Bu çalışma Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC), Royal Society ve Nottingham Üniversitesi tarafından desteklenmektedir.

Mant olarak işaretlenmiş nükleotid bağlanması üzerine floresans yoğunluğunu değiştirmek 1. belirlenmesi. <ol><li> Uygun bir reaksiyon tampon maddesi içinde 1 uM kinesin (nihai konsantrasyonlar) için 1 uM mant-etiketli bir nükleotit ekleyin. Tipik mikrotübül büyüme ve istikrarı faydaları bir tampon (tartışma) kullanılır. Yaygın olarak kullanılan bir tampon 80 mM piperazin-bis-2-etansülfonik asit (PIPES) içeren pH6.9, 1 mM MgCI2 ve 1 mM etilen glikol-bis-2, iminoeter-tetraasetik asit (EGTA). Not: Tüm protokolde belirtilen kinesin konsantrasyonu, nükleotid bağlama bölgeleri (örneğin, motorlu etki) konsantrasyonu anlamına gelir. Farklı kinesinler monomerler, dimerler veya tetramerler olarak bulunur ve her bir molekül için birden fazla nükleotid bağlanma bölgesini içerebilir. </li><li> Bir kuluçka dönemine (1-3 dakika) ve standart bir florimetre kullanılarak sonra, MANT-işaretlenmiş nükleotid-kinesin kompleksi için emisyon spektrumunu ölçmek. 365nm bir eksitasyon dalga boyu ve kullanmaölçmek 1nm artışlarla 400-500 nm arasında ışığı yaydığı. </li><li> Aşama 1.1 &#39;de kullanılan aynı reaksiyon tampon maddesi içinde 1 mM bir çözeltisi mant olarak işaretlenmiş nükleotid olun. </li><li> Daha önce açıklandığı gibi, tek bir nükleotid, MANT numune için emisyon spektrumunu ölçülür (bakınız Aşama 1.2). </li><li> Bu değer ile bölünerek (kinesin kullanılmadan doğrudan) çözelti içinde mant nükleotid spektrumunda tepe floresan yoğunluğunun dalga boyunda sinyaline normalize spektrumları. </li><li> (Örneğin, Şekil 2B) mantATP-bağlanmış ve / veya çözelti içinde mantADP bağlı kinesin ve mant nükleotid arasındaki floresans yoğunluğu farkları gözlemlemek için normalize spektrumları çizilir. </li></ol> MantATP için birleşme ve ayrılma oranı Katsayıların 2. Ölçüm <ol><li> -ücretsiz Tamponu 2 + herhangi bir uygun Mg en fazla 20 uM kinesin (tartışma) içindeki bir çözeltisine, (örneğin, 80 mM PIPES pH6.9, 1 mM EGTA,% 0.1 Tween 20) içinde, 1 ekleyinmM (son konsantrasyon) etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve 1 mM (son konsantrasyon) ditiyotreitol (DTT). Not: azaldıkça tampon Tween®20 ilavesi tavsiye edilir / tampon değişimi için kullanılan sütun üzerinde kinesin protein kaybını önler (Adımlar 2.3 ve 3.3) </li><li> 15 dakika boyunca 25 ° C&#39;da, çözelti inkübe edin. </li><li> (Malzemelerin listesine bakınız) kullanılarak üreticinin talimatlarına göre bir yerçekimi akışlı, G-25 Sephadex jel filtrasyon kolonu kullanılarak kinesin ayırın ihtiva etmeyen nükleotid ve EDTA ihtiva eder. <ol><li> Uygun bir Mg +2 tamponu -ücretsiz en az 3 sütun hacmi ile sütun dengeye (Basamak 2.1). Kolona kinesin-içeren çözelti yükleyin. Magnezyum klorürün son konsantrasyonu kinesin çözeltisi toplanmasından sonra 1 mM olacak şekilde, boş tüp, 100 mM, magnezyum klorür çözeltisinin uygun bir hacmi ilave bir toplama tüpü hazırlayın. Magnezyum klorürün ilavesi anında yardımcı olur dayanıklılıknükleotid içermeyen kinesin se. </li><li> Uygun bir Mg 2 + -ücretsiz tampon kullanarak kinesin Zehir. Hızlı çalışmak için zaman önemlidir bu yüzden nükleotid ücretsiz Kinesinler kararsızdır. Buz üzerinde nükleotid-serbest Kinezin&#39;e saklayın ve 1-2 saat içinde kullanın. </li></ol></li><li> Sırasında ya da öncesinde nükleotid içermeyen kinesin hazırlanmasına nükleotid içermeyen kinesin nihai çözelti ile aynı tampon maddesi içinde bir reaksiyon mantATP konsantrasyon geliştirilmesidir. 0.1 ila 50 uM (adım 2.5 ve tartışmaya bakınız) arasında değişen tipik bir dizi kinesin mevcut konsantrasyonuna göre gerekli mantATP konsantrasyonlarının aralığı belirler. </li><li> Nükleotid-serbest kinesin&#39;in bir konsantrasyon dizi hazırlayın. MantATP her bir konsantrasyonu (2.4 adım) için, nükleotid içermeyen kinesin bir konsantrasyon, MANT-işaretlenmiş nükleotid kinesin nükleotid bağlayıcı siteler üzerinde 5-10 kat molar fazla olacak şekilde hazırlanmalıdır. </li><li> Durdu-flo üzerinde dalgaboyu ayarlayın365 nm florimetrede w ve uzun geçişli filtre kullanılarak&gt; 400 nm ışık yaydığı toplamak. </li><li> Durdurulan bir akış florimetresi (Şekil 3A ve 3B Ankastre) kullanılarak 1 hacim / hacim oranı: mantATP en düşük konsantrasyonu ile başlayarak, 1 nükleotid içermeyen kinesin uygun bir konsantrasyonu ile mantATP karıştırın. Not: Reaksiyona giren maddeler karıştırma üzerine% 50 oranında seyreltilir. Karışıklığı önlemek için nükleotid konsantrasyon öncesi ve sonrası karıştırma (örneğin, 3.0 / 1.5 mM) not edin. </li><li> MANT grup, ışıkla hesaba üstel fonksiyon ayrıca sürekli olumsuz bir eğim hattına mantATP her konsantrasyonunda ölçülen floresan yoğunluğundaki değişim monte (örneğin, floresan, bir 0 .exp (atıl .T k) + (M =. T + 0 genliği, c) k gözlenen hız sabitidir ve T,) Şekil 3B ve açıklamalara bakın zamandır. Bu krizleri bir tespitmantATP her konsantrasyonunda sabiti (k, obs) oranı. Her bir K atıl bir birleşme ve ayrılma oranı sabiti (Şekil 1, k, 1 ve k-1) olan bir evrişim. </li><li> (Örneğin, Şekil 3C) mantATP konsantrasyonuna karşı taslak haline getirilmesi suretiyle k, atıl, birleşme ve ayrılma oranı sabitleri Deconvolve. Degrade ve y-ekseni kesişim elde etmek için doğrusal bir fonksiyonu (yani, k obs = k 1 [mantATP] + k -1) bu verileri uygun. Gradyan birimlerinin M-1 s-1 ile ilişkili mantATP (Şekil 1, k, 1) için oran sabiti temsil eder. Kesişim s-1 (tartışmaya bakınız) birimleri ile ayrılma oranı sabitesinin (Şekil 1, k-1) temsil etmektedir. Bu yaklaşım, aynı zamanda, ADP, birleşme ve ayrılma belirlemek için uygulanabilir: Notnükleotid olarak mantADP kullanılarak oran sabitleri (Şekil 1, k, k -4 4). </li></ol> MantADP için ayrışma oranı 3. Sabit ölçüm <ol><li> Uygun bir reaksiyon tampon maddesi içinde 2 uM kinesin eden bir çözeltiye, (örneğin, 80 mM PIPES pH6.9, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA,% 0.1 Tween 20), 50 uM mantADP (nihai konsantrasyon) ilave edilir. </li><li> 30 dakika boyunca 25 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> G-25 Sephadex kolonu kullanılarak, seçilen reaksiyon tampon maddesi içine kinesin alışverişi tamponu ile aşırı mantADP ve diğer serbest nükleotid kaldır, üreticinin talimatlarına uygun olarak (malzemelerin listesine bakınız). Kinesin Motor alanı şimdi mantADP yüklü olmalıdır. </li><li> 365 nm durdu akış florimetrede dalgaboyu ayarlayın ve uzun geçişli filtre kullanılarak&gt; 400 nm ışık yaydığı toplamak. </li><li> 50 katı veya daha büyük olan Mola mantADP.kinesin kompleksi (~ 1 uM) karıştırındurdurulan bir akış florimetre (Şekil 4A ve 4B, Ankastre) kullanılarak 1 h / h oranında bir 1 etiketlenmemiş ATP r fazla. </li><li> Tek bir üstel fonksiyon artı MANT grubunun ışıkla ağartma açıklamak için sürekli negatif bir eğim hattı zamanla gözlenen floresan yoğunluğundaki azalma monte (örneğin, floresan, bir 0 .exp (atıl .T k) + (m.t + = Bir 0 genliği, burada c), k gözlenen hızı sabittir ve t, zamandır,) Şekil 4B ve tartışmaya bakınız. Bu uyum tespit K atıl s-1 (tartışmaya bakınız) birimleriyle ADP (Şekil 1, k 4) ayrılması için oranı sabitidir. </li></ol>

