Bu çalışma Gazi İşleri US Department Merit Ödülü tarafından desteklenen ve bir NIH RW için R01CA138528 hibe edildi.

Tanım yapılarından oluşan 1. Hazırlık <ol><li> Protokolü başlamadan önce, bir N-terminal epitop (Myc veya HA) ve bakteriyel bir hücreden yüksek düzeyde protein ekspresyonu ve saflaştırılması için alt-tabaka çerçeve-içi glutation-S-transferaz (GST) ile bir memeli ifade vektörlerine klonlanabilir PRMTs Standart moleküler biyolojik teknikler kullanılarak lizatlarının. </li></ol> PRMTs 2. saflaştırılması <ol><li> İnsan bronş epitel hücrelerinin (Beas2B) sağlamak için, 100 mm kültür kaplarına kullanın. Passage hücreler her 3 gün ve onları izdiham büyümeye izin vermeyin. </li><li> Transfeksiyondan bir önceki gün, 100 mm kültür çanağı içinde 10 ml kültür ortamı içinde 7.5 x 10 5 hücre tohum. Girdap hücreler eşit olarak dağıtmak, ve 5% CO2 nemlendirilmiş inkübatör içinde 37 ° C&#39;de inkübe etmek. </li><li> Ertesi gün, medya aspire ve serum ve antibiyotik olmadan kültür ortamı 5 ml ekleyin. Girdap ve orta aspire. Bu adımı tekrarlayın biridaha fazla zaman, ve son olarak da, serum / antibiyotik içermeyen ortamdan 5 ml ilave edilir ve transfeksiyondan devam edin. </li><li> Steril 1.5 ml&#39;lik plastik bir santrifüj tüpüne, serum barındırmayan ortam içinde 750 ul plazmit DNA&#39;nın 6 ug seyreltin. </li><li> Başka bir 1.5 ml&#39;lik plastik bir santrifüj tüpü, serum barındırmayan ortam içinde 750 ul transfeksiyon tepkin maddesi 30 ul seyreltin. </li><li> Seyreltilmiş DNA (aşama 2.4) içeren tüp seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi çözeltisi (adım 2.5) aktarın. Pipetleme ve birkaç kez yavaşça karıştırın. </li><li> 15 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin transfeksiyon karışımı. </li><li> 15 dakika sonra, hücreler üzerine yavaşça transfeksiyon karışımı pipetle, girdap eşit karıştırın ve 5% CO2 nemlendirilmiş inkübatör içinde 37 ° C&#39;de inkübe etmek. </li><li> 3 saat sonra hücreler transfeksiyon karışımları içeren ortamın aspire. Serum ve antibiyotik ile desteklenmiş taze hücre kültür ortamı ilave edin. </li><li> % 5 nemlendirilmiş CO2 içinde 37 ° C&#39;de inkübe48 saat boyunca kuluçka makinesi. </li><li> 48 saat sonra liziz tamponu 1 ml hücreler lize edildi (1 x fosfat tamponlu tuzlu su,% 1 Nonidet P-40,% 0.5 sodyum deoksikolat,% 0.1 sodyum dodesil sülfat ve 1 ug / ml fenilmetil sülfonil fluorür). Hücre kaldırıcı plastik bir santrifüj tüpüne lisatlan toplayın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe lizatları. </li><li> Hücre lizatları artıklardan temizlemek için bir masaüstü santrifüj ile 10 dakika boyunca 15,000 x g&#39;de santrifüjleyin lizatları. [* Oldukça metilasyon analizi için enzimlerin saflaştırılması geçmeden önce bir anti-HA antikorlarına birleştirilmesi ile lizatları, bir alikotunun imünoblotlama ile HA-PRMT1 ekspresyonunu doğrulamak için tavsiye edilir.] </li><li> PRMTs saflaştırılması için, fosfat tamponlu tuzlu su içinde bir anti-HA afinite matrisi 50:50 süspansiyonu 30 ul (PBS) ile hücre lizatlarının 3 mg inkübe ve bir tüp rotatör içinde 4 ° C&#39;de gece boyunca döner. </li><li> Bir sonraki gün, toplamak için 2 dakika boyunca bir tezgah üstü santrifüj ile 14,000 x g&#39;de tüpler dönmeyeboncuklar. Süpernatant atılır ve 2 için 14,000 x g&#39;de santrifüj ile yıkaması ve ardından taneler [20 mM Tris (pH 8.0), 150 mM NaCI, 5 mM EDTA ve% 1 Triton X-100] her RIPA tamponunda, 1 ml ile 3 kez yıkayın Min. Üçüncü yıkamadan sonra, metilasyona tamponu ile bir kez 100 ul boncuk yıkama (50 mM Tris pH 8.5, 20 mM KCI, 10 mM MgCI2, 1 mM β-merkaptoetanol, 100 mM sükroz). Santrifüj işleminden sonra, süpernatant kaldırmak. Hareketsizleştirilmiş PRMTs ihtiva eden haplar, metilasyon deneyinde kullanılmak üzere hazırdır. [* Oldukça metilasyon tahlilde hemen hareketsiz PRMTs kullanmanız tavsiye edilir.] </li></ol> Yüzey 3. saflaştırılması <ol><li> GST-G3BP1 tek bir koloni 100 ug / ml ampisilin içeren Luria-Bertani (LB) aracı maddesinde 5 ml BL21 transforme inoküle. 