Name: specificity analysis of protein lysine methyltransferases using spot peptide arrays
Uploaded: 2014-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
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This work has been supported by the DFG grant JE 252/7.

ペプチド配列の調製<ol><li>ペプチド配列のプログラミング<ol><li> MultiPepスポッターソフトウェアを使用して合成するためのペプチド配列を設計します。 1文字のコードでペプチド配列を入力してください。 ペプチド1：TARKSTGGKA </li><li>定義された基板の認識に必要な重要なアミノ酸をスクリーニングするために特定のコマンド（.replace、A）とアラニン又はアルギニン散歩ライブラリを生成します。例えば、次の例の最初の行は、野生型配列であり、2行目からのペプチド中の各アミノ酸がアラニンに順次変更される。 、Aを交換 TARKSTG -ARKSTG T- A -RKSTG TA-A -KSTG TAR- A -STG TARK- A -TG TARKS- A -G TARKST- A </li><li> 、次のようなコマンド（.replace Rを使用してください。1.1.2で説明したようにコンセンサスを決定するためのペプチド配列を合成するために、すべての自然に利用可能なアミノ酸残基（これらの残基は、酸化、時には低い合成収率を受けやすいので、最終的には、システイン、メチオニンおよびトリプトファンを省略）で）N 等を交換酵素の基質配列モチーフ。 注： 図4（a）に示すように、横軸は、与えられたペプチド配列を示し、縦軸は、コマンドのために選択されるアミノ酸を表す。 1.1.2に示された配列と同様に、縦軸AはAlaで順次図の最初の行で指定された配列の各位置を置き換えることを意味する。図4（a）。同様に、アルギニン順次ので、他のアミノ酸と上の第2行の各アミノ酸を置換する。完全なペプチド配列のライブラリーは、系統的に番目の各々に設けられたペプチド基質配列における各残基を置換することによって合成される電子他の天然に入手可能なアミノ酸残基が、これは、所与の配列の各位置におけるそれぞれの残基の影響を理解するのに役立ちます。 </li><li>あるいは、既知のまたは予測ペプチド基質のメチル化が容易正および負のメチル化コントロールと共にPKMTの標的ペプチドとの（メチル化に知られているまたはメチル化されたことがないことが知られている、すなわちペプチド）ペプチドライブラリーを合成することを検証することができる。手動プログラミングによって、以下に示すように、目標リジンのメチル化を確認するために、アラニンに推定標的リジンを交換することにより、ペプチドを合成する。 野生型ペプチド：STGG K PRQFL 変異ペプチド：STGG A PRQFL 注：このソフトウェアは、相互作用に必要な重要なアミノ酸をマッピングするための配列の所望のフレームシフトとのエピトープマッピングのように、さまざまなライブラリを作成するための固有のスクリプトを持っています。 </li></ol></li><li>膜の調製、アミノ酸D試薬<ol><li> 10分間、DMF（N、N-ジメチルホルムアミド）のスポット膜を事前に膨潤した後、気泡やしわなしでSPOTシンセサイザーフレームに濡れた膜を置く。 </li><li>メンブレン100％エタノールで3回洗浄する。合成プログラムを開始する前に少なくとも10分間、完全に膜を乾燥させる。 </li><li>並行して、新たにNMPに溶解して、市販のFmoc保護アミノ酸の0.5 Mの作業濃度に調製し、 表1に記載したように活性剤と塩基とを準備する。 </li><li> SPOTシンセサイザのすべての廃液容器を空にしていることを確認して、DMF、エタノール及びピペリジンで溶剤リザーバを補充します。 注：これでマシンは合成のために準備ができている。 </li></ol></li><li>まずアミノ酸のスポッティング<ol><li>膜上の遊離アミノ基とアミド結合を生成するために、広告によって着信アミノ酸のカルボキシ基を活性化するディング活性剤（N、N &#39;ジイソプロピルカルボジイミド）およびアミノ酸誘導体の塩基溶液（エチルヒドロキシシアノ）。 </li><li>プログラム可能なロボットを用いてアミノ官能化PEG膜上の活性化アミノ酸の所望のボリュームを見つける。 注：これは、アミノ酸のC末端は、膜のアミノ基に結合されている。 </li><li>最初の活性化されたアミノ酸のより良いカップリングを確実にするために、この手順を3回繰り返します。 20分のための膜をインキュベートした後、未結合アミノ酸を除去するために、DMFで洗浄する。 </li></ol></li><li>非スポット領域上のフリースペースのブロッキング 注：膜のアミノ基へのすべてのペプチドの最初のC末端アミノ酸のカップリング後、スポット、スポットエリア内のアミノ基の一部との間のアミノ基がアミノ酸と結合を形成しない。 <ol><li>キャッピング溶液（DMF中20％無水酢酸）を用いてインキュベートすることにより、これらの遊離アミノ基をブロック5分間。 注：これは、膜の代わりに、成長するペプチド鎖のさらなるサイクルでアミノ酸のカップリングを回避する。 </li></ol></li><li> Fmoc基の除去<ol><li>ブロッキング後、DMFで4回、膜を洗浄した後のFmoc保護基を除去するために20分間、DMF中20％ピペリジンでインキュベートする。 注：この手順は、アミノ保護のFmoc基の除去につながり、それが脱保護と呼ばれています。 </li><li>その後、エタノールで2回DMFで二回膜を洗って、それが乾燥させます。 注：今膜は、次のアミノ酸のカップリングの準備ができている。 </li></ol></li><li>鎖延長 注：各アミノ酸の付加は、サイクルと呼ばれる。別に最初のアミノ酸のカップリングから、サイクルが結合されたアミノ酸のFmoc基の脱保護で開始し、それが成長して激励のアミノ基への着信アミノ酸の活性化カルボキシル基とのカップリングに続いて潮のチェーン。 <ol><li>所望のペプチド長が得られるまで繰り返して、1.3と1.5の手順。 </li></ol></li><li>染色 注：最後のサイクルの後、ペプチド配列は、ペプチドの合成に成功を確認するために、ブロモフェノールブルーで染色する。ブロモフェノールブルーは、ペプチドの遊離アミノ基と結合する。ペプチドスポットは、染色後に淡青色を示すが、スポットの強度は、ペプチド配列に依​​存して変化する。ピペリジンブロモフェノールブルーの存在下でペプチドを染色していないため、この染色は、ピペリジンの完全な除去を確認できる。また、これは、さらなる使用のためのペプチド配列をマークするのに役立つ。 <ol><li>最後の合成サイクルにおけるFmoc基の脱保護の後、DMF、100％エタノールでメンブレンを洗浄する。それは完全に青色になるまで、5分間の最低ブロモフェノールブルー（DMF中の0.02％ブロモフェノールブルー）を有する膜を扱う。 </li><li>その後、DMFおよびETHを有する膜を洗うサノールを10分間乾燥させた。今、シンセサイザーから膜を取り出し、手動で側鎖の脱保護（セクション1.8）を実行する。必要に応じて、ペプチド合成（ 図2）の結果を文書化するために膜を撮影。 </li></ol></li><li>サイドチェーン脱保護<ol><li>側鎖保護基および捕捉試薬（2.5％の水および2.5％トリイソプロピルシラン）からのアミノ酸の側鎖を保護するために切断するために、95％トリフルオロ酢酸（TFA）からなる側鎖脱保護混合物20~25 mlの膜を扱うこのステップの間変更。それは完全に密​​閉された化学薬品耐性のボックス内膜をカバーしていることを確認し、穏やかに振盪しながら1から2時間のためにそれをインキュベートし、脱保護混合物の十分なボリュームを取る。 </li><li> 2分ごとに、DCM（ジクロロメタン）20-25 mlの膜を6回洗浄し、最終的に二回、100％エタノールで、一晩デシケーターでそれを乾燥させてください。 注：今すぐ膜は、実験に使用することができる。ペプチドアレイの合成のスキームを図1に提供される。 </li></ol></li></ol> 2.タンパク質の発現および精製<ol><li> GST融合物としてPKMTsのタンパク質発現<ol><li>標準的な技術を用いて、GST融合タンパク質として発現させるために（をpGEX-6P2のような）細菌の発現ベクターに、完全長PK​​MTまたはその触媒ドメインをコードする遺伝子をクローニングする。 </li><li> BL21またはBL21コドンプラスE.挿入希望PKMTとベクトルを転送ヒートショック法または他の任意の方法によって大腸菌細胞。 </li><li>式の当日にルリア - ベルターニ（LB）メディアの30ミリリットルで前培養を準備し、継続的に振盪しながら7から8時間、37℃でインキュベートする。 </li><li>次に、LB培地1 Lを含む2 L大きなバッフル付きフラスコに予備培養物10mlを転送し、37℃でインキュベート 培養に到達するまで連続振盪インキュベーターで°C600nmで定義された光学密度ES。 注：これは、各タンパク質のために最適化することができるが、我々が日常的に約0.8のOD 600nmまでで誘導する。誘導温度を個別に各タンパク質について最適化されなければならない、いくつかのタンパク質は、22で良好な発現を示す °Cより高い温度でのいくつかの。 </li><li>イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシドを1mMで誘導し、培養物を誘導温度で10〜12時間増殖させ、次いで、15分間誘導温度に細胞を移す。 </li><li>その後15分間5000×gでの遠心分離によって細胞を回収し、最後に、他の用途のために-20℃でSTE緩衝液（10mMトリスpH8.0で、100mMのNaClおよび0.1mM EDTA）及び店舗30mlでペレットを洗浄する。 </li></ol></li><li>タンパク質精製<ol><li>細胞ペレットを解凍し、超音波処理緩衝液（50mMトリスpH7.5で、150mMのNaCl、1mMのDTT、5％グリセロール）30mlに再懸濁し、超音波処理によって破壊する。 注：このバッファnEEDSは、最終的に、各タンパク質のために最適化される。 </li><li> 1時間22000×gで細胞溶解物を遠心して、後から上清を収集し、グルタチオンセファロース4B樹脂600μlのを含むカラムを通過する。 </li><li>非特異的に結合したタンパク質を除去するために超音波処理緩衝液50mlおよび高塩緩衝液（50mMトリスpH7.5で、500mMのNaCl、1mMのDTT、5％グリセロール）100mlで次でカラムを洗浄する。 40 mMのグルタチオンを含む高塩緩衝液5mlで結合したタンパク質を溶出する。 </li><li>低いグリセロール（20mMトリスpH7.4中の100mMのKCl、0.5mMのDTTおよび10％グリセロール）pH7.4で2時間、後に20mMのトリス、100mMの塩化カリウム、0.5mMの透析緩衝液2リットル中に溶出したタンパク質を透析DTT、70％グリセロール、8時間または一晩。すべての精製バッファは4℃であり、タンパク質の変性を避けるために、低温室でタンパク質精製を行うことを確認してください。 </li></ol></li></ol> 3.ペプチドアレイのメチル化<ol><li>事前incuペプチド配列のbation <ol><li>酵素と高価な放射性標識したのAdoMetの浪費を避けるために適切な大きさの箱やビニール袋にいずれかのペプチド配列のメチル化を実行します。 10分間酵素なしそれぞれのメチル化緩衝液を含有する密封されたビニール袋中のペプチド配列膜をプレインキュベートし、標識された[メチル - 3 H] -AdoMet。例では、完全な特異プロファイルペプチドアレイ用のメチル化バッファーを8mlを使用するための緩衝液の体積は、配列のサイズに依存する。各酵素の量とのAdoMetの濃度を最適化します。 </li></ol></li><li>ペプチド配列のメチル化<ol><li> 1から2時間-AdoMetプレインキュベーション緩衝液を破棄し、それぞれのPKMTを含むメチル化バッファーの8ミリリットルで膜をインキュベートし、標識[メチル - 3 H]。 NOTE：メチル化反応に必要な酵素の量は、特定のPKMTの活性に依存し、我々は、典型的には、50nMの酵素フィンと私たちのスクリーニング実験を開始Al濃度。 </li></ol></li><li>ペプチド配列の洗濯<ol><li>その後、放射性廃棄物容器内のメチル化バッファーを破棄し、結合したタンパク質を除去するために5分間、100 mM重炭酸アンモニウム、および1％SDSを含む緩衝液20mlで5回のペプチドアレイを洗浄する。放射性廃棄物容器内の洗浄緩衝液を廃棄します。 </li></ol></li><li>放射性シグナルの検出<ol><li>洗浄した後のAmplify溶液（NAMP100V）の10ミリリットル中で5分間メンブレンをインキュベートする。 </li><li>その後、ビニール袋にペプチドアレイを密封、有機溶媒の放射性廃棄物容器にAmplifyソフトウェア液を捨て、オートラジオグラフィーカセットに入れ。 </li><li>暗い部屋でのペプチドアレイ上のオートラジオグラフィーフィルムを配置します。慎重にカセットを閉じ、-80でそれを公開する 必要な時間のためのC°。その後、結果を分析するためにフィルムを開発する。異なるexpositioで倍の画像のカップ​​ルをキャプチャn回強くメチル化ペプチド基質の飽和を回避する。 </li></ol></li></ol> 4.データ処理と解析<ol><li>スポット強度の濃度測定分析<ol><li>従来のスキャナでフィルムをスキャンし、デンシトメトリーでスポット強度を分析。 （フリーウェアです）この使用したImageJまたは商業プログラムの操作を行います。 注：私たちは、この作業にPhoretixソフトウェアを使用。 </li></ol></li><li>正規化と異なる膜からの結果の平均化<ol><li>三重に少なくともペプチドアレイメチル化実験を行う。 1.0として基準基板でのバックグラウンド減算および活性を設定することで、各実験のためにスキャンされた強度を正規化する。個々のスポットのデータを平均化し、それらを、平均値および標準偏差を報告する。 </li></ol></li><li>データ解析と表示<ol><li>相対活性を示すのにグレースケールまたはカラースキームを使用して2Dでデータをプロットします。こののWiかの操作をここに示すように、ExcelやSIGMAPLOT番目。また、データの質を分析するための反復実験の標準偏差の分布のプロットを準備する。 </li><li>定量的基質ペプチドの各残基の認識の精度を比較し、表示するには、私は差別係数D 16,17による位置xにおける各アミノ酸のPKMTの相対的な優先度を計算します。 D X; I = &lt;V のj≠I&gt; / V I - 1 ます。v iは、位置xとのアミノ酸のiを運ぶペプチド変異体のメチル化率である。ここで、&lt;ます。v jは≠i&gt;を含む位置xにおける異なるアミノ酸jは≠iのを運ぶすべての19のペプチドのメチル化の平均速度は、（ある野生型配列）。 注：このことによって定義される識別因子がバックグラウンドレベルに依存する。一つだけ残渣を差別、3％のバックグラウンドを持つ特定の位置で受け入れられた場合32.3倍が得られる。 0の判別係数の位置の結果での指定なし。 </li></ol></li></ol>

