sırada bulunan her bir amino asidi değiştirir. Tam peptid dizisi kütüphaneleri sistematik th ile birlikte gelen peptid alt-tabakası sırayla her bir tortu yerine sentezlenire diğer doğal olarak mevcut amino asit kalıntıları, bu verilen sırada, her pozisyonda her bir kalıntı etkisi anlamaya yardımcı olur. </li><li> Seçenek olarak ise, bilinen ya da tahmin edilen peptit alt tabakasma metilasyonu kolayca pozitif ve negatif kontroller metilasyon ile birlikte PKMT hedef peptidleri ile (metillenmiş bilinen ya da metile olduğu bilinmemektedir örneğin peptitler) peptid kütüphaneleri sentezlenmesi doğrulanabilir. Manuel programlama ile aşağıda gösterildiği gibi hedef lizin metilasyonunu onaylamak için alanin için varsayılan hedef lisin alışverişi peptidler sentez. Yabani tip peptit STGG K PRQFL Mutant peptit STGG bir PRQFL NOT: Yazılım aynı zamanda bir etkileşim için gerekli önemli amino asitleri eşleştirmek için dizinin istenen çerçeve kayması ile epitop haritalama gibi, çeşitli kütüphaneleri oluşturmak için doğal komut vardır. </li></ol></li><li> Membranın hazırlanması, amino asitler, bird Reaktifler <ol><li> 10 dakika boyunca, DMF (N, N-dimetilformamid) SPOT membran Ön kabarma ve bundan sonra da hava kabarcığı ve kırışıklık olmadan yerinde birleştirici çerçeve ıslak membran yerleştirin. </li><li> Membrana% 100 etanol ile üç kez yıkayın. Sentez programına başlamadan önce en az 10 dakika boyunca tamamen membranlar kurulayın. </li><li> Buna paralel olarak, taze NMP içinde çözdürülerek ticari olarak temin edilebilen Fmoc-korumalı amino asitler, 0.5 M çalışma konsantrasyonları hazırlamak ve Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi, aynı zamanda aktivatörü ve baz hazırlar. </li><li> SPOT synthesizer tüm atık çözüm kapları boşaltılması emin olun ve DMF, etanol ve piperidin solvent rezervuarları doldurun. NOT: Şimdi makine sentezi için hazır hale gelir. </li></ol></li><li> Birinci Amino Asit lekelenme <ol><li> Reklam tarafından gelen bir amino asidin karboksi grubunun aktif hale, zar üzerinde serbest amino grubu ile amit bağı oluşturmak içinDing aktivatör (N, N &#39;diizopropilkarbodiimid) ve amino asit türevine baz çözeltisi (Etil hidroksiimino siyanoasetat). </li><li> Programlanabilir robot kullanarak Amino-PEG işlevlendirilmiş membran üzerinde aktif amino asitler istenen hacimleri Nokta. NOT: Bu şekilde, bir amino asit, C-terminali zar amino grubuna birleştirilir. </li><li> İlk aktive amino asitin iyi kavramayı sağlamak için bu adımı üç kez tekrarlayın. Bağlanmamış amino asitlerini ayırmak için DMF ile yıkama, daha sonra 20 dakika boyunca zarın inkübe ve. </li></ol></li><li> Sigara nokta Alanları Ücretsiz Mekanların Engelleme Not: membran amino grubuna tüm peptitlerin birinci C-terminal amino asidin bağlanmasından sonra, lekeler ve ayrıca bir yer alanları içinde amino gruplarının bazıları arasındaki amino grupları, amino asitler ile bağlar oluşturmazlar. <ol><li> Kapama çözeltisi ile inkübe edilerek, bu, serbest amino grubu bloke (DMF içinde% 20 asetik anhidrit)5 dakika karıştırıldı. NOT: Bu membran yerine büyüyen peptid zinciri ile diğer çevrimlerde amino asitlerin bağlanmasını önler. </li></ol></li><li> Fmoc grubunun çıkarılması, <ol><li> Bloke edildikten sonra, DMF ile 4 kez zarın yıkanması ve daha sonra Fmoc koruma grubunun ayrılması için 20 dakika süre ile, DMF içinde% 20 piperidin ile inkübe edilir. NOT: Bu adım, bir amino-koruyucu Fmoc gruplarının bertaraf yol açar ve bu korumanın kaldırılması olarak adlandırılır. </li><li> Daha sonra etanol ile iki kez DMF ile birlikte iki kez, zarı yıkamak ve kurutun. Not: Hemen zar sonraki amino asitleri bağlamak için hazır hale gelir. </li></ol></li><li> Zincir uzama Not: her bir amino asit ilave edilmesi, bir devir denir. Yanı sıra, birinci amino asidin bağlanması ile ilgili çevrim bağlanmış amino asidin N Fmoc grubunun korumasının bozulması ile başlamakta ve büyüyen girişken amino grubuna gelen bir amino asidin aktive edilmiş karboksil grubunun bağlanması izlergelgit zinciri. <ol><li> İstenen peptid uzunluğu elde edilinceye kadar tekrarlayın 1.3 ve 1.5 adımları. </li></ol></li><li> Boyanma NOT: Son devirden sonra, peptid dizileri peptitlerin başarılı bir sentez teyit etmek için bromofenol mavisi ile boyanır. Bromofenol mavisi peptidlerin serbest amino grupları ile bağlanmaktadır. Peptit noktalar boyandıktan sonra açık mavi renk göstermek ama noktalar yoğunluğu peptid dizisi bağlı olarak değişir. Bu boyama peptidlerin renklendirilmesi çünkü piperidin bromofenol mavisi mevcudiyetinde, piperidin tamamen kaldırılması onay sağlar. Buna ek olarak, bu aynı zamanda daha fazla kullanım için peptid dizilerini işaretlemek için yardımcı olur. <ol><li> Son sentez çevriminde Fmoc grubunun korumasının giderilmesinden sonra, DMF ve% 100 etanol ile zarın yıkanması. Bu tamamen mavi olana kadar daha sonra 5 dakikalık bir minimum bromofenol mavisi (DMF içinde% 0.02 bromofenol mavisi) ile membran tedavi. </li><li> Daha sonra, DMF ve ETH ile kesilmesi, zarı yıkamakAnole 10 dakika boyunca kurutuldu. Şimdi synthesizer gelen zarı çıkar ve elle yan zincir Deproteksiyon (bölüm 1.8) gerçekleştirin. Gerekirse, peptid sentezi (Şekil. 2) sonuçlarını belgelemek için membran fotoğraflamak. </li></ol></li><li> Yan zincir korumasının bozulması <ol><li> Yan zincir koruma grupları ve tutucu reaktifler (% 2.5 su ve% 2.5 triizopropilsilan) amino asit yan zincirleri korumak bölmek için% 95 trifloroasetik asit (TFA) &#39;den oluşan bir yan zincir koruma kaldırma karışımının 20-25 ml membranlar tedavi Bu aşama sırasında değişiklik. Tamamen sıkıca kapalı kimyasal dirençli kutusunda zarı kapsamaktadır sağlamak ve yavaşça çalkalayarak 1-2 saat kuluçkaya yatırmaktır için korumayı kaldırma karışımın yeterli bir hacmi al. </li><li> 2 dakika her biri için, DCM (Diklorometan), 20-25 ml, membran altı kez yıkayın ve son olarak iki kez% 100 etanol ile ve gece boyunca bir kurutucu içinde kurutun. NOT: ŞimdiMembran deneyleri için de kullanılabilir. Peptid dizisi bir sentezleme şeması Şekil 1 &#39;de verilmiştir. </li></ol></li></ol> 2. Protein Ekspresyonu ve Saflaştırma <ol><li> GST füzyonları olarak PKMTs Protein Ekspresyonu <ol><li> Standart teknikler kullanılarak GST-füzyon proteini olarak ifade etmek tam uzunluktaki PKMT ya da (pGEX-6p2) gibi bir bakteriyel ekspresyon vektörü içine katalitik domenini kodlayan genin