The authors would like to thank members of the Yi laboratory especially Zhaojie Zhang for fruitful discussions regarding linker design and ligation efficiencies, as well as the American Cancer Society for supporting this work through a postdoctoral fellowship (#125209) to J.E.L. Research reported in this publication was also supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under Award Number R01AR059697 (to R.Y.) and a research grant from the Linda Crnic Institute for Down Syndrome. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

Not: Bu, tüm işlem boyunca RNase içermeyen koşulları sağlamak için çok önemlidir. 3 &#39;Bağlayıcının 1. Adenylation <ol><li> Nükleaz içermeyen H2O içinde 100 uM 3 ligasyon reaksiyonları için tasarlanmış DNA oligonükleotid seyreltin Not: oligonükleotidi bir 5 &#39;fosfat grubu, 5 bir randomize dinükleotid&#39; ucuna ve 3 &#39;dideoxycytosine olmalıdır. 5 PCP 10 &#39;fosfat grubu etkili 5 için Mth enzimin bir gerekliliktir&#39;. Fosfat doğrudan modifikasyonu ile bir polinükleotid kinaz ile oligonükleotidin ön-muamele ile ilave ya da istenebilir. 5 &#39;ucunda, randomize dinükleotit hangi belirli bir son uç diğerleri üzerinde 6 tepkileri birleştirilmesi için bir RNA ligaz sergiler sekansı tercih en aza indirmek için önemlidir. 3, oligonükleotid t &#39;ucuna dideoxycytosine 3 bir blokaj elemanının yerleştirir&#39;O sonraki bağlama adımları sırasında bağlayıcı-bağlayıcı konkatamerler oluşumunu inhibe eden ve aynı zamanda bağlama reaksiyonu, 11 3 &#39;3&#39;ün ucunda oluşturulan miRNA-Bağlayıcı molekülün ucunu&#39; için blok teşkil eder. Aşağıdaki gibi tarafsız miR-Dizi yöntemi için seçilen oligonükleotid linker dizisi olduğu için: 5&#39;PO 4 NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3. &#39; </li><li> 200 pmol 3 &#39;oligonükleotidi, 4 ul 10x için 5&#39; DNA adenilasyon tampon maddesi, 4 ul 1 mM ATP, 4 ul Mde RNA ligaz, nükleaz içermeyen H2O 40 ul&#39;lik nihai bir hacme kadar: Aşağıdaki adenilasyon reaksiyon bir araya getirin. </li><li> 1 saat boyunca 65 ° C&#39;de reaksiyon inkübe edin. 5 dakika boyunca 85 ° C&#39;ye ısıtılması yolu ile reaksiyonu bitirin. </li><li> Kalıntı ATP kaldırmak ve gelecekteki reaksiyonlarda beklenmedik ligasyonu önlemek için% 100 2.5 hacim etanol ve 10 M amonyum asetat 1/3 hacme ilavesiyle adenylated bağlayıcı çökeltilmesi. <ol><li> Kısaca, al karıştırıncohol, tuz ve 20 dakika boyunca 4 ° C&#39;de bir mikrosantrifüj içinde tam hızda eğirme homojenlik oligo çözeltisi (~ 15,000 xg). Adenylated oligo 50-100 uM vermek üzere nükleaz içermeyen H2O uygun hacimde% 70 etanol, kuru hava ve tekrar süspansiyon pelet yıkayın. </li></ol></li><li> % 18 poliakrilamidjeli çalıştırarak adenilasyon onaylayın. <ol><li> Birlikte, aşağıdakileri karıştırarak jel hazırlayın: 6.3 g üre,% 40 akrilamid 6.75 mi, ve 10x TBE 1.5 mi. H 2 O 15 ml ilave edilir. </li><li> Üre tamamen çözülene kadar karıştırın ve amonyum persülfat (BP), ve 15 ul tetramethlyethylenediamine (TEMED) (ağ / hac), 150 ul% 10 ekleyin. </li><li> Jel 1x TBE oda sıcaklığında tampon maddesi ile jel genişliğinin 24 V / cm &#39;de 30 dakika boyunca ön-run kurduğunda. Tamponu ile çalışan 30 dk kadar bir kez yıkayın kuyular. </li><li> Ile adenylated oligonükleotitlerin ve 2x denatüre RNA yükleyici tampon eşit hacimde (% 95 (h / h) formamid 5 pmol karıştırın% 0.02 SDS,% 0.02 bromofenol mavisi (ağırlık / hacim),% 0.01 (ağırlık / hacim) (w / v) Ksilen siyanol, 1.0 mM EDTA) içinde, ısı kısa bir süre için 75 ° C ve buz üzerinde soğutuldu oturmaktadır. Jelin kuyuya, örneğin tamamına koyun. Aynı zamanda, bir sigara adenylated kontrol benzer bir miktar ve düşük molekül ağırlıklı boyutu standartlarına uygun bulunmaktadır. </li><li> Bromofenol mavi jel tabanına yol ¾&#39;ünü kadar 24 V / cm jel üzerinde çalıştırıldı. 