Yazarlar SEM görüntüleme için SU-8 üretimi ve Maria Becker (ISAS) Ulrich Marggraf (ISAS) müteşekkiriz. Araştırma mali Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), bir Bundesministerium für Bildung und Forschung hibe (Bmbf 0101-31P6541) tarafından ve Ministerium für Yenilik, Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen tarafından desteklenmiştir. Heike Hardelauf sayesinde Uluslararası Leibniz Enstitüsü &quot;Systems Biology Lab-on-a-Chip&quot; mali destek için.

Protokoller nörologlar için tasarlanmıştır, ve Şekil 2&#39;de özetlenmiştir. Gibi ticari ya da kurumsal tesisler için dış kaynaklı olduğunu PDMS çoğaltma için kullanılan SU-8 ustaları bu mikroimalat tavsiye ederiz. İki katman maskesi tasarımları Kimya sitesinde 12 Royal Society hakkında ek bilgi (ZIP) olarak serbestçe kullanılabilir. Önemli olarak, birinci tabaka, SU-8 2,5-3,0 um derinliğe kadar imal edilmiştir ve 25-30 um&#39;lik bir derinliğe kadar ikinci olmalıdır. Bu etkili nöron arraying için gerekli temel boyutları vardır. 3 mikron veya açısal nöronlar iki bölme 12 arasında taşınan veya göç önlemek için de gereklidir. PDMS&#39;nin 1. Mikroakışkan Cihaz Çoğaltma <ol><li> 10:1 &#39;lik bir oranda sertleştirme maddesi (184) ile iyice karıştırın PDMS prepolimer ve tipik olarak 20 dakika boyunca bir vakumlu desikatör içinde edilen karışım gaz çıkışına. Alternatif olarak, karışımı koymakbir 50 ml Falcon tüpüne ve düşük g kullanımı ture Gaz çıkışı için santrifüje. </li><li> 80 ° C ocak üzerinde 2 katmanlı mikrostrüktür SU-8 gofret yerleştirin ve gofret üzerindeki her bir aygıta polimer çerçeveleri hizalayın. ≥ 5 mm derinliğe çerçeve içine dökün ve PDMS&gt; 1 saat tam sertleşmesini sağlamak için ısı sağlar. </li><li> Tedavi kez, ocak gelen gofreti çıkarın ve düz bir yüzey üzerinde soğumasını bekleyin. </li><li> Nazikçe ödül gofret çerçeve ve PDMS için sert bir neşter ile (uzakta SU-8 mikroyapılarda itibaren) bir köşesinden koruyucu gözlük ve iş giyin. </li><li> Çerçevesinden PDMS kalıp kaldırmak ve aşırı PDMS&#39;nin cihaz Döşeme bir makas kullanın. PDMS ince bir film polimer çerçeve ile gofret yüzeyi arasında yayılır, bu sözde yanıp sönen sıklıkla üretilir. </li><li> Kalan PDMS tüm gofret uygulanır ve depolama sırasında gofretin korumak için tedavi edilebilir. Önceki sonraki cihaz kalıplama bu kaldırmak ve bunu yaparken herhangi bir p kaldırınyüzeyinden kirletici ifade. </li></ol> 2.. Cihaz Montaj ve Arabağlantı <ol><li> 3 mm çaplı biyopsi yumruk kullanarak 6 arayüzü liman hazırlayın. Iyi ışık koşullarında ve mikroakışkan kanalları ile limanların uyum yardım için yukarı bakacak mikrostrüktürlü özelliklere sahip, karanlık bir yüzey üzerinde çalışın. </li><li> Partiküller için aygıtı kontrol edin. Tersinir yapışkan bant kullanarak bu çıkarın. </li><li> , Bu esnek bir tabanı üzerine PDMS-sertleştirme ajanı karışımının (10:01, 601) küçük bir hacmi (~ 0.5 mi) dökülerek hazırlanır: mikroakışkan devresi, bir cam lamel üzerine monte edilen bir ince PDMS tabaka kullanılarak kapsüllenmiştir bakteriyolojik dereceli Petri. Yavaşça, PDMS tabakası üzerine bir lamel basarak birkaç dakika için ocak ve termal kür üzerine yerleştirin. Çabuk soğutulduktan sonra, Petri kabı lamel PDMS bilayeri kesip ödül için bir neşter kullanabilirsiniz. Gerekirse makasla kesin. </li><li> Plazma bağ PDMS cihazıve iyi bir sızdırmazlık üretmek için destek katmanı: Optimum koşullar alet özeldir. Örneğin, 40 saniye boyunca 0,2 mbar oksijen atmosferinde 70 W ve 40 kHz&#39;de çalışan bir plazma fırın mükemmel bir PDMS-PDMS bağı oluşturur. Plazma tedavi kez, her iki parçayı bastırarak ve tam bağ için bir dakika bırakın. </li><li> Pompaları ve şırınga ile arayüzü için silikon tüp (3,2 mm OD 1,6 mm ID) kullanın. </li></ol> 3.. Biyomateryal desenlendirilmesi mikroakışkan İşlemleri In situ biyomateryal modelleme, nöron kültür ve akışkan tedaviler için protokoller, Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51389/51389fig2highres.jpg" width="500" /> Şekil 2.. Illustrated mikroakışkan protokolleri. A) PL ve PLL-PEG-g-yapıya model verme; hücre yapışma tabakasının ilavesi (örn.,PL, yeşil), buharlaşma hizalanmış su maskeyi B) maruz PL Atmosferik hava plazma tedavisi üreten.; İki anten pin. C) PBS aspirasyon ile (mavi) ile yıkama PLL-PEG-g PL. D) Delivery (kırmızı ile plazma ile muamele edilmiş bölge kontamine olmasını önlemek için kullanılan pembe bir yıldız ile gösterilen plazma giriş anten ile kullanılır, ) kaplamak için aspirasyon plazma tedavi bölgeler E) Hücre yükleme ile.; aspirasyon hem komşu bölmelerin nöronların eşzamanlı microfluidic arraying, bir hidrostatik tahrikli akış G) İzole akışkan tedaviler kullanılarak F) medya (pembe) perfüzyon.; Bir test maddesi (siyah) çevresel tedavi aspirasyon ve aspirasyon ile alt merkez girişinden verilen H), merkezi işlemi ile alt yan girişten verdi. Şekil ve efsane Kimya Royal Society izni ile yeniden(RSC) 12. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51389/51389fig2highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> PDMS mikroakışkan kanalları yapıştırılarak hemen ardından plazma (temas açısı ≤ 5 °) derece hidrofilik vardır. Bu tip yüzeyler örneğin farklılaşmış insan SH-SY5Y nöron benzeri hücreler gibi hücre hatlarının yapışması ve kültürü için uygundur. Birincil nöronlar ve bu Lund mezensefalik insan hücre hattı (LUHMES), bir poliamin kaplama, polilisin (PL) veya poliornitin (PO) ya da ön-madde olarak nöronal hücre çizgilerinin kültürünün ex vivo kültür, bir elektrostatik çapa olarak gereklidir. Buna ek olarak bu, laminin ve fibronektin gibi yapışma proteinleri sıklıkla integrin arabirim kaplama olarak gereklidir. Ancak, PL ve PO kaplamalar kolayca dizi sitelerine mikroakışkan teslim engelleyen ve aynı zamanda istenmeyen kayma gerilmeleri heybetli, nöronlar bağlamak. Bu sorunu çözmek için-çip biyomateryaldesenlendirme tuzak siteler ve akıbet mikrokanalların de yapışma malzemeleri lokalize için gereklidir. Bu, aynı zamanda ara bölmesi bağlantılarının gelişimini teşvik eder ve yerel dolanması azaltır. Bu protokol, aynı zamanda proteinler ve nöronlar uzun kültür sırasında istenen yerle sınırlı olduğundan emin olmak için, komşu bölgelere PEG maddelerin eklenmesini içerir. Aşağıdaki protokol, Şekil 3 belgelenmiştir: <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51389/51389fig3highres.jpg" width="500" /> Şekil 3.. Su plazma neticede tarafından biyomalzeme desenlendirme için maskeleme. A) PDMS micropillars plazma neticede yerinde su menisküs çivileme ile su maskeleme sürecinin İllüstrasyon. Düşey düzlemde menisküsün eğrilik ihmal edilmiştir. B) su maske menisküs p kırmızı bir boya ile görüntülenmiştir ve konumlandırılmışprotein plazma neticede. D sonra görüntülü atış. C) desenli PL-FITC kaplama) eklenmesi plazma desenli PL-FITC kaplama reddeden ve hücre itici PLL-g-PEG-TRITC. Bu SH-SY5Y hücrelerinin kayıt için ve aynı zamanda LUHMES hücreler için ek bir katman fibronektin desenlendirme için kullanılmıştır. Şekil ve Kimya Royal Society (RSC) izni ile yeniden efsane 12. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51389/51389fig3highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <ol><li> Plazma neticede tarafından In-situ Biyomateryal Desenlendirme Su maskeleme <ol><li> Kısa bir süre sonra, plazma yapıştırma pipet orta alt bağlantı noktasına PL ya da PO (100 ug / ml içinde 1 x PBS) içinde bir 0.5 ul hacim. Birkaç saniye içinde tüm mikroakışkan devre kılcal hareket ile doldurulur. Birkaç dakika bekletin Polya ile tam kat hidrofil PDMS yüzeyler içinmayın. </li><li> 1 dakika boyunca (Şekil 2C bakınız) 1x PBS ile aspirasyon odaklı yıkanarak bağlanmamış poliamin molekülleri çıkarın. </li><li> Bağlantı noktaları tüm PBS çıkarın ve bir mikroskop ile aydınlatma aygıtı ısı. Bu hızlı su maske oluşumu için limanlarından buharlaşmayı artırır. Su maskesi (Şekil 3A&#39;da gösterilmiş ve Şekil 3B&#39;de belgelenen) ~ 5 dakika içinde kurulur. </li><li> Su maskeleme tamamlanmasını sağlamak üzere mikroskobu ile cihazı kontrol edin. Dizi sitenin üst rezervuar yapılar su maskesi (~ 15 dk) istikrarı uzatmak için maske tasarımı dahil unutmayınız. </li><li> Limanlar (Şekil 2B) içine paslanmaz çelik işaretçilerine yerleştirin. Bu boş mikroakışkan kanal içine 19,20 (2 MHz, 30 kV sinyal faaliyet, örneğin), atmosferik basınçta bir çift elle tutulan korona deşarjı ya da Tesla üreteci tarafından üretilen plazma için kullanılır. T ucu Noktao bir pim ve plazma ucuna yakın bir kaynak ≤ 1 saniye Mikrokanallı tedavi plazma. Plazma modelli gözlemlemek için düşük ışık koşullarında kullanın. </li><li> Bir yıkama kademesinden ile su maskeyi çıkarın. Üst 3 limanlardan paralel aspirasyon kullanın. Paralel aspirasyon ulaşmak için bir aspirasyon pompası 4-yollu bir adaptör ile bağlı silikon tüp 4 eşit uzunlukta kullanın. Aspirasyon başlatın ve mikroakışkan devre boyunca PBS çizmek için alt 3 liman içine PBS dağıtmak. Bu şekilde, bir PDMS-poliamin kontrast madde (Şekil 3C) üretilir. Mikroakışkan devreden PBS boşaltın ve yerli, hidrofobik durumunu geri yüklemek için birkaç saat bekletin. Bu hücre yapışması PDMS tam geçirgen olmayan işler. </li><li> Bu, laminin ve fibronektin gibi ek yapışma malzemeler, aşağıdaki adımlar hemen su maskenin kaldırılmasından sonra, gerekli olan ve yapılmalıdır ihtiyaç olmalıdır: Pipet greft kopolimerdir poli-L &#39;lik bir hacmi, 10 ul- Lizin-poli (etilen glikol) (PBS içinde PLL-PEG-g, 100 ug / ml) hem de alt yan kanal içine, 2 dakika boyunca, üst yan kanallarından aspirasyon ile izledi. </li><li> Akışını kesintiye uğratmadan, bir PBS tamponu ile değişimi ile aşırı PLL-g-PEG kaldırın. PEG ünitesi protein adsorpsiyonu ve hücre yapışmasını önlemek için hareket 17,21 ile bu kat seçici olmayan poliamin kaplı bölgeleri. </li><li> Bu, laminin ve fibronektin gibi yapışma proteinleri, daha sonra poli-amin kaplama ile ko-lokalize edilmiş olabilir: Bu ECM proteinleri (tipik olarak 10 ug / ml) pipetle 10 ul hacimli üç alt bağlantı noktalarına. Aygıt protein çözeltisi ile doldurulmuş ve kaliteli bir kaplama elde etmek için 1 saat boyunca inkübe kadar ilk üç limanlardan aspire. </li><li> Taban 3 limanlardan PBS aspire fazla proteinleri çıkarın. </li></ol></li><li> Mikroakışkan Tek Nöron arraying <ol><li> ÖDENEK ile Başbakan cihazlarmedya yedik. Alt 3 limanlarına 20 ul birimler eklemek ve üst üç limanlarından paralel aspirasyon hızla medya ile mikroakışkan devresini doldurun. Bir aspirasyon pompası eşit uzunlukta silikon tüp aracılığı ile çift için bir 4 yollu hortum konnektörü 3 üst bağlantı noktaları kullanın. </li><li> (Şekil 1 &#39;de 0,) yan giriş delikleri her birine bir ayrıştırılmış hücre süspansiyonu 20 ul (1 x 10 6 hücre / ml) ilave edin. </li><li> Bir akış regülatörü ile bir aspirasyon pompası donatmak veya üst 3 limanlarından nazik aspirasyon için bir şırınga kullanın. Komple nöron arraying tipik olarak 1 dakika gerektirir. </li><li> Sonraki mikroakışkan cihazlarda arraying için bir pipet ile 4 yan bağlantı noktası kalan nöronlar fazla hasat. </li><li> Boru çıkarın. Medya ile tüm portları doldurun ve inkübatör cihazı yerleştirin. Birkaç saat içinde hücreler, biyo materyal desen tamamen yapışkan hale gelir. </li></ol></li><li> Nöron Kültürü, Seçici Fluidic Tedavi ve Immunostaining <ol><li> Hidrostatik yem (2 mm kolon yükseklik farkı uygun şekilde yavaş olduğu) kullanarak periyodik perfüzyon ile medya değişimi. </li><li> Alternatif olarak, standart hücre kültürleri gibi (2-3 gün) periyodik medya alışverişi, medya mikroakışkan cihaz daldırın. </li><li> Aşağıdaki gibi nöron kültür bölmesinde veya merkezi nörit gelişimi bölmesine ya da tedavi için seçici akışkan elde edilir: ilgi kanalın alt portuna test maddesi 20 ul dağıtın ve hemen yukarıda limandan aspirat. Uzun süreli tedavi, bir akış düzenleme cihazı kullanıldığında akış oranını azaltmak ve gerektiği gibi test maddesini doldurmak için. </li><li> Immün protokoller her bir moleküler hedef ve bağlantılı reaktifler için değişir. Yavaş bir akış hızı kullanıldı nöronlara kesme kaynaklı hasar riskini karşı için. Bu, normal protokol kez uzanan tam sistem perfüze edilmesi için artan uygulama süresi ile sonuçlanır. Hy(2 mm örneğin) farklı sütun yüksekliği ile bağlantı noktalarını kullanarak drostatic perfüzyon reaktifleri teslim etmek için kullanılmıştır. Bir pompa kullanılarak Daha hızlı reajan ilave etme ve çıkarma deneysel zaman ölçekleri azaltmak için kullanılabilir. Alt 3 limanlarından reaktifleri çizmek için üst 3 portlarına bir aspirasyon pompası bağlayın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Campenot, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+control+of+neurite+development+by+nerve+growth+factor.">Local control of neurite development by nerve growth factor.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 74 (10), 4516-4519 (1997).</li><li>Campenot, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+sympathetic+neurons+in+compartmentalized+cultures.+I.+Local+control+of+neurite+growth+by+nerve+growth+factor.">Development of sympathetic neurons in compartmentalized cultures. I. Local control of neurite growth by nerve growth factor.</a> Dev Biol. 93 (1), 1-12 (1982).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+multicompartment+device+for+neuroscience+research.">Microfluidic multicompartment device for neuroscience research.</a> Langmuir. 19, 1551-1556 (2003).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat Methods. 2 (8), 559-565 (2005).</li><li>Kilinc, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian-like+degeneration+of+central+neurons+after+synchronized+and+geometrically+registered+mass+axotomy+in+a+three-compartmental+microfluidic+chip.">Wallerian-like degeneration of central neurons after synchronized and geometrically registered mass axotomy in a three-compartmental microfluidic chip.</a> Neurotox. Res. 19, 149-161 (2011).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporally+controlled+and+multifactor+involved+assay+of+neuronal+regeneration+after+chemical+injury+in+an+integrated+microfluidics.">Spatiotemporally controlled and multifactor involved assay of neuronal regeneration after chemical injury in an integrated microfluidics.</a> Anal. Chem. 84 (15), 6444-6453 (2012).