Diese Forschung wurde von National Institute of Health Zuschuss Zahlen R01NS050452 und R01EB009429 finanziert. Herstellung der Cantilever-Chips wurde von außen durch Mitarbeiter an der Nanofabrication Einrichtung an der Cornell University durchgeführt. Alle Geräte in der freitragenden Herstellungsprozess verwendet wurde in dieser Anlage entfernt. Besonderen Dank an Mandy Esch und Jean-Matthieu Prot für die Unterstützung bei freitragenden Mikrofabrikation. Video-Animation des Auslegers Funktionalität wurde von Charles Hughes, Alex und Eric Zelenin Imperiale aus dem synthetischen Reality Lab an der UCF erzeugt.

1. Freischwinger Chipfertigungs Dargestellten Details der beschriebenen Herstellungsschritte sind in Figur 1 versehen. <ol><li> Platzieren Silicon-On-Insulator (SOI)-Wafer in einem Ofen gebacken und bei 125 ° C für 20 Minuten, um sie zu entwässern. </li><li> Abscheidung einer 1,5 um dicken Schicht aus Siliziumoxid auf den Griff Schicht des entwässerten SOI Wafers unter Verwendung einer Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD)-Tool. </li><li> Platzieren des Wafers auf dem Spin-Coater Futter mit der Vorrichtungsschicht nach oben weist. Sicherzustellen Wafer zentriert Streifen 2 ml P20-Primer auf der Mitte des Wafers und Schleudern bei 3000 Upm für 60 sec bei einer Beschleunigung von 1000 Umdrehungen / sec. P20 Primer fördert die Haftung des Photoresist an der Vorrichtungsschicht. </li><li> Während der Wafer weiterhin auf dem Spin-Coater Futter Streifen 2 ml S1818 Photoresist auf die Mitte des Wafers und Schleudern bei 3000 Upm für 60 sec bei einer Beschleunigung von 1000 Umdrehungen / Sek obtain eine 1,5 um dicke Schicht Photolack. </li><li> Legen Sie die Wafer auf einer heißen Platte und führen Sie einen Soft backen bei 115 ° C für 1 min. </li><li> Durchführen einer harten Kontakt UV Belichtung unter Verwendung einer Photolithographie-Kontaktmaskenausrichter, um das Muster von der Auslegermaske auf den Fotolack auf der Geräteschicht übertragen. Berechnung der Belichtungszeit auf der Grundlage einer Belichtungsenergie von 125 mJ / cm 2 für S1818 Photoresist. </li><li> Entwicklung der Photolack durch Eintauchen der Wafer in einem Fotolack 726 MIF-Entwickler für 1 min unter leichtem Schütteln der Wafer hin und her. </li><li> Spülen Sie die Wafer mit deionisiertem (DI) Wasser und trocknen Sie sie am besten mit einem Spin-rinse Trockner (SRD)-Tool. </li><li> Entfernen des Photoresists von der Kante des Wafers (bis zu 5 mm von der Kante) mit einem Wattestäbchen in Aceton getaucht. </li><li> Laden Sie die Wafer in einer tiefen Reactive Ion Etch (DRIE) Werkzeug, mit dem Photoresist Seite nach oben, und führen Sie ein Rezept, um die strukturierte Siliziumschicht durch die Devi ätzence-Schicht. Die vergrabene Oxidschicht dient als Ätzstopp, so führen eine Ätzung mit 50% bis 100% mehr Zyklen, als erwartet wird erforderlich zu sein, um ein vollständiges Ätzen zu gewährleisten. </li><li> Platzieren des Wafers in einem heißen Bad Photoresistlösung für 20 min, um die Fotolackentfernung. Übertragen Sie die Wafer einem Eilgang-Rinser (QDR), um die Wafer mit DI-Wasser spülen. Nach der Fotolackentfernung, laden Sie die Wafer in einer SRD-Tool zu spülen und trocknen Wafer. Überprüfen Sie die Wafer unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, der Ausleger Muster erscheint, wie erwartet. </li><li> Abscheidung einer 1 um dicken Schicht von undotiertem Siliziumoxid auf der Bauteilschicht des Wafers unter Verwendung eines PECVD-Anlage. Diese Oxidschicht dient als Schutzschicht für die Ausleger während der weiteren Verarbeitungsschritte. </li><li> Platzieren des Wafers auf dem Spin-Coater Spannfutter mit der Griffschicht nach oben, um die Verarbeitung von der Rückseite des Wafers beginnen. Sicherzustellen Wafer zentriert Streifen 2 ml P20-Primer auf der Mitte des Wafers und Schleudern bei 3000 UpMfür 60 Sekunden bei einer Beschleunigung von 1000 U / sec. </li><li> Während der Wafer weiterhin auf dem Spin-Coater Futter Streifen 2 ml SPR220-4.5 Photoresist auf die Mitte des Wafers und Schleudern bei 2000 Upm für 45 sec bei einer Beschleunigung von 1000 Umdrehungen / sec, um eine 6,5 um dicke Schicht zu erhalten, Photoresist. </li><li> Legen Sie die Wafer auf einer heißen Platte Nähe, um eine weiche backen bei 115 ° C für 2 min durchzuführen. </li><li> Mit Hilfe eines Photolithographie Kontakt Ausrichter der Lage, vorne / hinten Ausrichtung, richten Sie die Rückseite Fenster Maske auf der Vorderseite freitragende Muster und führen Sie eine harte Kontakt UV-Exposition, um die Muster von der Rückseite Fenster Maske auf den Photolack auf dem Griff Schicht übertragen. Verwenden Sie eine Belichtungszeit, basierend auf Belichtungsenergiewert von 480 mJ / cm 2 für SPR220-4.5 Photolack berechnet. </li><li> Nach der UV-Belichtung, lassen die Scheiben bleiben in einem dunklen Raum 30 Minuten lang vor dem nächsten Verarbeitungsschritt. </li><li> Entwickeln des Photoresists durch Eintauchen des Wafers inein 726 MIF Photoresistentwickler für 2 min unter leichtem Schütteln der Wafer hin und her. </li><li> Spülen Sie die Wafer mit deionisiertem (DI) Wasser und trocknen Sie sie am besten mit einem Spin-rinse Trockner (SRD)-Tool. </li><li> Platzieren der Wafer in einem Ofen bei 90 ° C für 12 Stunden. </li><li> Ätzen der Silizium-Oxid-Schicht auf der Rückseite des Wafers unter Verwendung eines RIE-System mit fluorierten Gasen und ein Rezept für das Ätzen umfaßt. Die strukturierte Oxid auf der Rückseite des Wafers wirkt als eine Ätzmaske für die weitere Verarbeitung. Untersuchen der Wafer unter dem Mikroskop, um zu gewährleisten, daß das Siliziumoxid in der freiliegenden Fenster vollständig geätzt. </li><li> Entfernen des Photoresists auf dem Rand des Wafers (bis zu 5 mm von der Kante) mit einem Reinraum Tupfer in Aceton getaucht. </li><li> Laden Sie die Wafer in einem DRIE Werkzeug mit und führen Sie ein Rezept, um die strukturierte Griffschicht bis zu einer Tiefe von 500 um mit der vergrabenen Oxidschicht, die als Ätzstopp ätzen. Aufgeteilt in mehrere dieses Etch läuft auf eine übermäßige Erwärmung des zu verhindernWafer, die im Widerspruch Ätzen des Silizium bewirkt. Dieser Ätzschritt entfernt das Silizium unter den Auslegern. </li><li> Durchführen einer nassen Ätzschritt unter Verwendung von 25% verdünnte HF-Ätzmittel, um die vergrabene Oxidschicht unterhalb der Ausleger und die schützende Oxidschicht auf der Oberseite der Kragarme abzustreifen. HINWEIS: Dieser Schritt setzt die untere Oberfläche der Siliziumausleger und öffnet ein Fenster unter einen Zugriff auf den Ausleger mit der Lasersonde ist. </li><li> Spülen der Wafer mit einer Reihe von Wasserbädern DI und sorgfältig mit Stickstoff trocken. Da die Ausleger sind nur an ihrer Basis unterstützt, verwenden Sie keine Sprays kraft DI-Wasser oder Inertgas direkt auf den Auslegern. </li><li> Spalten die einzelnen Chips aus dem Wafer entlang der Schicht während der Griff Ätzschritt hergestellt spalten Linien. </li></ol> 2. Zellkultur <ol><li> Bereiten 13F Deckgläser nach bisher veröffentlichten Methoden 17. HINWEIS: Wenn 13F Buchtrslips nicht verfügbar sind, kann jede beliebige hydrophobe Oberfläche mit einem Kontaktwinkel von über 95 ° verwendet werden. </li><li> Sterilisieren Cantilever-Chips und 13F Deckgläschen in einer 70% igen Ethanollösung und an der Luft trocknen in einem Flow-Haube. </li><li> Zeigen einzelnen Cantilever-Chips auf der Oberseite der Deckgläser 13F in einem Standard-12-Well-Platte. </li><li> Mantel die Ausleger mit dem Biopolymer oder Oberflächenmodifikation für die Zelltyp optimiert wird nach den Standard-Zellkulturprotokolle verwendet. </li><li> Resuspendieren der Zellen in ihrer spezifischen Wachstumsmedium auf die gewünschte Konzentration. HINWEIS: Dieses Protokoll wird bei einer erheblichen Anzahl von Zellen fallen durch die Fenster freitragende und nicht zu der gewünschten Auslegeroberfläche anhaftenden führen. Zellpräparate sollten daher 3-4x konzentrierter als für Standard-Deckglas Vorbereitungen getroffen werden. B. Aussäen von Rattenskelettmuskelsatellitenzellen wird typischerweise unter Verwendung einer Aussaatdichte von 500 bis 700 Zellen / mm ² durchgeführt 15,16Und sind mit Cantilever-Substrate bei 2.000 Zellen / mm ² eingesetzt. Optimierungsversuche sollte mit neuen Zellquellen durchgeführt werden, um eine geeignete Aussaatdichte zu ermitteln. </li><li> Je 200 ul der Zellsuspension auf dem Ausleger Chipoberfläche, wodurch die Blase des Mediums deckt die freitragende Fenster ganz. Wenn das Medium transportiert durch das Fenster und keine statische Ball oberhalb der Ausleger bilden ersetzen 13F Deckglas und erneut versuchen, die Beschichtung. </li><li> Übertragen Sie die Platte mit den Chips in einen Inkubator und damit die Zellen für mindestens 1 Stunde (vorzugsweise 2-3 h) entsprechen. </li><li> Nach diesem Zeitraum Beschichtung, sterile Pinzette, um den Chip zu einer sauberen und die Kultur mit 1 ml Wachstumsmedium zu übertragen, ohne Deckglas 13F und nachfüllen. </li><li> Bringen Sie die Platte in den Inkubator. </li><li> Pflegen Zellen nach ihren Standardprotokoll für die In-vitro-Wartung auf Deckgläsern. Für Skelettmuskelzellen,einen Schalter der Mediumzusammensetzung zu Myotuben Bildung zu induzieren, wenn Zellen konfluent erforderlich. </li></ol> 3. Einrichten von Hardware und Software für Cantileverauslenkung Analyse <ol><li> Legen Sie einen beheizten Kulturschale in die Stufe eines aufrechten Elektrophysiologie Mikroskop. </li><li> 3 ml des Nährmediums werden die Zellen noch in (+ 10 mM HEPES) suspendiert, um die erhitzte Mikroskoptisch. </li><li> Halterung aus Edelstahl-Elektroden auf der Innenseite der erhitzten Kulturschale in einem Abstand von 15 mm und sie an einen Impulsgenerator, fähig zur Herstellung von Feldstimulationsimpulse variierender Intensität, Frequenz und Wellenform, damit das System die Feldstimulation zu erzeugen von Zellen, wenn angemessen. </li><li> Schraube eine Helium-Neon-Laser, auf XY Translationsstufen angebracht sind, die an der Unterseite des