klonlanması. </li><li> BL21 BL21 veya kodon artı E. takın istenen PKMT ile vektör aktarın ısı şoku yöntemi ya da herhangi bir başka yöntem ile coli hücreleri. </li><li> İfade gün Luria-Bertani (LB) ortamı içinde 30 ml bir ön-kültür hazırlanması ve sürekli çalkalanarak 7-8 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Daha sonra, LB ortamı 1 L ihtiva eden bir 2 L&#39;lik büyük saptırma plakalı şişeler içine ön kültür, 10 ml transferi ve 37 ° C&#39;de inkübe Kültür ulaşamayacağı kadar sürekli sallayarak inkübatör ° C600 nm &#39;de tanımlanan bir optik yoğunluk, es. Not: Bu, her bir protein için optimize edilebilir birlikte, rutin olarak yaklaşık 0.8 olan bir OD 600Nm neden olur. indüksiyon sıcaklığı her bir protein için optimize edilmiş olması gerekir, bazı proteinler 22 ° C&#39;de iyi bir ifade göstermektedir ° C ve daha yüksek sıcaklıklarda bir. </li><li> Daha sonra izopropil-p-D-tiyogalaktopiranosid 1 mM; özellikle, 15 dakika boyunca indüksiyon sıcaklığına hücreleri Shift Kültür indüksiyon sıcaklığında 10-12 saat boyunca büyümeye olanak sağlar. </li><li> Daha sonra 15 dakika boyunca 5000 x g&#39;de santrifüj ile hücreler hasat ve son olarak da daha fazla kullanım için -20 ° C &#39;de STE tampon maddesi (10 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCI ve 0.1 mM EDTA) ve mağaza 30 ml pelet yıkayın. </li></ol></li><li> Protein Saflaştırma <ol><li> Hücre topağı çözülme ve sonikasyon tamponu (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCI, 1 mM DTT ve% 5 gliserol) 30 ml yeniden askıya ve sonikasyon ile bozmaktadır. NOT: Bu tampon nEEDS sonuç olarak her bir protein için optimize edilmiş olması. </li><li> 1 saat süre ile 22,000 x g&#39;de hücre lizat santrifüj ve daha sonra süpernatan toplamak ve glutatiyon Sefaroz 4B reçine 600 ul ihtiva eden bir sütun içinden geçer. </li><li> 50 sonikasyon tamponu ml yüksek tuz tamponu (7.5 50 mM Tris pH, 500 mM NaCI, 1 mM DTT ve% 5 gliserol), belirlenmemiş biçimde bağlı proteinleri uzaklaştırmak için 100 ml bir sonraki ile kolon yıkayın. 40 mM glutatiyon içeren yüksek tuz tamponu, 5 ml ile bağlı proteini elüte. </li><li> Düşük gliserol (20 mM Tris pH 7.4, 100 mM KCI, 0.5 mM DTT ve% 10 gliserol), pH 7.4, 2 saat boyunca ve daha sonra 20 mM Tris, 100 mM KCI, 0.5 mM diyaliz tampon maddesinin 2 L Tasfiye edilen proteini Dialyze DTT ve% 70 gliserol 8 saat veya gece boyunca karıştırılmıştır. Tüm saflaştırma tampon, 4 ° C &#39;de olduğundan emin olun ve protein denatürasyonunu önlemek için soğuk bir odada, protein saflaştırma gerçekleştirmek. </li></ol></li></ol> 3. Peptid dizisi Metilasyon <ol><li> Ön incuPeptit Dizilerin lenme <ol><li> Enzim ve pahalı radyoaktif etiketli AdoMet israfını önlemek için uygun büyüklükte bir kutu ya da plastik bir torbaya ya peptit dizisi metilasyon gerçekleştirin. 10 dakika boyunca enzimsiz ilgili metilasyon tampon içeren plastik torba içinde peptid dizisi membran ve etiketlenmiş [metil-3H] -AdoMet önceden inkübe edin. Örnek tam özellik profilini peptid dizisi için metilasyon tamponu 8 ml kullanmak için tampon hacmi, dizinin boyutuna bağlıdır. Her enzim için miktar ve AdoMet konsantrasyonu optimize. </li></ol></li><li> Peptit Dizilerinin metilasyonu <ol><li> Ön kuluçka tamponu atılır ve ilgili PKMT içeren metilasyon tamponu 8 ml membran inkübe ve etiketli [metil-3H] -AdoMet 1 saat ila 2. Not: bir metilasyon reaksiyonu için gerekli olan enzim miktarı belirli PKMT aktivitesine bağlıdır, bizim tarama deneyleri, 50 nM enzim yüzgeç genellikle başlatmaark konsantrasyonu. </li></ol></li><li> Peptit Dizilerinin Yıkama <ol><li> Daha sonra radyoaktif atık konteynerine metilasyon tampon atın ve bağlanmış proteinin ayrılması için 5 dakika için 100 mM amonyum bikarbonat ve% 1 SDS içeren tampon içinde, 20 ml ile 5 kez peptid dizileri yıkayın. Bir radyoaktif atık kabına yıkama tampon atın. </li></ol></li><li> Radyoaktif Sinyal Algılama <ol><li> Yıkamalardan sonra, radyo frekans sinyallerini çözeltisi (NAMP100V), 10 ml, 5 dakika boyunca zarın inkübe edilir. </li><li> Sonra, organik çözücüler için radyoaktif atık kabına güçlendir çözüm atmak bir plastik torba içinde peptit dizisi mühür ve bir otoradyografisidir kasetine koymak. </li><li> Karanlık bir odada peptid dizisindeki otoradyografisi filmi yerleştirin. Dikkatle kaseti kapatın ve en maruz -80 Gerekli süre için C °. Sonra, sonuçları analiz filmi geliştirmek. Farklı Expositio ile kez görüntü birkaç Yakalaman kere kuvvetle metile peptid yüzeylerde doygunluğunu önlemek için. </li></ol></li></ol> 4. Veri İşleme ve Analizi <ol><li> Nokta şiddetler dansitometrik Analizi <ol><li> Geleneksel tarayıcı filmi tarayın ve densitometri spot yoğunluklarını analiz. (Ücretsiz) bu kullanarak ImageJ veya ticari bir program yapın. NOT: Bu görev için Phoretix yazılımını kullanın. </li></ol></li><li> Normalleştirme ve Farklı Membranların gelen Sonuçlarının Ortalaması <ol><li> En az üç kez peptit dizisi metilasyon deneyler. 1.0 gibi bir referans yüzeyde arka plan çıkarma ve aktivitesini ayarlayarak her deney için taranan yoğunluklarını Normale. Bireysel noktalar için veri ortalama ve onlara olarak ortalama değerleri ve standart sapmaları rapor. </li></ol></li><li> Veri Analizi ve Görüntü <ol><li> Göreceli aktivitesini belirtmek için bir gri tonlama veya renk düzeni kullanarak 2D verileri çizilir. Bu wi yapınth Excel veya SigmaPlot burada gösterildiği gibi. Aynı zamanda, veri kalitesi analizi için tekrarlanan deneylerde standart sapmalarının bir dağılım grafiği hazırlanır. </li><li> Karşılaştırarak nicel substrat peptit her bakiyenin tanıma doğruluğu görüntülemek için bir ayrım faktör D 16,17 pozisyonunda x her bir amino asit i PKMT göreli tercih hesaplanır: D X i = &lt;V j ≠ i&gt; / V i - 1 V I pozisyon X ve amino asit i taşıyan peptit varyantının metilasyon oranı Burada &lt;h j ≠ i&gt; de dahil olmak üzere, x konumuna, farklı bir amino asit j ≠ i taşıyan 19 peptitlerin metilasyonu ortalama oranı (bir Vahşi tip sekansı). NOT: Bu tanımlanan ayrımcılık faktörü arka plan düzeyine bağlıdır. Tek Tortu,% 3 bir arka plan, bir ayrım ile belli bir pozisyonda kabul edilirse32,3 faktör elde edilmiştir. Bir pozisyonda hiçbir tercih 0 bir ayrımcılık faktörü sonuçlanır. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Margueron, R., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+structure+and+the+inheritance+of+epigenetic+information.">Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information.