Biz kitle spektrometrik destek için UAMS Proteomik Tesis teşekkür ederim. Bu proje için finansman NIH hibe P20RR015569, P20RR016460 ve R01DA025755 tarafından sağlandı.

Bu protokol, Blair ve ark değiştirilir. 6. 1. LSD1 demetilasyonu Assay <ol><li> 20 ul&#39;lik bir son hacim içinde, demetilaz tampon içinde 0.25 g di-metil histon H3 peptit (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biyotin) (50 mM Tris-Cl, pH 8.5, 50 mM KCI, 5 mM MgCl2,% 5 ile 125 ng rekombinant LSD1 kombine gliserol). Buna ek olarak, herhangi bir enzim ile bir peptid sadece kontrol gerçekleştirmek. Kontrol bölümü 3 ve indirgeyici metilasyon gerekmez. </li><li> 37 de 2 saat boyunca inkübe ° C. </li><li> Peptidler toplamak için, her bir örnek için 8 uL Póros R2, 20 mikron boncuklar ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca ajite. Metanol 1 hacmine sahip boncuk 1 hacim süspanse ederek Poros boncuklar hazırlamak ve daha sonra% 5 formik asit /% 0.2 TFA içerisinde 10 hacim ekleyin. </li><li> Durumu iki ucu içine% 0.1 TFA 20 uL aspirasyon ve bir pipet ile geri dışarı iterek C 18 ZipTips. % 0,1 T ile iki kez yapınFA, dört adet 70% asetonitril ile kere /% 0.1 TFA, ve% 0.1 TFA ile yeniden dört kez. </li><li> ZipTips in C&#39;de 18 reçinesi arkasında boncuk bulamaç pipet ve bir pipet ile yoluyla hacmi iterek şartlandırılmış C&#39;de 18 ZipTips üzerine iki numune (kontrolü ve demetilaz reaksiyonu) yerleştirin. </li><li> % 0.1 TFA içerisinde 20 uL ile iki kez yıkanır ZipTips. </li><li> % 70 asetonitril /% 0.1 TFA içerisinde 40 uL içinde elüt edilmesi. </li><li> Bir SpeedVac konsantratör tamamen her seyreltici Lyophilize. </li></ol> 2. Redüktif Metilasyon Bu protokolün bir kısmı Blair ve ark modifiye edilir. Ve Rayment ve ark. 6,7. <ol><li> 50 mM fosfat tamponu, pH 7.4 100 ul içinde demetilaz Reaksiyon tekrar askıya. </li><li> Demetilaz reaksiyon, 15 mg / mL boran dimetilamin 8 uL ekleyin. Boran dimetilamin 15 mg / mL stok çözelti vermesi için, 50 mM fosfat tamponu, pH 7.4 içinde çözülür.Bu taze yapılmalıdır. </li><li> Demetilaz reaksiyon için, 250 mM döteryumlanmış formaldehit 16 uL ekleyin. 250 mM Döteryumlanmış formaldehid H 2 0 içinde stok seyreltilmesi ile hazırlanır. Bu taze yapılmalıdır. </li><li> 2 saat süreyle 4 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Adımları 2.2, 2.3 ve 2.4 tekrarlayın. </li><li> Adım 2.2 tekrarlayın. </li><li> 4 ° C&#39;de inkübe ~ 15 saat boyunca. </li><li> Demetilaz örnek için, 1M Tris, indirgeyici metilasyon reaksiyonu gidermek için pH 7.4 12.5 uL ekleyin. </li></ol> 3. MALDI Kütle Spektrometresi <ol><li> Demetilaz reaksiyon Poros R2 20 mikron boncuk ekleyin ve adımları 1,3-1,6 açıklandığı gibi ZipTips üzerinde toplamak. </li></ol> Not: 50 mM fosfat tamponu, pH 7.4 100 uL, kontrol yeniden askıya alma ve diğer örnek adım 3.1 başlayarak gibi davran. <ol start="2"><li> % 33 doyurmak 2 uL kullanılarak bir MALDI Örnek plakası üzerine ZipTips gelen kontrol ve demetilaz Reaksiyon numuneleri elüt edilmesid 2,5-dihidroksibenzoik asit. % 33 2,5-dihidroksibenzoik asit hazırlamak için,% 70 asetonitril /% 0.1 TFA içerisinde doymuş% 33 kadar seyreltik daha sonra% 70 asetonitril /% 0.1 TFA içerisinde 2,5-dihidroksibenzoik asit, doymuş bir çözelti yapmak ve. Yıkanan örnekleri kurulayın ve kristalize izin verin. </li><li> Bir PerkinElmerSciex MALDI-prOTOF kütle spektrometresi veya mevcut yüksek çözünürlüklü MALDI kütle spektrometresi 8,9,10 kullanarak kütle spektrumları toplayın. </li><li> Spektrumları görüntüleme ve kütle spektrometre üreticisi tarafından sağlanan PerkinElmerSciex TOFworks yazılım veya yazılım kullanarak pik alanları ayıklayın. </li><li> Tandem kütle spektrometresi