Mikroskoptisches und so einstellen, daß der Laserstrahl durch die Basis der erhitzten Kulturschale in einem Winkel von 30 ° gerichtet RelativE auf die Ebene des Auslegers. </li><li> Schraube eine Quadranten-Photodetektormodul, auf XY Translations Stufen montiert, die an der Unterseite des Mikroskoptisches und die Position, so dass der reflektierte Laserstrahl landet in der Mitte der 4 Quadranten. Abbildung 2 gibt einen Überblick über die Hardware einrichten die für die Durchführung des beschriebenen Protokolls. </li><li> Schreiben Sie ein Software-Programm, um die Linearantriebe, die über den Auslegern scannen steuern. Schreiben des Software-Programms mit Bezug auf das Flußdiagramm in Figur 3 versehen. Die für die Verwendung mit diesem System programmiert graphische Schnittstelle ist in Figur 4 vorgesehen. </li></ol> 4. Aufnahme Cantileverauslenkung Daten <ol><li> Schalten Sie den Freischwinger-Analyse-Hardware und der zugehörigen Software. </li><li> Legen Sie die beheizten Bühne Thermistor in das Medium und warten, bis es 37 ° C zu lesen. </li><li> Legen Sie die Cantilever-Chip in die Stufe mit der cantilevers in Richtung der rechten Seite der Bühne ausgerichtet. </li><li> Schalten Sie das Mikroskop-Lichtquelle. </li><li> Fokussieren Sie das Mikroskop, um die Kanten der Ausleger in den Blick zu bringen und mit dem Laser / Photodetektor Steuerungssoftware, um den Laserstrahl an der Spitze des Auslegers 1. HINWEIS Position: Unter der Annahme, die Ausleger sind auf der rechten Seite der Bühne, Freischwinger 1 ausgerichtet ist die in der oberen linken Ecke des Arrays positioniert und Zahlen laufen auf 16 in der unteren linken. Cantilever 17 ist in der oberen rechten Position und läuft bis 32 in der unteren rechten (5A). </li><li> Drücken Sie &quot;Play&quot; auf der Recording-Software. </li><li> Positionieren des Fotodetektors, so dass der Signalpegel &quot;0&quot; in sowohl x als auch y-Rahmen, indem die Schrittmotoren Steuerung des Photodetektors. </li><li> Set Freischwinger 1 Position in der Laser / Photodetektor Steuersoftware (Abbildung 4). </li><li> Bewegen Sie den Laser auf die Spitze des Auslegers 16, wiederholen Sie Schritt 4.7., Und legen cantilevER 16 Position in der Laser / Photodetektor Steuerungssoftware. </li><li> Bewegen Sie den Laser auf die Spitze des Auslegers 32, wiederholen Sie Schritt 4.7., Und setzen Ausleger 32 Position in der Laser / Photodetektor Steuerungssoftware. </li><li> Bewegen Sie den Laser auf die Spitze des Auslegers 17, wiederholen Sie Schritt 4.7., Und setzen Ausleger 17 Position in der Laser / Photodetektor Steuerungssoftware. </li><li> Schalten Sie das Mikroskop Lichtquelle und das Deckenlicht im Labor. </li><li> Drücken Sie auf &quot;Record&quot; auf der Recording-Software. </li><li> Stellen Sie den Impulsgenerator Hardware bis 40 ms, 5 V Impulse mit einer Frequenz von 1 Hz, und schalten Sie das Gerät ein. HINWEIS: Optional, beschäftigen optimierte Stimulationsprotokolle für bestimmte Zellquellen an dieser Stelle, die angegebenen Einstellungen sind Leitlinien auf der Basis gesammelter Daten mit Hilfe von Mensch und Nagetier-Zellquellen 12,13,15,16. </li><li> Mit dem Laser / Photodetektor Steuerungssoftware, setzen Sie die Hardware, um über die 32 Freischwinger Array scannen, Anhalten für 5 Sekunden bei jedem aufe. </li><li> Wenn der Scan der 32 Ausleger abgeschlossen ist, schalten Sie den Stimulator, dann stoppen Sie die Aufnahme-Software und bringen Sie die Datendatei. </li><li> Untersuchen Sie die aufgezeichneten Trace von jedem Ausleger zum Nachweis von Kontraktion. Notieren Sie jedes Frei mit positiven Antworten. Einer Kontraktion wird als Peak bezeichnet, wenn die Durchbiegung mindestens 0,1 V über der Basislinie. </li><li> Entfernen Sie alle nicht mehr reagiert Ausleger aus der Scan-Protokoll auf der Laser / Photodetektor Steuerungssoftware. </li><li> Die aktiven Ausleger können dann ohne Stimulation, um eine Lesung der spontanen Kontraktionsaktivität der Zelle erhalten erneut gescannt werden. </li><li> Führen Scans mit oder ohne weites Feld elektrische Stimulation nach Zugabe einer therapeutischen Verbindung zu dem Medium, um ihre Wirkung auf die funktionelle Leistung der kultivierten Zellen zu beobachten. </li><li> Zuführen Müdigkeit Einschätzungen von elektrischen Stimulation der Zellen über einen längeren Zeitraum und Scanebenen contr<html> actility zu messen, wie lange es dauert, Spitzenkraft unter einen bestimmten Schwellenwert fällt. </li><li> In Experimenten, in denen Motorneuronen in Co-Kultur mit Muskel gehalten wird, zu messen neuromuskulären Verbindungsbildung durch Behandlung von Motoneuronen-Myotuben Ausleger Co-Kulturen mit einem neuronalen Stimulans (wie Glutamat) oder synaptische Inhibitor (zB D-Tubocurarin) und Scannen und Zunahmen und Abnahmen der Spontanaktivität bzw. 16. </li><li> Führen bestimmte Abtastungen, wie durch die Anforderungen der geplanten Experimenten bestimmt. </li></ol> 5. Analyse der Daten Cantileverauslenkung <ol><li> Verwendung modifizierter Stoney-Gleichungen 15 (siehe unten), um rohe Cantileverauslenkung Daten (in Volt) in eine Auslesung der Stress in der Zellschicht oder Myotube (in Pascal) und eine direkte Messung der zellulären Kontraktionskraft (in nano-Newton) zu konvertieren: ad / 51866 / 51866eq1.jpg &quot;/&gt; Gleichung 1 <img alt="Gleichung 2" fo:content-width="2in" width="300" src="/files/ftp_upload/51866/51866eq2.jpg" /> Gleichung 2 </li><li> Wobei δ = Auslegerspitzenbiegung und Spannung durch die Myotuben hergestellt, σ c = Spannung, die durch die Myotuben hergestellt, unter der Annahme einer gleichförmigen dicken Film über die gesamte Breite des freitragenden, C = der Detektorsystem-spezifischen Koeffizienten in Bezug Spannung der Laserposition auf dem Foto -Detektor, θ = der Winkel der Laser und der Detektor relativ zu der Ebene des Auslegers, E Si = die Elastizitätsmoduls von Silizium, Si t = die Dicke des Auslegers, t f = Myotuben Dicke, V Si = Verhältnis Giftes Silizium, L = Länge Ausleger, P = Weglänge des Lasers von Cantileverspitze zu Detektor und w <sub&gt; Si = die Breite des Auslegers. Eine schematische Erläuterung, die in diesen Gleichungen verwendeten Begriffe ist in 6 vorgesehen. </li><li> Angenommen, die Myotuben wird ein gleichmäßiger Film ist die Kraft in der Myotuben gleich der Kraft in dem Film, was zu Gleichung 3 durch Gleichsetzen der Berechnung der Kraft von Stress und die angenommene Zellquerschnittsfläche, die für die Anwendung der Stoney verwendet wurde Gleichung. <img alt="Gleichung 3" fo:content-width="1.5in" src="files/ftp_upload/51866/51866eq3.jpg" /> Gleichung 3 </li><li> Folgenden Funktionsdatenerfassung, beheben Cantilever-Chips für immunzytochemische Analyse oder nutzen Zellen für Proteine ​​oder DNA-Analyse unter Verwendung von Standardverfahren. </li><li> Optional liefern die Zellen in den Inkubator statt der Vorbereitung für die molekulare Analyse, um funktionale Leistung zu einem späteren Zeitpunkt, neu zu bewerten. </li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+and+morphological+characterization+of+rat+embryonic+motor+neurons+in+a+defined+system.">Electrophysiological and morphological characterization of rat embryonic motor neurons in a defined system.</a> Biotechnology progress. 19, 1756-1761 (2003).</li><li>Rumsey, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Node+of+Ranvier+formation+on+motor+neurons+in+vitro.">Node of Ranvier formation on motor neurons in vitro.</a> Biomaterials. 30, 3567-3572 (2009).</li><li>Murugan, R., Molnar, P., Rao, K. P., Hickman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterial+Surface+patterning+of+self+assembled+monolayers+for+controlling+neuronal+cell+behavior.">Biomaterial Surface patterning of self assembled monolayers for controlling neuronal cell behavior.</a> International journal of biomedical engineering and technology. 2, 104-134 (2009).</li><li>Guo, X., Johe, K., Molnar, P., Davis, H., Hickman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+human+fetal+spinal+cord+stem+cell+line,+NSI-566RSC,+and+its+induction+to+functional+motoneurons.">Characterization of a human fetal spinal cord stem cell line, NSI-566RSC, and its induction to functional motoneurons.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 4, 181-193 (2010).</li><li>Varghese, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+target+for+amyloid+beta+toxicity+validated+by+standard+and+high-throughput+electrophysiology.">A new target for amyloid beta toxicity validated by standard and high-throughput electrophysiology.</a> PLoS ONE. 5, e8643 (2010).</li><li>Natarajan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+cardiomyocytes+on+microelectrode+arrays+as+a+functional,+high+information+content+drug+screening+platform.">Patterned cardiomyocytes on microelectrode arrays as a functional, high information content drug screening platform.</a> Biomaterials. 32, 4267-4274 (2011).</li><li>Davis, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+Cortical+Oligodendrocyte-Embryonic+Motoneuron+Co-Culture:+An+Axon-Oligodendrocyte+Interaction+Model.">Rat Cortical Oligodendrocyte-Embryonic Motoneuron Co-Culture: An Axon-Oligodendrocyte Interaction Model.</a> Journal of biomaterials and tissue. 2, 206-214 (2012).</li><li>Natarajan, A., DeMarse, T., Molnar, P., Hickman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+In+Vitro+Feed-Forward+Networks.">Engineered In Vitro Feed-Forward Networks.</a> J Biotechnol Biomater. 3, 2 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die kritischen Schritte bei der Analyse von Mikrobiegebalken zum Nachweis der zellulären Kontraktion sind die Anordnung der Auslegerchip innerhalb des Mikroskoptisch, und die nachfolgende Ausrichtung des Lasers und Photodetektors mit der Spitze der Ecke Auskragungen in der Anordnung. Wenn dies nicht genau durchgeführt, dann wird die Software nicht in der Lage, die Positionen der übrigen Cantilever in der Anordnung zu extrapolieren, bei der Datensammlung potentiell zu einer Akkumulation von falschen Negativen führen....