250 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de bir gece boyunca kültürler büyütün. </li><li> Bir sonraki gün, taze LB aracı ve Kontrol 50 ml kültür, gece boyunca aktarmainue (yaklaşık 2 saat sürer) bir OD 0,5-0,7 600 büyümeye. </li><li> OD 600 0,5-0,7 ulaştığında, 250 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de ek bir 4 saat daha kültüre 1 mM nihai konsantrasyona kadar izopropil-β-D-tiyogalaktozid (IPTG) ekleyin ve devam edin. </li><li> 10 dakika boyunca 1500 x g&#39;de santrifüj ile hücreler hasat ve -80 ° C &#39;de GST saflaştırılması veya deposu için pelet işler. </li><li> Liziz tamponu, 5 ml bakteriyel pelet yeniden askıya (proteaz inhibitörleri, lizozim, 100 ug / ml ile 1 x PBS&#39;de% 0.1 Triton X-100) ve 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe lizatları. Bu zamanda bakteriyel lizatlar genomik DNA&#39;nın serbest bırakılması için bulanık ve yapışkan görünür. </li><li> Sonikasyon ile genomik DNA (1 sn% 30 lik bir genlik ile her biri 10 palslarının) kayma. </li><li> 10 dakika boyunca 15,000 x g&#39;de santrifüj ile lizatları temizleyin ve 15 ml&#39;lik bir tüp için berrak bir aktif madde aktarın. Süpernatant değil temizse Santrifüj tekrarlayıngasyon süreci bir kez daha. </li><li> Bununla birlikte, buz gibi soğuk PBS ile iki kez GST-sefaroz boncuklar yıkama ve PBS GST-sefarozun 50:50 süspansiyon elde etmek. Temizlenmiş, bakteri hücre lizat GST-sefaroz süspansiyonu 200 ul ilave edin ve 1 saat boyunca 4 ° C &#39;de döner. </li><li> 1 saat sonra, boncuk toplamak için 3 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüj tüpleri. Boncuklar buz gibi soğuk PBS ile 3 kez yıkayın. </li><li> Son yıkamadan sonra, elüsyon tamponu (50 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCI, 30 mM glutatyon) 100 ul boncuk tekrar süspansiyon ve 10 dakika boyunca 4 ° C &#39;de döner. </li><li> 2 dakika boyunca 15,000 x g&#39;de santrifüj tüpleri ve başka bir plastik bir santrifüj tüpü içine, saflaştırılmış proteini ihtiva eden üst sıvıyı aktarır. Saflaştırılmış protein konsantrasyonunu tahmin etmek için, sığır serumu albümini (BSA) ile birlikte bilinen miktarlarda saflaştırılmış proteinin 5 ul SDS poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile analiz gerçekleştirmek. </li></ol> 4. Metilasyon Deneyi NOT: radyoizotop çalışmaları ve radyoaktif izotoplar ile deneyler üzerinde kurumun protokolleri ile uyumlu belirlenmiş ayrı bir alanda aşağıdaki adımları uygulayın. <ol><li> Saflaştırılmış GST-alt-tabaka ve metilasyon 1x tamponu (50 mM Tris, pH 8.5, 20 mM KCI, 10 mM MgCI2, 1 mM β-merkaptoetanol, 100 mM sükroz), 1 uCi ihtiva eden bir ana karışımı 2 ug ekleyin, S-adenosil L-[metil-3H] metionin ve su hareketsizleştirilmiş PRMTs (aşama 2.13) ile 10 ul bir son hacme ve 1 saat boyunca 30 ° C&#39;de reaksiyonu inkübe edin. </li><li> 1 saat sonra, 2 x SDS örnek tampon maddesi 10 ul ilave ederek reaksiyonu durdurun. 10 dakika boyunca 95 ° C&#39;de numunelerin bozunmasından sonra, bir SDS-PAGE jeli üzerinde örnekleri ayırın. </li><li> Daha sonra, yarı-kuru elektroforetik transferi ile nitroselüloz zarı üzerine SDS jelden ayrılan proteinlerin aktarın. </li><li> Aktarımından sonra, bir ile membran kapakutofluor (bir oto radyografik görüntü yoğunlaştırıcı), yavaşça, oda sıcaklığında 2 saat boyunca sallayın. 2 saat sonra, autofluor kapalı dökün ve daha sonra kullanmak üzere saklayın. [* Radyoaktif malzeme olarak tüp Etiket] </li><li> Çabuk hava bir filtre kağıdı üzerinde kuru zar, bir plastik torba içinde sızdırmaz hale getirir ve -20 ° C&#39;de X-ışını filmine maruz membran. Yeterli pozlama süresi 5-30 gün arasında değişmektedir. </li></ol> PRMT İfade ve Yüzey Eşit Yükleniyor 5. Onayı <ol><li> Yeterli maruz elde edildikten sonra, bloke etme tampon içeren plastik bir kutu [Tween-20 (TBST +% 3 yağsız süt), Tris-tamponlanmış tuzlu su] için zarı transferi ve yavaşça 1 saat boyunca sallayın. </li><li> Radyoaktif atık olarak engelleme tampon atın. 4 ° C&#39;de gece boyunca TBST içinde (1000 sulandırma 1) bir anti-HA antikoru ile membran inkübe Hafifçe çalkalanarak ° C olarak ölçülmüştür. </li><li> TBST ile 3x zarın yıkanması ve HRP-işaretli anti-fare ikincil antikoru ile membran inkübeHafifçe çalkalanarak 1 saat boyunca oda sıcaklığında TBST (1 5000 seyreltme). </li><li> 1 saat sonra, TBST&#39;dir 3x zarın yıkanması ve bir HRP alt-tabaka ile kimyasal parlama proteinlerin tespiti gerçekleştirmek. </li><li> HA-etiketli PRMTs saptandıktan sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca Ponseau-S boyama solüsyonu ile membran inkübe edin. Hızlı GST etiketli substratlar tespit etmek için su ile zar 3 kez yıkayın. Görüntüyü tarayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Paik, W. K., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+methylase+I.