</li><li>Kim, Y. T., Karthikeyan, K., Chirvi, S., Dave, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuro-optical+microfluidic+platform+to+study+injury+and+regeneration+of+single+axons.">Neuro-optical microfluidic platform to study injury and regeneration of single axons.</a> Lab Chip. 9, 2576-2581 (2009).</li><li>Hellman, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+axonal+injury+and+regeneration+in+micropatterned+neuronal+culture+using+pulsed+laser+microbeam+dissection.">Examination of axonal injury and regeneration in micropatterned neuronal culture using pulsed laser microbeam dissection.</a> Lab Chip. 10 (16), 2083-2092 (2010).</li><li>Kunze, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-pathological+connected+primary+neurons+in+a+microfluidic+device+for+Alzheimer+studies.">Co-pathological connected primary neurons in a microfluidic device for Alzheimer studies.</a> Biotechnol. Bioeng. 108 (9), 2241-2245 (2011).</li><li>Liu, W. W., Goodhouse, J., Jeon, N. L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+chamber+for+analysis+of+neuron-to-cell+spread+and+axonal+transport+of+an+alpha-herpesvirus.">A microfluidic chamber for analysis of neuron-to-cell spread and axonal transport of an alpha-herpesvirus.</a> PLoS One. 3 (6), (2008).</li><li>Markus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Varicella-Zoster+virus+(VZV)+infection+of+neurons+derived+from+human+embryonic+stem+cells:+Direct+demonstration+of+axonal+infection,+transport+of+VZV,+and+productive+neuronal+infection.">Varicella-Zoster virus (VZV) infection of neurons derived from human embryonic stem cells: Direct demonstration of axonal infection, transport of VZV, and productive neuronal infection.</a> J. Virol. 85 (13), 6220-6233 (2011).</li><li>Dinh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+construction+of+minimalistic+neuronal+co-cultures.">Microfluidic construction of minimalistic neuronal co-cultures.</a> Lab Chip. 13 (7), 1402-1412 (2013).</li><li>Tan, W. H., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+trap-and-release+integrated+microfluidic+system+for+dynamic+microarray+applications.">A trap-and-release integrated microfluidic system for dynamic microarray applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (4), 1146-1151 (2007).</li><li>Frimat, J. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+array+with+cellular+valving+for+single+cell+co-culture.">A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture.</a> Lab Chip. 11 (2), 231-237 (2011).</li><li>Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+enzyme+concentrations,+kinetics,+and+inhibition+analysis+using+high-density+hydrodynamic+cell+isolation+arrays.">Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays.</a> Anal. Chem. 78 (14), 4925-4930 (2006).</li><li>Frimat, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+network+formation+assay:+A+spatially+standardized+neurite+outgrowth+analytical+display+for+neurotoxicity+screening.">The network formation assay: A spatially standardized neurite outgrowth analytical display for neurotoxicity screening.</a> Lab Chip. 10, 701-709 (2010).</li><li>Hardelauf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fidelity+neuronal+networks+formed+by+plasma+masking+with+a+bilayer+membrane:+analysis+of+neurodegenerative+and+neuroprotective+processes.">High fidelity neuronal networks formed by plasma masking with a bilayer membrane: analysis of neurodegenerative and neuroprotective processes.</a> Lab Chip. 11 (16), 2763-2771 (2011).</li><li>Whitesides, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry.">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).</li><li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDMS+bonding+by+means+of+a+portable,+low-cost+corona+system.">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).</li><li>Frimat, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+stencilling+methods+for+cell+patterning.">Plasma stencilling methods for cell patterning.</a> Anal. Bioanal. Chem. 395 (3), 601-609 (2009).</li><li>Huang, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(L-lysine)-g-poly(ethylene+glycol)+layers+on+metal+oxide+surfaces:+surface-analytical+characterization+and+resistance+to+serum+and+fibrinogen+adsorption.">Poly(L-lysine)-g-poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: surface-analytical characterization and resistance to serum and fibrinogen adsorption.</a> Langmuir. 17, 489-498 (2001).</li><li>Li, N., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+topographical+and+biochemical+cues+by+axons+during+growth+on+microfabricated+3-D+substrates.">Integration of topographical and biochemical cues by axons during growth on microfabricated 3-D substrates.</a> Exp. Cell Res. 311 (2), 307-316 (2005).</li><li>Huang, L. R., Cox, E. C., Austin, R. H., Sturm, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+particle+separation+through+deterministic+lateral+displacement.">Continuous particle separation through deterministic lateral displacement.</a> Science. 304 (5673), 987-990 (2004).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+nanoparticle+functionality+and+toxicity+on+the+central+nervous+system.">A review of nanoparticle functionality and toxicity on the central nervous system.</a> J. R. Soc. Interface. 7, (2010).</li><li>Brenneman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+olfactory+transport+of+inhaled+manganese+((MnCl2)-Mn-54)+to+the+rat+brain:+Toxicokinetic+investigations+in+a+unilateral+nasal+occlusion+model.">Direct olfactory transport of inhaled manganese ((MnCl2)-Mn-54) to the rat brain: Toxicokinetic investigations in a unilateral nasal occlusion model.</a> Toxicol. Appl. Pharm. 169 (3), 238-248 (2000).</li><li>Magal&#227;es, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+neuritic+transport+of+scrapie+prion+protein+coincident+with+infection+of+neuronal+cells.">Uptake and neuritic transport of scrapie prion protein coincident with infection of neuronal cells.</a> J. Neurosci. 25 (21), 5207-5216 (2005).</li><li>Diogenes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+alpha-synuclein+oligomers+modulate+synaptic+transmission+and+impair+LTP+via+NMDA-receptor+activation.">Extracellular alpha-synuclein oligomers modulate synaptic transmission and impair LTP via NMDA-receptor activation.</a> J Neurosci. 32 (34), 11750-11762 (2012).</li><li>Egger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila.">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nat. Protoc. 8 (5), 958-965 (2013).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Mikroakışkan arraying teknik minimalist kültürleri kurulması için hassas tek bir nöron kullanım sağlar türünün ilk. Mikroakışkan yapılarla hücre desen hizalamak için in situ biyomateryal-yapıya model verme yöntemi, güçlü bir yaklaşım ile birleştiğinde, bu minimalistik kültürler azaltılmış yerel dolanması ile yüksek düzeyde intercompartment bağlantısı vardır. Basit bir tasarım değişiklikleri görselleştirme ve kantitatif analiz için tek tek aksonlar izole etmek...