The in vitro culture of muscle cells from both human and rodent sources has been possible for decades1,2. However, while standard coverslip preparations are useful for biochemical assessment, they do not facilitate analysis of the cell&#8217;s primary functional output (contractility), and therefore are of somewhat limited value as a means to assess cellular maturation and performance. In order to maximize the amount of data obtainable from such in vitro cultures, it is necessary to advance the development of systems capable of housing such cells in configurations that permit the real-time assessment of their functional performance. The establishment of a multitude of three dimensional muscle models has made some progress toward fulfilling this need, and such systems have been used in a number of publications as a means to assess the contractile capacity of cultured muscle cells in vitro3-5. While such systems are invaluable for tissue modeling and reconstruction studies, they are limited in their applicability for studies of single cell responses. In such cases where single fiber studies are necessary, complex and labor intensive ex vivo methodologies remain the only option6-10. Furthermore, current movement toward the development of complex, multi-organ platforms for drug development and screening protocols requires the establishment of systems which are non-invasive, easily scalable and which integrate readily with supporting cells and tissue models11. 
Microscale cantilevers offer a simple method for assessing the functional contractile capacity of single cells/small populations of cells12,13. The technique is based on modified Atomic Force Microscopy (AFM) technology14, and uses a laser and photo-detector system to measure microscale cantilever deflection in response to cultured myotube contractile activity. Modified Stoney&#8217;s equations are then used to calculate stress in the myotube, and the force exerted by the myotube in order to generate the observed substrate deflection15. A scanning program has been written which enables simultaneous assessment of multiplexed cantilever arrays, offering potential moderate to high through-put applications for drug toxicity/efficacy studies15,16. Such technology may prove invaluable in the development of functional, pre-clinical assays for predicting drug efficacy in vivo. Furthermore, fabrication of cantilever chips in silicon does not impede post analysis processing of cells for standard biomolecular assays such as immunostaining, western blotting and PCR. 
This manuscript provides detailed instructions on the fabrication and preparation of microscale silicon cantilevers, the hardware and software set-up, and the operating guidelines for assessing the functionality of contractile cells cultured on these chips. Standard cell culture techniques can be implemented for plating and maintenance of cells on these surfaces, hence any contractile cell type for which reliable culture parameters exist should be able to integrate with this device with ease. The relatively simple 2D culture parameters utilized in this system makes integration of other cell models or addition of cell types that can interact with muscle (such as innervating neurons) straight-forward, greatly increasing the applicability of this model in the development of more complex functional in vitro assays and multi-organ models of mammalian systems.

