Name: highly efficient ligation of small rna molecules for microrna quantitation by high-throughput sequencing
Uploaded: 2014-11-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
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The authors would like to thank members of the Yi laboratory especially Zhaojie Zhang for fruitful discussions regarding linker design and ligation efficiencies, as well as the American Cancer Society for supporting this work through a postdoctoral fellowship (#125209) to J.E.L. Research reported in this publication was also supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under Award Number R01AR059697 (to R.Y.) and a research grant from the Linda Crnic Institute for Down Syndrome. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

注：それは全体の手順の際にRNaseフリーの条件を維持するために重要である。 3 &#39;リンカーの1アデニル化<ol><li>ヌクレアーゼフリーのH 2 O中に100μMまでの3 &#39;ライゲーション反応のために設計されたDNAオリゴヌクレオチドを希釈 注：オリゴヌクレオチドは、5 &#39;リン酸基、5位の​​無作為化ジヌクレオチド&#39;末端および3 &#39;デオキシシトシンを持つ必要があります。 5アデニル10 &#39;リン酸基は、効率的な5 M番目の酵素の要件である」。リン酸塩は、ポリヌクレオチドキナーゼを有するオリゴヌクレオチドの前処理によって追加された、または直接変更して注文することができる。 5 &#39;末端にランダム化されたヌクレオチドは、特定の最終端が他の6を介して反応を接合するためのRNAリガーゼは、展示順序設定を最小にするために重要である。 3オリゴtの &#39;末端ジデオキシシトシン3にブロッキング要素を配置&#39;Oその後の連結工程の間のリンカー-リンカーコンカテマーの形成を阻害し、ライゲーション反応を11 3 &#39;の端部に形成されたmiRNAのリンカー分子の末端を「ブロックする働きをする。次のように公平なのmiR-配列方法のために選択されたオリゴヌクレオチドリンカー配列は、次のとおりです。5&#39;PO 4 NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3」。 </li><li> 200 pmolの3 &#39;リンカーオリゴヌクレオチド、4μlの10倍の5&#39;のDNAアデニル化バッファー、4μlの1mMのATP、4μlのM番目の RNAリガーゼ、ヌクレアーゼフリーのH 2 O を 40μlの最終体積に次のアデニル化反応を組み立てます。 </li><li> 1時間65℃で反応をインキュベートする。 5分間85℃に加熱して反応を停止。 </li><li>残留ATPを除去し、将来の反応において予期せぬライゲーションを防ぐために、100％エタノールおよび10 M酢酸アンモニウム1/3容積の2.5倍量を添加することによってアデニル化リンカーを沈殿させる。 <ol><li>簡単に言えば、アルを混ぜるcohol、塩、および20分間、4℃で微量フルスピードで回転して均一にオリゴ溶液（〜15000×gで）。アデニル化オリゴの50〜100μMを得るためにヌクレアーゼフリーのH 2 O を適切な容量の70％エタノール、空気乾燥、および再懸濁でペレットを洗浄。 </li></ol></li><li> 18％ポリアクリルアミドゲルを実行することにより、アデニル化を確認します。 <ol><li> 6.3グラムの尿素、40％のアクリルアミドの6.75ミリリットル、および10倍TBEの1.5ミリリットル：一緒に以下を混合することによりゲルを準備します。 H 2 O 15ミリリットルを追加します。 </li><li>尿素が完全に溶解するまで混合し、過硫酸アンモニウム（APS）および15μlのtetramethlyethylenediamine（TEMED）（w / v）の150μlの10％を加える。 </li><li>ゲルを1×TBEを室温でランニング緩衝液でゲル幅の24 V / cm 2で30分間、予備泳動を設定した後。ランニング緩衝液で30分間が起動したらフラッシュ井戸。 </li><li>とアデニル化オリゴヌクレオチドおよびRNAローディングバッファー（95％（v / v）のホルムアミドを、変性2倍の等容積の5ピコモルを混ぜる0.02％SDS、0.02％ブロモフェノールブルー（w / vの）、0.01％（w / vの）（w / v）のキシレンシアノール、1.0mMのEDTA）、熱簡単に75℃、そして氷上で冷却した凍結した。ゲルのウェルにサンプル全体を分注する。また、非アデニル化制御の同一の量、及び低分子量サイズ標準を含む。 </li><li>ブロモフェノールブルーがゲルの底部への道の3/4になるまで、24 V / cmのでゲルを実行します。 