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SPOT合成ここに記載されるように、タンパク質 - タンパク質相互作用部位をマッピングし、ペプチド修飾酵素の基質認識を調査するための強力な方法である。 SPOT法により合成されたペプチドは、これは、各インスタンスに確認することが困難であり、90％を超える純度21を有することが報告されているが、しかし、SPOT合成は、依然として、いくつかの欠点を有している。した...

過去20年間、いくつかの報告は、細胞の発達および癌のようないくつかの疾患において、翻訳後修飾（PTM）の重要性を実証したが、最近、タンパク質のリジンのメチル化は、他の重要なPTMとして浮上している。最初にヒストンリジンのメチル化は、本質的なクロマチンマークであることが見出されたが、後の研究は、いくつかの非ヒストンタンパク質1~4のリジンのメチル化を示した。リジン残基のεアミノ基へのS-アデノシル-L-メチオニンからのメチル基の連続的な移動は、ヒトゲノム中に60以上のタンパク質を含むタンパク質のリジンメチルトランスフェラーゼ（PKMTs）と呼ばれる酵素のファミリーによって触媒される。 PKMTsは、最初に特定のリジン残基をメチル化、ヒストン修飾酵素として発見されたが、後の報告は、これらはまた、非ヒストンタンパク質5をメチル化できることを実証した。現在までに、約5000リジンメチル化部位は、異なるタンパク質上で同定された6 </sアップ&gt;が、これらの変更に関与する酵素は、多くの場合、特定されていません。その理由の一つは、最もPKMTsの特異性が広く研究されていないことである。そのため、反復的にPKMTsの新規基質が発見されていることを発生する。 PKMTsの基質特異性の詳細な知識の欠如は、それらの生物学的機能と役割の理解を妨げる。詳細PKMTの特異性を研究するために、1若しくは数個のアミノ酸が異なる多くのペプチド基質のメチル化率を測定する必要があり、理想的には、ペプチドアレイを用いて行われる、比較。得られた特異性プロファイルに基づいて、PKMTsの潜在的基質をさらに研究することができることを同定することができる。 ペプチド配列は、抗体の生化学分析のために広く使用されているツールは、ペプチド修飾酵素およびタンパク質-タンパク質相互作用部位（抗体-抗原、受容体-リガンド）のマッピング7-9である。ペプチドの数百SUCのために必要とされるHアプリケーション。別の方法は、それらの間で樹脂上でのペプチド合成は、非常に一般的に使用され、ペプチド合成のために利用可能であるが、それは、スループットに制限があり、それが比較的高価である。これらの問題は、フランクと同僚10によるSPOT合成法の導入により解決された。 SPOT合成法は、並行して、数百のペプチドの合成を可能にし、平均して、樹脂の合成に比べて安価である。セルロース膜上に合成されたペプチドは、膜から切断し、溶液アッセイにおいて、またはペプチドマイクロアレイ10-13を調製するための遊離ペプチドとして使用することができ、様々なアプリケーションまたはペプチドのいずれかのために直接使用することができる。 SPOT合成は、固体支持体としてのセルロース膜を使用し、標準的なFmoc化学10-13を用いる固相ペプチド合成の変異体である。したがって、ペプチド鎖の合成は、C末端から始まりに向かって進行するリボソームにおける生物学的合成とは対照的に、N末端。セルロース膜は、第一の活性化アミノ酸（ 図1）の取付けのために官能化される。 SPOT法は、自動化ピペッティングシステムを用いて膜上の規定のスポットへの溶媒の液滴中の活性化されたアミノ酸の逐次的送達に基づいている。液体の液滴は、それが後でペプチド合成における化学反応のためのオープンな反応器として機能する円形のウェットスポットを形成し、多孔質膜上に分配される。スポットサイズは​​体積分注し、膜の吸収能力によって決定され、そのようなスポットの倍数は、アレイとして配置されている。合成のスケールは、スポットサイズ、膜の積載量と相関する。スポットのアレイの密度との間の距離は、スポットサイズを変化させることによって管理されている。セルロース膜はchemicに耐性は、安価で、ペプチド合成において固相として、いくつかの利点を有する水溶液中で安定であり、取り扱いが容易で、ペプチド合成に使用するals。また、その親水性の性質は、いくつかの生物学的アッセイシステムに適しています。 SPOT合成は、ペプチドの必要数に応じて、（ペプチドの1000など）を手動で行うか、自動化することができる。 Intavis（ケルン、ドイツ）から完全に自動化されたSPOT合成は、我々の用途に用いられる。これは、異なる量および異なる長さのペプチドの合成を可能にする。また、段階的合成14,15によって調製することができる線状ペプチドは、定期的に、最大42個のアミノ酸の付加ペプチドが、15〜20アミノ酸長で合成される。しかしながら、アミノ酸の数を増加させることは、ペプチドの品質に影響を与える全体的なカップリング収率の低下につながる。なぜならスポットあたりのペプチドの量が少ないと、製品はしばしば精製が困難であり、個々のペプチドの品質を容易に評価することはできない。したがって、結果は、SPOT PEPTから得IDEの配列のいずれかのペプチドの合成において、所望のペプチド配列を含むタンパク質を合成することによって基準に従って精製し、分析することができる大規模で標準的な方法によって合成されたペプチドを確認しなければならない。それでも、我々は高い信頼性がSPOT合成を見つけ、再現性があることが一般に生じる。 SPOT合成は、いくつかの市販の修飾アミノ酸はまた、合成のために使用することができ、タンパク質構成アミノ酸に制限ペプチドは、側鎖保護基の最終的な切断の前と後に修正されることを可能にし、さらに、それはまた、組み込むことを可能にされていない、リン酸化されたメチル化またはアセチル化アミノ酸は11。 SPOT法により合成固定化ペプチドライブラリーは、直接、多くの生物学的および生化学的アッセイのために使用することができる。我々はPKMTsの基質特異性を調べるために300-400ペプチドを含むペプチドアレイを用いた。酵素によるMODIFIのために陽イオンは、ペプチド配列は、それぞれPKMTと共にインキュベートされ、適切な緩衝液中に[メチル- 3 H]標識-AdoMet。それぞれの基質のメチル化は、オートラジオグラフィー（ 図3）を介して、ペプチド基質へのAdoMetから放射性標識されたメチル基の酵素的転移を下記によって分析される。この手順によって、ペプチドアレイは、同時に異なるペプチド基質のメチル化の研究を可能にする。この方法の1つの重要な利点は、メチル化動態の線形位相の間に、各ペプチドの相対的なメチル化は、解離定数（k 猫 / Kで割った触媒速度定数に比例するように、すべてのペプチドは、競争においてメチル化されていることであるそれぞれのペプチド基質に対する酵素のD）。したがって、各スポットに取り込まれた放射活性の量は、直接特定のペプチドに向かって酵素活性と相関している。使い方ペプチド配列のメチル化実験の結果、PKMTの特異性プロファイルが定義され、この新規基質に基づくこ​​とができるが前提とすることができる。ペプチド配列は、ペプチドレベルでの新規基質のメチル化の迅速かつ費用効率的な検証を可能にする。このために、アレイは、標的部位でのLysのAlaの代わりにを含む修飾されたペプチド、ならびに陽性および陰性対照ペプチドと共に予測新規基質を含有する調製される。最後に、新規基質は一緒にターゲットのLysがAlaに変更され、メチル化は、タンパク質レベルで確認することができる変異体を有するタンパク質として調製することができる。結果に応じて、これは、新たに記載されるタンパク質基質のメチル化の潜在的な役割に対処する生物学的研究が続いている。