<html> Nöronal doku oldukça karmaşıktır; uzaysal hücre kişiler ve özellikle akson ve dendrit çıkıntılar aracılığı ile tanımlanan katmanları ve bölmeler içinde ve plastik bağlantı ile sipariş heterojen bir hücre karışımı. Yeni teknikler derin anlayışlar ve hastalık, gelişme ve sağlıklı fonksiyonu merkezi unravel mekanizmaları kazanmak için daha fazla deneysel özgürlüğünü engellemediği için gereklidir. Campenot odası 1,2 ve daha yakın zamanda mikrofabrike düzenlemeleri 3,4 seçici olarak farklı somatik popülasyonları karıştırmayı ve aynı zamanda nörit çıkıntılar yeteneği ile ağ nöronal ko-kültürler ex vivo hazırlanması için kullanılabilir. Bu mikroakışkan cihazlar, örneğin kimyasal 5,6 ya da lazer axotomy 6-8, tauopathy 9, viral yayılması 10,11 ve akson 4 mRNA lokalizasyonu aşağıdaki akson dejenerasyon ve rejenerasyon incelemek için kullanılmıştır. ent &quot;&gt; Neurobiologists ulaşmak uzatmak için, teknolojik gelişmeler minimalist nöronal co-kültürler hazırlamaları gerekmektedir. Bu, tek hücre ve hücre altı hassas sistemin soruşturma için nöronal ağ çözülmesini sağlar. Minimal hücre sayıları için gereklilik, Parkinson hastalığı, kulak spiral gangliyon, periferik dopaminerjik nöronlar için ilgili substantia nigra hücreleri dahil seyrek hücre tipleri, analiz etmek ve kök hücreler imkanı açar. Bunun ötesinde, hücresel ekonomi 3R&#39;si girişimi alakalı. Bu mikroakışkan platformları, büyük ölçekli toksisite ekranları veya diğer yüksek verim kullanma, hayvan nöronlar gerektiren veri zengin deneysel serisi şimdi kabul edilebilir. Bu yazıda mikroakışkan cihazın imalatı ve kullanılması için protokolleri açıklanmıştır. In situ biomateri bir kombinasyon halinde mikroakışkan arrayingal desenleme yöntemi minimal hücre numaralarını kullanarak son derece birbirine bağlı nöronal ortak kültürlerin kayıt için kullanılabilir. Mikroakışkan arraying bir diferansiyel akış yaklaşım mikro yapılı pnömatik gevşetmeli bir yapı trans devresi (Şekil 1 &#39;de SEM görüntüleri ile birlikte gösterilmiştir) içinde yer alan bu sayede 12-15, dayanmaktadır. Nörit gelişimi kanal girişleri - yol 0 1 → mikrostrüktürlü delik doğrusal bir dizi nöronlar taşınması için alt akışkan bir direnç (R2&gt; R 1) sahiptir. Tek bir hücre tarafından tuzak doluluk yerel komşu tuzakları sonraki hücreleri yakalama için akıcılık aktarmak akışını engellemektedir. Dizideki tuzakları tam doluluk fazla nöron uzaklaştırılması için işlemin bir bypass moduna üretmek için kavisli bir yolda (0 → 2) içine akıcılık aktarmak için akışkan oranını (R 1&gt; R 2) geçer. Şekil 1.. Mikroakışkan Devre. Nörit gelişimi kanalları ile birbirine kültür odaları sınırdaş olan tek nöron arraying A) diferansiyel direnç akışkan devresi,. B, menisküs iğneleme micropillars ile iki tabakalı bölümlere nöron ko-kültür dizinin C) SEM görüntüleri. Bu tasarım sayesinde, trident şeklinde nöron hapsi yapılar nörit çıkıntılar fasikülasyon teşvik etmek için kullanılmıştır. Şekil ve Kimya Royal Society (RSC) izni ile yeniden efsane 12. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51389/51389fig1highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> Düzlemsel alt-tabakalar üzerinde micropatterned nöronal ağların hazırlanması kolayca exampl için (elde edilebilir<html> Bizim gruptan es, Frimat vd. 16 ve Heike ve diğ. 17) bkz. Ancak, PDMS cihazlar içinde ve microfluidic kanalları bu mikrometre çaplı uyum şartı ile biyoaktif malzeme desen özetleyen bir büyük bir teknik sorun teşkil etmektedir. Bölüm 3.1 &#39;de bir protokol in-çip ya da in situ olarak, biyo-malzeme desen hazırlanması sunulmuştur. Bu desenler uzun kültür timescales sırasında nöron kayıt etkinleştirmek ve bölmeler arasında çıkıntılar teşvik. Menisküs-çivileme mikro nöron siteleri ve nörit gelişimi kanalları arraying ile adlandırılan bir su maske hizalamak için kullanılır. Maruz kalan yüzeyleri, biyo materyal bir modelin oluşturulması için parçalandı oysa su maskesi, plazma muamelesi esnasında yapışma molekülü kaplamalar korur. Buna ek olarak, protokoller, hücre kültürü için ve farklı ko-kültür bölmelerin seçici tedavisi için gerekli olan akışkan izolasyonu için temin edilmiştir. ve_content &quot;&gt; protokoller Benzer şekilde, yerinde biyomalzeme desenleme buharlaşma ve yüzey gerilimi olayları istismar, basittir. poli çoğaltma (dimetilsiloksan) (PDMS) mikroakışkan cihazlar 18 için yumuşak litografi kullanıcı dostu ilkelerini güçlendirmek için tasarlanmıştır ve yalnızca ucuz bir el plazma kaynağı gerektiren. microfluidic devre bu operasyonları yapma etkili programlar hücre yükleme ve kompartman spesifik tedaviler sadece doğru alt portuna maddelerin dağıtımı ve yukarıdan aspire meselesi. Bu şekilde, bu neurobiologists vermek için tasarlanmıştır kendi laboratuarlarında microfluidic cihazlar hazırlamak ve kullanmak için özgürlük.