</a> Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).</li><li>Dawson, M. A., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenetics:+from+mechanism+to+therapy.">Cancer epigenetics: from mechanism to therapy.</a> Cell. 150, 12-27 (2012).</li><li>Helin, K., Dhanak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+proteins+and+modifications+as+drug+targets.">Chromatin proteins and modifications as drug targets.</a> Nature. 502, 480-488 (2013).</li><li>Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+methylation+at+the+surface+and+buried+deep:+thinking+outside+the+histone+box.">Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).</li><li>Rathert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+lysine+methyltransferase+G9a+acts+on+non-histone+targets.">Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets.</a> Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).</li><li>Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. M., Skrzypek, E., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhosphoSite:+A+bioinformatics+resource+dedicated+to+physiological+protein+phosphorylation.">PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation.</a> Proteomics. 4, 1551-1561 (2004).</li><li>Reineke, U., Volkmer-Engert, R., Schneider-Mergener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+peptide+arrays+prepared+by+the+SPOT-technology.">Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 12, 59-64 (2001).</li><li>Winkler, D. F., Andresen, H., Hilpert, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOT+synthesis+as+a+tool+to+study+protein-protein+interactions.">SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions.</a> Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).</li><li>Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+kinase+target+phosphorylation+consensus+motifs+using+peptide+SPOT+arrays.">Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays.</a> Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).</li><li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SPOT-synthesis+technique.+Synthetic+peptide+arrays+on+membrane+supports--principles+and+applications.">The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications.</a> Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).</li><li>Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+arrays+on+cellulose+support:+SPOT+synthesis,+a+time+and+cost+efficient+method+for+synthesis+of+large+numbers+of+peptides+in+a+parallel+and+addressable+fashion.">Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion.</a> Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).</li><li>Li, S. S., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+peptide+array+to+identify+binding+motifs+and+interaction+networks+for+modular+domains.">Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains.</a> Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).</li><li>Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+peptide+arrays+using+SPOT-technology+and+the+CelluSpots-method.">Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method.</a> Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).</li><li>Toepert, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+SPOT+synthesis+and+native+peptide+ligation+to+create+large+arrays+of+WW+protein+domains.">Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).</li><li>Volkmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+application+of+peptide+arrays:+quo+vadis+SPOT+technology.">Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology.</a> Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).</li><li>Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+substrate+specificity+of+the+Dim-5+histone+lysine+methyltransferase+using+peptide+arrays.">Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays.</a> Chemistr., &amp; biology. 15, 5-11 (2008).</li><li>Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SET8+H4K20+protein+lysine+methyltransferase+has+a+long+recognition+sequence+covering+seven+amino+acid+residues.">The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues.</a> Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).</li><li>Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+analysis-based+identification+of+new+methylation+targets+of+the+SET7/9+protein+lysine+methyltransferase.">Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase.</a> Chemistr., &amp; Biology. 18, 111-120 (2011).</li><li>Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+analysis+and+novel+substrates+of+the+protein+lysine+methyltransferase+NSD1.">Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1.</a> Chemistr., &amp; Biology. 21, 226-237 (2014).</li><li>Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scansite+2.0:+Proteome-wide+prediction+of+cell+signaling+interactions+using+short+sequence+motifs.">Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs.</a> Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).</li><li>Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+design+based+on+an+antibody+complementarity-determining+region+(CDR):+construction+of+porphyrin-binding+peptides+and+their+affinity+maturation+by+a+combinatorial+method.">Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method.</a> Chemistry. 6, 3196-3203 (2000).</li><li>Kramer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spot+synthesis:+observations+and+optimizations.">Spot synthesis: observations and optimizations.</a> J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).</li><li>Stadler, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+synthesis+of+peptide+arrays+with+a+laser+printer.">Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).</li><li>Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+substrates+for+Cdk5+and+new+targets+for+Cdk5+inhibitors+using+high-density+protein+microarrays.">Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays.</a> Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).</li><li>Mah, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+analysis+of+protein+kinase+complex+Dbf2-Mob1+by+peptide+library+and+proteome+array+screening.">Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening.</a> BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