+Purification+and+properties+of+the+enzyme.">Protein methylase I. Purification and properties of the enzyme.</a> J Biol Chem. 243, 2108-2114 (1968).</li><li>Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+immediate-early+TIS21+protein+and+the+leukemia-associated+BTG1+protein+interact+with+a+protein-arginine+N-methyltransferase.">The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase.</a> J Biol Chem. 271, 15034-15044 (1996).</li><li>Boffa, L. C., Karn, J., Vidali, G., Allfrey, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+NG,+NG,-dimethylarginine+in+nuclear+protein+fractions.">Distribution of NG, NG,-dimethylarginine in nuclear protein fractions.</a> Biochem Biophys Res Commun. 74, 969-976 (1977).</li><li>Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+methylation+at+a+glance.">Arginine methylation at a glance.</a> J Cell Sci. 120, 4243-4246 (2007).</li><li>Lee, Y. H., Stallcup, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+protein+arginine+methylation+of+nonhistone+proteins+in+transcriptional+regulation.">Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation.</a> Mol Endocrinol. 23, 425-433 (2009).</li><li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+methylation+in+mammals:+who,+what,+and+why.">Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why.</a> Mol Cell. 33, 1-13 (2009).</li><li>Bikkavilli, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dishevelled3+is+a+novel+arginine+methyl+transferase+substrate.">Dishevelled3 is a novel arginine methyl transferase substrate.</a> Scientific reports. 2, 805 (2012).</li><li>Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+methylation+of+G3BP1+in+response+to+Wnt3a+regulates+{beta}-catenin+mRNA.">Arginine methylation of G3BP1 in response to Wnt3a regulates {beta}-catenin mRNA.</a> J Cell Sci. 124, 2310-2320 (2011).</li><li>Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt3a-stimulated+LRP6+phosphorylation+is+dependent+upon+arginine+methylation+of+G3BP2.">Wnt3a-stimulated LRP6 phosphorylation is dependent upon arginine methylation of G3BP2.</a> J Cell Sci. , (2012).</li><li>Tini, M., Naeem, H., Torchia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+analysis+of+arginine+methylation+in+transcription.">Biochemical analysis of arginine methylation in transcription.</a> Methods Mol Biol. 523, 235-247 (2009).</li><li>Lee, J., Cheng, D., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+in+protein+methylation.">Techniques in protein methylation.</a> Methods Mol Biol. 284, 195-208 (2004).</li><li>Cheng, D., Vemulapalli, V., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+applied+to+the+study+of+protein+arginine+methylation.">Methods applied to the study of protein arginine methylation.</a> Methods Enzymol. 512, 71-92 (2012).</li><li>Zurita-Lopez, C. I., Sandberg, T., Kelly, R., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+protein+arginine+methyltransferase+7+(PRMT7)+is+a+type+III+enzyme+forming+omega-NG-monomethylated+arginine+residues.">Human protein arginine methyltransferase 7 (PRMT7) is a type III enzyme forming omega-NG-monomethylated arginine residues.</a> J Biol Chem. 287, 7859-7870 (2012).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada tarif edilen protokol rutin olarak tespit PRMT substratların metilasyon durumunu belirlemek için kullanılır. Bu sağlam ve tutarlı bir tahlil de kendi alt tabakalar için PRMTs spesifıtesine kesin kanıt sağlayacaktır. Bu deneyde başarısı için anahtar bileşenleri şunlardır: Memeli hücrelerinde PRMTs 1. ekspresyonu arıtılmış PRMTs 2. Aktivite, 3. ekspresyonu ve alt-tabaka saflaştırılması ve nitroselüloz zara 4. Tam proteinlerin western transfer. Rekombinant ifa...