<table><tbody><tr><td>PDMS Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS Elastosil RT 601</td><td>Wacker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>VWR</td><td>630-1590</td><td>130-160 mm thick</td></tr><tr><td>3 mm biopsy punches</td><td>Kai Medical</td><td></td><td>Handle with care - extremely sharp</td></tr><tr><td>Tygon tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td>S-50-HL</td><td>1.65 mm ID; 3.35 mm OD</td></tr><tr><td>1 ml syringe (Inkjekt and Omnifix)</td><td>Braun</td><td>6064204</td><td></td></tr><tr><td>4-Way tubing connector</td><td>VWR or Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow regulator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>722645</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mm pins</td><td>Dressmaking Departments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLL-g-PEG</td><td>SuSoS</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)</td><td>Stability in storage can be an issue</td></tr><tr><td>poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Polylysine-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3069</td><td></td></tr><tr><td>Polyornithine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Inverted fluorescent microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Example aspiration pump</td><td>KNF Neuberger, Laboport</td><td>N811KVP</td><td></td></tr><tr><td>Hand held corona discharge device</td><td>Leybold-Heraeus, USA</td><td>VP23</td><td>May not comply with your country&#039;s safety standards</td></tr><tr><td>Femto plasma oven</td><td>Diener Electronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vacuum dessicator or centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of neuronal co-cultures with single cell precision