1×TBE中の1x SYBR-金溶液と装置、ポストステインゲルを分解し、UV-イルミボックス（ 図2）上で可視化する。 注： &quot;は入力RNA」コントロールは、入力RNAのサンプルと比較して、PCR産物を多量に得られていない場合、ゲルは、上記と同様にアデニル化オリゴを精製する。 </li></ol></li></ol> 2.リンカライゲーションmiRNAの3 &#39;末端に<ol><li> 3 &#39;ライゲーション<ol><li> （w / v）のPEG 8000、0.5＆1.0μlの50％：リストの順に氷上で次のコンポーネントを組み立てる＃956; lの10倍のRNAリガーゼ緩衝液（500mMのトリス-HCl pH7.5で、100mMのMgCl 2を 、10mMのDTT）、1.0μlを、3 &#39;リンカー（100μM）、0.5μlのRNアーゼ阻害剤、0.5〜8.0μgのトータルRNAをアデニル化0.5μlのT4 RNAリガーゼ2、5μlの最終体積にヌクレアーゼフリーのH 2 Oを。 </li><li>解決策が原因で一度完全に混合し、PEG 8000の高濃度の渦に粘性が高すぎるようにピペッティングすることによって反応を混ぜ、加熱蓋付きサーマルサイクラーで反応を置く。 16℃にブロックを設定し、4時間インキュベートする。 注：反応は、ライゲーション効率の損失なしに20μlの最終容量にスケールアップすることができる。本質的に同一のライゲーション効率を得るために、周囲温度でまたは一晩、4℃で4時間反応させる。 </li></ol></li><li>ゲル精製<ol><li> 3 &#39;連結後、2×RNAローディングバッファーを等量の反応混合する。 5分間70℃に加熱し、氷上でクールなスナップ。 </li&gt; <li> PAGE精製のために15％ポリアクリルアミドゲル上でサンプルを実行する。 <ol><li>ステップ1.5で前に説明したのと同様の方法で、7 M尿素を含む15％ポリアクリルアミドゲルを調製。 </li><li>少なくとも30分間ゲル幅の24 V / cmのでゲルを事前に実行します。電源、フラッシュ井戸、負荷サンプルをオフにして、実行前と同じ電圧でゲルを実行します。 </li><li>ブロモフェノールブルーがちょうどゲルを出るまで、サンプルをロードして、ページを実行します。所望の生成物をキシレンシアの近くに移行されます。 </li></ol></li></ol></li><li>染色、可視化、および切除<ol><li> 15分間の1xランニングバッファー（TBE）、1X SYBR-金、岩クリーントレイにゲル装置と場所ゲルを分解します。 </li><li>染色皿からゲルを取り出し、清潔なラップで覆われたUVトランスイルミボックスを視覚化する。ライゲーション産物は、長さが約45ヌクレオチドであるべきである。 </li><li>きれいなrazoでライゲーション産物を含む領域を切り出し0.5ミリリットルのマイクロ遠心管におけるrブレードと場所。 </li></ol></li><li>生成物の単離と降水<ol><li>ピアス30Gの針を0.5 mlマイクロチューブの底と第二クリーンで低リテンションにピアスチューブを配置し、1.5ミリリットルマイクロチューブ。 〜15000×gで5分間遠心する。 </li><li>視覚的に全体のゲル切片は、内管の穴を通って移動したことを確認します。必要であれば、近い穴にいくつかのゲルフラグメントをプッシュするクリーンなピペットチップを使用しています。 </li><li>空の0.5ミリリットルチューブを捨てるとアクリルアミドスラリーに高塩カラムバッファー（HSCB 400のNaCl、25mMのトリス塩酸pH7.5で、0.1％SDS）400μlのを追加します。 4℃で一晩ロック管（群）。 </li><li>ワイドボアピペットチップを用いて0.22ミクロンの酢酸セルローススピンカラムにスラリーを移す。離れアクリルアミドゲルマトリックスからすべての液体を収集する〜15000×gで室温で3分間遠心。 </li><li>クリーンで低保持力に液体を移す、1.5ミリリットルチューブ含める20 mg / mlのグリコーゲンを1μlる。等量のイソプロパノールおよび1/10体積の酢酸ナトリウムを加える。チューブを数回反転させることによって溶液を混合し、20分間℃の冷凍庫-80℃で沈殿する。 </li><li> 20分間、4℃でフルスピードで遠心機は、核酸をペレット化する。上清を除去し、70％エタノールで洗う。室温で10分間空気乾燥したペレットを、5 &#39;ライゲーション工程に直接進む。 </li></ol></li></ol>リンカハイブリッド3.リンカーライゲーション5 &#39;へのmiRNA-3の終わり」 <ol><li>ペレット化核酸に、次のコンポーネントを追加します。2μlのPEG 8000（50％w / v）の、0.5μlの10倍のRNAリガーゼバッファー、0.5μlのATP（10mM）を、0.5μlのNN-RNAオリゴ（100μM）、およびH 4μlの最終体積に2 Oの。 NOTE：5&#39;-反転ジデオキシTCUACAGUCCGACGAUCNN3は以下 &#39;および製造業者によってHPLCで精製したように、「NN-RNAオリゴ&#39;の組成物である。 </li><li>ミックス繰り返し上下にピペッティングすることによって、このサンプル。ペレットが完全に再可溶化されたことを確認するためにいくつかの時間（最大5分）のためにこれを行う。再可溶化は、問題がある場合は、37℃にサンプル短時間（3~5分）を加熱し、混合するためのピペッティングを再開する。 </li><li> RNase阻害剤およびT4 RNAリガーゼ1（5台）の1：1混合ペレットを溶液中に帰ってきたら、1の1μLを含むクリーンなPCRチューブに内容を転送。再び上下にピペッティングして混ぜる。 </li><li> 4時間、37℃でサーマルサイクラーで反応をインキュベートする。 