<ol>
	<li>Marx, A., Hoenger, A., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+kinesin+motor+proteins.">Structures of kinesin motor proteins.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66, 958-966 (2009).</li><li>Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+superfamily+motor+proteins+and+intracellular+transport.">Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).</li><li>Friel, C. T., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+kinesin+ATP+turnover+to+translocation+and+microtubule+regulation:+one+engine,+many+machines.">Coupling of kinesin ATP turnover to translocation and microtubule regulation: one engine, many machines.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 377-383 (2012).</li><li>Yun, M., Zhang, X., Park, C. G., Park, H. W., Endow, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+pathway+for+activation+of+the+kinesin+motor+ATPase.">A structural pathway for activation of the kinesin motor ATPase.</a> EMBO J. 20, 2611-2618 (2001).</li><li>Hirose, K., Akimaru, E., Akiba, T., Endow, S. A., Amos, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+conformational+changes+in+a+kinesin+motor+catalyzed+by+interaction+with+microtubules.">Large conformational changes in a kinesin motor catalyzed by interaction with microtubules.</a> Mol. Cell. 23, 913-923 (2006).</li><li>Kikkawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switch-based+mechanism+of+kinesin+motors.">Switch-based mechanism of kinesin motors.</a> Nature. 411, 439-445 (2001).</li><li>Friel, C. T., Bagshaw, C. R., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysing+the+ATP+turnover+cycle+of+microtubule+motors.">Analysing the ATP turnover cycle of microtubule motors.</a> Methods Mol. Biol. 777, 177-192 (2011).</li><li>Bagshaw, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+analogues+at+a+glance.">ATP analogues at a glance.</a> J. Cell Sci. 114, 459-460 (2001).</li><li>Friel, C. T., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinesin-13+MCAK+has+an+unconventional+ATPase+cycle+adapted+for+microtubule+depolymerization.">The kinesin-13 MCAK has an unconventional ATPase cycle adapted for microtubule depolymerization.</a> EMBO J. 30, 3928-3939 (2011).</li><li>Gilbert, S. P., Webb, M. R., Brune, M., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+of+processive+ATP+hydrolysis+by+kinesin.">Pathway of processive ATP hydrolysis by kinesin.</a> Nature. 373, 671-676 (1995).</li><li>Sadhu, A., Taylor, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+kinesin+ATPase.">A kinetic study of the kinesin ATPase.</a> J. Biol. Chem. 267, 11352-11359 (1992).</li><li>Woodward, S. K., Eccleston, J. F., Geeves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+the+interaction+of+2'(3')-O-(N-methylanthraniloyl)-ATP+with+myosin+subfragment+1+and+actomyosin+subfragment+1:+characterization+of+two+acto-S1-ADP+complexes.">Kinetics of the interaction of 2'(3')-O-(N-methylanthraniloyl)-ATP with myosin subfragment 1 and actomyosin subfragment 1: characterization of two acto-S1-ADP complexes.</a> Biochemistry. 30, 422-430 (1991).</li><li>Hackney, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+of+ADP-stimulated+ADP+release+and+dissociation+of+tethered+kinesin+from+microtubules.+Implications+for+the+extent+of+processivity.">Pathway of ADP-stimulated ADP release and dissociation of tethered kinesin from microtubules. Implications for the extent of processivity.</a> Biochemistry. 41, 4437-4446 (2002).</li><li>Lockhart, A., Cross, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+motility+of+the+Eg5+microtubule+motor.">Kinetics and motility of the Eg5 microtubule motor.</a> Biochemistry. 35, 2365-2373 (1996).</li><li>Chen, C. J., Porche, K., Rayment, I., Gilbert, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ATPase+pathway+that+drives+the+kinesin-14+Kar3Vik1+powerstroke.">The ATPase pathway that drives the kinesin-14 Kar3Vik1 powerstroke.</a> J. Biol. Chem. 287, 36673-36682 (2012).</li><li>Moyer, M. L., Gilbert, S. P., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+of+ATP+hydrolysis+by+monomeric+and+dimeric+kinesin.">Pathway of ATP hydrolysis by monomeric and dimeric kinesin.</a> Biochemistry. 37, 800-813 (1998).</li><li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Direct Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=real-time+measurement+of+rapid+inorganic+phosphate+release+using+a+novel+fluorescent+probe+and+its+application+to+actomyosin+subfragment+1+ATPase.">real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase.</a> Biochemistry. 33, 8262-8271 (1994).</li><li>Goodrich, J. A., Kugel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Binding and Kinetics for Molecular Biologists. 4, 69-97 (2006).</li><li>Gell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+reconstituted+in+vitro+and+imaged+by+single-molecule+fluorescence+microscopy.">Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy.</a> Methods Cell Biol. 95, 221-245 (2010).</li><li>Olmsted, J. B., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+and+nucleotide+requirements+for+microtubule+polymerization+in+vitro.">Ionic and nucleotide requirements for microtubule polymerization in vitro.</a> Biochemistry. 14, 2996-3005 (1975).</li><li>Brinkley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules:+a+brief+historical+perspective.">Microtubules: a brief historical perspective.</a> J. Struct Biol. 118, 84-86 (1997).</li><li>Ostap, E. M., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+kinetic+characterization+of+the+Acanthamoeba+myosin-I+ATPase.">Biochemical kinetic characterization of the Acanthamoeba myosin-I ATPase.</a> J. Cell Biol. 132, 1053-1060 (1996).</li><li>Eccleston, J. F., Moore, K. J., Brownbridge, G. G., Webb, M. R., Lowe, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+approaches+to+the+study+of+the+p21ras+GTPase+mechanism.">Fluorescence approaches to the study of the p21ras GTPase mechanism.</a> Biochem. Soc. Trans. 19, 432-437 (1991).</li><li>Ahmadian, M. R., Wittinghofer, A., Herrmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+methods+in+the+study+of+small+GTP-binding+proteins.">Fluorescence methods in the study of small GTP-binding proteins.</a> Methods Mol. Biol. 189, 45-63 (2002).