Campenot odasının mikrofluidik düzenlemeleri nörobilim eden büyük ilgi çekmiştir. Bunlar birbirine ko-kültür platformları enfeksiyon ve hastalık yayılması için gelişimsel ve fonksiyonel nörobiyoloji kapsayan, çeşitli sorular araştırmak için kullanılabilir. Ancak, geleneksel sistemleri önemli hücresel primer dopaminerjik substantia nigra, spiral ganglionlar ve Drosophilia melanogaster nöronlar gibi düşük bolluk hücrelerini inceleyerek yetersiz girdileri (bölmesi başına binlerce), ve yüksek verimlilik deney için pratik gerektirir. Kültürler de son derece yoğun yerel olarak iki kültür birbirine az çıkıntılar (&lt;% 10) ile, dolanmış edilir. (I) microfluidic tek nöron yöntemi arraying ve plazma desenlendirme biyomateryal kaplamalar REGI için (ii) bir su maskeleme yöntemi: Bu yazıda basit mikroakışkan ve desenlendirme protokoller bu sorunları ele tarif edilmiştirnöronlar ster ve bölmeler arasında gelişimini teşvik eder. Minimalistik nöronal ko-kültürler yüksek düzeyde (&gt; 85%) intercompartment bağlantısı ile hazırlandı ve tek bir hücre hassasiyet ile yüksek verimli neurobiology deneyleri için de kullanılabilir.