1x TBE 1x SYBR-altın çözeltisi ile cihaz, post-leke jel sökmeye ve UV-transilluminator&#39;de kutusu (Şekil 2) görselleştirmek. Not: girdi RNA örnekleri ile karşılaştırıldığında Jel &quot;, herhangi bir giriş RNA &#39;olarak kontrol PCR ürününün yüksek miktarda elde edilir, yukarıda tarif edilene benzer bir şekilde adenylated oligo temizler. </li></ol></li></ol> 2. Bağlayıcı Ligasyon miRNA 3 &#39;ucuna <ol><li> 3 &#39;Ligasyon <ol><li> (Ağ / hac) PEG 8000, 0.5 ve 1.0 ul% 50: sıraya uygun olarak buz üzerinde, aşağıdaki bileşenleri monte956. l 10x RNA ligaz tamponu (500mM Tris-HCI pH 7.5, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT), 1.0 ul, 3 &#39;Linker (100 uM), 0.5 ul RNaz inhibitörü, 0,5-8,0 ug toplam RNA, adenylated 0.5 ul T4 RNA ligaz, 2, 5 ul&#39;lik nihai bir hacme kadar nükleaz içermeyen H2O. </li><li> Çözelti girdaba çok viskoz olduğu gibi bağlı bir kez iyice karıştırılır PEG 8000 yüksek konsantrasyonu pipetleme tepkime karışımı ısıtılmış kapak ile, bir termal döngü reaksiyonu yerleştirin. 16 ° C&#39;ye kadar bloğu ayarlama, ve 4 saat süreyle inkübe edin. Not: Reaksiyon bağlanma verimliliği herhangi bir kayıp olmadan 20 ul bir son hacme kadar ölçeklendirilebilir. Çevre sıcaklığında 4 saat boyunca reaksiyona girmesi ya da gece boyunca 4 ° C &#39;de esas itibarıyla benzer bağlanma verimliliği elde edilir. </li></ol></li><li> Jel saflaştırma <ol><li> 3 &#39;Ligasyondan sonra, 2x RNA yükleyici tampon maddesinin eşit hacmi ile reaksiyona karıştırın. 5 dakika boyunca 70 ° C&#39;ye kadar ısı ve buz üzerinde serin ek. </li&gt; <li> PAGE arıtılması için bir% 15 poliakrilamid jeli üzerinde örnek çalıştırın. <ol><li> Adım 1.5&#39;te daha önce tarif edilene benzer bir şekilde, 7 M üre ihtiva eden bir% 15 poliakrilamid jelinde hazırlayın. </li><li> En az 30 dakika boyunca jel genişliği 24 V / cm jel ön çalıştırın. Öncesi dönemde aynı geriliminde güç kaynağı, floş kuyuları, yük örnek ve çalışma jel kapatın. </li><li> Örnek yükleyin ve Bromophenol mavi jel çıkıldı sadece kadar PAGE çalıştırın. Arzu edilen ürün, iksilen siyanol yakın hareket edecektir. </li></ol></li></ol></li><li> Boyama, Görselleştirme ve Eksizyon <ol><li> 15 dakika boyunca 1x çalışan tampon (TBE), 1x SYBR-altın ve kaya temiz tepsiye jel aparat ve yer jel sökmeye. </li><li> Boyanması çanak jel çıkarın ve temiz bir plastik wrap ile kaplı UV transilluminator&#39;de kutusunda görselleştirmek. Ligasyon ürünü, uzunluğu yaklaşık 45 nükleotid olacaktır. </li><li> Temiz bir Razo ile ligasyon ürünü içeren bölgeyi tüketim0.5 ml mikro-santrifüj tüpüne r bıçak ve yer. </li></ol></li><li> Ürün İzolasyon ve Yağış <ol><li> Pierce, 30 G iğne ile 0.5 ml mikrosantrifüj tüp alt ve ikinci bir temiz, düşük tutma deldi tüp yeri, 1.5 ml mikrosantrifüj tüp. ~ 15,000 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje. </li><li> Görme tüm jel dilim iç tüp delikten hareket ettiğini teyit etmektedir. Gerekirse, yakın deliğe bazı jel parçaları itmek için temiz bir pipet kullanın. </li><li> Boş 0.5 mi tüp atılır ve akrilamid bulamaca yüksek tuzlu kolon tamponu 400 ul (25 mM Tris-HCI pH 7.5,% 0.1 SDS HSCB 400 mM NaCl) ilave edin. Gece boyunca 4 ° C &#39;de kaya tüpü (s). </li><li> Geniş çaplı bir pipet kullanarak 0.22 mikron selüloz asetat spin kolon bulamaç aktarın. ~ 15,000 x g&#39;de, oda sıcaklığında 3 dakika boyunca santrifüje uzaklıkta akrilamid jel matrisi tüm sıvı toplamak. </li><li> Temiz, düşük tutma sıvı transfer, 1.5 ml tüp içerir20 mg / ml glikojen 1 ul ing. Bir izopropanol eşit hacim ve 10/1 inci hacim sodyum asetat ekleyin. Tüpü birkaç kez baş aşağı çevirerek çözeltisi karıştırın ve 20 dakika boyunca ° C sıcaklıkta dondurucuya -80 hızlandırabilir. </li><li> 20 dakika boyunca 4 ° C &#39;de tam hızda santrifüje nükleik asidi: pelet. Süpernatantı ve% 70 etanol içinde yıkayın. Havada kurutma, oda sıcaklığında 10 dakika süre ile pellet halindedir ve 5 &#39;bağlama