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Burada, bir kinesin&#39;in için nükleotid devletler arasındaki geçişlerin kinetik gözlem ve analiz için protokolleri sunuyoruz. Bu protokoller, floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin ile bağlantılı olarak hızlı karıştırma yöntemi durdu akışı kullanmaktadır. Bu tip yöntem kinesinlerin 9-11,13-16 çeşitli nükleotid bağlanma ve ayrılma incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Fosfat serbest (Şekil 1, Aşama 3) gözlenmesini izin vermez açıklanan yöntemler. Bununla birlikte, durdurmalı akış bir floresan yoğunluğu değişim 17 bağlanması için fosfat üretimini fosfat algılama proteini kullanarak, bu geçiş gözlemlemek için kullanılabilir. Proteine ​​bağlanan genel olarak, flüoresans yoğunluğunda bir artış sergiler küçük flüorofor methylanthraniloyl (mant) kullanımı ile etiketlenmiş nükleotitler, sunulan yöntemler. Ayrıca, MANT florofor zaman R 2 &#39;veya 3&#39; pozisyon ya da konjügeibose, genellikle 9-12 nükleotid bağlanma, çözünme veya hidroliz üzerine çok az veya hiç etkisi yoktur. Mant-etiketli nükleotidler ticari kaynaklardan (malzemelerin listesine bakınız) kolayca elde edilebilir ve tek bir izomer 8 için saflaştınrken hızla yeniden dengeye olarak, 2 &#39;ve 3&#39; konjügat karışımları olarak sağlanmıştır. Mant-etiketli nükleotidler nükleotid bağlama ve ayrışma kinetikleri görülebildiği ile mükemmel bir bildirici molekül oluşturmak. , Floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin kullanılması tarif edilen deneyler üzerinden flüoresans yoğunluğunda bir gerçek zaman değişikliği okumak olduğu anlamına gelir. Bu reaktifler, hızlı karıştırma ve daha sonraki reaksiyon ile bağlantılı floresan değişikliklerin gerçek zamanlı gözlem sağlar durdurmalı akış floresan, bu deneyler, ideal hale getirir. Saptama yöntemi olarak karıştırma tekniği ve floresan gibi durdu akışı araya gelmesi göreceli olarak örnek EF bir sistem üretirficient. Örneğin, 0.8 gerektirir Şekil 3C&#39;de gösterilen veri elde etmek için - saflaştırılmış kinesin-13 1.0 mg, MCAK ve Şekil 4B&#39;de gösterilen veri elde etmek için, saflaştırılmış ~ kinesin-13, 0.3 mg MCAK gerektirir. Bir florofor olarak mant kullanımının bir dezavantajı, ışıkla eğilimli olmasıdır. Bu durdu-akış, kinesin yokluğunda, reaksiyon tampon maddesi ile mant olarak işaretlenmiş nükleotid ihtiva eden bir çözelti karıştırma ile reaksiyon kinetiği kinesin ayrı olarak görülmektedir. MANT grubu ağartılmış olduğunda, flüoresans yoğunluğunda bir yavaş azalması gözlenmektedir. MANT grubunun photobleaching tarif edilen protokollere kullanılan çizelgesinin aralığı üzerinde iyi bir doğrusal fonksiyonu ile tarif edilmektedir. Bu yüzden, ışıkla ağartma için veri düzeltmek için, basit bir şekilde tek bir parametre ile tarif edilen bir doğrusal fonksiyonu (örneğin, mt + c) &#39;yerine daha sık yassı bir temel hat ile tarif edilen bir taban içeren bir üstel fonksiyon için uygun etmektir. mantATP bağlama MantATP arasında Birleşme ve ayrışmaya ilişkin oran sabitleri mikrotübül yokluğunda kinesin nükleotid bağlanma yeri ile bağlantılı olarak kalır (Kısım 2) ADP ölçülürken, çıkarılmalıdır. Bu mantATP, birleşme ve ayrılma (Şekil 1, aşama 1) ADP ayrışma ayrı olarak görülmektedir sağlar. Bu kinesin nükleotid bağlanma sitelerinin (2.1 adım) üzerinden EDTA en az 50-kat fazlası ile inkübe edilir elde etmek. EDTA Mg 2 + iyonları nükleotid 11 salınımına neden nükleotid-bağlayıcı cebinden, uzaklaşmak için Mg 2 + neden tecrit. Yürütülmesi 2.1 adım Bu nedenle, - 2.3, bu Mg +2 ücretsiz tampon kullanmak hayati önem taşımaktadır. Nükleotid-serbest kinesin protein tampon ücretsiz nükleotid gelen ve EDTA hem ayırmak için alışverişinde olduğunu. Bu ayrılık, bir tek yerçekimi akışı ge gerçekleştirmek içinl filtrasyon kolon yeterlidir basit ve (malzemelerin listesini görmek) kullanmak için hızlıdır. Nükleotid serbest kinesin ile mantATP etkileşimi, birleşme ve ayrılma oranı sabiti (2.8 aşamasının) kıvrım giderme sağlamak için mantATP konsantrasyonda (Basamak 2.4) aralığında gerçekleştirilir. Bu tip deney arkasındaki teori, ayrıca tek mantATP en düşük konsantrasyonu ile başlar, bu deneyler içinde referans 18&#39;de açıklanmaktadır. Bu, farklı konsantrasyonları arasında yıkama aşamasına olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Büyük olasılıkla mantATP konsantrasyonu arttıkça durdu akış florimetrede hassasiyetini ayarlamak için gerekli olacaktır. MantATP konsantrasyonu her zaman sözde birinci dereceden koşulları sağlamak için kinesin nükleotid bağlanma sitelerinin konsantrasyonuna göre en az 5 kat fazla olmalıdır. MantATP konsantrasyonu artar Bununla birlikte, sinyal değişimi düşüşler kinesin bağlanan nükleotid fraksiyonu olarak gömülmek hale gelir. Therefo, kinesin konsantrasyonu da mantATP her yeni konsantrasyonu artırılır, bu tür yeniden mantATP konsantrasyonu, nükleotid bağlanma sitelerinin (2.6 adım) fazla 10 kat molar fazlalık daha asla daha fazladır. mantADP Ayrılma MantADP için birleşme ve ayrılma oranı sabitleri mantATP (Kısım 2) için tarif edilen aynı yöntemle belirlenebilir açabilir. Bir kinesin ADP ayrışması doğrudan mantADP.kinesin kompleks, etiketlenmemiş ATP (adım 3.5) fazlası ile karıştırılır mantADP (Aşama 3.1-3.3) nükleotid bağlanma sitesi önyüklemeyle gözlenebilir. Fazla etiketsiz ATP kinesin&#39;in için mantADP yeniden bağlanmasının önler ve böylece mantADP örgütlenme ayrı olarak uyulması gereken ayrışma reaksiyonu (Şekil 1, k 4) verir. Bu tahlilde, etiketlenmemiş ATP konsantrasyonu nuc en azından bir 50 kat fazla mol olmalıdırbağlanma yeri oligonükleotid. Bu deneyde arkasındaki teori de bu doğrudan yöntem, Aşama 2.8 &#39;de tarif edilen Y-eksenine göre sabit bir ekstrapolasyon ayrışma hızı için daha doğru bir değer verir referans 18&#39;de açıklanmaktadır. Mikrotübüller İçerme Açıklanan yöntemler aynı zamanda mikrotübül mevcudiyetinde nükleotid bağlama ve ayrışma kinetiklerini belirlemek için kullanılabilir. Mikrotübüller önce durdu-akış karıştırma nükleotid ihtiva eden bir şırıngaya konur: Şekil 3B ve 4B alt şırınga (Insets). Bu mikrotübülleri, uygun olarak, bu yapılandırmada, kinesin aynı zamanda nükleotid karşılayacaktır. Stabilize mikrotübüller tübülin polimerin ömrü, stabilize edici kimyasal ya kullanımı ile uzatılmış olduğu, kullanılan örneğin &#39;guanosin-5 gibi taksol veya nonhydrolysable GTP analoğu gibi - [(α, β) -methyleno] trifosfat (GMPCPP, malzeme listesine bakınız). Bu sıvı azot 9,19 birçok ay boyunca saklanabilir mikrotübülleri yapmak GMPCPP sahip tübülin polimerizasyonu iki çevrim kullanmak mümkündür. Önceden hazırlanmış mikrotübül kullanılması nedeniyle, bu tahliller yapmak için pratik güçlüklerle azaltır. Tahlillerinde mikrotübül dahil etmek için, bir mikrotübül stabilite için uygun olan bir reaksiyon tamponu kullanılması önemlidir. Tercih tamponu (BRB80 olarak da bilinir), 80 mM PIPES pH 6.9, 1 mM MgCI2, 1 mM EGTA 20,21 ihtiva eden en yaygın olarak kullanılan tampon madde ile, borularla vardır. Açıklanan yöntemler kinesinlerin ile kullanımı sınırlı değildir, ancak uyarlanmış herhangi bir nükleotid bağlayıcı proteine ​​uygulanabilir. Örneğin, benzer yöntemlerin moleküler motorlar 12,22 arasında miyozin ailesi ve mant etiketli guanozin nükleotitlerin kullanılması daha uzun ve üyelerinin ATP devir döngüsü uygulanmıştırBu tip yöntemler, proteinleri, GTP ye hidrolize 23,24.

Kinesinler yüksek oranda korunan bir motor fonksiyonun 1 ile karakterize edilen bir protein süper-familyası vardır. Kinesin motor fonksiyonun bir nükleotid bağımlı bir şekilde mikrotübül ile etkileşime girer. Kinesin aile üyeleri mikrotübül dinamiklerini 2,3 düzenleyen olmayan translocating mikrotübül son bağlayıcı kinesinlerin Mikrotübüllerin boyunca yönlendirilmiş bir şekilde yük taşımak translocating kinesinlerin, fonksiyonları bir dizi görüntüler. Kinesinler, 4-6 iskeleti mikrotübül ile etkileşimlerini düzenleyen adensosine-5&#39;-trifosfat (ATP) ciro kullanın. ATP, ADP ADP.Pi ya da nükleotid bağlı olabilir (Şekil 1) için mikrotübül kinesin motor fonksiyonun ve dolayısıyla afinite konformasyonu, nükleotid durumuna göre değişir. Bir kinesin&#39;in moleküler mekanizmasını anlamak için, ATP ciro ve mikrotübül etkileşim arasındaki ilişkinin bir anlayış gereklidir.refore, kinesin alanda önemli bir amacı, farklı nükleotid durumlarının fonksiyonel özellikleri ve mikrotübüllerin varlığında ve yokluğunda her ikisinin arasındaki geçişlere kinetiklerini nitelendirilmesidir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="2in" width="200" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig1highres.jpg" /> Bir kinesin&#39;in için basit ATP ciro döngüsü Şekil 1. Dört olası durumlar oluşur:. Nükleotid-free (Φ) dört geçişler her bir ileri ve bir ile karakterize, ADP.P i-bağlı, ATP bağlı ve ADP-bağlı Geriye hız sabiti (k x ve sırasıyla -x k). ATP ciro kimyasal çevrim mikrotübül etkileşim mekanik döngüsüne bağlanmış anlamak için, bir kuru microtub yokluğunda sınırlayıcı ATP ciro döngüsünde hangi aşamasını belirlemek gerekirModüller, ve sonra çevrim mikrotübül varlığı ile değiştirilmektedir biçimini belirler. En basit ATP çevirme süresi dört ayrı kimyasal adımlardan oluşur: (1) ATP boş yere bağlanabilen (Φ ve boş, yani nükleotid içermeyen kinesin temsil eder); (2) ATP bölünmesi; (3) ayrışma fosfat ve (4) ADP ayrılma (Şekil 1). Oran-sınırlayıcı aşama tamamlandıktan ATP devir döngüsü için hız sabitini belirler. Bu nedenle, tek tek geçişler her ölçülmüş ve tam devir için hız sabiti ile karşılaştırılır sınırlayıcı oran olan adım belirlemek için. Yöntem burada açıklanmayan genel ATP çevirme süresi hızı sabitini ölçmek için değil Burada referans 7&#39;de bulunabilir, tek tek kimyasal aşamalar için oran sabitleri belirlenebilir edildiği metotları da tarif eder. Bir nükleotid hidroliz proteinin çevirme süresi bireysel geçişleri çalışma mevcut yöntemler vardır. Burada sunulan yöntemler sunar advantagflorofor ile işaretlenmiş nükleotidlerin methylanthraniloyl özelliklerinin e 8 genellikle protein bağlanması üzerine, flüoresans yoğunluğunda bir değişme sergilemekte mant, olarak adlandırılır. Küçük boyutlu riboz (Şekil 2A) ile birleştirildiğinde, genellikle nükleotid bağlayıcı ya da hidroliz 9-12 kinetikleri üzerinde çok az ya da hiçbir etkisi yoktur, anlamına gelir, çünkü MANT grubu kullanılır. Burada, bir kinesin ATP ciro döngüsünde nükleotid bağlama ve ayrışma gözlenmesine imkan vermek için durdurmalı akış floresan ile bağlantılı olarak mant-işaretlenmiş nükleotidlerin kullanımını anlatan protokolleri sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>2&amp;rsquo;/3&amp;rsquo;-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5&amp;rsquo;triphosphate&amp;nbsp;</td><td>Jena Biosciences</td><td># NU-202</td><td>mantATP</td></tr><tr><td>2&amp;rsquo;/3&amp;rsquo;-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5&amp;rsquo;-diphosphate&amp;nbsp;</td><td>Jena Biosciences</td><td># NU-201</td><td>mantADP</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Roche</td><td># 10519979001</td><td>The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100&amp;nbsp;mM in 100&amp;nbsp;mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;. Concentration should be verified by absorption at 260&amp;nbsp;nm (e = 15,400&amp;nbsp;M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20&amp;nbsp;&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td>0.5&amp;nbsp;M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled.</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Melford</td><td>MB1015</td><td>1&amp;nbsp;M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin.</td></tr><tr><td>NAP-5 column</td><td>GE Healthcare</td><td># 17-0853</td><td>G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Biosciences</td><td># NU-405</td><td>nonhydrolysable analogue of GTP</td></tr><tr><td>Stopped-flow fluorimeter&amp;nbsp;</td><td>Applied Photophysics</td><td>SX20</td><td>A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1&amp;nbsp;-&amp;nbsp;100&amp;nbsp;sec to be monitored.</td></tr></tbody></table>

use of stopped-flow fluorescence and labeled nucleotides to analyze the atp turnover cycle of kinesins

Mikrotübül ilişkili motor proteinlerinin kinesin süperailesi hem ATP hidrolizler ve mikrotübülleri bağlayan bir karakteristik motorlu etki alanını paylaşır. Kinesinler ATP ciro ve mikrotübül etkileşim hem süperailesinin genelinde farklılıklar gösterebilir. Bu farklılıkların, kargo taşımacılığı, Mikrotubullerin sürgülü, mikrotübül depolimerizasyona ve mikrotübül stabilizasyonu gibi çeşitli fonksiyonları belirli kinesinlerin terzi. Bir kinesin&#39;in etki mekanizmasını anlamak için ATP ciro kimyasal çevrim mikrotübül etkileşimin mekanik döngüsü birleştiğinde nasıl anlamak önemlidir. ATP çevirme süresi incelemek için, bir yaklaşım; çevriminde tek tek adımları görselleştirmek için, floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin kullanılmasıdır. ATP ciro döngüsündeki her bir nükleotid geçiş kinetiklerini belirlemek tam döngüsü tespit edilmesi için oran-sınırlayıcı aşama ya da aşamalara sağlar. Bir kinesin için, içerisinde, hız kesici aşama bilmek önemlidirkinesin mikrotübüller ile etkileşime girdiğinde mikrotübül yokluğu, bu adım, genel olarak birkaç bin kat olarak hızlanır. Mikrotübüllerin yokluğunda Bu daha sonra tamamen kinesin ATP çevirme süresi anlama mikrotübül mevcudiyetinde ile karşılaştırılır. Tek tek nükleotid geçişler kinetiği genellikle elle özellikle mikrotübül varlığında, reaktifleri, gözlenmek için çok hızlıdır. Hızlı bir karıştırma cihazının, kinetik bir kaç milisaniye gibi kısa bir zaman ölçeği içinde gözlemlenen sağlayan bir durdurmalı akış florimetresi olarak, bu tür geçiş izlemek için de kullanılabilir. Burada, durdu akışı ile hızlı karıştırma reaktiflerin bir kinesin ATP çevirme süresi incelemek için, floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin ile bağlantılı olarak kullanıldığı protokolleri açıklar.