Burada tarif edildiği gibi SPOT sentezi, protein-protein etkileşimi sitesi harita ve peptit değiştirici enzim alt-tabaka tanıma araştırmak için güçlü bir yöntemdir. SPOT yöntemi ile sentezlenmiş peptitler, bu, her bir durumda teyit etmek zordur% 90&#39;dan daha fazla saflığa 21 için rapor edilmiştir, ancak Ancak, SPOT sentezi, hala bazı dezavantajlara sahiptir. Bu nedenle, sonuçlar örneği kullanılarak protein etki ya da standart yöntemlerle sentezlenebilir saflaştırılmış peptidler...

Son iki yılda, çeşitli raporlar hücresel gelişim ve kanser gibi çeşitli hastalıkların, ancak son zamanlarda protein lisin metilasyonu bir başka hayati PTM olarak ortaya çıkmıştır içinde post-translasyonel modifikasyonlar (PTM) önemini göstermiştir. Başlangıçta sübstrat olarak histon lizin metilasyon önemli bir kromatin işareti olarak bulunurken, daha sonra çalışmalar da çeşitli sivil histon proteinler 1-4 lizin metilasyon gösterdi. lizin kalıntılarının ε-amino grubunda ve S-adenosil-L-metionin metil gruplarının bir transferi insan genomunda 60 proteinleri içeren protein Lizin metiltransferaz (PKMTs) olarak adlandırılan bir enzim ailesi tarafından katalize edilmektedir. PKMTs başlangıçta belirli lizin kalıntısı metillenmesi ancak daha sonra raporlar da olmayan histon proteinler 5 metillenmesi olabilir gösterdi histon modifiye enzimler olarak tespit edildi. Şimdiye kadar, yaklaşık 5.000 lizin metilasyon siteleri farklı proteinler 6 tespit edildi </skadar&gt;, ancak bu değişiklikler sorumlu enzimler genellikle tespit edilmez. Bunun bir nedeni, çoğu PKMTs özgünlüğü yoğun çalışılmamıştır olmasıdır. Bu nedenle, tekrar tekrar PKMTs yeni alt-tabakalar tespit edilmesi meydana gelir. PKMTs substrat seçiciliği detaylı bilgi eksikliği biyolojik fonksiyon ve rol anlayış engellemektedir. Ayrıntılı olarak PKMT özgünlüğünü incelemek için, bir veya birkaç amino asitin farklı bir çok peptit alt tabakasma metilasyonu oranları ölçülebilir olmalı ve ideal olarak peptid dizileri kullanılarak yapılır ki, karşılaştırıldı. Elde edilen özgüllük profilleri göre PKMTs potansiyel alt-tabakalar bundan başka incelenebilir olduğu tespit edilebilir. Peptid dizileri yaygın olarak antikorlar, peptid değiştirici enzimler ve protein-protein etkileşim bölgeleri (antikor-antijen, reseptör-ligand), 7-9 haritalama biyokimyasal analizi için kullanılan araçlardır. Peptidlerin birkaç yüz suc için gerekli olanh uygulamaları. Farklı yöntemler onları çok yaygın olarak kullanılan bir reçine üzerinde sentez peptit arasında, peptid sentezi için kullanılabilir, ancak bu verim değeri sınırlıdır ve bu nispeten pahalıdır. Bu sorunlar Frank ve arkadaşları 10 tarafından SPOT sentez yöntemi tanıtımıyla çözüldü. SPOT sentez yöntemi paralel olarak birkaç yüz peptitlerin sentezini sağlar ve ortalama reçine sentezi göre ucuzdur. selüloz zarı üzerinde sentezlenen peptidler zar ayrılır ve çözelti deneylerinde serbest peptidler olarak kullanılabilir ya da peptid mikrodiziler 10-13 hazırlamak için edilebilir çeşitli uygulamalar veya peptidlere doğrudan kullanılabilir. SPOT sentezi katı bir destek olarak bir selüloz zar kullanılır ve standart Fmoc kimyası kullanan 10-13 katı fazlı peptit sentezi, bir çeşididir. Bu nedenle, peptid zincirlerinin sentezlenmesi C-terminal ucunda başlar ve doğru ilerlerRibozomlar biyolojik sentezi aksine N-terminal ucu. Selüloz membranlar ilk olarak aktif amino asitler (Şek. 1) bağlanması için fonksiyonalize edilir. SPOT yöntem otomatik bir pipet sistemi kullanılarak zar üzerinde tanımlanan noktalar için çözücünün bir damlacık içinde aktive edilmiş bir amino asitlerin ardışık doğum dayanmaktadır. sıvı damlacık daha sonra peptit sentezinde kimyasal reaksiyonlar için açık bir reaktör olarak işlev yapan bir dairesel ıslak nokta oluşturur gözenekli zar üzerinde dağıtılır. spot büyüklüğü tevzi hacmi ve membran emme kapasitesi ile belirlenir, bu noktalar katları dizileri olarak düzenlenmiştir. sentez ölçekli nokta büyüklüğü ve membran yükleme kapasitesi ile ilişkilidir. noktalar ve dizilerin yoğunluğu arasındaki mesafe nokta boyutları değişen yönetilmektedir. Selüloz membran peptid sentezinde katı faz olarak bir çok avantajı vardır, bu kullanılan kimyasal için, ucuz toleranslıdırsulu çözeltiler içinde kararlı ve kolay olarak peptid sentezinde kullanılan als. Buna ek olarak, hidrofil bir karakter gösterir çeşitli biyolojik tahlil sistemleri için uygun yapar. SPOT Sentez elle gerçekleştirilir veya peptitler gerekli sayısına bağlı olarak, peptidler (1000&#39;ler için) otomatik hale getirilebilir. INTAVIS (Köln, Almanya) Tam otomatik SPOT sentezleyici bizim uygulamalar için kullanılır. Farklı miktarlarda ve farklı uzunlukta peptit sentezini mümkün kılar. Ayrıca, adım adım sentezi 14,15 hazırlanabilir doğrusal peptidler düzenli 42 amino asidin eklenmesi peptitlerde, 15-20 amino asit uzunluğunda sentezlenir. Bununla birlikte, amino asit sayısının artması peptidlerin kalitesini etkiler genel birleştirme verimi, azalmalara yol açar. Çünkü nokta başına peptidler düşük bir miktarının bu ürünler genel olarak saflaştırılması zor olan ve ayrı ayrı peptitlerin ürünlerin kalitesi daha kolay değerlendirilemez. Bu nedenle, sonuçlar SPOT Pept eldeide dizileri saflaştırılmış ve peptid sentezinde veya arzu edilen peptid dizilerini ihtiva eden proteinlerin sentezlenmesi ile standartlara göre analiz edilebilir büyük ölçekli standart yöntemler ile sentezlenir peptidler ya onaylanmalıdır. Yine, biz son derece güvenilir olması için SPOT sentezini buldum ve tekrarlanabilir olması genellikle sonuçları. SPOT sentez olan peptidler daha önce ve bundan başka son yan zincir koruma grubunun yarılması ve sonra modifiye sağlayan, amino asitler, aynı zamanda sentezi için kullanılabilecek çeşitli ticari olarak temin edilebilen tadil edilmiş amino asitler, proteinojenik ile sınırlı değildir, aynı zamanda dahil edilmesini sağlar fosforile metillenmiş ya da asitile edilmiş amino asitler, 11. SPOT yöntemi ile sentezlenmiş Hareketsizleştirilmiş peptit kolleksiyonları, çok sayıda biyolojik ve biyokimyasal analizler için de kullanılabilir. Bu PKMTs sübstrat spesifitesinin incelenmesi için 300-400 peptidleri içeren peptid dizileri kullanılabilir. Enzimatik modifi için, peptit dizileri, ilgili PKMT ile inkübe edilir ve uygun bir tampon maddesi içinde [metil- 3H] -AdoMet etiketli. ilgili alt-tabaka metilasyon otoradyografi ile peptid alt-tabakaya AdoMet gelen radyoaktif olarak etiketlenmiş metil grubu enzimatik transferi (Şek. 3) aşağıdaki şekilde analiz edilir. Bu prosedür ile, peptid dizileri, aynı zamanda, farklı peptit alt tabakasma metilasyonu çalışma sağlar. Bu yöntemin önemli bir avantajı, tüm peptidler metilasyon kinetiği doğrusal aşamasında, her bir peptidin nispi metilasyon ayrılma sabiti (k cat / K bölü katalitik hız sabiti ile orantılı olacak şekildedir, rekabet metillenmiş olmasıdır İlgili peptid maddesi için, enzim D). Bu nedenle, her bir nokta ile radyoaktivite miktarı, doğrudan belirli bir peptid karşı enzimatik aktivitesi ile ilişkilidir. Kullanmabir peptit dizisi metilasyon deneyin sonuçları, PKMT özgüllüğü profili teyit edilebilecektir, bu yeni yüzeylerde tanımlandığı gibidir ve dayalı olabilir. Peptit diziler peptid düzeyinde yeni yüzeylerde metilasyonu hızlı ve maliyet etkin doğrulama sağlar. Bunun için, dizi hedef bölgelerde yerine Lys Ala ihtiva eden modifiye edilmiş peptidler olarak pozitif ve negatif kontrol peptidleri ile birlikte tahmin edilen yeni alt tabakaların içeren hazırlanır. Son olarak, yeni alt-tabakalar bir araya mutantları ile protein, burada hedef Lys Ala ile değiştirilmiş olduğu ve metilasyon protein seviyesinde doğrulanabilir gibi hazırlanabilir. Sonuçlarına bağlı olarak, bu daha sonra yeni açıklanan protein maddelerinin metilasyonu potansiyel rolleri ele biyolojik çalışmalar takip edilmektedir.