yetenekleri sağlayan kullanılabilir bir kütle spektrometresi sistemi ile MS 2 ile reaksiyon ürünleri doğrulayın. </li></ol> 4. Veri Analizi <ol><li> Ağır formaldehid (Şekil 1B) kullanılarak hazırlandı izotopik örtüşme telafi etmek için, pik alanı 13 C&#39;de 2 ve 13 C&#39;de 4 izotopları relativ (A) oranının belirlenmesiindirgeyici metilasyon (Şekil 2A) uğramamıştır kontrol örneği için Monoizotopik pik e. Denklem 1: 13C2 / A 12C = r 1 Denklem 2: A 13C4 / A 12C = r 2 Bu sizin deney ve kütle spektrometresi özgü bu izotop devletlerin mevcut peptid oranı (r 1 ve r 2) verecektir. </li><li> Demetilaz reaksiyonu Örnek olarak, her durumda modifikasyon (Şek. 2B) mevcut peptid görece miktarı ölçülmesi için aşağıdaki formüllerde R 1 ve R2 değerlerinin kullanımı: Eşitlik 3: H3K4me2 = A 1 Eq 4: H3K4me = A 2 - r 1 (A 1) Denklem 5: H3K4 = A 3 - r 2 (A 1) - [r 1 (A 2 - r 1 (A 1))] </li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar LSD1 kullanarak, kantifikasyonunda MassSQUIRM etkinliğini göstermeklisin demetilasyon. Gibi Protokolü Text bölümünde açıklandığı üzere, bu LSD1 125 ng ve 0.25 g di-metil histon H3 peptit (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotin) ile bir demetilaz deneyi gerçekleştirilir. Kontrolü ve demetilaz Reaksiyon numuneleri indirgeyici metilasyonu ve MALDI kütle spektrometrisi tabi tutuldu. Indirgeyici metilasyon uğramadı kontrol reaksiyonu Bu peptid için tipik izotopik zarfı gösterdi ve denklemleri 1 ve 2 (Şekil 2A) için pik alanları sağlamıştır. Demetilaz reaksiyon için kütle spektrumu denklemler 3-5 (Şekil 2B) için pik alanı temin. Kontrolü ve demetilaz reaksiyondan pik alanları kullanarak, LSD1 aşağıdaki reaksiyon ürünleri vermek üzere peptid demetillenmiş belirlenmiştir:% 33.7 di-metil Lys4,% 42.3 mono-metil Lys4, ve% 24 un-metillenmiş Lys 4. Blair ve ark bakınız. Tam LSD1 demetilaz aktivitesinin analizi gibi inhibitörü çalışmaları için 6. Not böyle reaksiyon süresi, enzim olarak değişen değişkenlerkonsantrasyonu ve substrat konsantrasyonu faaliyet derinlemesine bir analiz için izin verecektir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3604/3604fig1.jpg" /> Şekil 1. MassSQUIRM bakış. (A) histon H3 bir peptidin N-terminali olarak gösterilir un-(yeşil), mono-(kırmızı), ya da di-(mavi), lisin 4 azından metillenmiş. Her peptid kimyasal bileşiminin değişimiyle miktar karmaşık hale diferansiyel iyonizasyon yol açar. (B) indirgeyici metilasyon tüm peptidler benzer şekilde iyonize neden olur di-metil durumuna tüm lisin artıkları dönüştürür. Indirgeyici metilasyon reaksiyonu ağır formaldehit kullanımı metilasyon orijinal kimlik retansiyon sağlar. Kapalı daireler ağır metilasyon işaret ederken açık daireler ışık metilasyon gösterir. Blair ve ark. 2011 6. modifiye edilmiştir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3604/3604fig2.jpg" /> Figüre 2. MassSQUIRM diferansiyel olarak metillenmiş peptidler ölçmek için kullanılabilir. (A) bir di-metillenmiş sentetik histon H3 peptit (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biyotin) R 1 ve denklemler 1 ve 2 &#39;de R 2 olarak kaydedildi kütle spektrometrisi ve Monoizotopik pik göre pik oranları kullanılarak analiz edilmiştir. (B) aynı sentetik peptid, 37 ° C de iki saat süreyle demetilaz tampon içinde 125 ng LSD1 ile inkübe edildi Örnekler daha sonra, analizi MassSQUIRM tabi tutuldu. Zirveleri örtüşen karışık bir nüfus olarak Şekil 1B görülen üç farklı metilasyon devletleri temsil eder. Monoizotopik Pik Alanları A 1, A 2 ve A 3 olarak kaydedildi. Pik alanları denklemleri 3-5 kullanılmıştır. Kapalı daireler ağır metilasyon işaret ederken açık daireler ışık metilasyon gösterir. Blair ve ark Modifiye. 2011 6.

