Bu araştırma Sağlık hibe numaraları R01NS050452 ve R01EB009429 Ulusal Enstitüsü tarafından finanse edildi. Konsol cips imalatı Cornell Üniversitesi&#39;nde bulunan Nanofabrikasyona Tesisinde işbirlikçileri tarafından dışarıdan gerçekleştirildi. Konsol üretim sürecinde kullanılan tüm ekipmanlar bu tesiste yer oldu. Konsol mikro-üretim ile yardım için Mandy Esch ve Jean-Matthieu Prot Special thanks. Konsol işlevsellik video animasyon UCF de Sentetik Gerçeklik Lab Charles Hughes, Alex Zelenin ve Eric Imperiale tarafından oluşturulmuştur.

1. Konsol Chip Fabrikasyon Açıklanan imalat adımlarının gösterilen ayrıntıları Şekil 1 &#39;de verilmiştir. <ol><li> Bir fırın içinde silikon üzerinde yalıtkan (SOI) gofret yerleştirin ve bunları kurutmak için 20 dakika boyunca 125 ° C&#39;de pişirilir. </li><li> Bir plazma kullanılarak susuz SOI gofretin sap tabakası üzerine silikon oksit, 1.5 mikron kalınlığında bir tabaka yatırın kimyasal buhar çöktürme (PECVD) aracı artırıldı. </li><li> Cihaz katman yukarı bakacak şekilde spin lak mandrenin gofret yerleştirin. , Gofret merkezli olduğundan emin olun 1,000 rpm / saniye bir hızlanma 60 saniye boyunca 3000 rpm&#39;de gofret merkezinde ve spin P20 astar 2 ml dağıtmak. P20 astar cihaz fotorezist tabakaya yapışmasını teşvik etmektedir. </li><li> Gofret spin lak mandrenin görünse de, o ile 1000 rpm / saniye oranında hızı 60 saniye boyunca 3000 rpm&#39;de S1818 gofretin ortasına ışığa ve spin 2 ml dağıtmakFotorezist 1.5 mikron kalınlığında bir tabaka btain. </li><li> Sıcak bir plaka üzerinde gofret yerleştirin ve 1 dakika boyunca 115 ° C&#39;de bir fırında yumuşak gerçekleştirin. </li><li> Cihaz üzerinde bir tabaka ışığa için konsol maskeden desen transfer etmek için bir iletişim fotolitografi maske hizalama kullanılarak sert kontakt UV ışınlarına maruz kalma gerçekleştirin. 125 mj / S1818 fotodirenç için cm 2 poz enerji değerine göre pozlama süresini hesaplayın. </li><li> Hafifçe ileri ve geri gofretin çalkalayarak, 1 dakika boyunca 726 MIF fotorezist geliştirici gofret daldırarak fotorezist geliştirir. </li><li> De-iyonize (DI) su ile durulayın gofret ve tercihen bir sıkma durulama kurutma makinesi (SRD) aracını kullanarak, kurutun. </li><li> Aseton batırılmış bir pamuk bez kullanılarak (kenardan 5 mm kadar) gofretin kenarından fotorezist çıkarın. </li><li> Fotorezist tarafı yukarı bakacak şekilde, bir Derin Reaktif İyon Asitli (DRIE) aracında gofret yükleyin ve devi ile desenli silikon tabakasını etch için bir reçete çalıştırınce katmanı. Bir aşındırma durak olarak gömülü oksit katmanı işlevleri, yani tam bir iz sağlamak için gerekli olması beklenmektedir% 100&#39;den daha fazla döngü için% 50 ile bir iz gerçekleştirin. </li><li> Fotorezist şerit 20 dakika boyunca sıcak bir fotorezist Banyo çözeltisi içindeki gofret yerleştirin. DI su ile gofret durulayın hızlı-dökümü-rinser (QDR) gofret aktarın. Fotorezist şerit ardından, durulama ve gofretin kuruması için SRD aracında gofret yükleyin. Beklendiği gibi konsol desen görünür sağlamak için bir mikroskop altında gofret kontrol edin. </li><li> Bir PECVD alet gofretin cihaz katmanda un katkılı bir silikon oksit 1 mikron kalınlığında bir tabaka bırakın. Daha fazla işlem kademesi sırasında konsollar için koruyucu tabaka olarak bu oksit tabakası çalışır. </li><li> Gofretin arka tarafının başlatmak üzere yukarı bakacak şekilde sap tabakası ile dönel kaplayıcı aynası üzerine, gofret yerleştirin. Olun gofret 3000 rpm&#39;de P20 gofretin ortasına astar ve spin 2 ml dağıtılması, ortalanır1000 rpm / saniye oranında hızı 60 sn. </li><li> Gofret spin lak mandrenin görünse de, bir 6.5 mikron kalınlığında bir tabaka elde edilmesi için 1000 rpm / saniye oranında hızı 45 saniye boyunca 2000 rpm&#39;de gofretin merkezi ve spin üzerine SPR220-4.5 fotodirenç 2 ml dağıtmak Fotorezist. </li><li> 2 dakika boyunca 115 ° C&#39;de bir fırında yumuşak gerçekleştirmek için bir yakınlık sıcak bir plaka üzerinde gofret yerleştirin. </li><li> Ön / arka uyum yeteneğine sahip bir fotolitografya temas hizalama kullanarak, ön yan konsol desen arka pencere maske hizalayın ve kolu katmanda fotodirenç için arka pencere maskeden desen transfer etmek için bir sert kontakt UV maruziyetini gerçekleştirin. 480 mj / SPR220-4.5 fotodirenç için cm 2 poz enerji değerine göre hesaplanan bir pozlama süresi kullanın. </li><li> UV&#39;ye maruz kalmadan sonra, çok ince bisküviler bir sonraki işleme aşamasından önce 30 dakika süre ile karanlık bir yerde kalmasını sağlar. </li><li> Gofretin daldırarak fotorezist geliştirilmesi2 dakika süre ile, 726 MIF fotorezist geliştirici hafifçe ileri ve geri gofreti çalkalandı. </li><li> De-iyonize (DI) su ile durulayın gofret ve tercihen bir sıkma durulama kurutma makinesi (SRD) aracını kullanarak, kurutun. </li><li> 12 saat boyunca 90 ° C&#39;de bir fırında gofret yerleştirin. </li><li> Florlu gazlar ile RIE sistemi ve oksit gravür için bir tarifi kullanarak gofret ters silikon oksit tabakası etch. Gofretin ters desenli oksit daha sonraki işlemler için bir aşındırma maske olarak görev yapar. Maruz kalan penceresinde silikon oksit tamamen kazınmış olduğundan emin olmak için bir mikroskop altında gofret kontrol edin. </li><li> Aseton batırılmış bir bez kullanılarak temiz oda (kenardan 5 mm kadar) gofretin kenarında fotorezist çıkarın. </li><li> Bir DRIE aracında gofret yüklemek ve bir aşındırma durak olarak gömülü oksit tabakası işleyişi ile 500 um&#39;lik bir derinliğe desenli tabaka sap oyulması için bir tarifi çalıştırın. Aşırı ısınmasını önlemek için birden çok çalışır içine bu etch bölünmüşsilikon tutarsız aşındırma neden gofret. Bu aşındırma adımı tamamen dirseklerin altında silikon kaldırır. </li><li> Dirseklerin altında gömülü oksit tabakası ve dirseklerin üstüne koruyucu oksit katman şerit,% 25 sulandırılmış HF pürüzlendirici kullanan bir ıslak aşındırma adımı gerçekleştirir. Not: Bu adım silikon konsolun alt yüzeyi serbest bırakır ve aynı zamanda lazer ile dirsekli araştırmak için bir erişim sağlamak için altına bir pencere açar. </li><li> DI su banyoları dizi ve azot ile dikkatlice kuru kullanarak gofret durulayın. Konsollar kendi üslerinde yalnızca desteklenen yana, doğrudan dirseklerin üzerine DI su veya inert gaz güçlü spreyler kullanmayın. </li><li> Sap tabakası aşındırma adımı esnasında üretilen klevajın çizgileri boyunca gofret bireysel fiş bölmektedir. </li></ol> 2. Hücre Kültürü <ol><li> Daha önce yayınlanmış yöntemlerden 17&#39;ye göre 13F lamelleri hazırlayın. NOT: Eğer 13F koyrslips mevcut değildir, 95 ° C&#39;nin üzerindeki bir temas açısına sahip herhangi bir hidrofobik yüzey kullanılabilir. </li><li> Konsol cips ve% 70 etanol çözeltisi içinde 13F lamelleri sterilize ve bir akış kaputu kurumaya bırakın. </li><li> Bir standart 12 plaka içindeki 13F lamelleri üstüne bireysel konsol cips yerleştirin. </li><li> Kaplayın hücre tipi için optimize biyopolimer veya yüzey modifikasyonu ile dirsekleri standart hücre kültür protokollere göre kullanılır. </li><li> Istenen konsantrasyona kendi özel büyüme ortamında hücrelerin yeniden askıya. NOT: Bu protokol konsol penceresinden düşen ve istenilen konsol yüzeyine yapışan olmayan hücrelerin önemli bir sayıda neden olur. Hücre preparasyonlar, bu sebepten, standart preparatları için bir örtücü cam, daha konsantre 3-4x yapılmalıdır. Örneğin, sıçan iskelet kas uydu hücreleri, tipik olarak tohumlama 500-700 hücre / mm kare 15,16 ilk önce tohum ekme yoğunluğu kullanılarak yürütülürVe / meydan aa 2000 hücre olacak şekilde konsol alt tabakalar kullanılmaktadır. Optimizasyon deneyler, uygun bir tohum yoğunluğu belirlemek