<table><tbody><tr><td>Ethanol abs Gradient Grade HPLC</td><td>Honeywell</td><td>10299901</td><td>Flammable</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-Dimethylformamide Peptide Synthesis</td><td>Biosolve</td><td>4193302</td><td>Flammable, Toxic</td></tr><tr><td>Piperidine &amp;ge;99% for Peptide Synthesis</td><td>Roth</td><td>A122.1</td><td>Flammable, Toxic, corrosive</td></tr><tr><td>Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate )</td><td>Novabiochem</td><td>8510860100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&amp;rsquo;&lt;/em&gt;-Diisopropylcarbodiimide purum &amp;ge;98% GC</td><td>Fluka</td><td>38370</td><td>Flammable, Toxic, corrosive</td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Roth</td><td>CP28.1</td><td>Flammable, Toxic, corrosive</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane 99%</td><td>Aldrich</td><td>233781</td><td>Flammable, Toxic</td></tr><tr><td>Dichlormethane &amp;ge;99.9%</td><td>Roth</td><td>P089.1</td><td>Carcinogenic</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Methyl-2-Pyrrolidone</td><td>Roth</td><td>4306.2</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Derivatized cellulose Membrane</td><td>Intavis AG K&amp;ouml;ln</td><td>32.1</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Roth</td><td>P088.2</td><td>Toxic, corrosive</td></tr><tr><td>Bromphenolblue</td><td>AppliChem</td><td>A3640.0010</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Hydrogen Carbonate</td><td>Roth</td><td>T871.2</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate Pellets</td><td>Roth</td><td>CN30.3</td><td>Toxic, Flammable</td></tr><tr><td>MultiPep Synthesizer</td><td>Intavis AG K&amp;ouml;ln</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>HyperfilmTM high performance film</td><td>GE Healthcare</td><td>28906837</td><td></td></tr><tr><td>Phoretix software</td><td>TotalLab</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

specificity analysis of protein lysine methyltransferases using spot peptide arrays

リジンのメチル化は、新たな翻訳後修飾であり、それは細胞の発達および多くの疾患において重要な役割を果たしているいくつかのヒストンおよび非ヒストンタンパク質、上で同定された。約5000リジンメチル化部位は、タンパク質のリジンメチルトランスフェラーゼの数十によって設定された異なるタンパク質、上で同定された。これは、各PKMTしかし今は、1つまたは2つの基板は、これらの酵素のいくつかのために同定されているまで、複数のタンパク質をメチル化することを示唆している。この問題に取り組むために、我々が導入しているペプチドアレイベースの基質特異性はPKMTsの分析。異なる配列を有するいくつかの基板のメチル化は1アレイ上でテストすることができるので、ペプチドアレイはPKMTsの特異性を特徴づけるための強力なツールです。我々はIntavis SPOT合成機を用いてセルロース膜上にペプチド配列を合成し、様々なPKMTsの特異性を分析した。これらの酵素のいくつかのために、その結​​果に基づいて、新規のubstratesを同定することができた。例えば、ペプチドアレイを用いることによりNSD1ために、我々はそれがH4のK44の代わりに報告H4K20のメチル化と加えH1.5K168は以前から知​​られているH3K36上非常に好ましい基質であることを示した。したがって、ペプチド配列は、生化学的にPKMTsを特徴付けるための強力なツールです。

ペプチドアレイが正常生化学PKMTsの特異性を特徴付けるために使用し、PKMTのいくつかの新規なヒストンおよび非ヒストン基質は、このアプローチ5,16-19によって同定した。 PKMT（または任意の酵素）の正確な基質スペクトルを定義すると、その分子機構と細胞機能の理解に向けて不可欠なステップである。 ペプチドSPOTアレイメチル化法の適用例として、NSD1 PKMT <sup...