MANT grubunun, flüoresans yoğunluğunda bir artış tipik olarak kinesin için mant olarak işaretlenmiş nükleotid bağlanması üzerine gözlenmiştir. Bununla birlikte, böyle bir sinyal değişikliğin büyüklüğü, söz konusu olan kinesin bağlıdır. Bu nedenle, bu kinetik deneyler için ilerlemeden önce bir flüoresan yoğunluğu değişim varlığını ve büyüklüğünü hem de teyit etmek için denge ölçümlerini gerçekleştirmek için yararlıdır. MantATP ve mantADP için tipik floresan spektroskopisi, ve kinesin-13, MCAK ile kompleks hem de Şekil 2B&#39;de gösterilmiştir. Bu veriler MCAK bağlanması üzerine mantATP ve mantADP her ikisi tarafından gösterilen floresan yoğunluğu artışı vurgulamaktadır. Bir kinesin&#39;in için mant nükleotid bağlanması üzerine floresan yoğunluğundaki değişim dernek ve ATP ve ADP hem dissosiasyonuna bildirmek için kullanılır (Bölüm 2 ve 3). MCAK durumunda, bir flüoresan yoğunluğu bir fark mantATP.kinesin ve mantADP.kinesin arasında görülmektedir <sus&gt; 9. Şekil 3 A, nükleotid içermeyen kinesin ile mantATP karıştırma üzerine cereyan eden, reaksiyon göstermektedir. Kinesin-13&#39;e mantATP bağlanması * ile oluşan floresan yoğunluğundaki artışı gösteren Örnek bilgileri, MCAK Şekil 3B&#39;de gösterilmiştir. Şekil 3B&#39;de gösterilen tipte veri mantATP bir konsantrasyon aralığında toplanır. MantATP konsantrasyonuna karşı belirlenen hız sabitleri (K gözlenen) bir grafiği Şekil 3C &#39;de gösterilmiştir. Bir doğrusal bir fonksiyonu bu verileri takılması (yani, k obs = k 1 [mantATP] + k -1) atıl (2.8 Adım) k katkıda hız sabitleri dekonvulasyon sağlar. Bu nedenle, esas ve mantATP için ayrışma oranı sabiti hem belirlenmesini sağlayan (Şekil 1, k, 1 ve k, <em&gt; -1 sırasıyla). Şekil 4A, etiketlenmemiş ATP fazlası ile mantADP.kinesin karıştırma üzerine cereyan eden, reaksiyon göstermektedir. Şekil 4B&#39;de veriler kinesin-13, MCAK ayrıldıktan sonra mantADP için gözlenen floresan yoğunluğu azalmayı göstermektedir. MantADP ayrılması için (adım 3.6), bir üstel fonksiyon için hız sabitini bu verileri uydurularak doğrudan belirlenir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig2highres.jpg" /> Fluorofor methylanthraniloyl (mant) ile etiketlenmiş nükleotidler Şekil 2. ATP çevirme süresi bireysel adımları izole etmek için kullanılır. Riboz üzerindeki yerine 2 &#39;veya 3&#39; ya da konjüge MANT fluorofor konumunu gösteren mantATP (A) yapısı. (B) çözeltisi (mAXP) olarak mantATP ve mantADP Normalize floresan spektrumu ve bir mantATPkinesin&#39;in MCAK (MATP + MCAK ve mADP + MCAK) ile kompleksi d mantADP. MantATP spektrumu çözelti içinde mantADP için azami floresan normalize çözelti içinde mantATP için azami floresans ve mantADP spektrumları için normalize edilir bulunmaktadır. MCAK ile karıştırılmış, MANT nükleotidlerin spektrumları 1 dakika karıştırma sonrası toplanır. Olarak protokolde açıklanan reaktifler ve florimetrenin ayarları konsantrasyonu 1.1 ve 1.2 adımları. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52142/52142fig3highres.jpg" /> MantATP arasında, bağlantı oranı sabitinin Şekil 3. ölçümü. (A) durdu-akış ile yer mesaja karıştırma alır tepkiyi gösteren şematik: mantATP (MATP) nükleotid-free Kinezin&#39;e bağlanır. Proteinine bağlanması üzerine, MANT grubu artar floresans yoğunluğu. (B) &#39;Flüoresan sinyali, değişiklik (siyah) MCAK ile mantATP (25 M) (5 M nu karıştırma üzerine gözlenencleotide içermeyen). Bu veri (tartışma) mant floroforun ışıkla hesapları tek bir üstel fonksiyonu artı sabit negatif eğim bir çizgi, sığdırma (kesik kırmızı) Ankastre:. Önce durdu akış florimetrede karıştırma şırınga içeriği. nükleotid içermeyen MCAK ile mantATP reaksiyonu için hesaplanmış bir (C) hız sabitleri (K atıl) mantATP konsantrasyonu ile karşılaştırıldı. Bu grafik, M-1 s birimleri ile, bağlantı oranı sabitinin (Şekil 1, k, 1) olan gradyanı -1 ve y-dinleme ayrılma oranı sabit kalır (Şekil 1, k-1) ile olan bir doğrusal bölgesine sahip olacaktır s birimleri -1. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52142/52142fig3large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> . MantADP ile yüklenmiş kinesin etiketlenmemiş ATP fazla bir katma seyreltilir: mantADP için ayrışma oranı sabiti Şekil 4 ölçümü (A) şematik akış durduruldu-sonrası karıştırma yer alan reaksiyon görünümüdür. Böylece ayrıştırma mantADP mantADP Birliği (tartışmaya bakınız) arka reaksiyonunu önlemek, etiketlenmemiş ATP ile değiştirilir. MANT grubunun flüoresan yoğunluğu, proteinin ayrıldıktan sonra azalmaktadır. Kinesin MCAK gelen mantADP dissosiye üzerine gözlenen (B) Floresans bir azalma. Floresan sinyali (siyah) (tartışma) mant grubun ışıkla hesabını tek bir üstel artı sürekli olumsuz bir eğim çizgisine uygun (kesikli kırmızı) &#39;dir. Belirlenen hız sabiti mantADP (Şekil 1, k ayrılması için hız sabitidir4) Ankastre:.. Durdurulmuş akış florimetrede karıştırma önce şırınga içeriği <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52142/52142fig4highres.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins at JoVE.com

Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

Kinesinler mikrotübüllerle nükleotid-bağımlı etkileşimi ile karakterize edilir: mikrotübül bir etkileşim döngüsü birleştiğinde ATP ciro bir döngü. Burada, floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin ve durdurmalı akış floresan kullanılarak kinesin ATP çevirme süresi bireysel nükleotid geçişler kinetiği analiz protokolleri açıklar.