için yeni bir hücre kaynakları ile yapılmalıdır. </li><li> Orta kabarcık tamamen konsol pencere kapsayan sağlanması konsol çip yüzeyi üzerine, hücre süspansiyonu 200 ul pipetle. Orta pencereden fitiller ve dirseklerin üstüne bir statik kabarcık oluşturmak vermezse 13F lamel değiştirmek ve kaplama reattempt. </li><li> Bir kuluçka yongası içeren plaka aktarın ve hücreler, en az 1 saat (tercihen 2-3 saat) boyunca yapışmaya izin verir. </li><li> Bu kaplama tamamlandıktan sonra, büyüme ortamı, 1 ml kültür, bir 13F lamel olmaksızın temiz bir çukuruna çipi transferi, ve en fazla steril forseps kullanır. </li><li> Inkübatör plaka dönün. </li><li> Lamelleri in vitro bakım için standart bir protokole uygun hücreleri korumak. Iskelet kası hücreleri için,Hücreler birleştiklerinde, gerekli olacaktır hale kez ortam bileşiminin bir anahtar miyotüp oluşumunu tetiklemek için karıştırılabilir. </li></ol> Konsol Saptırma Analiz için Donanım ve Yazılım 3.Kurulum <ol><li> Dik elektrofizyoloji mikroskop aşamasında içine ısıtılmış kültür çanak yerleştirin. </li><li> Isıtılmış mikroskop kademesine ile henüz (+ 10 mM HEPES) içinde süspanse edilmektedir besleme ortamının 3 ml ilave edilir. </li><li> 15 mm&#39;lik bir ayırma mesafesi ile ısıtılmış kültür çanak iç paslanmaz çelik elektrotlar monte ve bir darbe üreteci arasında değişen yoğunlukta, frekans ve dalga biçimi alan uyarım darbelerini üretebilen bağlamak, sistem alan uyarımı üretmek için izin Uygun zaman hücrelerin. </li><li> , Mikroskop tablonun alt tarafına, X ve Y platformlarının üzerine monte edilen bir helyum-neon lazer cıvata ve lazer ışını, bir 30 ° &#39;lik açı relativ de ısıtılmış kültür çanak tabanı boyunca yönlendirilecek şekilde ayarlayınkonsolun düzlemine e. </li><li> , Mikroskop sahne alt etmek, XY öteleme aşamalarında üzerine monte edilmiş bir kadran fotoğraf-dedektör modülü cıvata ve 4 kadranın merkezinde yansıyan lazer ışını topraklar. Şekil 2, böylece konumunu ayarlamak kurmak donanımın bir bakış sağlar Açıklanan protokol uygulanması için gerekli. </li><li> Cantilevers üzerinden tarama doğrusal aktüatörler kontrol etmek için bir yazılım program yazın. Şekil 3&#39;te sunulan akış şemasına değini ile yazılım programı yazmak. Bu sistem ile kullanılmak üzere programlanmış bir grafik arayüz Şekil 4&#39;te sunulmuştur. </li></ol> 4. Kaydı Konsol Sapma Veri <ol><li> Konsol analiz donanımı ve ilgili yazılımlar açın. </li><li> Ortama ısıtılmış sahne termistoru yerleştirin ve 37 ° C okumak için sabırsızlanıyorum. </li><li> Cantileve ile aşamaya konsol çipi takınSahnenin sağ tarafında yönelmiştir rs. </li><li> Mikroskop ışık kaynağı açın. </li><li> Konsol varsayarsak sahnenin sağında, konsol 1 yöneliktir: görünüm içine konsolun kenarlarını getirmek ve konsol 1. NOT ucunda lazer ışını konumlandırmak için lazer / fotoğraf dedektör kontrol yazılımı kullanmak için Odak mikroskop Dizinin sol üst konumlandırılmış biridir ve sayılar sol alt aşağı 16 çalıştırın. Konsol 17 sağ üst pozisyonda ve sağ alt (Şekil 5A) içinde 32 hareket eder. </li><li> Basın kayıt yazılımı üzerinde &quot;oynamak&quot;. </li><li> Sinyal foto-dedektörü kontrol kademeli motora ayarlayarak, x ve y çerçeveleri hem de &quot;0&quot; okur, böylece foto-dedektörü yerleştirin. </li><li> Lazer / fotoğraf-detektör kontrol yazılımı Set konsol 1 pozisyon (Şekil 4). </li><li> . Adımı 4.7 tekrarlayın, konsolun 16 ucuna lazer taşıyın ve cantilev seter lazer / fotoğraf-detektör kontrol yazılımı 16 pozisyon. </li><li> Lazer / fotoğraf-detektör kontrol yazılımı adımı 4.7. Ve set konsol 32 pozisyonunu tekrar, konsolun 32 ucuna lazer taşıyın. </li><li> Lazer / fotoğraf-detektör kontrol yazılımı adımı 4.7. Ve set konsol 17 pozisyonunu tekrar, konsolun 17 ucuna lazer taşıyın. </li><li> Mikroskop ışık kaynağı ve laboratuarda havai ışığı kapatın. </li><li> Kayıt yazılımı basın &quot;rekor&quot;. </li><li> 1 Hz frekansta 40 msn&#39;de, 5 V bakliyat için nabız jeneratörü donanımı ayarlayın ve makineyi açın. NOT: İsteğe bağlı olarak, bu noktada belirli bir hücre kaynakları için optimize edilmiş stimülasyon protokolleri istihdam, belirtilen ayarları insan ve kemirgen hücre kaynaklarının 12,13,15,16 kullanılarak toplanan verilere dayalı kurallar vardır. </li><li> Lazer / fotoğraf dedektör kontrol yazılımı kullanarak, her on 5 saniye durdurma, 32 konsol dizi boyunca tarama donanımı ayarlayınör. </li><li> 32 konsolun Tarama işlemi tamamlandığında, daha sonra kayıt yazılımı ve veri dosyasını getirmek, uyarıcı kapatın. </li><li> Kontraktil aktivite kanıt her bir dirsek gelen kaydedilen iz inceleyin. Olumlu tepkiler her konsolun bir kenara not edin. Saptırma taban üzerinde en az 0,1 V ise, bir daralma, bir tepe noktası olarak tanımlanır. </li><li> Lazer / fotoğraf dedektör kontrol yazılımı üzerinde tarama protokolü herhangi bir sigara duyarlı konsol çıkarın. </li><li> Aktif konsollar daha sonra hücrenin spontan kontraktil aktivitenin bir okuma almak için uyarı olmaksızın rescanned edilebilir. </li><li> Kültürlenen hücrelerin fonksiyonel çıktıya üzerindeki etkisini gözlemlemek için ortama terapötik bir bileşik ilave edildikten sonra, ya da geniş alan elektriksel uyarımı olmaksızın taramaları çalıştırın. </li><li> Elektriksel Uzun süre ve Contr tarama seviyeleri için hücreleri uyararak yorgunluk değerlendirmeler yürütmek<html> actility belirli bir eşiğin altına düşmesi pik gücü için ne kadar sürdüğünü ölçmek için. </li><li> Motor nöronlar, kas ile ko-kültür içinde muhafaza edilir deneylerde, nöromüsküler nöronal bir uyarıcı motonöron-miyotüp konsol ko-kültürler işlemi ile bağlantı oluşumu (glutamat gibi) veya sinaptik inhibitör ölçün (örneğin, D-tubokurarin) ve tarama spontan aktivitede artış ve azalışlar sırasıyla 16. </li><li> Planlanan deneyler ihtiyaçlarına göre belirlenecektir gibi özel taramalar yapar. </li></ol> Konsol Sapma Verilerin 5. Analiz <ol><li> Kullanım Stoney denklemleri 15 hücre tabakası veya miyotüp (Pascal), ve (nano-Newton) hücresel kasılma gücünün doğrudan ölçümü stres bir okuma içine (Volt) ham konsol sapma verilerini dönüştürmek için (aşağıda ayrıntılı) güncellendi: reklam / 51866 / 51866eq1.jpg &quot;/&gt; Denklem 1 <img alt="Denklem 2" fo:content-width="2in" width="300" src="/files/ftp_upload/51866/51866eq2.jpg" /> Denklem 2 </li><li> Δ = konsol ucu sapma ve stres miyotüp tarafından üretilen yerlerde, σ c üniforma kalın filmi konsol, C dedektörün tam genişliğini varsayarak miyotüp tarafından üretilen = stres, = fotoğrafın üstüne lazer konumuna gerilimi ilişkin sistemine özgü katsayısı -detector, θ = konsolun düzlemine lazer ve detektör açısının E Si silikon elastik modüle = t Si konsolun kalınlığı = t = f miyotüp kalınlığı v = Si oranı arasında Zehir silikon, L = konsol uzunluğu, dedektör konsol ucundan lazer P = yolu uzunluğu, w <sub&gt; Si konsolun genişliği =. Bu denklemlerde kullanılan terimleri açıklayan şematik Şekil 6&#39;da verilmiştir. </li><li> Düzgün bir film miyotüp olduğunu varsayarak, miyotüp yapan kuvvet Stoney uygulama için kullanılan stresten kuvvet hesaplama ve varsayılan hücre bir kesit alana eşitleyerek, 3. Denklem yol filmde kuvvete eşittir denklem. <img alt="Denklem 3" fo:content-width="1.5in" src="files/ftp_upload/51866/51866eq3.jpg" /> Denklem 3 </li><li> Fonksiyonel Veri toplama, imünositokimyasal analizler için konsol fiş düzeltmek veya standart teknikler kullanılarak protein veya DNA analizi için hücreler kullanır. </li><li> İsteğe bağlı olarak, daha sonraki bir zaman noktasında, işlevsel performansı yeniden değerlendirme amacıyla kuluçka yerine moleküler analiz için hazırlanırken hücreleri döner. </li></ol>