<ol>
	<li>Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics:+a+landscape+takes+shape.">Epigenetics: a landscape takes shape.</a> Cell. 128, 635-638 (2007).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li><li>Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+Regulation+by+Lysine+Demethylase+5+(KDM5)+Enzymes+in+Cancer.">Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer.</a> Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).</li><li>Cole, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+probes+for+histone-modifying+enzymes.">Chemical probes for histone-modifying enzymes.</a> Nat. Chem. Biol. 4, 590-597 (2008).</li><li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1.">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119, 941-953 (2004).</li><li>Blair, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MassSQUIRM:+An+assay+for+quantitative+measurement+of+lysine+demethylase+activity.">MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity.</a> Epigenetics. 6, 490-499 (2011).</li><li>Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+myosin+subfragment-1:+a+molecular+motor.">Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor.</a> Science. 261, 50-508 (1993).</li><li>Collom, S. L., Jamakhandi, A. P., Tackett, A. J., Radominska-Pandya, A., Miller, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CYP2E1+active+site+residues+in+substrate+recognition+sequence+5+identified+by+photoaffinity+labeling+and+homology+modeling.">CYP2E1 active site residues in substrate recognition sequence 5 identified by photoaffinity labeling and homology modeling.</a> Arch. Biochem. Biophys. 459, 59-69 (2007).</li><li>Gradolatto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+Yta7+Regulates+Histone+Gene+Expression.">Saccharomyces cerevisiae Yta7 Regulates Histone Gene Expression.</a> Genetics. 179, 291-304 (2008).</li><li>Taverna, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yng1+PHD+finger+binding+to+histone+H3+trimethylated+at+lysine+4+promotes+NuA3+HAT+activity+at+Lysine+14+of+H3+and+transcripiton+at+a+subset+of+targeted+ORFs.">Yng1 PHD finger binding to histone H3 trimethylated at lysine 4 promotes NuA3 HAT activity at Lysine 14 of H3 and transcripiton at a subset of targeted ORFs.</a> Mol. Cell. 24, 785-796 (2006).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