adımı doğrudan devam edin. </li></ol></li></ol> Bağlayıcı Hybrid 3. Bağlayıcı ligasyon 5 &#39;miRNA-3 Sonu&#39; <ol><li> Tanelenmiş nükleik asit için, aşağıdaki bileşenler eklemek: 2 ul PEG 8000 (% 50 ağırlık / hacim), 0.5 ul 10x RNA ligaz tamponu, 0.5 ul ATP (10 mM), 0.5 ul NN-RNA, oligo (100 uM), ve H 4 ul bir son hacim 2 O. NOT: 5&#39;-ters dideoksi-TCUACAGUCCGACGAUCNN3 &quot;ifadesi ve üretici tarafından HPLC ile saflaştırıldı &#39;NN-RNA, oligo&#39; in bileşimi olup. </li><li> Karıştırmakaşağı defalarca yukarı pipetleme ve bu örnek. Pelet tamamen yeniden solübilize olmuştur emin olmak için bir süre (5 dk) için yapın. Yeniden-solübilizasyon sorunlu ise, 37 ° C örnek kısaca (3-5 dk) ısı ve karıştırmak için pipetlenmesini devam. </li><li> RNaz inhibitörü ve T4 RNA ligaz 1 (5 birim): 1&#39;lik bir karışımı topak çözelti içinde geri sonra, bir 1 1 ul içeren temiz bir PCR tüpü aktarılmaktadır. Yine aşağı yukarı pipetleme karıştırın. </li><li> 4 saat 37 ° C&#39;de bir termal döngü reaksiyonu inkübe edin. CDNA sentezi hemen geçin. </li></ol> 4. ters transkripsiyon / cDNA Sentezi <ol><li> 5 Aşağıdaki bileşenleri ekleme ligasyon reaksiyonu: 2 ul 5X RT tampon maddesi, 0,75 ul 100 mM DTT, 1 ul Illumina RT primer 5&#39;-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3 &#39;(1 uM) ve 0.5 ul dNTP (10 mM) getirilmiştir. </li><li> 5 dakika boyunca 65 ° C&#39;ye kadar pipetleme ve ısı ile karıştırın. Sonra yavaş yavaş tezgah t üzerinde soğumasınıop. </li><li> Reaksiyon, buz üzerinde, oda sıcaklığında, bir yer tüpüne soğutuldu ve ters transkriptaz enzimi ve RNase inhibitör her biri 0.5 ul ekleyin sonra. Imalatçının talimatlarında belirtildiği uzatma aşaması için ısı döngüleyici içinde pipetleme ve yerine göre karıştırın. </li><li> Tamamlandığında eklenti nükleaz içermeyen H2O 5 ul 15 ul kadar cDNA kütüphanesinin son hacmi getirmek. </li></ol> 5. Kütüphane hazırlanması <ol><li> Endeksleme PCR için, buz üzerinde, aşağıdaki reaksiyon monte: 6 ul 5x Phusion Tampon, 1 ul dNTP (10 mM), 0.9 ul DMSO, 0.75 ul 5 &#39;primer (25 uM), 0.75 ul 3&#39; primer (25 uM), 3 ul cDNA kütüphanesi (girdi miktarına bağlı olarak değişken konsantrasyon), 0.5 ul Phusion Polimeraz (1 ünite), 30 ul&#39;lik nihai bir hacme kadar nükleaz içermeyen H2O. Şablonun ve sıralama platformu ile uyumluluğu sağlamak için primer dizileri seçinseçim. <ol><li> 15 saniye için 72 ° C &#39;de uzanmaktadır, birinci 4 çevrim için, 3 dakika boyunca 98 ° C de ilk denaturasyon 15 sn için 50 ° C&#39;de 15 saniye, tavlama için 98 ° C denatüre: PCR, aşağıdaki ayarlarla bir reaksiyondan . NOT: giriş malzemenin miktarına bağlı olarak, toplam PCR çevrim numaraları değişir. Tipik olarak, toplam RNA 1-2 ug bir giriş için, 13 toplam PCR döngüleri mıR-Dizi kütüphane oluşturmak için yeterlidir. </li><li> Tavlama ve uzatma çevrimi bir araya getirilmiş ve 30 sn için ve denatürasyon için 70 ° C sıcaklıkta gerçekleştirilmektedir, iki aşamalı bir şekilde, örneğin daha sonraki aşamalarda, durulamalar, 5-12, yürütmek tekrar 15 sn için 98 ° C &#39;dir. Not: Reaksiyon hacmi PCR programı duraklatma izin veren ve arzu edilen ürün bir görünüm için izlemek için önceden belirlenmiş bir döngü sayılarında, 10 ul bir kısım kaldırmak üzere 30 ul. Tipik haliyle, çevrimleri 10, 13 ve 16 toplam RNA numunesinin test için seçilir. </li></ol></li><li> Hazırlamak% 40 akrilamid ve 2 ml 10x TBE 1 ml, ve H2O 10 ml karıştırılarak% 8 denatüre edici olmayan akrilamid jeli. Daha sonra% 10 APS 100 ul ve TEMED 10 ul ekle. Jel dökün ve set edelim. <ol><li> 30 dakika boyunca jel genişliği, 12 V / cm jel ön çalıştırın. Floş kuyular. 