<ol>
	<li>Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+liberation+of+myogenic+cells+from+adult+rat+muscle.">Enzymatic liberation of myogenic cells from adult rat muscle.</a> Anat. Rec. 180, 645-661 (1974).</li><li>Yasin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+technique+for+growing+human+adult+skeletal+muscle+in+culture+starting+from+mononucleated+cells.">A quantitative technique for growing human adult skeletal muscle in culture starting from mononucleated cells.</a> J. Neurol. Sci. 32, 347-360 (1977).</li><li>Dennis, R. G., Kosnik, P. E., 2nd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitability+and+isometric+contractile+properties+of+mammalian+skeletal+muscle+constructs+engineered+in+vitro.">Excitability and isometric contractile properties of mammalian skeletal muscle constructs engineered in vitro.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36, 327-335 (2000).</li><li>Khodabukus, A., Baar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+electrical+stimulation+emphasizing+excitability+for+the+development+and+testing+of+engineered+skeletal+muscle.">Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle.</a> Tissue Eng Part C Methods. 18, 349-357 (2012).</li><li>Langelaan, M. L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+maturation+by+electrical+stimulation:+Differences+in+response+between+C2C12+and+primary+muscle+progenitor+cells.">Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells.</a> Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5, 529-539 (2011).</li><li>Stephenson, G. M., O'Callaghan, A., Stephenson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-fiber+study+of+contractile+and+biochemical+properties+of+skeletal+muscles+in+streptozotocin-induced+diabetic+rats.">Single-fiber study of contractile and biochemical properties of skeletal muscles in streptozotocin-induced diabetic rats.</a> Diabetes. 43, 622-628 (1994).</li><li>Harber, M., Trappe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+muscle+fiber+contractile+properties+of+young+competitive+distance+runners.">Single muscle fiber contractile properties of young competitive distance runners.</a> Journal of applied physiology (Bethesda, Md: 1985). 105, 629-636 (2008).</li><li>Hvid, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+days+of+muscle+disuse+impairs+single+fiber+contractile+function+in+young+and+old+healthy+men.">Four days of muscle disuse impairs single fiber contractile function in young and old healthy men.</a> Experimental gerontology. 48, 154-161 (2013).</li><li>Edman, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+performance+of+striated+muscle.">Contractile performance of striated muscle.</a> Advances in experimental medicine and biology. 682, 7-40 (2010).</li><li>Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+muscle+fiber+contractile+properties+in+adults+with+muscular+dystrophy+treated+with+MYO-029.">Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029.</a> Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).</li><li>Sung, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+mammalian+organ+systems+and+their+integration+into+models+of+whole+animals+and+humans.">Microfabricated mammalian organ systems and their integration into models of whole animals and humans.</a> Lab on a chip. 13, 1201-1212 (2013).</li><li>Wilson, K., Molnar, P., Hickman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+functional+myotubes+with+a+Bio-MEMS+device+for+non-invasive+interrogation.">Integration of functional myotubes with a Bio-MEMS device for non-invasive interrogation.</a> Lab on a chip. 7, 920-922 (2007).</li><li>Wilson, K., Das, M., Wahl, K. J., Colton, R. J., Hickman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+contractile+stress+generated+by+cultured+rat+muscle+on+silicon+cantilevers+for+toxin+detection+and+muscle+performance+enhancement.">Measurement of contractile stress generated by cultured rat muscle on silicon cantilevers for toxin detection and muscle performance enhancement.</a> PLoS ONE. 5, (2010).</li><li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscope.">Atomic Force Microscope.</a> Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).</li><li>Pirozzi, K. L., Long, C. J., McAleer, C. W., Smith, A. S., Hickman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+embryonic+skeletal+muscle+myotube+physical+characteristics+with+contractile+force+generation+on+an+atomic+force+microscope-based+bio-microelectromechanical+systems+device.">Correlation of embryonic skeletal muscle myotube physical characteristics with contractile force generation on an atomic force microscope-based bio-microelectromechanical systems device.</a> Applied physics letters. 103, 83108 (2013).</li><li>Smith, A., Long, C., Pirozzi, K., Hickman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+system+for+high-content+screening+of+neuromuscular+junctions+in+vitro.">A functional system for high-content screening of neuromuscular junctions in vitro.</a> Technology. 1, 37-48 (2013).</li><li>Stenger, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coplanar+molecular+assemblies+of+amino-+and+perfluorinated+alkylsilanes:+characterization+and+geometric+definition+of+mammalian+cell+adhesion+and+growth.">Coplanar molecular assemblies of amino- and perfluorinated alkylsilanes: characterization and geometric definition of mammalian cell adhesion and growth.</a> Journal of the American Chemical Society. 114, 8435-8442 (1992).</li><li>Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+long-term+in+vitro+tissue+engineered+model+of+neuromuscular+junctions.">A defined long-term in vitro tissue engineered model of neuromuscular junctions.</a> Biomaterials. 31, 4880-4888 (2010).</li><li>Rumsey, J. W., Das, M., Bhalkikar, A., Stancescu, M., Hickman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+the+mechanosensory+circuit+of+the+stretch+reflex+arc:+Sensory+neuron+innervation+of+intrafusal+muscle+fibers.">Tissue engineering the mechanosensory circuit of the stretch reflex arc: Sensory neuron innervation of intrafusal muscle fibers.</a> Biomaterials. 31, 8218-8227 (2010).</li><li>Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+tissue+engineering:+A+maturation+model+promoting+long-term+survival+of+myotubes,+structural+development+of+the+excitation-contraction+coupling+apparatus+and+neonatal+myosin+heavy+chain+expression.">Skeletal muscle tissue engineering: A maturation model promoting long-term survival of myotubes, structural development of the excitation-contraction coupling apparatus and neonatal myosin heavy chain expression.</a> Biomaterials. 30, 5392-5402 (2009).</li><li>Das, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+novel+serum-free+cell+culture+model+of+skeletal+muscle+differentiation+by+systematically+studying+the+role+of+different+growth+factors+in+myotube+formation.">Developing a novel serum-free cell culture model of skeletal muscle differentiation by systematically studying the role of different growth factors in myotube formation.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 378-387 (2009).</li><li>Stenger, D. A., Pike, C. J., Hickman, J. J., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+determinants+of+neuronal+survival+and+growth+on+self-assembled+monolayers+in+culture.">Surface determinants of neuronal survival and growth on self-assembled monolayers in culture.</a> Brain research. 630, 136-147 (1993).</li><li>Hickman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+pattern+design+for+in+vitro+cellular+networks+using+surface+photochemistry.">Rational pattern design for in vitro cellular networks using surface photochemistry.</a> Journal of Vacuum Scienc., &amp; Technology A: Vacuum, Surfaces, and Films. 12, 607-616 (1994).</li><li>Das, M., Molnar, P., Devaraj, H., Poeta, M., Hickman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+and+morphological+characterization+of+rat+embryonic+motor+neurons+in+a+defined+system.">Electrophysiological and morphological characterization of rat embryonic motor neurons in a defined system.</a> Biotechnology progress. 19, 1756-1761 (2003).</li><li>Rumsey, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Node+of+Ranvier+formation+on+motor+neurons+in+vitro.">Node of Ranvier formation on motor neurons in vitro.</a> Biomaterials. 30, 3567-3572 (2009).</li><li>Murugan, R., Molnar, P., Rao, K. P., Hickman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterial+Surface+patterning+of+self+assembled+monolayers+for+controlling+neuronal+cell+behavior.">Biomaterial Surface patterning of self assembled monolayers for controlling neuronal cell behavior.</a> International journal of biomedical engineering and technology. 2, 104-134 (2009).</li><li>Guo, X., Johe, K., Molnar, P., Davis, H., Hickman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+human+fetal+spinal+cord+stem+cell+line,+NSI-566RSC,+and+its+induction+to+functional+motoneurons.">Characterization of a human fetal spinal cord stem cell line, NSI-566RSC, and its induction to functional motoneurons.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 4, 181-193 (2010).</li><li>Varghese, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+target+for+amyloid+beta+toxicity+validated+by+standard+and+high-throughput+electrophysiology.">A new target for amyloid beta toxicity validated by standard and high-throughput electrophysiology.</a> PLoS ONE. 5, e8643 (2010).</li><li>Natarajan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+cardiomyocytes+on+microelectrode+arrays+as+a+functional,+high+information+content+drug+screening+platform.">Patterned cardiomyocytes on microelectrode arrays as a functional, high information content drug screening platform.</a> Biomaterials. 32, 4267-4274 (2011).</li><li>Davis, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+Cortical+Oligodendrocyte-Embryonic+Motoneuron+Co-Culture:+An+Axon-Oligodendrocyte+Interaction+Model.">Rat Cortical Oligodendrocyte-Embryonic Motoneuron Co-Culture: An Axon-Oligodendrocyte Interaction Model.</a> Journal of biomaterials and tissue. 2, 206-214 (2012).</li><li>Natarajan, A., DeMarse, T., Molnar, P., Hickman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+In+Vitro+Feed-Forward+Networks.">Engineered In Vitro Feed-Forward Networks.</a> J Biotechnol Biomater. 3, 2 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hücresel daralma kanıt için mikro konsol analiz kritik adımlar mikroskop sahne içindeki konsol çip yerleştirme ve dizideki köşe konsolun ucuyla lazer ve foto-dedektör sonraki hizalama vardır. Bu doğru yapılmazsa, o zaman yazılım potansiyel veri toplama sırasında yanlış negatif birikimine neden, dizideki kalan konsolun pozisyonlarını hesaplamak için mümkün olacaktır. Operatörler konsol çip lazer pozisyonları kalibre önce kültür çanak alt ile aynı hizada yalan emin olmak için dikkatli olm...