<table><tbody><tr><td>Primary rat muscle growth medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>1x</td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>1x</td></tr><tr><td>G5 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17503-012</td><td>1x</td></tr><tr><td>Glial-Derived Neurotrophic Factor</td><td>Cell sciences</td><td>CRG400B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Brain-Derived Neurotrophic Factor</td><td>Cell sciences</td><td>CRB600B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Ciliary Neurotrophic Factor</td><td>Cell sciences</td><td>CRC400A</td><td>40 ng/ml</td></tr><tr><td>Neurotrophin-3</td><td>Cell sciences</td><td>CRN500B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Neurotrophin-4</td><td>Cell sciences</td><td>CRN501B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Acidic Fibroblast Growth Factor</td><td>Life Technologies</td><td>13241-013&amp;nbsp;</td><td>25 ng/ml</td></tr><tr><td>Cardiotrophin-1</td><td>Cell sciences</td><td>CRC700B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Heparin Sulphate</td><td>Sigma</td><td>D9809&amp;nbsp;</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor</td><td>Sigma</td><td>L5158&amp;nbsp;</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Sigma</td><td>V0132</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>Primary rat muscle differentiation medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NB Activ 4</td><td>Brain Bits LLC</td><td>NB4-500</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Class 2 red diode laser</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photo-detector</td><td>Noah Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Model 2100 Pulse stimulator</td><td>A-M systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B Digitizer</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp microscope and stage</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Delta T4 culture dish controller</td><td>Bioptechs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axoscope software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW software</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&lt;sup&gt; o&lt;/sup&gt;C, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>NAPCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Class 2 microbiological flow hood</td><td>Labconco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes and tips</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