10x yükleme tamponu 1 ul ekle (15% Ficoll 400, 66 mM EDTA, 20 mM Tris-HCI, pH 8.0,% 0.1 (ağ / mavi / hacim) bromofenol hac) SDS,% 0.01 () 10 ul ekle boyutları her çukuruna 5 mm x 1 mm x 15 mm numune. Tipik olarak, her iyi örneklerin 30 ul yükleyebilirsiniz. Bromofenol mavi boya sadece jel alt bitene kadar 1x TBE tamponu içinde, jel genişliği 10 V / cm &#39;de örnek jel üzerinde çalıştırıldı. </li><li> Leke ve aşama 2.3&#39;de tarif edildiği gibi jel görselleştirmek. </li><li> 146 baz çift bant pulu ve Bölüm 2.4 de tarif edilene benzer bir şekilde, HSCB 0.25 ml, gece boyunca tasfiye edilir. Bir izopropanol eşit hacimde ve 10/1 inci hacim sodyum asetat DNA hızlandırabilir. % 70 e yıkama peletTE tamponunda -metanol ve tekrar süspansiyon. </li><li> Üreticinin tavsiyelerine göre PicoGreen kullanarak kütüphane niceliğini. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-ligase-dependent+biases+in+miRNA+representation+in+deep-sequenced+small+RNA+cDNA+libraries.">RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries.</a> RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).</li><li>Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+RNA+cloning+enables+accurate+quantification+of+miRNA+expression+by+deep+sequencing.">High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing.</a> Genome Biology. 14 (10), 109 (2013).</li><li>Consortium, T. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ENCODE+(ENCyclopedia+Of+DNA+Elements)+Project.">The ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) Project.</a> Science. 306 (5696), 636-640 (2004).</li><li>Consortium, T. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Linsen, S. E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+and+possibilities+of+small+RNA+digital+gene+expression+profiling.">Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling.</a> Nature Methods. 6 (7), 474-476 (2009).</li><li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing.">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39 (21), 141 (2011).</li><li>McLaughlin, L. W., Romaniuk, E., Romaniuk, P. J., Neilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+Acceptor+Oligoribonucleotide+Sequence+on+the+T4+RNA+Ligase+Reaction.">The Effect of Acceptor Oligoribonucleotide Sequence on the T4 RNA Ligase Reaction.</a> European Journal of Biochemistry. 125 (3), 639-643 (1982).</li><li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+bias+in+T4+RNA+ligase-mediated+3&#8242;-adapter+ligation.">Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3&#8242;-adapter ligation.</a> Nucleic Acids Research. 40 (7), 54 (2012).</li><li>Harrison, B., Zimmerman, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-stimulated+ligation:+enhanced+ligation+of+oligo-+and+polynucleotides+by+T4+RNA+ligase+in+polymer+solutions.">Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions.</a> Nucleic Acids Research. 12 (21), 8235-8251 (1984).</li><li>Torchia, C., Takagi, Y., Ho, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Archaeal+RNA+ligase+is+a+homodimeric+protein+that+catalyzes+intramolecular+ligation+of+single-stranded+RNA+and+DNA.">Archaeal RNA ligase is a homodimeric protein that catalyzes intramolecular ligation of single-stranded RNA and DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (19), 6218-6227 (2008).</li><li>Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Abundant+Class+of+Tiny+RNAs+with+Probable+Regulatory+Roles+in+Caenorhabditis+elegans.">An Abundant Class of Tiny RNAs with Probable Regulatory Roles in Caenorhabditis elegans.</a> Science. 294 (5543), 858-862 (2001).</li><li>Yi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DGCR8-dependent+microRNA+biogenesis+is+essential+for+skin+development.">DGCR8-dependent microRNA biogenesis is essential for skin development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 498-502 (2009).</li><li>Leung, A. K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+Ago2+binding+sites+from+mouse+embryonic+stem+cells+with+and+without+mature+microRNAs.">Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

Bu tarifnamede anlatılan yöntemler, bağlama verimliliği, yani PEG, randomize bağlayıcıların kullanımı yüksek konsantrasyonlarda ve bağlayıcıların 2,6,9 yüksek konsantrasyonu en üst düzeye çıkarmak için birkaç anahtar değişkenlerden kullanır. Bu yaklaşım, total RNA örnekleri 2 güvenilir kantitatif sıralama kütüphaneleri izin verir. Biz giriş RNA&#39;nın çoklu titrasyonlarını yaptık ve önceki metodoloji (veriler gösterilmemiştir) 1-8 mikrogram aralığında to...

Yüksek verim sıralama tabanlı metodolojileri yaygın ölçüde biyolojik sistemlerin 3,4 moleküler karmaşıklığı anlayışımızı genişleyen son yıllarda birçok biyolojik numunelere uygulanmıştır. Ancak, yüksek sekanslama için RNA örneklerinin hazırlanması çoğu zaman, bu güçlü teknikleri potansiyel kullanımını sınırlayan çalışan yönteme özgü belirli bir yanlılığı kazandırır. Bu yöntem, belirli önyargıları iyi ligasyon-temelli, küçük RNA kütüphane hazırlıkları 1,2,5,6 için belgelenmiştir. Bu önyargıları 1,000 kat varyasyon çılgınca değişken ve hata eğilimli sıralama verilerinden miRNA bereket çıkarsama yapma, eşit molar sentetik miRNA&#39;ların için sayıları okur sonuçlanabilir. Faj türevli, T4 RNA ligazların özelliklerine odaklanarak çalışmalar enzimler yüksek verimli sekanslama deneylerde belirlendiği gibi yanlı kitaplıkları ortaya nükleotid bazlı tercihleri ​​7, olduğu belgelenmiştir adres <s1,2,8&gt; kadar. RNA, ligazlar tarafından kazandırılan hatalarını en aza indirmek için, birden fazla stratejiler kullanılmıştır; makromoleküler, 9 boğmakta ligasyon siteye 6 proksimalinde adaptör üzerinde nükleotid dizisi randomizing ve ligasyon adaptörü 2 yüksek konsantrasyonlarda istihdam. Bu üç yaklaşımların bir kombinasyonu sayesinde yüksek verimlilik sıralaması (Şekil 1) uyumlu küçük RNA kütüphanelerin tarafsız hazırlanması için bir iş akışı geliştirdik. Mevcut protokoller ve optimize edilmiş bir yöntemle arasında doğrudan karşılaştırmalar için, bizim son raporunda 2 başvurun. Bu optimize edilmiş yöntem her iki 3 &#39;ve 5&#39; aşamalarında% 95&#39;ten ligasyonu verim alınmasını sağlamaktadır, sentetik ve biyolojik örnekler 2 küçük RNA moleküllerinin tarafsız bağlanmasını izin verir.

<table><tbody><tr><td>3&#039; Linker (5&#039; phosphorylated, 3&#039; blocked)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td></td></tr><tr><td>5&#039; Linker</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>5&#039; blocked, HPLC purified</td></tr><tr><td>T4RNL2 (1-249 K227Q)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0351S</td><td>Specialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters</td></tr><tr><td>10x Ligation buffer (without ATP)</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0351S</td><td></td></tr><tr><td>10x Ligation buffer (with ATP)</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0204L</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene glycol (mol. Wt. 8,000)</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality.</td></tr><tr><td>T4RNL1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III RT kit</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Phusion PCR kit</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Illumina RP1 primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Sequence information available from Illumina</td></tr><tr><td>Illumina RT primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Sequence information available from Illumina</td></tr><tr><td>Illumina index primer(s)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Sequence information available from Illumina</td></tr><tr><td>40% Acrylamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP14081</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethyethylenediamine (TEMED)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>2x Denaturing RNA loading buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0351S</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>SpinX Centricon tubes</td><td>Costar</td><td>CLS8161</td><td></td></tr><tr><td>Low retention microfuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>Adenylation kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2610L</td><td></td></tr></tbody></table>

highly efficient ligation of small rna molecules for microrna quantitation by high-throughput sequencing

MiRNA klonlama ve yüksek verim sıralama, miR-Dizi, tek nükleotid çözünürlükte miRNA&#39;lar ölçmek için bir transcriptome geniş bir yaklaşım olarak tek başına duruyor adlandırılır. Bu teknik MiRNA moleküllere 3 &#39;ve 5&#39; oligonükleotid adaptörler takılarak miRNA&#39;lar yakalar de novo miRNA keşif sağlar. Güçlü yeni nesil dizileme platformları ile birleştirilmesi sonucu, miR-Seq miRNA biyoloji çalışmaya vesile olmuştur. Ancak, oligonükleotid ligasyon adımlarla tarafından tanıtıldı önemli önyargılar doğru bir kantitasyon aracı olarak istihdam edilmesini miR-seg engellemiştir. Önceki çalışmalar, mevcut miR-Dizi yöntemleri önyargıları genellikle bazı miRNA&#39;ların 1,2 1.000 kata kadar hataları ile yanlış miRNA miktar yol açtığını göstermektedir. RNA ligasyonu ile kazandırılan bu önyargıları gidermek için, biz de 3 &#39;ve 5&#39; ligasyon adımlar için% 95&#39;in üzerinde ligasyonu verimliliği ile sonuçlanan bir küçük RNA ligasyonu yöntemi geliştirdik. Bu im Kıyaslamasürekli beklenen değerden az iki kat sapmayla numaraları okur verir, eşit molar veya farklı olarak karışık sentetik miRNA&#39;lar kullanarak kitaplık inşaat yöntemi olduğunu kanıtladı. Ayrıca, bu yüksek verimli miR-Dizi yöntem in vivo toplam RNA örneklerinde 2 doğru genom miRNA profilleme izin verir.

Yukarıdaki yöntemi için beklenen sonuçlar, ilk (Şekil 2) Mde RNA ligaz ile PCP tabi tutuldu DNA oligonükleotidin büyüklüğünde tek bir nükleotid vardiya (artış) gözlenmesi gerekir. 3 &#39;bağlanmasından sonra, akrilamid jel görselleştirme (bakınız Şekil 3), jel, 100-300 nükleotid bölgesinde barizdir net, yüksek molekül ağırlıklı bant gösterir. Bu kullanılan toplam RNA numunesi yüksek kalitede olduğunu gösterir (bozulmuş değil). İkinci olarak...

Watch this Scientific Journal Video about Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing at JoVE.com

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Yüksek Verim Dizilimine tarafından MicroRNA ölçümü için Küçük RNA molekülleri, yüksek Verimli ligasyonu

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

highly-efficient-ligation-small-rna-molecules-for-microrna

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

11.8K Görüntüleme.  University of Colorado, Boulder. MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs. 

Video: Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the research and pharmaceutical communities. To study miRNAs, it is essential that the quantification of microRNA levels is accurate and robust. By comparing wild-type to small RNA deficient mouse embryonic stem cells (mESC), we revealed a lack of accuracy and robustness in previous published multiplex qRT-PCR techniques. Here, we describe an optimized method, including purifying away excessive primers from previous multiplex steps before singleplex real time detection, which dramatically increases the accuracy and robustness of the technique. Furthermore, we explain how performing the technique on a microfluidic chip at nanoliter volumes significantly reduces reagent costs and permits time effective high throughput miRNA expression profiling.

Here we describe an optimized multiplex reverse transcriptase quantitative PCR (qRT-PCR) protocol in combination with a microfluidic platform as a cost and time effective high-throughput screening tool for microRNA (miRNA) expression levels, especially when working with limited amounts of sample.

Yüksek Verimli MicroRNA Profil: Optimize edilmiş, Multiplex QRT-PCR Fluidigm Dinamik ArrayTM IFCS Nanoliter Ölçeğinde

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Biyomühendislik

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in disease states and provide therapeutic targets and biomarkers. Here, we detail how to accurately quantify microRNAs. Briefly, this method describes isolating microRNAs, ligating them to adaptors suitable for high-throughput sequencing, amplifying the final products, and preparing a sample library. Then, we explain how to align the obtained sequencing reads to microRNA hairpins, and quantify, normalize, and calculate their differential expression. Versatile and robust, this combined experimental workflow and bioinformatic analysis enables users to begin with tissue extraction and finish with microRNA quantification.

Here, we describe a step-by-step strategy for isolating small RNAs, enriching for microRNAs, and preparing samples for high-throughput sequencing. We then describe how to process sequence reads and align them to microRNAs, using open source tools.

MikroRNA'ları Yalıtmak ve Sıralamak ve Açık Kaynak Araçlarını Kullanarak Analiz Etmek Için Komple Bir Boru Hattı

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

Genetik

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as plant microRNAs (miRNAs) carry a 2&#39;-O-methyl (2&#39;-OMe) modification at their 3&#39;&#160;terminal nucleotide. This modification adds another difficulty as it inhibits 3&#39;&#160;adapter ligation. We previously demonstrated that modified versions of the &#39;TruSeq (TS)&#39;&#160;protocol have less bias and an improved detection of 2&#39;-OMe RNAs. Here we describe in detail protocol &#39;TS5&#39;, which showed the best overall performance. TS5 can be followed either using homemade reagents or reagents from the TS kit, with equal performance.

We present a detailed small RNA library reparation protocol with less bias than standard methods and an increased sensitivity for 2&#39;-O-methyl RNAs. This protocol can be followed using homemade reagents to save cost or using kits for convenience.

Küçük RNA-seq iyileştirilmesi: Daha Az Önyargı ve 2'-O-Metil RNA'ların Daha İyi Tespiti

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome by identifying their molecular partners, DNA, proteins and/or RNAs. The latter can interact with lncRNA through networks involving proteins, but they can also be engaged in direct RNA/RNA interactions. We, therefore, developed an easy-to-use RNA pull-down procedure that allowed identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a lncRNA using psoralen, a molecule that cross-links only RNA/RNA interactions. Bioinformatics modeling of the lncRNA secondary structure allowed the selection of several specific antisense DNA oligonucleotide probes with a strong affinity for regions displaying a low probability of internal base pairing. Since the specific probes that were designed targeted accessible regions throughout the length of the lncRNA, the RNA-interaction zones could be delineated in the sequence of the lncRNA. When coupled with a high throughput RNA sequencing, this protocol can be used for the whole direct RNA interactome studies of a lncRNA of interest.

<meta charset="utf8"></head><body>Kodlamayan Uzun RNA ile Doğrudan RNA-RNA Etkileşiminde Bulunan RNA'ların Tanımlanması

An easy-to-use RNA pull-down protocol is designed for the identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a long non-coding RNA. The protocol uses psoralen as a fixative to cross-link only RNA/RNA interactions and provides the whole direct RNA interactome of a long non-coding RNA when coupled with RNA sequencing.

Kodlamayan Uzun RNA ile Doğrudan RNA-RNA Etkileşiminde Bulunan RNA'ların Tanımlanması

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and animals. Most miRNAs act as negative switches of gene expression targeting key genes. In plants, primary miRNAs (pri-miRNAs) transcripts are generated by RNA polymerase II, and they form varying lengths of stable stem-loop structures called pre-miRNAs. An endonuclease, Dicer-like1, processes the pre-miRNAs into miRNA-miRNA* duplexes. One of the strands from miRNA-miRNA* duplex is selected and loaded onto Argonaute 1 protein or its homologs to mediate the cleavage of target mRNAs. Although miRNAs are key signaling molecules, their detection is often carried out by less than optimal PCR-based methods instead of a sensitive northern blot analysis. We describe a simple, reliable, and extremely sensitive northern method that is ideal for the quantification of miRNA levels with very high sensitivity, literally from any plant tissue. Additionally, this method can be used to confirm the size, stability and the abundance of miRNAs and their precursors.

This method demonstrates use of the northern hybridization technique to detect miRNAs from total RNA extract.

Bitki MikroRNAlarının Saptanması ve Ölçülmesi için RNA Leke Analizi

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Biyokimya

AQRNA-seq Kullanarak tRNA Dinamiklerini Analiz Etme

AQRNA-seq for Quantifying Small RNAs

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate quantification of the pool of small RNAs. The AQRNA-seq library preparation procedure described here involves the use of custom-designed sequencing linkers and a step for reducing methylation RNA modifications that block reverse transcription processivity, which results in an increased yield of full-length cDNAs. In addition, a detailed implementation of the accompanying bioinformatics pipeline is presented. This demonstration of AQRNA-seq was conducted through a quantitative analysis of the 45 tRNAs in Mycobacterium bovis BCG harvested on 5 selected days across a 20-day time course of nutrient deprivation and 6 days of resuscitation. Ongoing efforts to improve the efficiency and rigor of AQRNA-seq will also be discussed here. This includes exploring methods to obviate gel purification for mitigating primer dimer issues after PCR amplification and to increase the proportion of full-length reads to enable more accurate read mapping. Future enhancements to AQRNA-seq will be focused on facilitating automation and high-throughput implementation of this technology for quantifying all small RNA species in cell and tissue samples from diverse organisms.

Yazar Spotlight: Küçük RNA'ların Haritalanmasında ve Protein Translasyon Mekanizmalarının Çözülmesinde AQRNA-seq Rolü

Absolute quantification RNA sequencing (AQRNA-seq) is a technology developed to quantify the landscape of all small RNAs in biological mixtures. Here, both the library preparation and data processing steps of AQRNA-seq are demonstrated, quantifying changes in the transfer RNA (tRNA) pool in Mycobacterium bovis BCG during starvation-induced dormancy.

Küçük RNA'ları Ölçmek için AQRNA-seq

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Yüksek Verim Dizilimine tarafından MicroRNA ölçümü için Küçük RNA molekülleri, yüksek Verimli ligasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Yüksek Verimli MicroRNA Profil: Optimize edilmiş, Multiplex QRT-PCR Fluidigm Dinamik ArrayTM IFCS Nanoliter Ölçeğinde

MikroRNA'ları Yalıtmak ve Sıralamak ve Açık Kaynak Araçlarını Kullanarak Analiz Etmek Için Komple Bir Boru Hattı

Küçük RNA-seq iyileştirilmesi: Daha Az Önyargı ve 2'-O-Metil RNA'ların Daha İyi Tespiti

Kodlamayan Uzun RNA ile Doğrudan RNA-RNA Etkileşiminde Bulunan RNA'ların Tanımlanması

Kodlamayan Uzun RNA ile Doğrudan RNA-RNA Etkileşiminde Bulunan RNA'ların Tanımlanması

Bitki MikroRNAlarının Saptanması ve Ölçülmesi için RNA Leke Analizi

Küçük RNA'ları Ölçmek için AQRNA-seq

Küçük RNA'ları Ölçmek için AQRNA-seq

Küçük RNA'ları Ölçmek için AQRNA-seq

İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)