The in vitro culture of muscle cells from both human and rodent sources has been possible for decades1,2. However, while standard coverslip preparations are useful for biochemical assessment, they do not facilitate analysis of the cell&#8217;s primary functional output (contractility), and therefore are of somewhat limited value as a means to assess cellular maturation and performance. In order to maximize the amount of data obtainable from such in vitro cultures, it is necessary to advance the development of systems capable of housing such cells in configurations that permit the real-time assessment of their functional performance. The establishment of a multitude of three dimensional muscle models has made some progress toward fulfilling this need, and such systems have been used in a number of publications as a means to assess the contractile capacity of cultured muscle cells in vitro3-5. While such systems are invaluable for tissue modeling and reconstruction studies, they are limited in their applicability for studies of single cell responses. In such cases where single fiber studies are necessary, complex and labor intensive ex vivo methodologies remain the only option6-10. Furthermore, current movement toward the development of complex, multi-organ platforms for drug development and screening protocols requires the establishment of systems which are non-invasive, easily scalable and which integrate readily with supporting cells and tissue models11. 
Microscale cantilevers offer a simple method for assessing the functional contractile capacity of single cells/small populations of cells12,13. The technique is based on modified Atomic Force Microscopy (AFM) technology14, and uses a laser and photo-detector system to measure microscale cantilever deflection in response to cultured myotube contractile activity. Modified Stoney&#8217;s equations are then used to calculate stress in the myotube, and the force exerted by the myotube in order to generate the observed substrate deflection15. A scanning program has been written which enables simultaneous assessment of multiplexed cantilever arrays, offering potential moderate to high through-put applications for drug toxicity/efficacy studies15,16. Such technology may prove invaluable in the development of functional, pre-clinical assays for predicting drug efficacy in vivo. Furthermore, fabrication of cantilever chips in silicon does not impede post analysis processing of cells for standard biomolecular assays such as immunostaining, western blotting and PCR. 
This manuscript provides detailed instructions on the fabrication and preparation of microscale silicon cantilevers, the hardware and software set-up, and the operating guidelines for assessing the functionality of contractile cells cultured on these chips. Standard cell culture techniques can be implemented for plating and maintenance of cells on these surfaces, hence any contractile cell type for which reliable culture parameters exist should be able to integrate with this device with ease. The relatively simple 2D culture parameters utilized in this system makes integration of other cell models or addition of cell types that can interact with muscle (such as innervating neurons) straight-forward, greatly increasing the applicability of this model in the development of more complex functional in vitro assays and multi-organ models of mammalian systems.