Protein metilasyonu ilk kez 1968 1 yılında tanımlanmıştır. Araştırmacılar 2 Bu post-translasyonel modifikasyon önemini takdir başladı, 1996 yılında PRMT1 ilk klonlanması kadar değildi. İlginç bir şekilde, nükleer özler proteinlerinin arginin kalıntısının yaklaşık% 2, bu değişiklik gösteren bolluğu, 3, metile edilir. Arginin olabilir arginin yan zincirleri içinde bir bazik yan zincire ve nitrojen / s olan, pozitif yüklü bir amino asit olup, çeviri sonrası bir metil grubu, arginin metilasyon 4-6 olarak bilinen bir süreç eklenmesi ile değiştirilmiş. Arginin metilasyon enzim yani bir sınıf ile katalize edilmektedir. Protein arjinin metil transferaz (PRMTs). Mono-ya da dimetile arjinin ve ikincisi işlemi 4-6 katalize PRMTs türüne bağlı olarak simetrik veya asimetrik olabilir halinde olabilir. Arginin gösterilecek ProteinlerE-glisin bakımından zengin motifleri PRMT aracılığıyla meydana gelen katalizler için potansiyel hedeflerdir. Substratların PRMT aracılı metilasyon normal hücresel homeostaz 7-9 için çok önemli olan, her biri, protein-protein etkileşimi, protein-nükleik asit etkileşimi, proteinin, fonksiyon, gen ekspresyonunu, ve / veya hücresel sinyal modüle ettiği gösterilmiştir. Protein arginin metilasyon biyolojik rolünü anlamak için, kesin etkili ve yeniden üretilebilir bir deneyler tespit PRMT substratların metilasyon durumunu oluşturmak için gereklidir. Substratlannın metilasyonunu katalize etmek üzere saflaştırılmıştır PRMTs yeteneklerini değerlendirir nitro metilasyon tahlilinde, arginin, metilasyon 10-12 araştırılması için kabul edilen bir testtir. Bu deneyin genel başarısı büyük oranda saflaştırılmış PRMTs aktivitesine bağlıdır. PRMTs ifade bakteri ya da memeli hücrelerinden 10,11 saflaştırılabilir. D Bu in vitro deney, metilasyon,Protokol bölümünde etailed, orjinal Tini ve arkadaşları 10 tarafından tarif edilen bir yönteme dayanmaktadır. Bu protokol, detaylı olarak, memeli hücrelerinde PRMT1 ekspresyonu ve saflaştırılması yer alan adımları göstermektedir. Protein bağlayıcı protein 1 (G3BP1), bilinen PRMT alt-tabaka 8, ras-GTPaz aktive edici ile metilasyonu katalizleme saflaştırılmış PRMT1 kabiliyeti daha olarak S-adenosil-L-[metil-3H] Metioninin varlığında değerlendirildi metil donör. Bu analizi kullanarak, güvenilir bir şekilde bir protein arginin metilasyon çalışmada temel bir adımdır metilat roman ya da bilinen alt-tabakalar için, PRMTs yeteneklerini tanımlayabilir.