utilization of microscale silicon cantilevers to assess cellular contractile function in vitro

Die Entwicklung von mehr vorausschauende und biologisch relevanten in-vitro-Tests liegt auf der Weiterentwicklung der vielseitigen Zellkultursysteme, die die funktionelle Beurteilung der gesetzten Zellen zu erleichtern sagt. Zu diesem Zweck bietet Mikrotechnik Ausleger eine Plattform, mit der die Funktionalität der Kontraktions einer Reihe von Zelltypen, einschließlich Skelett, Herz und Zellen der glatten Muskulatur zu messen, durch die Bewertung der Kontraktion induziert Substrat Biegen. Anwendung der gemultiplexten Auslegerarrays stellt die Mittel zur Entwicklung moderaten bis hohen Durchsatz Protokolle zur Beurteilung der Wirksamkeit von Medikamenten und Toxizität, Krankheits-Phänotyp und Progression sowie neuromuskuläre und andere Zell-Zell-Interaktionen. Diese Handschrift enthält die Details zur Herstellung zuverlässiger Cantilever-Arrays für diesen Zweck, und die erforderlich sind, um erfolgreich Kulturzellen auf diesen Flächen Methoden. Weitere Beschreibung über die notwendigen funktionalen anal führen Sie die Schritte vorgesehenlyse von kontraktilen Zelltypen auf solche Arrays mit einem neuartigen Laser-und Foto-Detektor-System gepflegt. Die repräsentativen Daten zur Verfügung gestellt Highlights die Präzision und reproduzierbare Art der Analyse der Kontraktionsfunktion möglich mit diesem System, sowie die breite Palette von Studien, denen solche Technologie kann angewandt werden. Erfolgreiche weit verbreitete Annahme dieses Systems konnten die Ermittler stellen die Mittel, um eine schnelle, kostengünstige funktionelle Studien in vitro durchzuführen, was zu genaueren Vorhersagen von Gewebe Leistung, die Entwicklung der Krankheit und der Reaktion auf neue therapeutische Behandlung.