<table><tbody><tr><td>Primary rat muscle growth medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>1x</td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>1x</td></tr><tr><td>G5 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17503-012</td><td>1x</td></tr><tr><td>Glial-Derived Neurotrophic Factor</td><td>Cell sciences</td><td>CRG400B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Brain-Derived Neurotrophic Factor</td><td>Cell sciences</td><td>CRB600B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Ciliary Neurotrophic Factor</td><td>Cell sciences</td><td>CRC400A</td><td>40 ng/ml</td></tr><tr><td>Neurotrophin-3</td><td>Cell sciences</td><td>CRN500B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Neurotrophin-4</td><td>Cell sciences</td><td>CRN501B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Acidic Fibroblast Growth Factor</td><td>Life Technologies</td><td>13241-013&amp;nbsp;</td><td>25 ng/ml</td></tr><tr><td>Cardiotrophin-1</td><td>Cell sciences</td><td>CRC700B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Heparin Sulphate</td><td>Sigma</td><td>D9809&amp;nbsp;</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor</td><td>Sigma</td><td>L5158&amp;nbsp;</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Sigma</td><td>V0132</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>Primary rat muscle differentiation medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NB Activ 4</td><td>Brain Bits LLC</td><td>NB4-500</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Class 2 red diode laser</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photo-detector</td><td>Noah Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Model 2100 Pulse stimulator</td><td>A-M systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B Digitizer</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp microscope and stage</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Delta T4 culture dish controller</td><td>Bioptechs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axoscope software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW software</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&lt;sup&gt; o&lt;/sup&gt;C, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>NAPCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Class 2 microbiological flow hood</td><td>Labconco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes and tips</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

utilization of microscale silicon cantilevers to assess cellular contractile function in vitro