<table><tbody><tr><td>S-adenosyl-L-[methyl-&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H] methionine</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ecoscint ultra&amp;nbsp;</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-270</td><td></td></tr><tr><td>Bottle top dispenser</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-900</td><td></td></tr><tr><td>AutoFluor</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-315</td><td></td></tr><tr><td>6 ml Scintillation Vials</td><td>National Diagnostics</td><td>SKU:SVC-06</td><td></td></tr><tr><td>GST-sepharose</td><td>GE Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutathione Reduced</td><td>Sigma</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Transfection reagent</td></tr><tr><td>Beas2B</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>US-Biologicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-HA affinity matrix</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nacl</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-rad gel doc</td><td>Bio Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-HA antibody</td><td>roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ponseau S</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro methylation assay to study protein arginine methylation

Protein arginin metilasyon çekirdeğinde en bol post-translasyonel modifikasyonlar biridir. Protein arginin metilasyon tespit ve / veya proteomik yaklaşımlar ile belirlenir, ve / ya da metil-arginin özel antikorlar ile immunoblotting edilebilir. Ancak, bu teknikler bazen yanıltıcı olabilir ve sık sık yanlış pozitif sonuçlar vermektedir. En önemlisi, bu teknikler, metilasyon deneyler, diğer yandan, hassas olan yararlı biyokimyasal deneyler, in vitro olarak. PRMT substrat spesifikliği desteklemek için doğrudan bir kanıt sağlayamaz ve tanımlanan proteinlerin gerçekte PRMT alt-tabakalar ise sürekli olarak ortaya koymaktadır. Tipik olarak in vitro deney, metilasyon, saflaştırılmış aktif PRMTs saflaştırılmış alt-tabaka ve bir radyo-izotop işaretli metil donörü (S-adenosil-L-[metil-3H] metionin) içerir. Burada katalitik olarak aktif PRMT1 bir yerde ifade PRMT aile üyesi izole edilmesi için bir adım adım protokol açıklar. BeniSaflaştırılmış PRMT1 arasında methyl transferaz aktiviteleri daha sonra S-adenosil-L-metil donörü [metil-3H] Metioninin varlığında, protein 1 (G3BP1) bağlayıcı bir Ras-GTPaz aktive edici protein, bilinen bir PRMT alt-tabaka test edilmiştir. Bu protokol, yeni fizyolojik PRMT1 substratların metilasyon durumunu oluşturulması için değil, aynı zamanda protein arginin metilasyon temel mekanizmasını anlamak için sadece kullanılabilecektir.