<table><tbody><tr><td>Ethanol abs Gradient Grade HPLC</td><td>Honeywell</td><td>10299901</td><td>Flammable</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-Dimethylformamide Peptide Synthesis</td><td>Biosolve</td><td>4193302</td><td>Flammable, Toxic</td></tr><tr><td>Piperidine &amp;ge;99% for Peptide Synthesis</td><td>Roth</td><td>A122.1</td><td>Flammable, Toxic, corrosive</td></tr><tr><td>Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate )</td><td>Novabiochem</td><td>8510860100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&amp;rsquo;&lt;/em&gt;-Diisopropylcarbodiimide purum &amp;ge;98% GC</td><td>Fluka</td><td>38370</td><td>Flammable, Toxic, corrosive</td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Roth</td><td>CP28.1</td><td>Flammable, Toxic, corrosive</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane 99%</td><td>Aldrich</td><td>233781</td><td>Flammable, Toxic</td></tr><tr><td>Dichlormethane &amp;ge;99.9%</td><td>Roth</td><td>P089.1</td><td>Carcinogenic</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Methyl-2-Pyrrolidone</td><td>Roth</td><td>4306.2</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Derivatized cellulose Membrane</td><td>Intavis AG K&amp;ouml;ln</td><td>32.1</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Roth</td><td>P088.2</td><td>Toxic, corrosive</td></tr><tr><td>Bromphenolblue</td><td>AppliChem</td><td>A3640.0010</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Hydrogen Carbonate</td><td>Roth</td><td>T871.2</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate Pellets</td><td>Roth</td><td>CN30.3</td><td>Toxic, Flammable</td></tr><tr><td>MultiPep Synthesizer</td><td>Intavis AG K&amp;ouml;ln</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>HyperfilmTM high performance film</td><td>GE Healthcare</td><td>28906837</td><td></td></tr><tr><td>Phoretix software</td><td>TotalLab</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