Daha fazla ön ve biyolojik olarak uygun in vitro tahlillerin gelişimi tohumlanmış hücrelerin fonksiyonel değerlendirilmesini sağlamak çok yönlü hücre kültür sistemlerinin ilerlemesi dayanmaktadır. Bu amaçla, mikro konsol bükme teknolojisi daralma kaynaklı alt tabakanın değerlendirilmesi yoluyla, iskelet, kalp ve düz kas hücreleri dahil hücre tipleri, bir dizi kasılma işlevselliğini ölçmek için hangi ile bir platform sunuyor. Birden fazla mesaj göndermiş konsol dizilerin uygulanması ilaç yeterlilik ve toksisitesini, hastalığın ilerlemesini fenotip ve yanı sıra, kas ve diğer hücre-hücre etkileşimleri değerlendirmek için yüksek verimli protokollere orta geliştirmek için bir araç sağlar. Bu yazıda, bu amaç için güvenilir bir konsol dizileri imal edilmesi için ayrıntıları ve bu yüzeyler üzerinde başarıyla kültürü hücreleri için gerekli olan bir yöntem sağlar. Ayrıca açıklama fonksiyonel anal gerçekleştirmek için gerekli adımlar sağlanırkontraktil hücre tipleri Ysis yeni lazer ve foto-dedektör sistemi kullanarak bu tür diziler üzerinde muhafaza. Vurgular hassasiyet ve bu sistem ile mümkün kontraktil fonksiyonun tekrar analiz tekrarlanabilir niteliği verilen temsili veriler, hem de çalışma geniş olan bu tür önlemlerin hale gelebilir. Bu sistemin başarılı yaygınlaşmasının araçlarla araştırmacılar doku performansı, hastalık gelişimi ve yeni terapötik tedaviye yanıtın daha doğru tahminlere yol açan, in vitro hızlı, düşük maliyetli fonksiyonel çalışmalar yapmak sağlayabilir.

Dirseklerin kontraktil hücrelerinin başarılı kültürü, standart hücre kültürü teknikleri (Şekil 5) kullanılarak, nispeten basit bir işlemdir. Yakalanma hücreleri destekleyici dirseklerin yüzdesi, hücre tipine bağlı olarak değişir incelenmiş ve belirli bir kültür tekniği kullanılmış olmasıdır. Sıçan arka bacak türetilen birincil embriyonik hücreleri kullanarak, kontraktil aktivite incelendi konsolun tespit% 12 (n = 4). Açıklanan lazer ve foto-dedektör sistemi kullanıl...

Watch this Scientific Journal Video about Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro at JoVE.com

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Bu protokol, in vitro kas hücrelerinin kasılma ölçmek için esnek kültür yüzeyleri olarak mikro silikon konsolun kullanımını tarif etmektedir. Hücresel kasılması, ölçülen kaydedilen ve in vitro kontraktil fonksiyon ölçmek için non-invazif ve ölçeklenebilir sisteminin temin edilmesiyle, kuvvet çıktılan dönüştürülebilir dirsekli bükme neden olur.

Mikro Silikon konsolun Kullanımı Hücresel kasılma fonksiyonunu değerlendirmek için<em&gt; İn Vitro</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

utilization-microscale-silicon-cantilevers-to-assess-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

10.2K Görüntüleme.  University of Central Florida.  Bu protokol, in vitro kas hücrelerinin kasılma ölçmek için esnek kültür yüzeyleri olarak mikro silikon konsolun kullanımını tarif etmektedir. Hücresel kasılması, ölçülen kaydedilen ve in vitro kontraktil fonksiyon ölçmek için non-invazif ve ölçeklenebilir sisteminin temin edilmesiyle, kuvvet çıktılan dönüştürülebilir dirsekli bükme neden olur. 

Video: Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration and cell-cell interactions. The two key parameters of cellular biomechanics are cellular deformability or stiffness and the ability of the cells to contract and generate force. Here we describe a quick and simple method to estimate cell stiffness by measuring the degree of membrane deformation in response to negative pressure applied by a glass micropipette to the cell surface, a technique that is called Micropipette Aspiration or Microaspiration.
Microaspiration is performed by pulling a glass capillary to create a micropipette with a very small tip (2-50 &mu;m diameter depending on the size of a cell or a tissue sample), which is then connected to a pneumatic pressure transducer and brought to a close vicinity of a cell under a microscope. When the tip of the pipette touches a cell, a step of negative pressure is applied to the pipette by the pneumatic pressure transducer generating well-defined pressure on the cell membrane. In response to pressure, the membrane is aspirated into the pipette and progressive membrane deformation or "membrane projection" into the pipette is measured as a function of time. The basic principle of this experimental approach is that the degree of membrane deformation in response to a defined mechanical force is a function of membrane stiffness. The stiffer the membrane is, the slower the rate of membrane deformation and the shorter the steady-state aspiration length.The technique can be performed on isolated cells, both in suspension and substrate-attached, large organelles, and liposomes.
Analysis is performed by comparing maximal membrane deformations achieved under a given pressure for different cell populations or experimental conditions. A "stiffness coefficient" is estimated by plotting the aspirated length of membrane deformation as a function of the applied pressure. Furthermore, the data can be further analyzed to estimate the Young's modulus of the cells (E), the most common parameter to characterize stiffness of materials. It is important to note that plasma membranes of eukaryotic cells can be viewed as a bi-component system where membrane lipid bilayer is underlied by the sub-membrane cytoskeleton and that it is the cytoskeleton that constitutes the mechanical scaffold of the membrane and dominates the deformability of the cellular envelope. This approach, therefore, allows probing the biomechanical properties of the sub-membrane cytoskeleton.

Here we describe a quick and simple method to measure cell stiffness. The general principle of this approach is to measure membrane deformation in response to well-defined negative pressure applied through a micropipette to the cell surface. This method provides a powerful tool to study biomechanical properties of substrate-attached cells.