<html> GST-G3BP1 metillenmesi HA PRMT1 ait özellikler, bir in vitro deneyi ile metilasyon belirlenmiştir. Beas2B hücre lizatlarından arıtıldı HA-etiketli PRMT1 GST-G3BP1 ihtiva eden bir metilasyon reaksiyonunda kullanılmıştır ve bir metil vericisi olarak S-adenosil-L-[metil-3H] metionin 1 uCi. PRMT1 etkili bir GST-G3BP1 (Şekil 1, üst panel) metilasyonunu katalize olabilir. Negatif kontrol (Şekil 1, üst panel, kuşak 1) olarak görev yapan, boş vektör ...

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation at JoVE.com

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginin metilasyonu, diğer bir deyişle, enzimler sınıfı tarafından katalizlenmektedir. Protein arjinin metil transferaz (PRMTs), proteinler içindeki arginines metil grup (lar) ilave enzimatik işlemidir. In vitro deney, metilasyon, bilinen veya yeni PRMT substratların metilasyon durumunu değerlendirmek için en güvenilir bir araçtır.

In vitro Metilasyona Tahlil Protein Arginin metilasyon Okuyacak

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

in-vitro-methylation-assay-to-study-protein-arginine-methylation

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

15.2K Görüntüleme.  University of Illinois at Chicago.  Protein arginin metilasyonu, diğer bir deyişle, enzimler sınıfı tarafından katalizlenmektedir. Protein arjinin metil transferaz (PRMTs), proteinler içindeki arginines metil grup (lar) ilave enzimatik işlemidir. In vitro deney, metilasyon, bilinen veya yeni PRMT substratların metilasyon durumunu değerlendirmek için en güvenilir bir araçtır. 

Video: In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Kertenkeleler Hareket Hız ve Yön Visual Hassasiyet Test

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Biyoloji

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and especially methylations, has re-emerged due to the important roles played by the enzymes that write and erase them in biological processes relevant to disease and cancer. Here, a sensitive in vitro assay for accurate analysis of RNA methylation writer activity on synthetic or in vitro transcribed RNAs is provided. This assay uses a tritiated form of S-adenosyl-methionine, resulting in direct labeling of methylated RNA with tritium. The low energy of tritium radiation makes the method safe, and pre-existing methods of tritium signal amplification, make it possible to quantify and to visualize the methylated RNA without the use of antibodies, which are commonly prone to artifacts. While this method is written for RNA methylation, few tweaks make it applicable to the study of other RNA modifications that can be radioactively labeled, such as RNA acetylation with 14C acetyl coenzyme A. Overall, this assay allows to quickly assess RNA methylation conditions, inhibition with small molecule inhibitors, or the effect of RNA or enzyme mutants, and provides a powerful tool to validate and expand results obtained in cells.

Here, an antibody-free in vitro assay for direct analysis of methyltransferase activity on synthetic or in vitro transcribed RNA is described.

RNA metiltransferaz aktivite analizi için Antibody Içermeyen tahlil

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

Genetik

Exploring the Arginine Methylome by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Protein-bound arginine is commonly methylated in many proteins and regulates their function by altering the physicochemical properties, their interaction with other molecules, including other proteins or nucleic acids. This work presents an easily implementable protocol for quantifying arginine and its derivatives, including asymmetric and symmetric dimethylarginine (ADMA and SDMA, respectively) and monomethyl arginine (MMA). Following protein isolation from biological body fluids, tissues, or cell lysates, a simple method for homogenization, precipitation of proteins, and protein hydrolysis is described. Since the hydrolysates contain many other components, such as other amino acids, lipids, and nucleic acids, a purification step using solid-phase extraction (SPE) is essential. SPE can either be performed manually using centrifuges or a pipetting robot. The sensitivity for ADMA using the current protocol is about 100 nmol/L. The upper limit of detection for arginine is 3 mmol/L due to SPE saturation. In summary, this protocol describes a robust method, which spans from biological sample preparation to NMR-based detection, providing valuable hints and pitfalls for successful work when studying the arginine methylome.