specificity analysis of protein lysine methyltransferases using spot peptide arrays

Lizin metilasyonu yükselen bir translasyon sonrası modifikasyon olup, hücre gelişimi ve bir çok hastalıkta önemli bir rol oynar burada bu, birkaç histon ve histon olmayan proteinleri üzerinde tespit edilmiştir. Yaklaşık 5.000 lisin metilasyon siteleri, protein lisin methyltransferases birkaç onlarca tarafından belirlenen farklı proteinler, tespit edilmiştir. Bu artık, sadece bir ya da iki alt-tabakalar, bu enzimlerin birkaç için tespit edilmiştir, ancak kadar her PKMT birden proteinleri metile işaret etmektedir. Bu sorunu yaklaşım, biz girmiştik peptit dizisi bazlı substrat özgüllüğü PKMTs analizleri. Peptid dizileri farklı dizi ile çeşitli substratların metilasyon bir dizi test edilebilir, çünkü PKMTs özgüllüğünü tanımlamak için güçlü araçlardır. Biz INTAVIS SPOT sentezleyici kullanılarak selüloz zarı üzerinde peptid dizileri sentezlenmiş ve çeşitli PKMTs özgüllüğünü analiz edilmiştir. Bu enzimlerin birçoğu için, sonuçlara göre, yeni substrates tanımlanabilir. Örneğin peptit dizileri kullanılarak NSD1 için, bunun H4 K44 yerine rapor H4K20 metile ve buna ek olarak H1.5K168 önceden bilinen H3K36 üzerinde yüksek ölçüde tercih edilen alt-tabaka olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, peptid dizileri biyokimyasal PKMTs karakterize güçlü araçlardır.

Bu yaklaşım 5,16-19 ile peptid dizileri başarılı bir şekilde biyokimyasal olarak PKMTs özgüllüğünü tanımlamak için kullanılmıştır ve PKMT birkaç yeni histon ve histon olmayan alt-tabakalar tanımlanmıştır. Bir PKMT (veya herhangi bir enzim) doğru substrat spektrumunu tanımlama moleküler mekanizması ve hücresel fonksiyonların anlaşılması yönünde önemli bir adımdır. Peptid SPOT dizi metilasyon yöntemin bir uygulama örnek olarak, NSD1 PKMT 1...

Watch this Scientific Journal Video about Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays at JoVE.com

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

SPOT Peptit Diziler Protein Lizin Methyltransferases Özgünlüğü Analizi

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

specificity-analysis-protein-lysine-methyltransferases-using-spot

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

13.9K Görüntüleme.  Stuttgart University. Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

Video: Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The mass production and distribution of antibodies specific to histone PTMs has greatly facilitated research on these marks. As histone PTM antibodies are key reagents for many chromatin biochemistry applications, rigorous analysis of antibody specificity is necessary for accurate data interpretation and continued progress in the field. This protocol describes an integrated pipeline for the design, fabrication and use of peptide microarrays for profiling the specificity of histone antibodies. The design and analysis aspects of this procedure are facilitated by ArrayNinja, an open-source and interactive software package we recently developed to streamline the customization of microarray print formats. This pipeline has been used to screen a large number of commercially available and widely used histone PTM antibodies, and data generated from these experiments are freely available through an online and expanding Histone Antibody Specificity Database. Beyond histones, the general methodology described herein can be applied broadly to the analysis of PTM-specific antibodies.

This manuscript describes methods for applying peptide microarray technology to specificity profiling of antibodies that recognize histones and their post-translational modifications.

Histon Antikor Özgüllüğünün Peptit Mikroarraylerle Analizi

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Biyokimya

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important for revealing protease function. The method proposed in this study determines protease specificity by measuring the molecular weight of unique substrates using Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. The substrates contain iminobiotin, while the cleaved site consists of amino acids, and the spacer consists of polyethylene glycol. The cleaved substrate will generate a unique molecular weight using a cleaved amino acid. One of the merits of this method is that it may be carried out in one pot using crude samples, and it is also suitable for assessing multiple samples. In this article, we describe a simple experimental method optimized with samples extracted from mouse lung tissue, including tissue extraction, placement of digestive substrates into samples, purification of digestive substrates under different pH conditions, and measurement of the substrates&#39; molecular weight using MALDI-TOF mass spectrometry. In summary, this technique allows for the identification of protease specificity in crude samples derived from tissue extracts using MALDI-TOF mass spectrometry, which may easily be scaled up for multiple sample processing.

Here, we present a protocol to determine protease specificity in crude mouse tissue extracts using MALDI-TOF spectrometry.

Proteaz özgüllük fare doku belirlenmesi MALDI-TOF Kütle spektrometresi tarafından ayıklar: PH özgüllük değişiklikler neden manipüle

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1 Nef, not only retain their biological function, but can also competitively inhibit the function of the full-length protein. A set of 20 Nef scanning peptides, 20 amino acids in length with each overlapping 10 amino acids of its neighbor, were used to identify motifs in Nef responsible for its induction of apoptosis. Peptides containing these apoptotic motifs induced apoptosis at levels comparable to the full-length Nef protein. A second peptide, derived from the Secretion Modification Region (SMR) of Nef, retained the ability to interact with cellular proteins involved in Nef's secretion in exosomes (exNef). This SMRwt peptide was used as the "bait" protein in co-immunoprecipitation experiments to isolate cellular proteins that bind specifically to Nef's SMR motif. Protein transfection and antibody inhibition was used to physically disrupt the interaction between Nef and mortalin, one of the isolated SMR-binding proteins, and the effect was measured with a fluorescent-based exNef secretion assay. The SMRwt peptide's ability to outcompete full-length Nef for cellular proteins that bind the SMR motif, make it the first inhibitor of exNef secretion. Thus, by employing the techniques described here, which utilize the unique properties of specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, one may accelerate the identification of functional motifs in proteins and the development of peptide-based inhibitors of pathogenic functions.

Techniques to dissect the mechanisms underlying the secretion of HIV-1 Nef in exosomes are described. Specific short peptides derived from Nef and protein transfection were exploited to determine the structure, function, and binding partners of Nef&#x2019;s Secretion Modification Region. These procedures have general relevance in many mechanistic studies.

Fonksiyonel Motifler ve Bağlama Ortaklar peptid bazlı Kimlik

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, including RNA processing, signal transduction, DNA damage response, miRNA biogenesis, and translation.
In recent years, thanks to biochemical and analytical developments, mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as the most effective strategy to characterize the cellular methyl-proteome with single-site resolution. However, identifying and profiling in vivo protein R-methylation by MS remains challenging and error-prone, mainly due to the substoichiometric nature of this modification and the presence of various amino acid substitutions and chemical methyl-esterification of acidic residues that are isobaric to methylation. Thus, enrichment methods to enhance the identification of R-methyl-peptides and orthogonal validation strategies to reduce False Discovery Rates (FDR) in methyl-proteomics studies are required.
Here, a protocol specifically designed for high-confidence R-methyl-peptides identification and quantitation from cellular samples is described, which couples metabolic labeling of cells with heavy isotope-encoded Methionine (hmSILAC) and dual protease in-solution digestion of whole cell extract, followed by off-line High-pH Reversed Phase (HpH-RP) chromatography fractionation and affinity enrichment of R-methyl-peptides using anti-pan-R-methyl antibodies. Upon high-resolution MS analysis, raw data are first processed with the MaxQuant software package and the results are then analyzed by hmSEEKER, a software designed for the in-depth search of MS peak pairs corresponding to light and heavy methyl-peptide within the MaxQuant output files.

Protein Arginine (R)-methylation is a wide-spread post-translational modification regulating multiple biological pathways. Mass spectrometry is the best technology to globally profile the R-methyl-proteome, when coupled to biochemical approaches for modified peptide enrichment. The workflow designed for the high confidence identification of global R-methylation in human cells is described here.

Global ve Yüksek Güvenilirlikli Protein R-Metilasyon Analizi için Kütle Spektrometrisine Dayalı Proteomik Yaklaşım

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the peptide biomarkers of disease or environmental stress, identifying neuropeptides, hormones, and bioactive intracellular peptides, discovering antimicrobial and nutraceutical peptides from protein hydrolysates, and can be used in studies to understand the proteolytic processes. The recent advance in sample preparation, separation methods, mass spectrometry techniques, and computational tools related to protein sequencing has contributed to the increase of the identified peptides number and peptidomes characterized. Peptidomic studies frequently analyze peptides that are naturally generated in cells. Here, a sample preparation protocol based on heat-inactivation is described, which eliminates protease activity, and extraction with mild conditions, so there is no peptide bonds cleavage. In addition, the relative quantitation of peptides using stable isotope labeling by reductive methylation of amines is also shown. This labeling method has some advantages as the reagents are commercially available, inexpensive compared to others, chemically stable, and allows the analysis of up to five samples in a single LC-MS run.

This article describes a sample preparation method based on heat-inactivation to preserve endogenous peptides avoiding degradation post-mortem, followed by relative quantitation using isotopic labeling plus LC-MS.

Peptidomik Çalışmalar için Aminlerin Indirgeyici Metilasyonunu Kullanarak Numune Hazırlama ve Göreli Nicellik

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small molecule studies and drug development 4. Many epigenetic regulators have only recently been discovered and are still in the process of being classified. Among these enzymes are lysine demethylases which remove methyl groups from lysines on histones and other proteins. Due to the novel nature of this class of enzymes, few assays have been developed to study their activity. This has been a road block to both the classification and high throughput study of histone demethylases. Currently, very few demethylase assays exist. Those that do exist tend to be qualitative in nature and cannot simultaneously discern between the different lysine methylation states (un-, mono-, di- and tri-). Mass spectrometry is commonly used to determine demethylase activity but current mass spectrometric assays do not address whether differentially methylated peptides ionize differently. Differential ionization of methylated peptides makes comparing methylation states difficult and certainly not quantitative (Figure 1A). Thus available assays are not optimized for the comprehensive analysis of demethylase activity.
Here we describe a method called MassSQUIRM (mass spectrometric quantitation using isotopic reductive methylation) that is based on reductive methylation of amine groups with deuterated formaldehyde to force all lysines to be di-methylated, thus making them essentially the same chemical species and therefore ionize the same (Figure 1B). The only chemical difference following the reductive methylation is hydrogen and deuterium, which does not affect MALDI ionization efficiencies. The MassSQUIRM assay is specific for demethylase reaction products with un-, mono- or di-methylated lysines. The assay is also applicable to lysine methyltransferases giving the same reaction products. Here, we use a combination of reductive methylation chemistry and MALDI mass spectrometry to measure the activity of LSD1, a lysine demethylase capable of removing di- and mono-methyl groups, on a synthetic peptide substrate 5. This assay is simple and easily amenable to any lab with access to a MALDI mass spectrometer in lab or through a proteomics facility. The assay has ~8-fold dynamic range and is readily scalable to plate format 5.