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Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

SPOTペプチド配列を用いてタンパク質リジンメチルトランスフェラーゼの特異性の解析

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

specificity-analysis-protein-lysine-methyltransferases-using-spot

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

13.9K ビュー.  Stuttgart University. Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

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Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The mass production and distribution of antibodies specific to histone PTMs has greatly facilitated research on these marks. As histone PTM antibodies are key reagents for many chromatin biochemistry applications, rigorous analysis of antibody specificity is necessary for accurate data interpretation and continued progress in the field. This protocol describes an integrated pipeline for the design, fabrication and use of peptide microarrays for profiling the specificity of histone antibodies. The design and analysis aspects of this procedure are facilitated by ArrayNinja, an open-source and interactive software package we recently developed to streamline the customization of microarray print formats. This pipeline has been used to screen a large number of commercially available and widely used histone PTM antibodies, and data generated from these experiments are freely available through an online and expanding Histone Antibody Specificity Database. Beyond histones, the general methodology described herein can be applied broadly to the analysis of PTM-specific antibodies.

This manuscript describes methods for applying peptide microarray technology to specificity profiling of antibodies that recognize histones and their post-translational modifications.

ペプチドマイクロアレイによるヒストン抗体特異性の解析

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

生化学

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important for revealing protease function. The method proposed in this study determines protease specificity by measuring the molecular weight of unique substrates using Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. The substrates contain iminobiotin, while the cleaved site consists of amino acids, and the spacer consists of polyethylene glycol. The cleaved substrate will generate a unique molecular weight using a cleaved amino acid. One of the merits of this method is that it may be carried out in one pot using crude samples, and it is also suitable for assessing multiple samples. In this article, we describe a simple experimental method optimized with samples extracted from mouse lung tissue, including tissue extraction, placement of digestive substrates into samples, purification of digestive substrates under different pH conditions, and measurement of the substrates&#39; molecular weight using MALDI-TOF mass spectrometry. In summary, this technique allows for the identification of protease specificity in crude samples derived from tissue extracts using MALDI-TOF mass spectrometry, which may easily be scaled up for multiple sample processing.

Here, we present a protocol to determine protease specificity in crude mouse tissue extracts using MALDI-TOF spectrometry.

MALDI-TOF 質量分析法によるマウス組織におけるプロテアーゼの特異性の定量抽出: 特異性変化を引き起こすに PH を操作します。

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, including RNA processing, signal transduction, DNA damage response, miRNA biogenesis, and translation.
In recent years, thanks to biochemical and analytical developments, mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as the most effective strategy to characterize the cellular methyl-proteome with single-site resolution. However, identifying and profiling in vivo protein R-methylation by MS remains challenging and error-prone, mainly due to the substoichiometric nature of this modification and the presence of various amino acid substitutions and chemical methyl-esterification of acidic residues that are isobaric to methylation. Thus, enrichment methods to enhance the identification of R-methyl-peptides and orthogonal validation strategies to reduce False Discovery Rates (FDR) in methyl-proteomics studies are required.
Here, a protocol specifically designed for high-confidence R-methyl-peptides identification and quantitation from cellular samples is described, which couples metabolic labeling of cells with heavy isotope-encoded Methionine (hmSILAC) and dual protease in-solution digestion of whole cell extract, followed by off-line High-pH Reversed Phase (HpH-RP) chromatography fractionation and affinity enrichment of R-methyl-peptides using anti-pan-R-methyl antibodies. Upon high-resolution MS analysis, raw data are first processed with the MaxQuant software package and the results are then analyzed by hmSEEKER, a software designed for the in-depth search of MS peak pairs corresponding to light and heavy methyl-peptide within the MaxQuant output files.

Protein Arginine (R)-methylation is a wide-spread post-translational modification regulating multiple biological pathways. Mass spectrometry is the best technology to globally profile the R-methyl-proteome, when coupled to biochemical approaches for modified peptide enrichment. The workflow designed for the high confidence identification of global R-methylation in human cells is described here.