The present protocol describes the preparation and quantitative measurement of free and protein-bound arginine and methyl-arginines by 1H-NMR spectroscopy.

Arginin Metilomunun Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Araştırılması

Protein-bound arginine is commonly methylated in many proteins and regulates their function by altering the physicochemical properties, their interaction ...

Kanser Araştırmaları

Proximity Ligation Assay Allows the Detection, Localization, and Quantification of Protein Arginine Methylation in Fixed Tissue

Arginine methylation is emerging as a key post-translational modification involved in a large range of biological processes. Its study in tissue is often limited by the lack of a specific antibody recognizing the target arginine residue. Proximity ligation assay (PLA) was originally developed to study protein/protein interactions. Here, we describe in detail a PLA protocol dedicated to the detection of arginine methylation that we applied to the glucocorticoid receptor (GR). Having previously shown that PRMT5 dimethylates GRs in cells, we used PLA with a pan symmetrical dimethyl antibody and an anti-GR antibody to measure GR methylation in breast tumors. We demonstrate that PLA offers a unique approach to measure arginine methylation of a target protein, even when the site of methylation has not been identified. This technique could be extended to other post-translational modifications where effective pan antibodies are available. Hence, we detail the PLA technology used to detect arginine methylation in fixed tissue using GR as an example.

<meta charset="utf8"></head><body>Yakınlık ligasyonu testi, sabit dokuda protein arginin metilasyonunun saptanmasına, lokalizasyonuna ve miktarının belirlenmesine izin verir

Proximity ligation assay is a very useful technique to localize and quantify arginine methylation of a given protein when the modified arginine residue is unknown and/or if no specific antibody is available.

Yakınlık ligasyonu testi, sabit dokuda protein arginin metilasyonunun saptanmasına, lokalizasyonuna ve miktarının belirlenmesine izin verir

Arginine methylation is emerging as a key post-translational modification involved in a large range of biological processes. Its study in tissue is often ...

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, including RNA processing, signal transduction, DNA damage response, miRNA biogenesis, and translation.
In recent years, thanks to biochemical and analytical developments, mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as the most effective strategy to characterize the cellular methyl-proteome with single-site resolution. However, identifying and profiling in vivo protein R-methylation by MS remains challenging and error-prone, mainly due to the substoichiometric nature of this modification and the presence of various amino acid substitutions and chemical methyl-esterification of acidic residues that are isobaric to methylation. Thus, enrichment methods to enhance the identification of R-methyl-peptides and orthogonal validation strategies to reduce False Discovery Rates (FDR) in methyl-proteomics studies are required.
Here, a protocol specifically designed for high-confidence R-methyl-peptides identification and quantitation from cellular samples is described, which couples metabolic labeling of cells with heavy isotope-encoded Methionine (hmSILAC) and dual protease in-solution digestion of whole cell extract, followed by off-line High-pH Reversed Phase (HpH-RP) chromatography fractionation and affinity enrichment of R-methyl-peptides using anti-pan-R-methyl antibodies. Upon high-resolution MS analysis, raw data are first processed with the MaxQuant software package and the results are then analyzed by hmSEEKER, a software designed for the in-depth search of MS peak pairs corresponding to light and heavy methyl-peptide within the MaxQuant output files.

Protein Arginine (R)-methylation is a wide-spread post-translational modification regulating multiple biological pathways. Mass spectrometry is the best technology to globally profile the R-methyl-proteome, when coupled to biochemical approaches for modified peptide enrichment. The workflow designed for the high confidence identification of global R-methylation in human cells is described here.