MassSQUIRM mono-ve di-metilasyon dahil lisin demethylases aktivitesinin analizi için kapsamlı bir ucuz ve niceliksel bir yöntemdir. MassSQUIRM reaksiyon ürününün aynı zamanda ara ürün için sadece kantitatif sunmaktadır. Bu testte LSD1 ve diğer histon demethylases mekanizması okuyan güçlü bir araç olarak kullanılabilir. Aynı zamanda böyle PHF8 olarak yeni keşfedilen lisin demetilaz enzimler sınıflandırmak ve belirli metil enzimleri için kullanılabilecek için yararlı olacaktır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> LSD1 </td><td> BPS Biosciences </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> H3K4me2-biotin peptit </td><td> in-house hazırlanır </td><td> hiçbiri </td></tr><tr><td> Poros R2 20 mikron boncuk </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-1129-06 </td></tr><tr><td> C 18 ZipTip </td><td> Millipore </td><td> ZTC18M </td></tr><tr><td> Trifloroasetik asit (TFA) </td><td> Thermo </td><td> 28904 </td></tr><tr><td> asetonitril </td><td> Balıkçı </td><td> A996 </td></tr><tr><td> 2,5-dihidroksibenzoik asit </td><td> Sigma </td><td> 85707 </td></tr><tr><td> Boran dimetilamin </td><td> Sigma </td><td> 180238 </td></tr><tr><td> izotopça ağır d 2-formaldehit </td><td> Cambridge İzotop Laboratuvarı </td&gt; <td> DLM-805-20 </td></tr><tr><td> Tris </td><td> Balıkçı </td><td> BP154 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Balıkçı </td><td> BP366 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> Balıkçı </td><td> BP214 </td></tr><tr><td> Gliserin </td><td> Balıkçı </td><td> G33 </td></tr><tr><td> Formik asit </td><td> Fluka </td><td> 06440 </td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Balıkçı </td><td> A452 </td></tr><tr><td> Na-fosfat </td><td> Balıkçı </td><td> BP329 </td></tr><tr><td> SpeedVac Konsantratörü </td><td> Bilgin </td><td> DNA110 </td></tr><tr><td> MALDI-prOTOF kütle spektrometresi ve TOFworks yazılım </td><td> PerkinElmerSciex </td><td> hiçbiri </td></tr></tbody></table>

application of masssquirm for quantitative measurements of lysine demethylase activity

Son zamanlarda, epigenetik düzenleyiciler 1-3 çok farklı hastalıklara kilit oyuncular olarak tespit edilmiştir. Sonuç olarak, bu enzim küçük molekül çalışmalar ve ilacın geliştirilmesi 4 ana hedefi vardır. Birçok epigenetik regülatörler son zamanlarda saptanmış olması ve sınıflandırılmaktadır süreci halen devam etmektedir. Bu enzimler arasında histonlar ve diğer proteinler üzerindeki lysines gelen metil grupları kaldırmak lisin demethylases vardır. Enzimlerin bu sınıfın yeni niteliği nedeniyle, birkaç testler faaliyetlerini incelemek için geliştirilmiştir. Bu sınıflandırma ve histon demethylases yüksek verimlilik çalışması hem de yol bloğu olmuştur. Günümüzde çok az demetilaz testler var. Var yaptığımız bu doğada nitel olma eğilimindedir ve aynı anda farklı lizin metilasyon devletler arasında ayırt edemez (un-, mono-, di-ve tri-). Kütle spektrometresi yaygın demetilaz etkinliğini belirlemek için kullanılan ancak mevcut kitle spektrometrik deneyleri yapmak edilirayirt metillenmiş peptidler farklı iyonize olmadığına ilişkin. Metillenmiş peptidlerin Diferansiyel iyonlaşma metilasyon devletler zor ve (Şekil 1A) kesinlikle niceliksel değil karşılaştırma yapar. Böylece mevcut testlerin demetilaz faaliyet kapsamlı bir analiz için optimize edilmiş değildir. Burada, böylece esas olarak aynı kimyasal maddeleri hale getirerek, tüm lysines di-metillenmiş olmak zorlamak için döteryumlanmış formaldehit ile amin gruplarının indirgeyici metilasyon dayanmaktadır MassSQUIRM olarak adlandırılan bir yöntem (izotopik indirgeyici metilasyon kullanılarak kütle spektrometrik kantitatif) ve dolayısıyla tarif iyonize aynı (Şekil 1B). Indirgeyici metilasyon izleyerek sadece kimyasal fark hidrojen ve MALDI iyonizasyon verimliliği etkilemez döteryum vardır. MassSQUIRM assay un-, mono-veya di-metillenmiş lysines ile demetilaz reaksiyon ürünleri için kesin. Assay da sa veren lisin methyltransferases için de geçerlidirBana reaksiyon ürünleri. Burada, indirgeyici bir metilasyon kimya ve MALDI kütle spektrometrisi LSD1 aktivitesini ölçmek için, bir sentetik peptid substrat üzerindeki 5, di-ve mono-metil grupları çıkarma yeteneğine sahip bir lisin demetilaz. Bir kombinasyonunu kullanmak Bu test kolay ve laboratuar veya bir proteomik tesisi yoluyla bir MALDI kütle spektrometresi erişimi olan herhangi bir laboratuvar kolayca tâbidir. Assay ~ 8 kat dinamik aralığı vardır ve plaka formatında 5 için kolayca ölçeklenebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity at JoVE.com