We present a method for using MALDI mass spectrometry and reductive methylation chemistry to quantify changes in lysine methylation.

Lizin demetilaz Faaliyet Kantitatif Ölçümler MassSQUIRM Uygulaması

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Biyoloji

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Peptit Diziler protein-protein etkileşim Siteleri belirlenmesi

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Characterization of Neuronal Lysosome Interactome with Proximity Labeling Proteomics

Lysosomes frequently communicate with a variety of biomolecules to achieve the degradation and other diverse cellular functions. Lysosomes are critical to human brain function, as neurons are postmitotic and rely heavily on the autophagy-lysosome pathway to maintain cellular homeostasis. Despite advancements in the understanding of various lysosomal functions, capturing the highly dynamic communications between lysosomes and other cellular components is technically challenging, particularly in a high-throughput fashion. Here, a detailed protocol is provided for the recently published endogenous (knock-in) lysosome proximity labeling proteomic method in human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived neurons. 
Both lysosomal membrane proteins and proteins surrounding lysosomes within a 10-20 nm radius can be confidently identified and accurately quantified in live human neurons. Each step of the protocol is described in detail, i.e., hiPSC-neuron culture, proximity labeling, neuron harvest, fluorescence microscopy, biotinylated protein enrichment, protein digestion, LC-MS analysis, and data analysis. In summary, this unique endogenous lysosomal proximity labeling proteomics method provides a high-throughput and robust analytical tool to study the highly dynamic lysosomal activities in live human neurons.

A neuronal lysosome proximity labeling proteomics protocol is described here to characterize the dynamic lysosomal microenvironment in human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Lysosomal membrane proteins and proteins that interact with lysosomes (stably or transiently) can be accurately quantified in this method with excellent intracellular spatial resolution in live human neurons.

Nöronal lizozom interaktomunun yakınlık etiketleme proteomikleri ile karakterizasyonu

Lysosomes frequently communicate with a variety of biomolecules to achieve the degradation and other diverse cellular functions. Lysosomes are critical to ...

Nörobilim

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein functions, for example, by changing enzymatic activity or by mediating interactions. Precise quantification of site-specific protein acylation occupancy, or stoichiometry, is essential for understanding the functional consequences of both global low-level stoichiometry and individual high-level acylation stoichiometry of specific lysine residues. Other groups have reported measurement of lysine acetylation stoichiometry by comparing the ratio of peptide precursor isotopes from endogenous, natural abundance acylation and exogenous, heavy isotope-labeled acylation introduced after quantitative chemical acetylation of proteins using stable isotope-labeled acetic anhydride. This protocol describes an optimized approach featuring several improvements, including: (1) increased chemical acylation efficiency, (2) the ability to measure protein succinylation in addition to acetylation, and (3) improved quantitative accuracy due to reduced interferences using fragment ion quantification from data-independent acquisitions (DIA) instead of precursor ion signal from data-dependent acquisition (DDA). The use of extracted peak areas from fragment ions for quantification also uniquely enables differentiation of site-level acylation stoichiometry from proteolytic peptides containing more than one lysine residue, which is not possible using precursor ion signals for quantification. Data visualization in Skyline, an open source quantitative proteomics environment, allows for convenient data inspection and review. Together, this workflow offers unbiased, precise, and accurate quantification of site-specific lysine acetylation and succinylation occupancy of an entire proteome, which may reveal and prioritize biologically relevant acylation sites.

Here, we present unbiased quantification of site-specific protein acetylation and/or succinylation occupancy (stoichiometry) of an entire proteome through a ratiometric analysis of endogenous modifications to modifications introduced after quantitative chemical acylation using stable isotope-labeled anhydrides. In combination with sensitive data-independent acquisition mass spectrometry, accurate site occupancy measurements are obtained.

Siteye özel Protein lizin asetilasyon ve Succinylation veri bağımsız edinme kütle spektrometresi kullanılarak Stoichiometry miktar

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into protein function. Despite the importance of multi-PTM enrichment studies, few studies investigate more than one PTM at a time, due partially to the expenses, time, and large protein quantities required to perform multiple global proteomic analysis of PTMs. The &#34;one-pot&#34; affinity enrichment detailed in this protocol overcomes these barriers by permitting the simultaneous identification and quantification of peptides with lysine residues containing acetylation and succinylation PTMs with low amounts of sample input. The protocol involves preparation of protein lysate from mouse livers of SIRT5 knockout mice, performance of trypsin digestion, enrichment for PTMs, and performance of mass spectrometric analysis using a data-independent acquisition (DIA) workflow. Because this workflow allows for the enrichment of two PTMs from the same sample simultaneously, it provides a practical tool to study PTM crosstalk without requiring large amounts of samples, and it greatly reduces the time required for sample preparation, data acquisition, and analysis. The DIA component of the workflow provides comprehensive PTM-specific information. This is particularly important when studying PTM site localization, as DIA provides comprehensive sets of fragment ions that can be computationally deciphered to differentiate between different PTM localization isoforms.

This workflow describes the performance of time- and cost-efficient enrichment of multiple protein post-translational modifications (PTMs) simultaneously for quantitative global proteomic analysis. The protocol utilizes peptide-level PTM enrichment with multiple conjugated antibodies, followed by data-independent acquisition mass spectrometry analysis to gain biological insights into PTM crosstalk.

Niceleme ve Site Yerelleştirmesi Için İki Çeviri Sonrası Modifikasyonun Eşzamanlı Affinity Zenginleştirmesi

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into ...