Floresan-Akış durdu ve Etiketli Nükleotidlerinin Kullanım kinesinlerin ATP Ciro Döngüsü Analiz için

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. ...

use-stopped-flow-fluorescence-labeled-nucleotides-to-analyze-atp

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Chemistry

15.5K Görüntüleme.  University of Nottingham.  Kinesinler mikrotübüllerle nükleotid-bağımlı etkileşimi ile karakterize edilir: mikrotübül bir etkileşim döngüsü birleştiğinde ATP ciro bir döngü. Burada, floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin ve durdurmalı akış floresan kullanılarak kinesin ATP çevirme süresi bireysel nükleotid geçişler kinetiği analiz protokolleri açıklar. 

Video: Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would not occur spontaneously. These proteins are crucial for essentially all aspects of cellular life, including metabolism, cell division, responses to environmental changes and movement. The protocol presented here describes a nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay that has been adapted to semi-high throughput screening of small molecule ATPase inhibitors. The assay has been applied to cardiac and skeletal muscle myosin II's, two actin-based molecular motor ATPases, as a proof of principle. The hydrolysis of ATP is coupled to the oxidation of NADH by enzymatic reactions in the assay. First, the ADP generated by the ATPase is regenerated to ATP by pyruvate kinase (PK). PK catalyzes the transition of phosphoenolpyruvate (PEP) to pyruvate in parallel. Subsequently, pyruvate is reduced to lactate by lactate dehydrogenase (LDH), which catalyzes the oxidation of NADH in parallel. Thus, the decrease in ATP concentration is directly correlated to the decrease in NADH concentration, which is followed by change to the intrinsic fluorescence of NADH. As long as PEP is available in the reaction system, the ADP concentration remains very low, avoiding inhibition of the ATPase enzyme by its own product. Moreover, the ATP concentration remains nearly constant, yielding linear time courses. The fluorescence is monitored continuously, which allows for easy estimation of the quality of data and helps to filter out potential artifacts (e.g., arising from compound precipitation or thermal changes).

A nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay has been adapted to semihigh throughput screening of small molecule myosin inhibitors. This kinetic assay is run in a 384-well microplate format with total reaction volumes of only 20 &#181;L per well. The platform should be applicable to virtually any ADP producing enzyme.

Küçük Molekül Inhibitörlerinin Taranması için NADH-Coupled ATPase Tsay'ın Yarı-Yüksek İş-İşLenme Adaptasyonu

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Biyokimya

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. This method combines expression of proteins tagged with the fluorescent non-canonical amino acid ANAP, and FRET between ANAP and fluorescent (trinitrophenyl) nucleotide derivatives. We present examples of nucleotide binding to ANAP-tagged KATP ion channels measured in unroofed plasma membranes and excised, inside-out membrane patches under voltage clamp. The latter allows for simultaneous measurements of ligand binding and channel current, a direct readout of protein function. Data treatment and analysis are discussed extensively, along with potential pitfalls and artefacts. This method provides rich mechanistic insights into the ligand-dependent gating of KATP channels and can readily be adapted to the study of other nucleotide-regulated proteins or any receptor for which a suitable fluorescent ligand can be identified.

This protocol presents a method for measuring adenine nucleotide binding to receptors in real time in a cellular environment. Binding is measured as F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between trinitrophenyl nucleotide derivatives and protein labeled with a non-canonical, fluorescent amino acid.

Sağlam, fonksiyonel membran proteinlerine bağlanan nükleotidin gerçek zamanlı olarak ölçülmesi

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins

This protocol describes how to create kinesin-powered molecular shuttles with a weak and reversible attachment of the kinesins to the surface. In contrast to previous protocols, in this system, microtubules recruit kinesin motor proteins from solution and place them on a surface. The kinesins will, in turn, facilitate the gliding of the microtubules along the surface before desorbing back into the bulk solution, thus being available to be recruited again. This continuous assembly and disassembly leads to striking dynamic behavior in the system, such as the formation of temporary kinesin trails by gliding microtubules.
Several experimental methods will be described throughout this experiment: UV-Vis spectrophotometry will be used to determine the concentration of stock solutions of reagents, coverslips will first be ozone and ultraviolet (UV) treated and then silanized before being mounted into flow cells, and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy will be used to simultaneously image kinesin motors and microtubule filaments.

We present a protocol to build molecular shuttles, where surface-adhered kinesin motor proteins propel dye-labelled microtubules. Weak interactions of the kinesins with the surface enables their reversible attachment to it. This creates a nanoscale system which exhibits dynamic assembly and disassembly of its components while retaining its functionality.

Moleküler mekikler Powered by geri dönülebilir olarak montaj Kinesins bağlı

This protocol describes how to create kinesin-powered molecular shuttles with a weak and reversible attachment of the kinesins to the surface. In contrast ...

Mühendislik

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and networks often contain subsets of microtubule arrays that differ in their dynamic properties. For example, in dividing cells, stable bundles of crosslinked microtubules coexist in close proximity to dynamic non-crosslinked microtubules. TIRF-microscopy-based in vitro reconstitution studies enable the simultaneous visualization of the dynamics of these different microtubule arrays. In this assay, an imaging chamber is assembled with surface-immobilized microtubules, which are either present as single filaments or organized into crosslinked&#160;bundles. Introduction of tubulin, nucleotides, and protein regulators allows direct visualization of associated proteins and of dynamic properties of single and crosslinked microtubules. Furthermore, changes that occur as dynamic single microtubules organize into bundles can be monitored in real-time. The method described here allows for a systematic evaluation of the activity and localization of individual proteins, as well as synergistic effects of protein regulators on two different microtubule subsets under identical experimental conditions, thereby providing mechanistic insights that are inaccessible by other methods.

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Here, a TIRF microscopy-based in vitro reconstitution assay is presented to simultaneously quantify and compare the dynamics of two microtubule populations. A method is described to simultaneously view the collective activity of multiple microtubule-associated proteins on crosslinked microtubule bundles and single microtubules.