Substrat bağlı Hücrelerinin Mikropipet Aspirasyon Hücre Rijitlik tahmin etmek

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

Biyomühendislik

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

Mekanik Stretch sırasında Canlı Hücre Görüntüleme

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanical Property Measurements at the Nanoscale in Air and Fluid

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by the probe tip and its contact area with the sample can be quantified, it is possible to determine the nanoscale mechanical properties (e.g., elastic or Young&#39;s modulus) of the surface being probed. A detailed procedure for performing quantitative AFM cantilever-based nanoindentation experiments is provided here, with representative examples of how the technique can be applied to determine the elastic moduli of a wide variety of sample types, ranging from kPa to GPa. These include live mesenchymal stem cells (MSCs) and nuclei in physiological buffer, resin-embedded dehydrated loblolly pine cross-sections, and Bakken shales of varying composition.
Additionally, AFM cantilever-based nanoindentation is used to probe the rupture strength (i.e., breakthrough force) of phospholipid bilayers. Important practical considerations such as method choice and development, probe selection and calibration, region of interest identification, sample heterogeneity, feature size and aspect ratio, tip wear, surface roughness, and data analysis and measurement statistics are discussed to aid proper implementation of the technique. Finally, co-localization of AFM-derived nanomechanical maps with electron microscopy techniques that provide additional information regarding elemental composition is demonstrated.

Quantifying the contact area and force applied by an atomic force microscope (AFM) probe tip to a sample surface enables nanoscale mechanical property determination. Best practices to implement AFM cantilever-based nanoindentation in air or fluid on soft and hard samples to measure elastic modulus or other nanomechanical properties are discussed.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Konsol Tabanlı Nanogirinti: Hava ve Sıvıda Nanoölçekte Mekanik Özellik Ölçümleri

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by ...

Mühendislik

Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been proven to be useful substrates for culturing cells in a physical microenvironment that partially mimics in vivo conditions. Here, we present a simple protocol for characterizing the Young's moduli of isotropic linear elastic substrates typically used for mechanobiology studies. The protocol consists of preparing a soft silicone substrate on a Petri dish or stiff silicone, coating the top surface of the silicone substrate with fluorescent beads, using a millimeter-scale sphere to indent the top surface (by gravity), imaging the fluorescent beads on the indented silicone surface using a fluorescence microscope, and analyzing the resultant images to calculate the Young's modulus of the silicone substrate. Coupling the substrate's top surface with a moduli extracellular matrix protein (in addition to the fluorescent beads) allows the silicone substrate to be readily used for cell plating and subsequent studies using traction force microscopy experiments. The use of stiff silicone, instead of a Petri dish, as the base of the soft silicone, enables the use of mechanobiology studies involving external stretch. A specific advantage of this protocol is that a widefield fluorescence microscope, which is commonly available in many labs, is the major equipment necessary for this procedure. We demonstrate this protocol by measuring the Young's modulus of soft silicone substrates of different elastic moduli.

Substrates with stiffness in the kilopascal-range are useful to study the response of cells to physiologically relevant micro-environment stiffness. Using just a widefield fluorescence microscope, the Young's modulus of soft silicone gels can be determined using an indentation with a suitable sphere.

Yumuşak silikon yüzeylerde sertlik ölçüm Widefield floresan mikroskop kullanarak Mechanobiology çalışmaları için

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the effect of applied extracellular tensile strain on cell populations in vitro via biochemical assays, a device has previously been designed which can be fabricated simply and is small enough to fit inside tissue culture incubators, as well as on top of microscope stages. However, the previous design of the polydimethylsiloxane substratum did not allow high-resolution subcellular imaging via oil-immersion objectives. This work describes a redesigned geometry of the polydimethylsiloxane substratum and a customized imaging setup that together can facilitate high-resolution subcellular imaging of live cells while under applied strain. This substratum can be used with the same, earlier designed device and, hence, has the same advantages as listed above, in addition to allowing high-resolution optical imaging. The design of the polydimethylsiloxane substratum can be improved by incorporating a grid which will facilitate tracking the same cell before and after the application of strain. Representative results demonstrate high-resolution time-lapse imaging of fluorescently labeled nuclei within strained cells captured using the method described here. These nuclear dynamics data give insights into the mechanism by which applied tensile strain promotes differentiation of oligodendrocyte progenitor cells.&#160;

Using a previously designed device to apply mechanical strain to adherent cells, this paper describes a redesigned substratum geometry and a customized apparatus for high-resolution single-cell imaging of strained cells with a 100x oil immersion objective.

Tek eksenli çekme gerinim altında canlı hücrelerde nükleer dinamiklerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

Simplified, High-throughput Analysis of Single-cell Contractility using Micropatterned Elastomers

Cellular contractile force generation is a fundamental trait shared by virtually all cells. These contractile forces are crucial to proper development, function at both the cellular and tissue levels,and regulate the mechanical systems in the body. Numerous biological processes are force-dependent, including motility, adhesion, and division of single-cells, as well as contraction and relaxation of organs such as the heart, bladder, lungs, intestines, and uterus. Given its importance in maintaining proper physiological function, cellular contractility can also drive disease processes when exaggerated or disrupted. Asthma, hypertension, preterm labor, fibrotic scarring, and underactive bladder are all examples of mechanically driven disease processes that could potentially be alleviated with proper control of cellular contractile force. Here, we present a comprehensive protocol for utilizing a novel microplate-based contractility assay technology known as fluorescently labeled elastomeric contractible surfaces (FLECS), that provides simplified and intuitive analysis of single-cell contractility in a massively scaled manner. Herein, we provide a step-wise protocol for obtaining two six-point dose-response curves describing the effects of two contractile inhibitors on the contraction of primary human bladder smooth muscle cells in a simple procedure utilizing just a single FLECS assay microplate, to demonstrate proper technique to users of the method. Using FLECS Technology, all researchers with basic biological laboratories and fluorescent microscopy systems gain access to studying this fundamental but difficult-to-quantify functional cell phenotype, effectively lowering the entry barrier into the field of force biology and phenotypic screening of contractile cell force.

This work presents a flexible protocol for utilizing fluorescently labeled elastomeric contractible surfaces (FLECS) Technology in microwell format for simplified, hands-off quantification of single-cell contractile forces based on visualized displacements of fluorescent protein micropatterns.

Mikrodesenli Elastomerler Kullanarak Tek Hücreli Kasılmanın Basitleştirilmiş, Yüksek Verimli Analizi

Cellular contractile force generation is a fundamental trait shared by virtually all cells. These contractile forces are crucial to proper development, ...