cDNA合成に即座に進みます。 </li></ol> 4.逆転写/ cDNA合成<ol><li> 5に次のコンポーネントを追加 &#39;ライゲーション反応：2μlの5×RT緩衝液、0.75μlの100 mMのDTT、1μlのイルミナのRTプライマー5&#39;-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#39;（1μM）、および0.5μlのdNTP類（10 mM）を。 </li><li> 5分間65℃にピペッティングし、熱で混ぜる。そして、ゆっくりとベンチtに冷やすオペアンプ。 </li><li>反応物を氷の上で室温、場所管に冷却し、逆転写酵素およびRNase阻害剤のそれぞれ0.5μlを添加したら。メーカーの説明書に示された伸長工程のためのサーマルサイクラー中でピペッティングと場所によって混ぜる。 </li><li>一度15μlの最大のcDNAライブラリの最終容量を持って来るためにヌクレアーゼフリーのH 2 O 5μlを添加完了。 </li></ol> 5.ライブラリの準備<ol><li>インデクシングPCRに、氷上で以下の反応を組み立てる：6μlの5倍のPhusionバッファー、1μlのdNTPを（10 mM）を、0.9μlのDMSO、0.75μlの5 &#39;プライマー（25μM）、0.75μlの3&#39;プライマー（25μM）を、 3μlのcDNAライブラリー（入力の量に応じて可変濃度）、0.5μlののPhusionポリメラーゼ（1単位）、ヌクレアーゼフリーのH 2 O を 30μlの最終体積に。テンプレートとのシーケンシングプラットフォームとの互換性を確保するためのプライマー配列を選択してください選択肢。 <ol><li>最初の4サイクルの間、3分間98℃での初期変性、15秒間98℃の変性、15秒間50℃でのアニーリング、15秒間72℃、延長：以下の設定でPCR反応を実行。 NOTE：入力材料の量に依存して、総PCRサイクル数を変化させる。典型的に、総RNAの1-2μgの入力のために、合計13回のPCRサイクルは、miR-配列のライブラリーを作製するのに十分である。 </li><li>アニーリングおよび伸長のサイクルを合わせて30秒の変性、70℃で実施される二段階の方法で、 例えばその後のサイクル、サイクル5-12を行うには、再び15秒間98℃である。 注：反応容量は、PCRプログラムを一時停止可能にし、所望の生成物の出現をモニターするために予め定められたサイクル数での10μlのアリコートを除去し、30μlのである。典型的には、サイクル10、13、及び16は、全RNA試料からの試験のために選択される。 </li></ol></li><li>準備する40％アクリルアミド2mlの10×TBEを1ml、及びH 2 O 10 mlまで混合することによって、8％非変性アクリルアミドゲル。次いで10％のAPSを100μlとTEMED10μlのを追加します。ゲルを注ぎ、セットしてみましょう。 <ol><li> 30分間のゲル幅の12 V / cmのでゲルを事前に実行します。 ·フラッシュ井戸。 （mMのEDTA、20mMトリス塩酸pH8.0で、0.1％（）​​はw / vの66、15％のフィコール-400、SDS、0.01％（v）のブロモフェノールブルー/ w）の10倍のローディングバッファーの1μlを加え、10μlのを追加寸法×15ミリメートル×1ミリメートル5ミリメートルの各ウェルにサンプル。一般的に、各ウェルは、サンプルの30μlにまで読み込むことができます。ブロモフェノールブルー色素がちょうどゲルの底部がなくなるまで1×TBE緩衝液中のゲル幅の10 V / cmのでサンプルゲルを実行します。 </li><li>ステップ2.3で説明したようにゲルを染色して可視化する。 </li><li> 146塩基対のバンドを切除し、セクション2.4に記載されているものと同様の方法でHSCB 0.25mlの中で一晩溶出する。等量のイソプロパノールおよび1/10体積の酢酸ナトリウムでDNAを沈殿。 70％Eの洗浄ペレットTE緩衝液中thanol再懸濁。 </li><li>製造業者の推奨に従ってピコグリーンを使ってライブラリを定量化する。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-ligase-dependent+biases+in+miRNA+representation+in+deep-sequenced+small+RNA+cDNA+libraries.">RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries.</a> RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).</li><li>Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+RNA+cloning+enables+accurate+quantification+of+miRNA+expression+by+deep+sequencing.">High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing.</a> Genome Biology. 14 (10), 109 (2013).</li><li>Consortium, T. E. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+Ago2+binding+sites+from+mouse+embryonic+stem+cells+with+and+without+mature+microRNAs.">Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

本明細書中に記載される方法論は、ライゲーション効率を最大化するためにいくつかの重要な変数の使用、すなわち、高いPEG濃度の、ランダム化されたリンカーの使用、およびリンカー2,6,9-高濃度になる。このアプローチは、総RNAサンプル2から確実に定量的なシーケンシングライブラリーを可能にする。我々は、入力されたRNAの複数の滴定を実施しており、先行する方法は1-...

ハイスループットシークエンシングに基づく方法は、広く大きく、生物系3,4の分子の複雑さの理解を拡大近年、多くの生物学的サンプルに適用されている。しかし、ハイスループット配列決定のためのRNA試料の調製は、多くの場合、これらの強力な技術の潜在的な有用性を制限し、採用手法に固有の固有のバイアスを与える。これらの方法は、特定のバイアスは十分にライゲーションベースの、小RNAライブラリ調製物を1,2,5,6-ために文書化されている。これらのバイアスはがち乱暴変数と誤差シーケンシングデータからのmiRNAの存在量の推定を行う、等モル合成miRNAの番号を読み込み中1000倍のばらつきが生じる。 ファージ由来のT4 RNAリガーゼの特性に焦点を当てた研究では、酵素は、ハイスループットシークエンシング実験においてバイアスされたライブラリとして現れるヌクレオチドベースのプリファレンス7を示すことを報告している<s1,2,8&gt;まで。 RNAリガーゼによって与えられるバイアスを最小にするために、多数の戦略が採用されてきた。高分子、9混雑ライゲーション部位6の近位にあるアダプタのヌクレオチド配列をランダム化し、ライゲーションアダプタ2の高濃度を用いる。これら三つのアプローチの組み合わせを通して、私たちは、ハイスループットシークエンシング（ 図1）のための互換性の低分子RNA図書館に関する調製するためのワークフローを開発しました。現在のプロトコルと私たちの最適化された方法との間の直接の比較のために、私たちの最近の報告書2を参照してください。この最適化された方法は、両方の3 &#39;および5&#39;のステップで95％より高いライゲーション効率が得られ、合成および生物学的試料2からの小RNA分子の公正な連結を可能にする。

<table><tbody><tr><td>3&#039; Linker (5&#039; phosphorylated, 3&#039; blocked)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td></td></tr><tr><td>5&#039; Linker</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>5&#039; blocked, HPLC purified</td></tr><tr><td>T4RNL2 (1-249 K227Q)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0351S</td><td>Specialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters</td></tr><tr><td>10x Ligation buffer (without ATP)</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0351S</td><td></td></tr><tr><td>10x Ligation buffer (with ATP)</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0204L</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene glycol (mol. Wt. 8,000)</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality.</td></tr><tr><td>T4RNL1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III RT kit</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Phusion PCR kit</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Illumina RP1 primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Sequence information available from Illumina</td></tr><tr><td>Illumina RT primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Sequence information available from Illumina</td></tr><tr><td>Illumina index primer(s)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td>Sequence information available from Illumina</td></tr><tr><td>40% Acrylamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP14081</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethyethylenediamine (TEMED)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>2x Denaturing RNA loading buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>Included with M0351S</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>SpinX Centricon tubes</td><td>Costar</td><td>CLS8161</td><td></td></tr><tr><td>Low retention microfuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>Adenylation kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2610L</td><td></td></tr></tbody></table>

highly efficient ligation of small rna molecules for microrna quantitation by high-throughput sequencing

のmiRNAのクローニングおよびハイスループットシークエンシング、のmiR-配列と呼ばれるが、一塩基分解能でmiRNAを定量化するためにトランスクリプトーム全体のアプローチとして単独で立っている。この技術は、miRNA分子の3 &#39;および5&#39;オリゴヌクレオチドアダプターを取り付けることによりmiRNAを捕捉し、 デノボ miRNAの検出を可能にする。強力な次世代シーケンシング·プラットフォームとのカップリング、のmiR-配列は、miRNA生物学の研究に尽力してきました。しかし、オリゴヌクレオチドライゲーション手順によって導入の重要なバイアスが正確な定量ツールとして採用されてからは、miR-配列を妨げてきた。これまでの研究では、現在のmiR-のSeq法におけるバイアスはしばしばいくつかのmiRNA 1,2- 1,000倍までのエラーで不正確なmiRNA定量化につながることを実証している。 RNAライゲーションによって与えられるこれらのバイアスを解決するために、我々は両方の3 &#39;および5&#39;ライゲーションステップのため95％以上のライゲーション効率が得られる低分子RNAライゲーション法を開発した。このIMのベンチマーク一貫して期待値から2倍未満偏差の数値を読み取って得られ、等モルまたは差動で混合合成miRNAを使用してライブラリー構築法を証明した。さらに、この高効率のmiR-配列法は、 インビボでの総RNA試料2からの正確なゲノムワイドなmiRNAプロファイリングを可能にする。

先行する方法のため、予想される結果は、最初に第M RNAリガーゼによるアデニル化（ 図2）に供したDNAオリゴヌクレオチドのサイズの単一のヌクレオチドシフト（増加）の観察である必要があります。 3 &#39;ライゲーション後、アクリルアミドゲルの視覚化は、ゲルの100-300ヌクレオチド領域において明らか鋭い高分子量のバンド（ 図3参照）を示している。これ...

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Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

ハイスループットシークエンシングによりマイクロRNA定量のための低分子RNA分子の高効率ライゲーション

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

11.8K ビュー.  University of Colorado, Boulder. MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs. 

ビデオ: Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most interestingly, sRNAs are also found outside of cells and are stably present in all biological fluids. As such, extracellular sRNAs represent a novel class of disease biomarkers and are likely involved in cell signaling and intercellular communication networks. To assess their potential as biomarkers, sRNAs can be quantified in plasma, urine, and other fluids. Nevertheless, to fully understand the impact of extracellular sRNAs as endocrine signals, it is important to determine which carriers are transporting and protecting them in biological fluids (e.g., plasma), which cells and tissues contribute to extracellular sRNA pools, and cells and tissues capable of accepting and utilizing extracellular sRNA. To accomplish these goals, it is critical to isolate highly pure populations of extracellular carriers for sRNA profiling and quantification. We have previously demonstrated that lipoproteins, particularly high-density lipoproteins (HDL), transport functional microRNAs (miRNA) between cells and HDL-miRNAs are significantly altered in disease. Here, we detail a new protocol that utilizes tandem HDL isolation with density-gradient ultracentrifugation (DGUC) and fast-protein-liquid chromatography (FPLC) to obtain highly pure HDL for downstream profiling and quantification of all sRNAs, including miRNAs, using both high-throughput sequencing and real-time PCR approaches. This protocol will be a valuable resource for the investigation of sRNAs on HDL.

This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.

非コード小型RNA定量化のための高密度リポタンパク質の単離

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

生化学

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the research and pharmaceutical communities. To study miRNAs, it is essential that the quantification of microRNA levels is accurate and robust. By comparing wild-type to small RNA deficient mouse embryonic stem cells (mESC), we revealed a lack of accuracy and robustness in previous published multiplex qRT-PCR techniques. Here, we describe an optimized method, including purifying away excessive primers from previous multiplex steps before singleplex real time detection, which dramatically increases the accuracy and robustness of the technique. Furthermore, we explain how performing the technique on a microfluidic chip at nanoliter volumes significantly reduces reagent costs and permits time effective high throughput miRNA expression profiling.

Here we describe an optimized multiplex reverse transcriptase quantitative PCR (qRT-PCR) protocol in combination with a microfluidic platform as a cost and time effective high-throughput screening tool for microRNA (miRNA) expression levels, especially when working with limited amounts of sample.

ハイスループットマイクロRNAプロファイリング：最適化されたマルチプレックスフリューダイナミックArrayTMのIFCSでナノリッタースケールでの定量RT - PCR

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

生物工学

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in disease states and provide therapeutic targets and biomarkers. Here, we detail how to accurately quantify microRNAs. Briefly, this method describes isolating microRNAs, ligating them to adaptors suitable for high-throughput sequencing, amplifying the final products, and preparing a sample library. Then, we explain how to align the obtained sequencing reads to microRNA hairpins, and quantify, normalize, and calculate their differential expression. Versatile and robust, this combined experimental workflow and bioinformatic analysis enables users to begin with tissue extraction and finish with microRNA quantification.

Here, we describe a step-by-step strategy for isolating small RNAs, enriching for microRNAs, and preparing samples for high-throughput sequencing. We then describe how to process sequence reads and align them to microRNAs, using open source tools.

MicroRNAを分離およびシーケンシングし、オープンソースツールを使用してそれらを分析するための完全なパイプライン

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

遺伝学

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as plant microRNAs (miRNAs) carry a 2&#39;-O-methyl (2&#39;-OMe) modification at their 3&#39;&#160;terminal nucleotide. This modification adds another difficulty as it inhibits 3&#39;&#160;adapter ligation. We previously demonstrated that modified versions of the &#39;TruSeq (TS)&#39;&#160;protocol have less bias and an improved detection of 2&#39;-OMe RNAs. Here we describe in detail protocol &#39;TS5&#39;, which showed the best overall performance. TS5 can be followed either using homemade reagents or reagents from the TS kit, with equal performance.

We present a detailed small RNA library reparation protocol with less bias than standard methods and an increased sensitivity for 2&#39;-O-methyl RNAs. This protocol can be followed using homemade reagents to save cost or using kits for convenience.

小型RNA-seqの改善:バイアスの減少と2'-O-メチルRNAの検出の改善

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and animals. Most miRNAs act as negative switches of gene expression targeting key genes. In plants, primary miRNAs (pri-miRNAs) transcripts are generated by RNA polymerase II, and they form varying lengths of stable stem-loop structures called pre-miRNAs. An endonuclease, Dicer-like1, processes the pre-miRNAs into miRNA-miRNA* duplexes. One of the strands from miRNA-miRNA* duplex is selected and loaded onto Argonaute 1 protein or its homologs to mediate the cleavage of target mRNAs. Although miRNAs are key signaling molecules, their detection is often carried out by less than optimal PCR-based methods instead of a sensitive northern blot analysis. We describe a simple, reliable, and extremely sensitive northern method that is ideal for the quantification of miRNA levels with very high sensitivity, literally from any plant tissue. Additionally, this method can be used to confirm the size, stability and the abundance of miRNAs and their precursors.

This method demonstrates use of the northern hybridization technique to detect miRNAs from total RNA extract.

植物マイクロRNAの検出と定量のためのRNAブロット分析

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

AQRNA-seqを用いたtRNA動態の解析

AQRNA-seq for Quantifying Small RNAs

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate quantification of the pool of small RNAs. The AQRNA-seq library preparation procedure described here involves the use of custom-designed sequencing linkers and a step for reducing methylation RNA modifications that block reverse transcription processivity, which results in an increased yield of full-length cDNAs. In addition, a detailed implementation of the accompanying bioinformatics pipeline is presented. This demonstration of AQRNA-seq was conducted through a quantitative analysis of the 45 tRNAs in Mycobacterium bovis BCG harvested on 5 selected days across a 20-day time course of nutrient deprivation and 6 days of resuscitation. Ongoing efforts to improve the efficiency and rigor of AQRNA-seq will also be discussed here. This includes exploring methods to obviate gel purification for mitigating primer dimer issues after PCR amplification and to increase the proportion of full-length reads to enable more accurate read mapping. Future enhancements to AQRNA-seq will be focused on facilitating automation and high-throughput implementation of this technology for quantifying all small RNA species in cell and tissue samples from diverse organisms.

著者スポットライト:低分子RNAのマッピングとタンパク質翻訳メカニズムの解明におけるAQRNA-seqの役割

Absolute quantification RNA sequencing (AQRNA-seq) is a technology developed to quantify the landscape of all small RNAs in biological mixtures. Here, both the library preparation and data processing steps of AQRNA-seq are demonstrated, quantifying changes in the transfer RNA (tRNA) pool in Mycobacterium bovis BCG during starvation-induced dormancy.

低分子RNAの定量のためのAQRNA-seq

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

定量リアルタイムPCRを用いて脳脊髄液マイクロRNAプロファイリング

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

医学

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs during early development are technically challenging due to the limiting cell number. Moreover, many approaches require a miRNA of interest to be defined in assays such as northern blotting, microarray, and qPCR. Therefore, the expression of many miRNAs and their isoforms have not been studied during early development. Here, we demonstrate a protocol for small RNA sequencing of sorted cells from early mouse embryos to enable relatively unbiased profiling of miRNAs in early populations of neural crest cells. We overcome the challenges of low cell input and size selection during library preparation using amplification and gel-based purification. We identify embryonic age as a variable accounting for variation between replicates and stage-matched mouse embryos must be used to accurately profile miRNAs in biological replicates. Our results suggest that this method can be broadly applied to profile the expression of miRNAs from other lineages of cells. In summary, this protocol can be used to study how miRNAs regulate developmental programs in different cell lineages of the early mouse embryo.

We describe a technique for profiling microRNAs in early mouse embryos. This protocol overcomes the challenge of low cell input and small RNA enrichment. This assay can be used to analyze changes in miRNA expression over time in different cell lineages of the early mouse embryo.

初期マウス胚からのシーケンシングのための小型RNAライブラリーの調製

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

ハイスループットシークエンシングによりマイクロRNA定量のための低分子RNA分子の高効率ライゲーション

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非コード小型RNA定量化のための高密度リポタンパク質の単離

ハイスループットマイクロRNAプロファイリング：最適化されたマルチプレックスフリューダイナミックArrayTMのIFCSでナノリッタースケールでの定量RT - PCR

MicroRNAを分離およびシーケンシングし、オープンソースツールを使用してそれらを分析するための完全なパイプライン

小型RNA-seqの改善:バイアスの減少と2'-O-メチルRNAの検出の改善

植物マイクロRNAの検出と定量のためのRNAブロット分析

低分子RNAの定量のためのAQRNA-seq

低分子RNAの定量のためのAQRNA-seq

低分子RNAの定量のためのAQRNA-seq

定量リアルタイムPCRを用いて脳脊髄液マイクロRNAプロファイリング

初期マウス胚からのシーケンシングのための小型RNAライブラリーの調製