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Biz lisin metilasyon değişiklikleri ölçmek için MALDI kütle spektrometresi ve indirgeyici metilasyon kimya kullanmak için bir yöntem sunuyoruz.

Lizin demetilaz Faaliyet Kantitatif Ölçümler MassSQUIRM Uygulaması

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

application-masssquirm-for-quantitative-measurements-lysine

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

13.3K Görüntüleme.  University of Arkansas for Medical Sciences. Biz lisin metilasyon değişiklikleri ölçmek için MALDI kütle spektrometresi ve indirgeyici metilasyon kimya kullanmak için bir yöntem sunuyoruz.

Video: Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this procedure amino functionalized 'lysine' and guanido functionalized 'arginine' peptoid monomers can be included within the same peptoid sequence. This procedure uses on-resin (N-(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)ethyl) or Dde protection, orthogonal conditions to the Boc protection of lysine monomers. Subsequent deprotection allows an efficient on-resin guanidinylation reaction to form the arginine residues. The procedure is compatible with the commonly used submonomer method of peptoid synthesis, allowing simple peptoids to be made using common laboratory equipment and commercially available reagents. The representative synthesis, purification and characterization of two mixed peptoids is described. The evaluation of these compounds as potential anti-infectives in screening assays against Leishmania mexicana is also described. The protozoan parasite L. mexicana is a causative agent of cutaneous leishmaniasis, a neglected tropical disease that affects up to 12 million people worldwide.

A protocol to synthesize peptoids with mixed cationic functionality in the same sequence is presented (lysine- and arginine-type monomers). Subsequent testing of these compounds against Leishmania mexicana, the protozoan parasites that cause cutaneous leishmaniasis, is also described.

Bunların Anti layişmanya Faaliyet karışık Lizin tipi / Arjinin-monomerleri ve Değerlendirilmesi peptoidler Sentezi için etkili bir yöntem

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

Biyokimya

Methods to Identify the NMR Resonances of the 13C-Dimethyl N-terminal Amine on Reductively Methylated Proteins

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a proven technique for protein structure and dynamic studies. To study proteins with NMR, stable magnetic isotopes are typically incorporated metabolically to improve the sensitivity and allow for sequential resonance assignment. Reductive 13C-methylation is an alternative labeling method for proteins that are not amenable to bacterial host over-expression, the most common method of isotope incorporation. Reductive 13C-methylation is a chemical reaction performed under mild conditions that modifies a protein&#39;s primary amino groups (lysine &#949;-amino groups and the N-terminal &#945;-amino group) to 13C-dimethylamino groups. The structure and function of most proteins are not altered by the modification, making it a viable alternative to metabolic labeling. Because reductive 13C-methylation adds sparse, isotopic labels, traditional methods of assigning the NMR signals are not applicable. An alternative assignment method using mass spectrometry (MS) to aid in the assignment of protein 13C-dimethylamine NMR signals has been developed. The method relies on partial and different amounts of 13C-labeling at each primary amino group. One limitation of the method arises when the protein&#39;s N-terminal residue is a lysine because the &#945;- and &#949;-dimethylamino groups of Lys1 cannot be individually measured with MS. To circumvent this limitation, two methods are described to identify the NMR resonance of the 13C-dimethylamines associated with both the N-terminal &#945;-amine and the side chain &#949;-amine. The NMR signals of the N-terminal &#945;-dimethylamine and the side chain &#949;-dimethylamine of hen egg white lysozyme, Lys1, are identified in 1H-13C heteronuclear single-quantum coherence spectra.