質量分析に基づくプロテオミクスアプローチによるグローバルで信頼性の高いタンパク質R-メチル化分析

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

メチルトランスフェラーゼのプロファイリングおよびその他の S -アデノシル- L</subキャプチャの複合質量分析法（CCMS）別> -ホモシステイン結合タンパク質

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

生物学

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small molecule studies and drug development 4. Many epigenetic regulators have only recently been discovered and are still in the process of being classified. Among these enzymes are lysine demethylases which remove methyl groups from lysines on histones and other proteins. Due to the novel nature of this class of enzymes, few assays have been developed to study their activity. This has been a road block to both the classification and high throughput study of histone demethylases. Currently, very few demethylase assays exist. Those that do exist tend to be qualitative in nature and cannot simultaneously discern between the different lysine methylation states (un-, mono-, di- and tri-). Mass spectrometry is commonly used to determine demethylase activity but current mass spectrometric assays do not address whether differentially methylated peptides ionize differently. Differential ionization of methylated peptides makes comparing methylation states difficult and certainly not quantitative (Figure 1A). Thus available assays are not optimized for the comprehensive analysis of demethylase activity.
Here we describe a method called MassSQUIRM (mass spectrometric quantitation using isotopic reductive methylation) that is based on reductive methylation of amine groups with deuterated formaldehyde to force all lysines to be di-methylated, thus making them essentially the same chemical species and therefore ionize the same (Figure 1B). The only chemical difference following the reductive methylation is hydrogen and deuterium, which does not affect MALDI ionization efficiencies. The MassSQUIRM assay is specific for demethylase reaction products with un-, mono- or di-methylated lysines. The assay is also applicable to lysine methyltransferases giving the same reaction products. Here, we use a combination of reductive methylation chemistry and MALDI mass spectrometry to measure the activity of LSD1, a lysine demethylase capable of removing di- and mono-methyl groups, on a synthetic peptide substrate 5. This assay is simple and easily amenable to any lab with access to a MALDI mass spectrometer in lab or through a proteomics facility. The assay has ~8-fold dynamic range and is readily scalable to plate format 5.

We present a method for using MALDI mass spectrometry and reductive methylation chemistry to quantify changes in lysine methylation.

リジン脱メチル化酵素活性の定量測定のためのMassSQUIRMのアプリケーション

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and function at specific regions is regulated by the local enrichment of histone post-translational modifications (hPTMs) and variants, chromatin-binding proteins, including transcription factors, and DNA methylation. The proteomic characterization of chromatin composition at distinct functional regions has been so far hampered by the lack of efficient protocols to enrich such domains at the appropriate purity and amount for the subsequent in-depth analysis by Mass Spectrometry (MS). We describe here a newly designed chromatin proteomics strategy, named ChroP (Chromatin Proteomics), whereby a preparative chromatin immunoprecipitation is used to isolate distinct chromatin regions whose features, in terms of hPTMs, variants and co-associated non-histonic proteins, are analyzed by MS. We illustrate here the setting up of ChroP for the enrichment and analysis of transcriptionally silent heterochromatic regions, marked by the presence of tri-methylation of lysine 9 on histone H3. The results achieved demonstrate the potential of ChroP in thoroughly characterizing the heterochromatin proteome and prove it as a powerful analytical strategy for understanding how the distinct protein determinants of chromatin interact and synergize to establish locus-specific structural and functional configurations.

By combining native and crosslinking chromatin immunoprecipitation with high-resolution Mass Spectrometry, ChroP approach enables to dissect the composite proteomic architecture of histone modifications, variants and non-histonic proteins synergizing at functionally distinct chromatin domains.

ChroPアプローチは、クロマチンの遺伝子座特異的プロテオームの風景を分析するために、チップと質量分析を組み合わせ

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

ペプチド配列の使用タンパク質間相互作用部位を同定

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Characterization of Neuronal Lysosome Interactome with Proximity Labeling Proteomics

Lysosomes frequently communicate with a variety of biomolecules to achieve the degradation and other diverse cellular functions. Lysosomes are critical to human brain function, as neurons are postmitotic and rely heavily on the autophagy-lysosome pathway to maintain cellular homeostasis. Despite advancements in the understanding of various lysosomal functions, capturing the highly dynamic communications between lysosomes and other cellular components is technically challenging, particularly in a high-throughput fashion. Here, a detailed protocol is provided for the recently published endogenous (knock-in) lysosome proximity labeling proteomic method in human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived neurons. 
Both lysosomal membrane proteins and proteins surrounding lysosomes within a 10-20 nm radius can be confidently identified and accurately quantified in live human neurons. Each step of the protocol is described in detail, i.e., hiPSC-neuron culture, proximity labeling, neuron harvest, fluorescence microscopy, biotinylated protein enrichment, protein digestion, LC-MS analysis, and data analysis. In summary, this unique endogenous lysosomal proximity labeling proteomics method provides a high-throughput and robust analytical tool to study the highly dynamic lysosomal activities in live human neurons.

A neuronal lysosome proximity labeling proteomics protocol is described here to characterize the dynamic lysosomal microenvironment in human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Lysosomal membrane proteins and proteins that interact with lysosomes (stably or transiently) can be accurately quantified in this method with excellent intracellular spatial resolution in live human neurons.

近接標識プロテオミクスを用いたニューロンリソソームインタラクトームの特性評価

Lysosomes frequently communicate with a variety of biomolecules to achieve the degradation and other diverse cellular functions. Lysosomes are critical to ...

神経科学

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein functions, for example, by changing enzymatic activity or by mediating interactions. Precise quantification of site-specific protein acylation occupancy, or stoichiometry, is essential for understanding the functional consequences of both global low-level stoichiometry and individual high-level acylation stoichiometry of specific lysine residues. Other groups have reported measurement of lysine acetylation stoichiometry by comparing the ratio of peptide precursor isotopes from endogenous, natural abundance acylation and exogenous, heavy isotope-labeled acylation introduced after quantitative chemical acetylation of proteins using stable isotope-labeled acetic anhydride. This protocol describes an optimized approach featuring several improvements, including: (1) increased chemical acylation efficiency, (2) the ability to measure protein succinylation in addition to acetylation, and (3) improved quantitative accuracy due to reduced interferences using fragment ion quantification from data-independent acquisitions (DIA) instead of precursor ion signal from data-dependent acquisition (DDA). The use of extracted peak areas from fragment ions for quantification also uniquely enables differentiation of site-level acylation stoichiometry from proteolytic peptides containing more than one lysine residue, which is not possible using precursor ion signals for quantification. Data visualization in Skyline, an open source quantitative proteomics environment, allows for convenient data inspection and review. Together, this workflow offers unbiased, precise, and accurate quantification of site-specific lysine acetylation and succinylation occupancy of an entire proteome, which may reveal and prioritize biologically relevant acylation sites.

Here, we present unbiased quantification of site-specific protein acetylation and/or succinylation occupancy (stoichiometry) of an entire proteome through a ratiometric analysis of endogenous modifications to modifications introduced after quantitative chemical acylation using stable isotope-labeled anhydrides. In combination with sensitive data-independent acquisition mass spectrometry, accurate site occupancy measurements are obtained.

部位特異的タンパク質のリジンのアセチル化のサクシニル化化学量論組成データに依存しない取得質量分析法による定量

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into protein function. Despite the importance of multi-PTM enrichment studies, few studies investigate more than one PTM at a time, due partially to the expenses, time, and large protein quantities required to perform multiple global proteomic analysis of PTMs. The &#34;one-pot&#34; affinity enrichment detailed in this protocol overcomes these barriers by permitting the simultaneous identification and quantification of peptides with lysine residues containing acetylation and succinylation PTMs with low amounts of sample input. The protocol involves preparation of protein lysate from mouse livers of SIRT5 knockout mice, performance of trypsin digestion, enrichment for PTMs, and performance of mass spectrometric analysis using a data-independent acquisition (DIA) workflow. Because this workflow allows for the enrichment of two PTMs from the same sample simultaneously, it provides a practical tool to study PTM crosstalk without requiring large amounts of samples, and it greatly reduces the time required for sample preparation, data acquisition, and analysis. The DIA component of the workflow provides comprehensive PTM-specific information. This is particularly important when studying PTM site localization, as DIA provides comprehensive sets of fragment ions that can be computationally deciphered to differentiate between different PTM localization isoforms.

This workflow describes the performance of time- and cost-efficient enrichment of multiple protein post-translational modifications (PTMs) simultaneously for quantitative global proteomic analysis. The protocol utilizes peptide-level PTM enrichment with multiple conjugated antibodies, followed by data-independent acquisition mass spectrometry analysis to gain biological insights into PTM crosstalk.

定量化とサイトローカリゼーションのための2つの翻訳後修飾の同時アフィニティエンリッチメント

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into ...

SPOTペプチド配列を用いてタンパク質リジンメチルトランスフェラーゼの特異性の解析

要約

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ペプチドマイクロアレイによるヒストン抗体特異性の解析

MALDI-TOF 質量分析法によるマウス組織におけるプロテアーゼの特異性の定量抽出: 特異性変化を引き起こすに PH を操作します。

質量分析に基づくプロテオミクスアプローチによるグローバルで信頼性の高いタンパク質R-メチル化分析

メチルトランスフェラーゼのプロファイリングおよびその他の S -アデノシル-_{L -ホモシステイン結合タンパク質}

リジン脱メチル化酵素活性の定量測定のためのMassSQUIRMのアプリケーション

ChroPアプローチは、クロマチンの遺伝子座特異的プロテオームの風景を分析するために、チップと質量分析を組み合わせ

ペプチド配列の使用タンパク質間相互作用部位を同定

近接標識プロテオミクスを用いたニューロンリソソームインタラクトームの特性評価

部位特異的タンパク質のリジンのアセチル化のサクシニル化化学量論組成データに依存しない取得質量分析法による定量

定量化とサイトローカリゼーションのための2つの翻訳後修飾の同時アフィニティエンリッチメント

SPOTペプチド配列を用いてタンパク質リジンメチルトランスフェラーゼの特異性の解析

要約

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ペプチドマイクロアレイによるヒストン抗体特異性の解析

MALDI-TOF 質量分析法によるマウス組織におけるプロテアーゼの特異性の定量抽出: 特異性変化を引き起こすに PH を操作します。

質量分析に基づくプロテオミクスアプローチによるグローバルで信頼性の高いタンパク質R-メチル化分析

メチルトランスフェラーゼのプロファイリングおよびその他の S -アデノシル- L -ホモシステイン結合タンパク質

リジン脱メチル化酵素活性の定量測定のためのMassSQUIRMのアプリケーション

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部位特異的タンパク質のリジンのアセチル化のサクシニル化化学量論組成データに依存しない取得質量分析法による定量

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メチルトランスフェラーゼのプロファイリングおよびその他の S -アデノシル-_{L -ホモシステイン結合タンパク質}