Global ve Yüksek Güvenilirlikli Protein R-Metilasyon Analizi için Kütle Spektrometrisine Dayalı Proteomik Yaklaşım

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

Biyokimya

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

Baskılı Genler DNA metilasyon Belirlenmesi Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level. There are several methods, both in vitro and in vivo, to evaluate protein binding, and at least two methods that complement the shortcomings of each other should be conducted to obtain reliable insights. 
For an in vivo assay, the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay represents the most popular and least invasive approach that enables to detect protein-protein interaction within living cells, as well as identify the intracellular localization of the interacting proteins 1,2. In this assay, non-fluorescent N- and C-terminal halves of GFP or its variants are fused to tested proteins, and when the two fusion proteins are brought together due to the tested proteins&#x2019; interactions, the fluorescent signal is reconstituted3-6. Because its signal is readily detectable by epifluorescence or confocal microscopy, BiFC has emerged as a powerful tool of choice among cell biologists for studying about protein-protein interactions in living cells 3. This assay, however, can sometimes produce false positive results. For example, the fluorescent signal can be reconstituted by two GFP fragments arranged as far as 7 nm from each other due to close packing in a small subcellular compartment, rather that due to specific interactions7.
Due to these limitations, the results obtained from live cell imaging technologies should be confirmed by an independent approach based on a different principle for detecting protein interactions. Co-immunoprecipitation (Co-IP) or glutathione transferase (GST) pull-down assays represent such alternative methods that are commonly used to analyze protein-protein interactions in vitro. However, iIn these assays, however, the tested proteins must be readily soluble in the buffer that supportsused for the binding reaction. Therefore, specific interactions involving an insoluble protein cannot be assessed by these techniques.
 Here, we illustrate the protocol for the protein membrane overlay binding assay, which circumvents this difficulty. In this technique, interaction between soluble and insoluble proteins can be reliably tested because one of the proteins is immobilized on a membrane matrix. This method, in combination with in vivo experiments, such as BiFC, provides a reliable approach to investigate and characterize interactions faithfully between soluble and insoluble proteins. In this article, binding between Tobacco mosaic virus (TMV) movement protein (MP), which exerts multiple functions during viral cell-to-cell transport8-14, and a recently identified plant cellular interactor, tobacco ankyrin repeat-containing protein (ANK) 15, is demonstrated using this technique.

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Testing protein-protein interaction is indispensable for dissection of protein functionality. Here, we introduce an in vitro protein-protein binding assay to probe a membrane-immobilized protein with a soluble protein. This assay provides a reliable method to test interaction between an insoluble protein and a protein in solution.

Protein Membran Kaplama Testi: Çözünür ve çözünmez Proteinler Arasında Etkileşim Test Protokolü In vitro</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

DNA Metilasyonu: bisülfit modifikasyonu ve Analiz

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

Protein-Protein Etkileşimi Okumak Manyetik Boncuk Kullanarak Bir Sıvı Faz Affinity Yakalama Testi: Poliovirüs-Nanobody Örnek

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

In vitro Metilasyona Tahlil Protein Arginin metilasyon Okuyacak

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Kertenkeleler Hareket Hız ve Yön Visual Hassasiyet Test

RNA metiltransferaz aktivite analizi için Antibody Içermeyen tahlil

Arginin Metilomunun Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Araştırılması

Yakınlık ligasyonu testi, sabit dokuda protein arginin metilasyonunun saptanmasına, lokalizasyonuna ve miktarının belirlenmesine izin verir

Yakınlık ligasyonu testi, sabit dokuda protein arginin metilasyonunun saptanmasına, lokalizasyonuna ve miktarının belirlenmesine izin verir

Global ve Yüksek Güvenilirlikli Protein R-Metilasyon Analizi için Kütle Spektrometrisine Dayalı Proteomik Yaklaşım

Baskılı Genler DNA metilasyon Belirlenmesi Arabidopsis Endosperm

Protein Membran Kaplama Testi: Çözünür ve çözünmez Proteinler Arasında Etkileşim Test Protokolü In vitro

DNA Metilasyonu: bisülfit modifikasyonu ve Analiz

Protein-Protein Etkileşimi Okumak Manyetik Boncuk Kullanarak Bir Sıvı Faz Affinity Yakalama Testi: Poliovirüs-Nanobody Örnek