Methods to Identify the NMR Resonances of the 13C-Dimethyl N-terminal Amine on Reductively Methylated Proteins

Two methods for assigning the &#945;- and &#949;-dimethylamine nuclear magnetic resonance signals of a reductively 13C-methylated N-terminal lysine are described. One method utilizes the pH-induced selectivity of the reductive methylation reaction, and the other uses aminopeptidase to selectively remove the N-terminal lysine.

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a proven technique for protein structure and dynamic studies. To study proteins with NMR, stable magnetic ...

Kimya

Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the interpretation of the biological activity of any compound in drug development or in basic research projects. In epigenetics, target engagement is most often assessed by the analysis of proxy markers instead of measuring the union of the compound to the target. Downstream biological readouts that have been analyzed include the histone mark modulation or gene expression changes. KDM1A is a lysine demethylase that removes methyl groups from mono- and dimethylated H3K4, a modification associated with the silencing of gene expression. Modulation of the proxy markers is dependent on the cell type and function of the genetic make-up of the cells investigated, which can make interpretation and cross-case comparison quite difficult. To circumvent these problems, a versatile protocol is presented to assess the dose effects and dynamics of the direct KDM1A target engagement. The assay described makes use of a KDM1A chemoprobe to capture and quantify uninhibited enzyme, can be broadly applied to cells or tissue samples without the need for genetic modification, has an excellent window of detection, and can be used both for basic research and analysis of clinical samples.

Here, we present a protocol to measure KDM1A target engagement in a human or animal cell, tissue or blood samples treated with KDM1A inhibitors. The protocol employs chemoprobe tagging of the free KDM1A enzyme and direct quantification of the target occupation using chemoprobe-based immunoassays and can be used in preclinical and clinical studies.

Chemoprobe tabanlı bağışıklık sistemini kullanarak KDM1A hedef etkileşimi doğrudan ölçümü

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the ...

Exploring the Arginine Methylome by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Protein-bound arginine is commonly methylated in many proteins and regulates their function by altering the physicochemical properties, their interaction with other molecules, including other proteins or nucleic acids. This work presents an easily implementable protocol for quantifying arginine and its derivatives, including asymmetric and symmetric dimethylarginine (ADMA and SDMA, respectively) and monomethyl arginine (MMA). Following protein isolation from biological body fluids, tissues, or cell lysates, a simple method for homogenization, precipitation of proteins, and protein hydrolysis is described. Since the hydrolysates contain many other components, such as other amino acids, lipids, and nucleic acids, a purification step using solid-phase extraction (SPE) is essential. SPE can either be performed manually using centrifuges or a pipetting robot. The sensitivity for ADMA using the current protocol is about 100 nmol/L. The upper limit of detection for arginine is 3 mmol/L due to SPE saturation. In summary, this protocol describes a robust method, which spans from biological sample preparation to NMR-based detection, providing valuable hints and pitfalls for successful work when studying the arginine methylome.

The present protocol describes the preparation and quantitative measurement of free and protein-bound arginine and methyl-arginines by 1H-NMR spectroscopy.

Arginin Metilomunun Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Araştırılması

Protein-bound arginine is commonly methylated in many proteins and regulates their function by altering the physicochemical properties, their interaction ...

Kanser Araştırmaları

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, including RNA processing, signal transduction, DNA damage response, miRNA biogenesis, and translation.
In recent years, thanks to biochemical and analytical developments, mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as the most effective strategy to characterize the cellular methyl-proteome with single-site resolution. However, identifying and profiling in vivo protein R-methylation by MS remains challenging and error-prone, mainly due to the substoichiometric nature of this modification and the presence of various amino acid substitutions and chemical methyl-esterification of acidic residues that are isobaric to methylation. Thus, enrichment methods to enhance the identification of R-methyl-peptides and orthogonal validation strategies to reduce False Discovery Rates (FDR) in methyl-proteomics studies are required.
Here, a protocol specifically designed for high-confidence R-methyl-peptides identification and quantitation from cellular samples is described, which couples metabolic labeling of cells with heavy isotope-encoded Methionine (hmSILAC) and dual protease in-solution digestion of whole cell extract, followed by off-line High-pH Reversed Phase (HpH-RP) chromatography fractionation and affinity enrichment of R-methyl-peptides using anti-pan-R-methyl antibodies. Upon high-resolution MS analysis, raw data are first processed with the MaxQuant software package and the results are then analyzed by hmSEEKER, a software designed for the in-depth search of MS peak pairs corresponding to light and heavy methyl-peptide within the MaxQuant output files.