Su maskeleme patlatır yüzey gerilimi. Hava-sıvı arayüzünde basınç tolerans [eğrilik yarıçapına sahip ters terazi <img fo:content-width="1in" src="files/ftp_upload/51389/51389eq1.jpg" width="113" /> , Mikroakışkan boyutlarda son derece kararlı arabirimleri üreten. Micropillars etkin yerinde su maskesi çapa. Su maske oluşumu ısıtma artmış oranı ile, mikroakışkan limanlardan buharlaştırma ile tahrik edilir. Düşük büyütme (4X - 10X) gelen ısı kullanılarak mikroskop aydınlatma, su maske ti...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision at JoVE.com

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Tek bir nöron mikroakışkan arraying ve biyomalzeme kaplamaların içinde-çip plazma desenlendirme için su maskeleme için protokoller anlatılmıştır. Yüksek birbirine eş hücre kültürleri en az girişler kullanılarak hazırlanabilir.

Tek Hücre Hassas Nevronik Co-kültürler hazırlanması

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

preparation-of-neuronal-co-cultures-with-single-cell-precision

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K Görüntüleme.  ISAS.  Tek bir nöron mikroakışkan arraying ve biyomalzeme kaplamaların içinde-çip plazma desenlendirme için su maskeleme için protokoller anlatılmıştır. Yüksek birbirine eş hücre kültürleri en az girişler kullanılarak hazırlanabilir. 

Video: Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Gelişim Biyolojisi

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Grubuyla Fare Kortikal Nöron Kültürler hazırlanması

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Biyoloji

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

İlköğretim Rat Kortikal Nöronlar ve Glia bilaminar Co-kültür

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Nörobilim

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

Sıçan Embriyonik Nöral Hücre İzolasyonu ve Kültür: Bir Hızlı Protokol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA (&#947;-aminobutyric acid) is the predominant inhibitory neurotransmitter in the brain. It is released from the presynaptic terminals of inhibitory neurons within highly specialized intercellular junctions known as synapses, where it binds to GABAA receptors (GABAARs) present at the plasma membrane of the synapse-receiving, postsynaptic neurons. Activation of these GABA-gated ion channels leads to influx of chloride resulting in postsynaptic potential changes that decrease the probability that these neurons will generate action potentials. 
During development, diverse types of inhibitory neurons with distinct morphological, electrophysiological and neurochemical characteristics have the ability to recognize their target neurons and form synapses which incorporate specific GABAARs subtypes. This principle of selective innervation of neuronal targets raises the question as to how the appropriate synaptic partners identify each other. 
To elucidate the underlying molecular mechanisms, a novel in vitro co-culture model system was established, in which medium spiny GABAergic neurons, a highly homogenous population of neurons isolated from the embryonic striatum, were cultured with stably transfected HEK293 cell lines that express different GABAAR subtypes. Synapses form rapidly, efficiently and selectively in this system, and are easily accessible for quantification. Our results indicate that various GABAAR subtypes differ in their ability to promote synapse formation, suggesting that this reduced in vitro model system can be used to reproduce, at least in part, the in vivo conditions required for the recognition of the appropriate synaptic partners and formation of specific synapses. Here the protocols for culturing the medium spiny neurons and generating HEK293 cells lines expressing GABAARs are first described, followed by detailed instructions on how to combine these two cell types in co-culture and analyze the formation of synaptic contacts.