Erfolgreiche Kultur von kontraktilen Zellen Ausleger ist ein relativ einfaches Verfahren, unter Verwendung von Standard-Zellkulturtechniken (Abbildung 5). Der Anteil der Ausleger unterstützt Vertrags Zellen variiert je nach Zelltyp untersucht und spezifische Kulturtechnik beschäftigt. Verwendung von primären embryonalen Zellen aus Rattenhinterglieder abgeleitet wurden kontraktile Aktivität auf 12% der untersuchten Ausleger erfaßt wird (n = 4). Analyse der Kontraktionsfähigkeit unter Verwendung der...

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Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Mikro Siliziumcantilevern biegsam Kulturoberflächen zur Messung der Kontraktionskraft der Muskelzellen in vitro. Zellkontraktion bewirkt Cantilever Biege, die gemessen werden können, aufgezeichnet und umgerechnet in die Messwerte von Kraft und bietet eine nicht-invasive und skalierbaren System zur Messung Kontraktionsfunktion in vitro.

Nutzung von Microscale Siliziumcantilevern to Cellular Kontraktionsfähigkeit beurteilen<em&gt; In-vitro-</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

utilization-microscale-silicon-cantilevers-to-assess-cellular

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

10.2K Aufrufe.  University of Central Florida.  Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Mikro Siliziumcantilevern biegsam Kulturoberflächen zur Messung der Kontraktionskraft der Muskelzellen in vitro. Zellkontraktion bewirkt Cantilever Biege, die gemessen werden können, aufgezeichnet und umgerechnet in die Messwerte von Kraft und bietet eine nicht-invasive und skalierbaren System zur Messung Kontraktionsfunktion in vitro. 

Serie: Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration and cell-cell interactions. The two key parameters of cellular biomechanics are cellular deformability or stiffness and the ability of the cells to contract and generate force. Here we describe a quick and simple method to estimate cell stiffness by measuring the degree of membrane deformation in response to negative pressure applied by a glass micropipette to the cell surface, a technique that is called Micropipette Aspiration or Microaspiration.
Microaspiration is performed by pulling a glass capillary to create a micropipette with a very small tip (2-50 &mu;m diameter depending on the size of a cell or a tissue sample), which is then connected to a pneumatic pressure transducer and brought to a close vicinity of a cell under a microscope. When the tip of the pipette touches a cell, a step of negative pressure is applied to the pipette by the pneumatic pressure transducer generating well-defined pressure on the cell membrane. In response to pressure, the membrane is aspirated into the pipette and progressive membrane deformation or "membrane projection" into the pipette is measured as a function of time. The basic principle of this experimental approach is that the degree of membrane deformation in response to a defined mechanical force is a function of membrane stiffness. The stiffer the membrane is, the slower the rate of membrane deformation and the shorter the steady-state aspiration length.The technique can be performed on isolated cells, both in suspension and substrate-attached, large organelles, and liposomes.
Analysis is performed by comparing maximal membrane deformations achieved under a given pressure for different cell populations or experimental conditions. A "stiffness coefficient" is estimated by plotting the aspirated length of membrane deformation as a function of the applied pressure. Furthermore, the data can be further analyzed to estimate the Young's modulus of the cells (E), the most common parameter to characterize stiffness of materials. It is important to note that plasma membranes of eukaryotic cells can be viewed as a bi-component system where membrane lipid bilayer is underlied by the sub-membrane cytoskeleton and that it is the cytoskeleton that constitutes the mechanical scaffold of the membrane and dominates the deformability of the cellular envelope. This approach, therefore, allows probing the biomechanical properties of the sub-membrane cytoskeleton.

Here we describe a quick and simple method to measure cell stiffness. The general principle of this approach is to measure membrane deformation in response to well-defined negative pressure applied through a micropipette to the cell surface. This method provides a powerful tool to study biomechanical properties of substrate-attached cells.

Mikropipette Aspiration von Substrat-attached Cells zu schätzen Zelle Stiffness

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

Forschung

Biotechnik

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

Live Cell Imaging bei Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanical Property Measurements at the Nanoscale in Air and Fluid

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by the probe tip and its contact area with the sample can be quantified, it is possible to determine the nanoscale mechanical properties (e.g., elastic or Young&#39;s modulus) of the surface being probed. A detailed procedure for performing quantitative AFM cantilever-based nanoindentation experiments is provided here, with representative examples of how the technique can be applied to determine the elastic moduli of a wide variety of sample types, ranging from kPa to GPa. These include live mesenchymal stem cells (MSCs) and nuclei in physiological buffer, resin-embedded dehydrated loblolly pine cross-sections, and Bakken shales of varying composition.
Additionally, AFM cantilever-based nanoindentation is used to probe the rupture strength (i.e., breakthrough force) of phospholipid bilayers. Important practical considerations such as method choice and development, probe selection and calibration, region of interest identification, sample heterogeneity, feature size and aspect ratio, tip wear, surface roughness, and data analysis and measurement statistics are discussed to aid proper implementation of the technique. Finally, co-localization of AFM-derived nanomechanical maps with electron microscopy techniques that provide additional information regarding elemental composition is demonstrated.

Quantifying the contact area and force applied by an atomic force microscope (AFM) probe tip to a sample surface enables nanoscale mechanical property determination. Best practices to implement AFM cantilever-based nanoindentation in air or fluid on soft and hard samples to measure elastic modulus or other nanomechanical properties are discussed.

Rasterkraftmikroskopie Cantilever-basierte Nanoindentation: Messungen mechanischer Eigenschaften auf der Nanoskala in Luft und Flüssigkeit

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by ...

Ingenieurwesen

Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been proven to be useful substrates for culturing cells in a physical microenvironment that partially mimics in vivo conditions. Here, we present a simple protocol for characterizing the Young's moduli of isotropic linear elastic substrates typically used for mechanobiology studies. The protocol consists of preparing a soft silicone substrate on a Petri dish or stiff silicone, coating the top surface of the silicone substrate with fluorescent beads, using a millimeter-scale sphere to indent the top surface (by gravity), imaging the fluorescent beads on the indented silicone surface using a fluorescence microscope, and analyzing the resultant images to calculate the Young's modulus of the silicone substrate. Coupling the substrate's top surface with a moduli extracellular matrix protein (in addition to the fluorescent beads) allows the silicone substrate to be readily used for cell plating and subsequent studies using traction force microscopy experiments. The use of stiff silicone, instead of a Petri dish, as the base of the soft silicone, enables the use of mechanobiology studies involving external stretch. A specific advantage of this protocol is that a widefield fluorescence microscope, which is commonly available in many labs, is the major equipment necessary for this procedure. We demonstrate this protocol by measuring the Young's modulus of soft silicone substrates of different elastic moduli.

Substrates with stiffness in the kilopascal-range are useful to study the response of cells to physiologically relevant micro-environment stiffness. Using just a widefield fluorescence microscope, the Young's modulus of soft silicone gels can be determined using an indentation with a suitable sphere.

Messung der Steifigkeit weichem Silikon Substrate für Mechanobiology Studien mit einem Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the effect of applied extracellular tensile strain on cell populations in vitro via biochemical assays, a device has previously been designed which can be fabricated simply and is small enough to fit inside tissue culture incubators, as well as on top of microscope stages. However, the previous design of the polydimethylsiloxane substratum did not allow high-resolution subcellular imaging via oil-immersion objectives. This work describes a redesigned geometry of the polydimethylsiloxane substratum and a customized imaging setup that together can facilitate high-resolution subcellular imaging of live cells while under applied strain. This substratum can be used with the same, earlier designed device and, hence, has the same advantages as listed above, in addition to allowing high-resolution optical imaging. The design of the polydimethylsiloxane substratum can be improved by incorporating a grid which will facilitate tracking the same cell before and after the application of strain. Representative results demonstrate high-resolution time-lapse imaging of fluorescently labeled nuclei within strained cells captured using the method described here. These nuclear dynamics data give insights into the mechanism by which applied tensile strain promotes differentiation of oligodendrocyte progenitor cells.&#160;

Using a previously designed device to apply mechanical strain to adherent cells, this paper describes a redesigned substratum geometry and a customized apparatus for high-resolution single-cell imaging of strained cells with a 100x oil immersion objective.

Hochauflösende Bildgebung von Kerndynamik in Live-Zellen unter Uniaxialer Tensile-Straße

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

Simplified, High-throughput Analysis of Single-cell Contractility using Micropatterned Elastomers

Cellular contractile force generation is a fundamental trait shared by virtually all cells. These contractile forces are crucial to proper development, function at both the cellular and tissue levels,and regulate the mechanical systems in the body. Numerous biological processes are force-dependent, including motility, adhesion, and division of single-cells, as well as contraction and relaxation of organs such as the heart, bladder, lungs, intestines, and uterus. Given its importance in maintaining proper physiological function, cellular contractility can also drive disease processes when exaggerated or disrupted. Asthma, hypertension, preterm labor, fibrotic scarring, and underactive bladder are all examples of mechanically driven disease processes that could potentially be alleviated with proper control of cellular contractile force. Here, we present a comprehensive protocol for utilizing a novel microplate-based contractility assay technology known as fluorescently labeled elastomeric contractible surfaces (FLECS), that provides simplified and intuitive analysis of single-cell contractility in a massively scaled manner. Herein, we provide a step-wise protocol for obtaining two six-point dose-response curves describing the effects of two contractile inhibitors on the contraction of primary human bladder smooth muscle cells in a simple procedure utilizing just a single FLECS assay microplate, to demonstrate proper technique to users of the method. Using FLECS Technology, all researchers with basic biological laboratories and fluorescent microscopy systems gain access to studying this fundamental but difficult-to-quantify functional cell phenotype, effectively lowering the entry barrier into the field of force biology and phenotypic screening of contractile cell force.

This work presents a flexible protocol for utilizing fluorescently labeled elastomeric contractible surfaces (FLECS) Technology in microwell format for simplified, hands-off quantification of single-cell contractile forces based on visualized displacements of fluorescent protein micropatterns.

Vereinfachte Hochdurchsatzanalyse der Einzelzellkontraktilität mit mikrostrukturierten Elastomeren

Cellular contractile force generation is a fundamental trait shared by virtually all cells. These contractile forces are crucial to proper development, ...

Mechano-Node-Pore Sensing: A Rapid, Label-Free Platform for Multi-Parameter Single-Cell Viscoelastic Measurements

Cellular mechanical properties are involved in a wide variety of biological processes and diseases, ranging from stem cell differentiation to cancer metastasis. Conventional methods for measuring these properties, such as atomic force microscopy (AFM) and micropipette aspiration (MA), capture rich information, reflecting a cell's full viscoelastic response; however, these methods are limited by very low throughput. High-throughput approaches, such as real-time deformability cytometry (RT-DC), can only measure limited mechanical information, as they are often restricted to single-parameter readouts that only reflect a cell's elastic properties. In contrast to these methods, mechano-node-pore sensing (mechano-NPS) is a flexible, label-free microfluidic platform that bridges the gap in achieving multi-parameter viscoelastic measurements of a cell with moderate throughput. A direct current (DC) measurement is used to monitor cells as they transit a microfluidic channel, tracking their size and velocity before, during, and after they are forced through a narrow constriction. This information (i.e., size and velocity) is used to quantify each cell's transverse deformation, resistance to deformation, and recovery from deformation. In general, this electronics-based microfluidic platform provides multiple viscoelastic cell properties, and thus a more complete picture of a cell's mechanical state. Because it requires minimal sample preparation, utilizes a straightforward electronic measurement (in contrast to a high-speed camera), and takes advantage of standard soft lithography fabrication, the implementation of this platform is simple, accessible, and adaptable to downstream analysis. This platform's flexibility, utility, and sensitivity have provided unique mechanical information on a diverse range of cells, with the potential for many more applications in basic science and clinical diagnostics.

Presented here is a method to mechanically phenotype single cells using an electronics-based microfluidic platform called mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). This platform maintains moderate throughput of 1-10 cells/s while measuring both the elastic and viscous biophysical properties of cells.

Mechano-Node-Pore Sensing: Eine schnelle, markierungsfreie Plattform für viskoelastische Multiparameter-Einzelzellmessungen

Cellular mechanical properties are involved in a wide variety of biological processes and diseases, ranging from stem cell differentiation to cancer ...

Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate underlying a cell must be manipulated. While hydrogels with graded stiffness and long-term migration assays have proven useful in durotaxis studies, immediate, acute responses to local changes in substrate tension allow focused study of individual cell movements and subcellular signaling events. To repeatably test the ability of cells to sense and respond to the underlying substrate stiffness, a modified method for application of acute gradients of increased tension to individual cells cultured on deformable hydrogels is used which allows for real time manipulation of the strength and direction of stiffness gradients imparted upon cells in question. Additionally, by fine tuning the details and parameters of the assay, such as the shape and dimensions of the micropipette or the relative position, placement, and direction of the applied gradient, the assay can be optimized for the study of any mechanically sensitive cell type and system. These parameters can be altered to reliably change the applied stimulus and expand the functionality and versatility of the assay. This method allows examination of both long term durotactic movement as well as more immediate changes in cellular signaling and morphological dynamics in response to changing stiffness.

Mechanical forces are important for controlling cell migration. This protocol demonstrates the use of elastic hydrogels that can be deformed using a glass micropipette and a micromanipulator to stimulate cells with a local stiffness gradient to elicit changes in cell structure and migration.

Einzelzelle Durotaxis Assay zur Beurteilung der mechanischen Steuerung der zellulären Bewegung und verwandter Signalereignisse

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...

Biologie

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of serially linked sarcomeres, the smallest contractile units in muscle. Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in patients with mutations in genes encoding for sarcomeric proteins. The study of myofibril mechanics allows for the assessment of actin-myosin interactions without potential confounding effects of damaged, adjacent myofibrils when measuring the contractility of single muscle fibers. Ultrastructural damage and misalignment of myofibrils might contribute to impaired contractility. If structural damage is present in the myofibrils, they likely break during the isolation procedure or during the experiment. Furthermore, studies in myofibrils provide the assessment of actin-myosin interactions in the presence of the geometrical constraints of the sarcomeres. For instance, measurements in myofibrils can elucidate whether myofibrillar dysfunction is the primary effect of a mutation in a sarcomeric protein. In addition, perfusion with calcium solutions or compounds is almost instant due to the small diameter of the myofibril. This makes myofibrils eminently suitable to measure the rates of activation and relaxation during force production. The protocol described in this paper employs an optical force probe based on the principle of a Fabry-P&#233;rot interferometer capable of measuring forces in the nano-Newton range, coupled to a piezo length motor and a fast-step perfusion system. This setup enables the study of myofibril mechanics with high resolution force measurements.

Presented here is a protocol to assess the contractile properties of striated muscle myofibrils with nano-Newton resolution. The protocol employs a setup with an interferometry-based, optical force probe. This setup generates data with a high signal-to-noise ratio and enables the assessment of the contractile kinetics of myofibrils.

Isolieren von Myofibrils von Skelettmuskelbiopsien und Bestimmung der Kontraktilenfunktion mit einem Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

High-Throughput Contractile Measurements of Hydrogel-Embedded Intact Mouse Muscle Fibers Using an Optics-Based System

In vitro cell culture is a powerful tool to assess cellular processes and test therapeutic strategies. For skeletal muscle, the most common approaches involve either differentiating myogenic progenitor cells into immature myotubes or the short-term ex vivo culture of isolated individual muscle fibers. A key benefit of ex vivo culture over in vitro is the retention of the complex cellular architecture and contractile characteristics. Here, we detail an experimental protocol for the isolation of intact flexor digitorum brevis muscle fibers from mice and their subsequent ex vivo culture. In this protocol, muscle fibers are embedded in a fibrin-based and basement membrane matrix hydrogel to immobilize the fibers and maintain their contractile function. We then describe methods to assess the muscle fiber contractile function using an optics-based, high-throughput contractility system. The embedded muscle fibers are electrically stimulated to induce contractions, after which their functional properties, such as sarcomere shortening and contractile velocity, are assessed using optics-based quantification. Coupling muscle fiber culture with this&#160;system allows for high-throughput testing of the effects of pharmacological agents on contractile function and ex vivo studies of genetic muscle disorders. Finally, this protocol can also be adapted to study dynamic cellular processes in muscle fibers using live-cell microscopy.

Skeletal muscle function can be assessed by quantifying the contractility of isolated muscle fibers, traditionally using laborious, low-throughput approaches. Here, we describe an optics-based, high-throughput method to quantify the contractility of hydrogel-embedded muscle fibers. This approach has applications for drug screening and therapeutic development.

Hochdurchsatz-Kontraktionsmessungen von Hydrogel-eingebetteten intakten Muskelfasern der Maus mit einem optikbasierten System

In vitro cell culture is a powerful tool to assess cellular processes and test therapeutic strategies. For skeletal muscle, the most common approaches ...

Nutzung von Microscale Siliziumcantilevern to Cellular Kontraktionsfähigkeit beurteilen

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