Protein Arginine (R)-methylation is a wide-spread post-translational modification regulating multiple biological pathways. Mass spectrometry is the best technology to globally profile the R-methyl-proteome, when coupled to biochemical approaches for modified peptide enrichment. The workflow designed for the high confidence identification of global R-methylation in human cells is described here.

Global ve Yüksek Güvenilirlikli Protein R-Metilasyon Analizi için Kütle Spektrometrisine Dayalı Proteomik Yaklaşım

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Nitel ve Nicel Saptanması için Tahliller ve Protein Antimikrobiyal karakterizasyonu

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Etkinlik Ölçüm Bir Testi Escherichia coli Lizin Decarboxyase Đndüklenebilir

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Biyoloji

Limosilactobacillus reuteri'de Raportör Proteinlerin Ölçümü DSM20016

Methods for Electroporation and Transformation Confirmation in Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Lactobacillus were an incredibly large, diverse genus of bacteria comprising 261 species, several of which were commensal strains with the potential for use as a chassis for synthetic biological endeavors within the gastrointestinal tract. The wide phenotypic and genotypic variation observed within the genus led to a recent reclassification and the introduction of 23 novel genera.
Due to the breadth of variations within the old genera, protocols demonstrated in one member may not work as advertised with other members. A lack of centralized information on how exactly to manipulate specific strains has led to a range of ad hoc approaches, often adapted from other bacterial families. This can complicate matters for researchers starting in the field, who may not know which information does or does not apply to their chosen strain.
In this paper, we aim to centralize a set of protocols with demonstrated success, specifically in&#160;the Limosilactobacillus reuteri strain designation F275 (other collection numbers: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), along with troubleshooting advice and common issues one may encounter. These protocols should enable a researcher with little to no experience working with L. reuteri DSM20016 to transform a plasmid, confirm transformation, and measure system feedback in a plate reader via a reporter protein.

Yazar Spotlight: Limosilactobacillus reuteri'de Elektroporasyon ve Dönüşüm Doğrulama Yöntemleri DSM20016  

Here, we present protocols for working with Limosilactobacillus reuteri DSM20016, detailing growth, plasmid transformation, colony PCR, fluorescent reporter protein measurement, and limited plasmid mini-prep, as well as common issues and troubleshooting. These protocols allow the measurement of reporter proteins in DSM20016, or confirmation via colony PCR if no reporter is involved.

Limosilactobacillus reuteri DSM20016'da Elektroporasyon ve Transformasyon Doğrulama Yöntemleri

Lactobacillus were an incredibly large, diverse genus of bacteria comprising 261 species, several of which were commensal strains with the potential for ...

Lizin demetilaz Faaliyet Kantitatif Ölçümler MassSQUIRM Uygulaması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Bunların Anti layişmanya Faaliyet karışık Lizin tipi / Arjinin-monomerleri ve Değerlendirilmesi peptoidler Sentezi için etkili bir yöntem

Methods to Identify the NMR Resonances of the ¹³C-Dimethyl N-terminal Amine on Reductively Methylated Proteins

Chemoprobe tabanlı bağışıklık sistemini kullanarak KDM1A hedef etkileşimi doğrudan ölçümü

Arginin Metilomunun Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Araştırılması

Global ve Yüksek Güvenilirlikli Protein R-Metilasyon Analizi için Kütle Spektrometrisine Dayalı Proteomik Yaklaşım

Nitel ve Nicel Saptanması için Tahliller ve Protein Antimikrobiyal karakterizasyonu

Etkinlik Ölçüm Bir Testi Escherichia coli Lizin Decarboxyase Đndüklenebilir

Limosilactobacillus reuteri DSM20016'da Elektroporasyon ve Transformasyon Doğrulama Yöntemleri

Limosilactobacillus reuteri DSM20016'da Elektroporasyon ve Transformasyon Doğrulama Yöntemleri

Limosilactobacillus reuteri DSM20016'da Elektroporasyon ve Transformasyon Doğrulama Yöntemleri