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

The molecular mechanisms that co-ordinate the formation of inhibitory GABAergic synapses during ontogeny are largely unknown. To study these processes,we have developed a co-culture model system which incorporates embryonic medium spiny GABAergic neurons cultured together with stably transfected human embryonic kidney 293 (HEK293) cells expressing functional GABAA receptors.

Co-kültür Model Birleşmeyle GABA&#39;erjik Orta Spiny Nöronlar ve HEK293 Hücreler inhibitör Synapse Oluşumu istikrarlı bir şekilde GABA ifade<sub&gt; A</sub&gt; Reseptörler

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

Dolaylı nöron astrosit Coculture Deneyi: Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Nöron glia Etkileşimleri Detaylı Soruşturma Set-up

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

A Scalable Method to Study Neuronal Survival in Primary Neuronal Culture with Single-cell and Real-Time Resolution

Neuronal loss is at the core of many neuropathologies, including stroke, Alzheimer's disease, and Parkinson's disease. Different methods were developed to study the process of neuronal survival upon cytotoxic stress. Most methods are based on biochemical approaches that do not allow single-cell resolution or involve complex and costly methodologies. Presented here is a versatile, inexpensive, and effective experimental paradigm to study neuronal survival. This method takes advantage of sparse fluorescent labeling of the neurons followed by live imaging and automated quantification. To this aim, the neurons are electroporated to express fluorescent markers and co-cultured with non-electroporated neurons to easily regulate cell density and increase survival. 
Sparse labeling by electroporation allows a simple and robust automated quantification. In addition, fluorescent labeling can be combined with the co-expression of a gene of interest to study specific molecular pathways. Here, we present a model of stroke as a neurotoxic model, namely, the oxygen-glucose deprivation (OGD) assay, which was performed in an affordable and robust homemade hypoxic chamber. Finally, two different workflows are described using IN Cell Analyzer 2200 or the open-source ImageJ for image analysis for semi-automatic data processing. This workflow can be easily adapted to different experimental models of toxicity and scaled up for high-throughput screening. In conclusion, the described protocol provides an approachable, affordable, and effective in vitro model of neurotoxicity, which can be suitable for testing the roles of specific genes and pathways in live imaging and for high-throughput drug screening.

Here, we present a simple, potent, and versatile methodology to investigate neuronal survival upon cytotoxic stress in primary cortical neurons with cellular resolution in real time or in fixed material.

Neuronal loss is at the core of many neuropathologies, including stroke, Alzheimer's disease, and Parkinson's disease. Different methods were developed to ...

 CNS Etkileşim Çalışmaları için Primer Mikroglia ve Nöron Ko-Kültür Protokolü

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS homeostasis. They are a major population of immune cells associated with CNS disease activity, adopting&#160;reactive phenotypes that potentially contribute to neuronal injury during chronic neurodegenerative diseases such as multiple sclerosis (MS). The distinct mechanisms by which microglia regulate neuronal function and survival during health and disease remain limited due to challenges in resolving the complex in vivo interactions between microglia, neurons, and other CNS environmental factors. Thus, the in vitro approach of co-culturing microglia and neurons remains a valuable tool for studying microglia-neuronal interactions. Here, we present a protocol to generate and co-culture primary microglia and neurons from mice. Specifically, microglia were isolated after 9-10 days in vitro from a mixed glia culture established from brain homogenates derived from neonatal mice between post-natal days 0-2. Neuronal cells were isolated from brain cortices of mouse embryos between embryonic days 16-18. After 4-5 days in vitro, neuronal cells were seeded in 96-well plates, followed by the addition of microglia to form the co-culture. Careful timing is critical for this protocol as both cell types need to reach experimental maturity to establish the co-culture. Overall, this co-culture can be useful for studying microglia-neuron interactions and can provide multiple readouts, including immunofluorescence microscopy, live imaging, as well as RNA and protein assays.

Yazar Spotlight: Hastalık Koşullarında Mikroglia-Nöronal Etkileşimleri İncelemek için İn Vitro Ko-Kültür Modeli

This protocol describes a microglia-neuronal co-culture established from primary neuronal cells isolated from mouse embryos at embryonic days 15-16 and primary microglia generated from the brains of neonatal mice at post-natal days 1-2.

Tek Hücre Hassas Nevronik Co-kültürler hazırlanması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım

Grubuyla Fare Kortikal Nöron Kültürler hazırlanması

İlköğretim Rat Kortikal Nöronlar ve Glia bilaminar Co-kültür

Sıçan Embriyonik Nöral Hücre İzolasyonu ve Kültür: Bir Hızlı Protokol

Co-kültür Model Birleşmeyle GABA'erjik Orta Spiny Nöronlar ve HEK293 Hücreler inhibitör Synapse Oluşumu istikrarlı bir şekilde GABA ifade

Dolaylı nöron astrosit Coculture Deneyi: Bir

A Scalable Method to Study Neuronal Survival in Primary Neuronal Culture with Single-cell and Real-Time Resolution

Murin Primer Mikroglia ve Kortikal Nöronların Üretilmesi ve Birlikte Kültürlenmesi

Murin Primer Mikroglia ve Kortikal Nöronların Üretilmesi ve Birlikte Kültürlenmesi

Murin Primer Mikroglia ve Kortikal Nöronların Üretilmesi ve Birlikte Kültürlenmesi