Çapraz Bağlı ve Tek Mikrotübüllerin Dinamiğinin In Vitro TIRF Mikroskobu ile Eşzamanlı Görselleştirilmesi

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of catalytic motor domains, located at opposite ends of the active complex. This unique architecture enables kinesin-5 motors to crosslink and slide apart antiparallel spindle microtubules (MTs), thus providing the outwardly-directed force that separates the spindle poles apart. Previously, kinesin-5 motors were believed to be exclusively plus-end directed. However, recent studies revealed that several fungal kinesin-5 motors are minus-end directed at the single-molecule level and can switch directionality under various experimental conditions. The Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 is an example of such bi-directional motor protein: in high ionic strength conditions single molecules of Cin8 move in the minus-end direction of the MTs. It was also shown that Cin8 forms motile clusters, predominantly at the minus-end of the MTs, and such clustering allows Cin8 to switch directionality and undergo slow, plus-end directed motility. This article provides a detailed protocol for all steps of working with GFP-tagged kinesin-5 Cin8, from protein overexpression in S. cerevisiae cells and its purification to in vitro single-molecule motility assay. A newly developed method described here helps to differentiate between single molecules and clusters of Cin8, based on their fluorescence intensity. This method enables separate analysis of motility of single molecules and clusters of Cin8, thus providing the characterization of the dependence of Cin8 motility on its cluster size.

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

The bi-directional mitotic kinesin-5 Cin8 accumulates in clusters that split and merge during their motility. Accumulation in clusters also changes the velocity and directionality of Cin8. Here, a protocol for motility assays with purified Cin8-GFP and analysis of motile properties of single molecules and clusters of Cin8 is described.

Tek Moleküllerin Motilitesi ve S. cerevisiae Hücrelerinden Saflaştırılmış Çift Yönlü Kinesin-5 Cin8 Kümeleri

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopy has a high signal-to-background ratio, but it suffers from photobleaching and photodamage of the fluorescent proteins. Label-free techniques such as interference reflection microscopy (IRM) and interferometric scattering microscopy (iSCAT) circumvent the problem of photobleaching but cannot readily visualize single molecules. This paper presents a protocol for combining IRM with a commercial TIRF microscope for the simultaneous imaging of microtubule-associated proteins (MAPs) and dynamic microtubules in vitro. This protocol allows for high-speed observation of MAPs interacting with dynamic microtubules. This improves on existing two-color TIRF setups by eliminating both the need for microtubule labeling and the need for several additional optical components, such as a second excitation laser. Both channels are imaged on the same camera chip to avoid image registration and frame synchronization problems. This setup is demonstrated by visualizing single kinesin molecules walking on dynamic microtubules.

We present a protocol for implementing interference-reflection microscopy and total-internal-reflection-fluorescence microscopy for the simultaneous imaging of dynamic microtubules and fluorescently labeled microtubule-associated proteins.

Dinamik Mikrotübülleri ve İlişkili Proteinleri Görüntülemek için Eşzamanlı Girişim Yansıması ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved single-molecule studies and has gained immense popularity in detecting and understanding the dynamic behavior of fluorescent-tagged molecules. Here, we describe a detailed method for&#160;in vitro single-molecule studies of kinesin-3 family motors using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy. Kinesin-3 is a large family that plays critical roles in cellular and physiological functions ranging from intracellular cargo transport to cell division to development. We have shown previously that constitutively active dimeric kinesin-3 motors exhibit fast and superprocessive motility with high microtubule affinity at the single-molecule level using cell lysates prepared by expressing motor in mammalian cells. Our lab studies kinesin-3 motors and their regulatory mechanisms using cellular, biochemical and biophysical approaches, and such studies demand purified proteins at a large scale. Expression and purification of these motors using mammalian cells would be expensive and time-consuming, whereas expression in a prokaryotic expression system resulted in significantly aggregated and&#160;inactive protein. To overcome the limitations posed by bacterial purification systems and mammalian cell lysate, we have established a robust Sf9-baculovirus expression system to express and purify these motors. The kinesin-3 motors are C-terminally tagged with 3-tandem fluorescent proteins (3xmCitirine or 3xmCit) that provide enhanced signals and decreased photobleaching. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of Sf9 purified proteins demonstrate that kinesin-3 motors are fast and superprocessive akin to our previous studies using mammalian cell lysates. Other applications using these assays include detailed knowledge of oligomer conditions of motors, specific binding partners paralleling biochemical studies, and their kinetic state.

This study details purification of KIF1A(1-393LZ), a member of kinesin-3 family, using Sf9-baculovirus expression system. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of these purified motors exhibited robust motility properties comparable to motors from mammalian cell lysate. Thus, Sf9-baculovirus system is amenable to express and purify motor protein of interest.

Sf9 Saflaştırılmış Süperprosesif Kinesin-3 Ailesi Motorlarının Tek Moleküllü Analizi

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and regulated by different suites of binding proteins unique for each polymer. Many studies now demonstrate that the dynamics of both cytoskeletal polymers are intertwined and that this crosstalk is required for most cellular behaviors. A number of proteins involved in actin-microtubule interactions have already been identified (i.e., Tau, MACF, GAS, formins, and more) and are well characterized with regard to either actin or microtubules alone. However, relatively few studies showed assays of actin-microtubule coordination with dynamic versions of both polymers. This may occlude emergent linking mechanisms between actin and microtubules. Here, a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy-based in vitro reconstitution technique permits the visualization of both actin and microtubule dynamics from the one biochemical reaction. This technique preserves the polymerization dynamics of either actin filament or microtubules individually or in the presence of the other polymer. Commercially available Tau protein is used to demonstrate how actin-microtubule behaviors change in the presence of a classic cytoskeletal crosslinking protein. This method can provide reliable functional and mechanistic insights into how individual regulatory proteins coordinate actin-microtubule dynamics at a resolution of single filaments or higher-order complexes.

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

This protocol is a guide for visualizing dynamic actin and microtubules using an in vitro total internal fluorescence (TIRF) microscopy assay.

Aktin ve Mikrotübül Eşleşme Dinamiğinin In Vitro Total İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu ile Görselleştirilmesi

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

ATP-bağımlı Kromatin Tadilat Enzimler Faaliyetlerinin Analizi için biyokimyasal Tahliller

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

Biyoloji

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Here, a protocol is presented to identify Kinesin-1 cargos. A motorless mutant of the Kinesin-1 heavy chain (KIF5B) aggregates in the cytoplasm and induces aggregation of its cargos. Both aggregates are detected under fluorescence microscopy. A similar strategy can be employed to identify cargos of other motor proteins.

Floresan mikroskobu kullanarak kinesin-1 Cargos Tanımlanması

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...