Mechano-Node-Pore Sensing: A Rapid, Label-Free Platform for Multi-Parameter Single-Cell Viscoelastic Measurements

Cellular mechanical properties are involved in a wide variety of biological processes and diseases, ranging from stem cell differentiation to cancer metastasis. Conventional methods for measuring these properties, such as atomic force microscopy (AFM) and micropipette aspiration (MA), capture rich information, reflecting a cell's full viscoelastic response; however, these methods are limited by very low throughput. High-throughput approaches, such as real-time deformability cytometry (RT-DC), can only measure limited mechanical information, as they are often restricted to single-parameter readouts that only reflect a cell's elastic properties. In contrast to these methods, mechano-node-pore sensing (mechano-NPS) is a flexible, label-free microfluidic platform that bridges the gap in achieving multi-parameter viscoelastic measurements of a cell with moderate throughput. A direct current (DC) measurement is used to monitor cells as they transit a microfluidic channel, tracking their size and velocity before, during, and after they are forced through a narrow constriction. This information (i.e., size and velocity) is used to quantify each cell's transverse deformation, resistance to deformation, and recovery from deformation. In general, this electronics-based microfluidic platform provides multiple viscoelastic cell properties, and thus a more complete picture of a cell's mechanical state. Because it requires minimal sample preparation, utilizes a straightforward electronic measurement (in contrast to a high-speed camera), and takes advantage of standard soft lithography fabrication, the implementation of this platform is simple, accessible, and adaptable to downstream analysis. This platform's flexibility, utility, and sensitivity have provided unique mechanical information on a diverse range of cells, with the potential for many more applications in basic science and clinical diagnostics.

Presented here is a method to mechanically phenotype single cells using an electronics-based microfluidic platform called mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). This platform maintains moderate throughput of 1-10 cells/s while measuring both the elastic and viscous biophysical properties of cells.

Mekano-Düğüm-Gözenek Algılama: Çok Parametreli Tek Hücreli Viskoelastik Ölçümler için Hızlı, Etiketsiz Bir Platform

Cellular mechanical properties are involved in a wide variety of biological processes and diseases, ranging from stem cell differentiation to cancer ...

Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate underlying a cell must be manipulated. While hydrogels with graded stiffness and long-term migration assays have proven useful in durotaxis studies, immediate, acute responses to local changes in substrate tension allow focused study of individual cell movements and subcellular signaling events. To repeatably test the ability of cells to sense and respond to the underlying substrate stiffness, a modified method for application of acute gradients of increased tension to individual cells cultured on deformable hydrogels is used which allows for real time manipulation of the strength and direction of stiffness gradients imparted upon cells in question. Additionally, by fine tuning the details and parameters of the assay, such as the shape and dimensions of the micropipette or the relative position, placement, and direction of the applied gradient, the assay can be optimized for the study of any mechanically sensitive cell type and system. These parameters can be altered to reliably change the applied stimulus and expand the functionality and versatility of the assay. This method allows examination of both long term durotactic movement as well as more immediate changes in cellular signaling and morphological dynamics in response to changing stiffness.

Mechanical forces are important for controlling cell migration. This protocol demonstrates the use of elastic hydrogels that can be deformed using a glass micropipette and a micromanipulator to stimulate cells with a local stiffness gradient to elicit changes in cell structure and migration.

Hücresel Hareketin Mekanik Kontrolünün Ve İlgili Sinyal Olaylarının Değerlendirilmesi için Tek Hücreli Durotaksis Tsay

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...

Biyoloji

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of serially linked sarcomeres, the smallest contractile units in muscle. Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in patients with mutations in genes encoding for sarcomeric proteins. The study of myofibril mechanics allows for the assessment of actin-myosin interactions without potential confounding effects of damaged, adjacent myofibrils when measuring the contractility of single muscle fibers. Ultrastructural damage and misalignment of myofibrils might contribute to impaired contractility. If structural damage is present in the myofibrils, they likely break during the isolation procedure or during the experiment. Furthermore, studies in myofibrils provide the assessment of actin-myosin interactions in the presence of the geometrical constraints of the sarcomeres. For instance, measurements in myofibrils can elucidate whether myofibrillar dysfunction is the primary effect of a mutation in a sarcomeric protein. In addition, perfusion with calcium solutions or compounds is almost instant due to the small diameter of the myofibril. This makes myofibrils eminently suitable to measure the rates of activation and relaxation during force production. The protocol described in this paper employs an optical force probe based on the principle of a Fabry-P&#233;rot interferometer capable of measuring forces in the nano-Newton range, coupled to a piezo length motor and a fast-step perfusion system. This setup enables the study of myofibril mechanics with high resolution force measurements.

Presented here is a protocol to assess the contractile properties of striated muscle myofibrils with nano-Newton resolution. The protocol employs a setup with an interferometry-based, optical force probe. This setup generates data with a high signal-to-noise ratio and enables the assessment of the contractile kinetics of myofibrils.

İskelet Kas Biyopsilerinden Miyofibrillerin İzlenmesi ve Nano-Newton Çözünürlük Transdüseri ile Kontraktil Fonksiyonun Belirlenmesi

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

High-Throughput Contractile Measurements of Hydrogel-Embedded Intact Mouse Muscle Fibers Using an Optics-Based System

In vitro cell culture is a powerful tool to assess cellular processes and test therapeutic strategies. For skeletal muscle, the most common approaches involve either differentiating myogenic progenitor cells into immature myotubes or the short-term ex vivo culture of isolated individual muscle fibers. A key benefit of ex vivo culture over in vitro is the retention of the complex cellular architecture and contractile characteristics. Here, we detail an experimental protocol for the isolation of intact flexor digitorum brevis muscle fibers from mice and their subsequent ex vivo culture. In this protocol, muscle fibers are embedded in a fibrin-based and basement membrane matrix hydrogel to immobilize the fibers and maintain their contractile function. We then describe methods to assess the muscle fiber contractile function using an optics-based, high-throughput contractility system. The embedded muscle fibers are electrically stimulated to induce contractions, after which their functional properties, such as sarcomere shortening and contractile velocity, are assessed using optics-based quantification. Coupling muscle fiber culture with this&#160;system allows for high-throughput testing of the effects of pharmacological agents on contractile function and ex vivo studies of genetic muscle disorders. Finally, this protocol can also be adapted to study dynamic cellular processes in muscle fibers using live-cell microscopy.

Skeletal muscle function can be assessed by quantifying the contractility of isolated muscle fibers, traditionally using laborious, low-throughput approaches. Here, we describe an optics-based, high-throughput method to quantify the contractility of hydrogel-embedded muscle fibers. This approach has applications for drug screening and therapeutic development.

Optik tabanlı bir sistem kullanarak hidrojel gömülü bozulmamış fare kas liflerinin yüksek verimli kasılma ölçümleri

In vitro cell culture is a powerful tool to assess cellular processes and test therapeutic strategies. For skeletal muscle, the most common approaches ...

Mikro Silikon konsolun Kullanımı Hücresel kasılma fonksiyonunu değerlendirmek için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler