Yazarlar tekniğinin gelişimine ve yazının üretimine katkıda Dowling laboratuar üyeleri (Aaron Reifler, Trent Waugh, Angela Busta, ve William Telfer) teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Taubman Enstitüsü, Michigan Üniversitesi Pediatri Bölümü ve Müsküler Distrofi Derneği (JJD MDA186999) ve Sağlık Ulusal Enstitüsü (JJD 1K08AR054835) hibe kısmen tarafından finanse edildi.

1.. Poli-L-Lizin hazırlanması kaplı kapak (Süre: 1 saat) Kaplama lamelleri hızlı miyofiberde oluşan çökmesi ve yapışma sağlar. Bu miyofiberde oluşan izolasyonu (Adım 2) &#39;in ayrışma aşaması esnasında gerçekleştirilebilir. <ol><li> Kesme ve bir 60 mm Petri kabı (herhangi bir marka) altındaki Parafilm yerleştirin. </li><li> Bir 60 mm doku kültürü çanağı içinde Parafilm mikroskop kapak camı fişleri (12 mm çapında) yerleştirilir ya da 24 oyuklu plakalar, tekli oyuklar içerisinde tek tek yerleştirin. </li></ol> Not 1: Bu küçük yuvarlak lamelleri miyofiberde oluşan sayılar konsantre ve aşırı antikor kullanımını azaltmaya yardımcı olur. Not 2: Diğer boyutu lamelleri çalışacaktır ancak, kullanılan reaktif ve embriyoların hacimleri buna göre ayarlanması gerekir. <ol start="3"><li> Pipet Petri kabındaki her bir kapak camı ile ilgili poli-L-lizin çözeltisi (% 0.01) 50-200 ul. </li><li> Lamelleri en az bir ho oturmak için izin37 ° C&#39;de ur Uzun inkubasyon olumsuz sonuçlarını etkilemeyecektir. </li><li> Kapak cam, poli-L-lisin çözüm çıkarın ve 100 ul 1 x PBS, en az iki kez yıkayın. </li><li> Lamelleri kurumasını bekleyin. </li><li> Lameller şimdi myofibers için hazırız. </li></ol> Not 3: sterilite sağlamak için, kaplama, bir başlık ve otoklav lamelleri yapılabilir. Not 4: alt Parafilm ile 60 mm Petri kabı tutun. Bu kurulum miyofiberde oluşan kaplama ve immunolabeling (daha sonra adım) sırasında kullanılan olacaktır. Alternatif 1: Bunun yerine, kullanımdan hemen önce kaplama lamelleri, kaplanmış bir lamel stok kullanılabilir. 2 ml poli-L-lizin ihtiva eden en az bir 60 mm Petri kabı, çok sayıda lamelleri içeren 4 ° C&#39;de saklanabilir. Bu alternatif ile myofibers için lamelleri işlem aşamasında 1,5 başlar. Alternatif 2: Ayrıca, poli-L-omitin kat lamelleri. Tonun daha yoğun emek olmakla birlikte, poli-L-ornitin kaplı lamelleri UV muamele edilmiş olabilir, çünkü daha uzun süreli kültür için yararlıdır. UV tedavisi ve dikkatli steril tekniği ile canlı myofibers genellikle 4-7 gün kültür içinde muhafaza edilebilir. 2. Myofibers Zebra balığı Embriyolar ve Kaplama (: 1 ila 3 saat Süresi) Ayrışma Not: standart protokol 3 dpf&#39;e (gün sonrası fertilizasyon) embriyolar için en iyi geçerlidir. <ol><li> Standart bir 1.5 ml santrifüj tüpüne zebra balığı embriyo transferi ve mümkün olduğu kadar fazla balık suyu çıkarmak. Tipik olarak, daha az olsa da tüp başına 10-20 embriyo, kullanılabilir. Birden fazla 20-25 embriyo kullanılması genellikle aşırı bir yoğunluk hazırlanması ile sonuçlanır. <ol><li> Elle 5 forseps # kullanarak, önce disosiyasyonundan chorions çıkarın. Seçenek olarak ise, kimyasal koryon kaldırma 10-15 dakika Pronaz tedavisi ile elde edilir. Tipik olarak, koryon önceki kaldırma sadece gerektiğinde bir mut önceden onaykarınca fenotip veya morfoloji gereklidir, ya da aşamaları kullanırken embriyolar doğal koryon yumurtadan nerede. </li></ol></li><li> Embriyoları içeren tüp CO 2 bağımsız medya 900 ul ekleyin. </li><li> 100 kollajenaz tip II ul, nihai konsantrasyonu 3.125 mg / ml ayrışmasını başlatmak için (31.25 mg / 1x PBS içinde seyreltilmiş ml Stock at kolajenaz solüsyon) eklenir. Kollajenaz IV, aynı zamanda ayrılması için de kullanılabilir. </li><li> Orbital bir karıştırıcı üzerinde embriyolar döndürün ve toz haline getirme için bir P1000 Pipetman kullanılarak oda sıcaklığında 30 dakika çiğnemek. </li></ol> Not 2: Dikkatle embriyo ayrışmayı izlemek; (özellikle over) üzerinden veya ayrışma altında protokol başarısızlığın en yaygın nedenleri vardır. Sindirim için Times toz haline getirme, tüp başına embriyo sayısı ve embriyo yaşı yoğunluğuna bağlı olarak değişecektir. Ayrıca kas iskelet mutantlardan embriyolar için (doğal tür ile karşılaştırıldığında), genellikle daha azdır. Not3: embriyo yaş Ortalama sindirim süresi: = 1 saat 1 dpf, 2 dpf&#39;e = 1.5 saat, 3 dpf&#39;e = 2 hr ve = 2-2.5 saat 4 dpflik. <ol start="5"><li> Hayır bütün embriyolar görünür, ama sağlam parçaları hala görünür olduğunda sindirim Dur - Bu Overdigestion önlemek için şarttır. </li><li> Pelet hücrelere 3-5 dakika boyunca 0,8-2,3 xg&#39;de ayrışmış embriyolar ile santrifüj tüpleri. </li><li> Peletleşmiş hücrelerden süpernatant kaldırmak ve CO 2 bağımsız medya ile 2x yıkayın. </li><li> Hücrelerin tekrar süspansiyon taze CO 2 bağımsız medya ekleyebilirsiniz. 1 ml tipik haliyle, 10-20 embriyo preparatlarıyla için kullanılır. Hacmi embriyo sayısına göre ölçeklenebilir. </li><li> P1000 bir pipet kullanarak, 70 um&#39;lik bir filtreden embriyo süspansiyon geçmektedir. Bu hazırlık istenmeyen enkaz kaldırmak yardımcı olur. </li></ol> Not 4: Embriyo Süspansiyon istenmeyen birikintileri temizlemek için bir 40 um&#39;lik bir filtreden bir kez daha filtre edilebilir. Bir çift filtrasyon, kurtarma approxim olduğunu1 ml &#39;lik bir başlangıç ​​hacminden rilmesi 800 ul. <ol start="10"><li> Her bir poli-L-lizin kaplı lamel miyofiberde oluşan süspansiyonu yaklaşık 50-100 ul ekleyin. </li></ol> Not 5: alt Parafilm ile Petri tabaklarında adım 2.9 yapın, önceden hazırlanmış. Parafilm kaplı lamelleri akıp miyofiberde oluşan süspansiyon tutar. Buharlaşmasını önlemek için kapalı Petri yemekleri tutun. <ol start="11"><li> Myofibers oda sıcaklığında kaplanan kapak slipleri üzerine, yaklaşık 1 saat yerleşmeye izin verin. </li></ol> Not 6: myofibers 5-10 dakika içinde yerleşmeye başlayacak. Ancak, iyi miyofiberde oluşan bağlanması için, 1 saat (1-2 saat) bir minimum tavsiye edilir. Myofibers uzun yerleşmek için izin hazırlık zarar vermez. (Gece ​​boyunca dahil) daha uzun inkubasyon için, antibiyotikler ortama ilave edilebilir. Antibiyotik ve steril tekniği ile canlı kültürler genellikle 1-2 gün süreyle muhafaza edilebilir. <ol start="12"><li> Canlı myofibers bu noktada görülmektedir. Embriyolar 2 dpf den myofibers ve daha sonra çizgili ve uzunlamasına hücreleri (Şekil 1) olarak görülecektir. Bu noktada, myofibers şimdi canlı analiz veya immunolabeling için hazırız. </li></ol> Not 7: embriyolardan dpf&#39;e 1&#39;den İskelet kası gibi uzun ve açıkça çizgili lifleri plaka değil. Bunun yerine, büyük myoballs görebilir. Buna ek olarak, peletleme sonrası faz ayrışması sırasında myoballs bir pelet elde etmek için 5000 x g&#39;de 8 dakika boyunca santrifüje tabi az olması gerekir 1 dpf (2.6 adım). Bu aşamada embriyolar analizi için, bu özellikle iskelet kası 23 EGFP ifade eden transgenik hat kullanmak tavsiye edilir. Bu, diğer kaynaklardan karşı kas kökenli hücrelerin tanımlanmasına izin verir. 3. Disosiye Zebra balığı myofibers floresan İmmünoboyama (Saat: yaklaşık 1 gün) 3.1. Immunolabeling <ol><li> Bir kısmını çıkarmakkaplanmış lamel yapışık myofibers medya </li><li> % 4 paraformaldehit ya da metanol kullanılarak, hücreler. PFA için, medya hacmi ½ kaldırmak ve PFA aynı miktarda değiştirin. , Tüm hacim kaldırmak, daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca saptamak PFA 50-100 ul ile değiştirin ve ek bir 10 dakika boyunca düzeltin. Alkol tespiti, buzla soğutulmuş metanol ya da aseton için, sırasıyla, 10 dakika ya da 5 dakika boyunca 4 ° C &#39;de uygulanabilir. </li><li> Myofibers en az 1 adet 1 x PBS ya da PBS ile 3-5x artı% 0.1 TWEEN yıkayın. Ortalama yıkama hacmi lamel ortalama 50-100 ul. </li><li> Myofibers solüsyonu (stokları çalışma) bloke edin ve oda sıcaklığında 20-60 dakika kuluçkalayın. Bloke edici çözelti, birincil ve ikincil antikorlar bağlı olarak değişecektir. Laboratuarda kullanılan en yaygın iki (1) 1x PBS, 2 mg / ml BSA,% 1 serum koyun,% 0.25 Triton X-100, kesin ve (2)% 0.2 Triton X-100, 2 mg / ml (0.2 olan % BSA) ve% 5 koyun / keçi serumu. </li><li> Çözümü engelleme çıkarın ve b ya seyreltilmiş primer antikor ekleyinçözeltisi ya da PBS kilitleme. 4 ° C de bir gece inkübe myofibers Parafilm ya emin olun veya antikor ile kaplanmış miyofiberde oluşan yüklü lamelleri içeren Petri şal saran sarın. Nemli bir kağıt havlu küçük parçalar nemlendirilmiş odası oluşturmak için ilave edilebilir. </li><li> Lamelleri primer antikor çıkarın ve 5 dakika PBS ile veya engelleme çözümü için lamelleri 3-5x yıkayın. </li><li> 1x PBS ya da oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca bloke çözeltisi içinde seyreltilmiş uygun konsantrasyonda ikincil antikor ekleyin. </li><li> İkinci antikorunu çıkarın ve oda sıcaklığında her biri 5 dakika boyunca PBS içinde myofibers 3-5x yıkayın. </li></ol> 3.2. Montaj lamelleri <ol start="9"><li> Bir mikroskop lamı antifade ayıracı 1-2 damla uygulayın. </li><li> Dikkatle pick-up kaplamalı ve immunolabled lamel mikroskop lamı üzerine antifade reaktif üzerinde lamel (myofibers aşağı) forseps ve yer kullanarak. </li></ol> C yönüne Dikkat: Not 1oated lamel kritiktir. <ol start="11"><li> Sert ve katı bir yüzeye 1-2 Kimwipes yatıyordu. Çabuk antifade reaktif üzerinde oturan kaplı lamelleri ile slayt ters ve Kimwipes (aşağı lamel) yerleştirin. </li><li> Aşırı antifade kaldırmak ve slayt ve lamel arasında sıkı bir mühür formu mikroskop lamı köşelerine hafif bir basınç uygulayın </li><li> , Oda sıcaklığında 5-10 dakika için kurumaya kalan antifade ardından myofibers 4 ° C &#39;de (Şekil 2A ve B) veya imajı hazır izin ver </li></ol> 4. GCaMP3 kullanarak canlı hücre Kalsiyum Görüntüleme Canlı hücre deneyleri (adım 2.10 aşağıdaki gibi) önceden tespit etmek myofibers yapılabilir. Aşağıdaki protokol GCaMP3 24, iskelet kası, belirli zebra balığı α-aktin promoteri (pSKM) 23 ile ifade edilen bir genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi, ifade myofibers canlı görüntüleme açıklar. Seçenek olarak,Bu teknik hali hazırda bu tür Fura-2 kalsiyum göstergesi boyalar kullanmak için adapte edilebilir. <ol><li> PSKM ile embriyolar enjekte: GCaMP3 1-2 hücreli aşamada inşa </li><li> 3 dpf, larvaları toplamak ve bölümler 1 ve 2 de tarif edildiği gibi myofibers hazırlar. Myofibers 1 saat arasında, en az yapışmaya izin verin. Bu teknik için, 24 oyuklu tabaklarda lamelleri hazırlanması gereklidir. </li><li> Dikkatle fazla ortamı çıkartın ve oda sıcaklığında taze CO 2 bağımsız medya 300 ul ekleyin. </li><li> Bir ters mikroskop altında hücre dikkate alınmalıdır. GCaMP3 olumlu myofibers yeşil floresan altında görünür olmalıdır. </li><li> Istenirse, kayıt için kamerayı ayarlayın. </li><li> CO 2 bağımsız medya 30 mM kafein çözeltisi hazırlayın. Hücreleri uyarmak için, yavaşça büyütme altında kuyuya kafein çözeltisi 300 ul pipet. 5-10 sn içinde, GCaMP olumlu myofibers floresan hızlı bir artış (Şekil 3) ile kafein yanıt vermelidir. Myofibers da sözleşme olabilir. Notun, kafein sarkoplazmik retikulum mağazalardan 25 kalsiyum salınımını uyarır. Bu tür KCl 26 ve riyanodin 4 gibi diğer maddeler, uyarılabilir kalsiyum serbest incelemek için kullanılabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Dulhunty, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation-contraction+coupling+from+the+1950s+into+the+new+millennium.">Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33, 763-772 (2006).</li><li>Bannister, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+the+myoplasmic+gap:+recent+developments+in+skeletal+muscle+excitation-contraction+coupling.">Bridging the myoplasmic gap: recent developments in skeletal muscle excitation-contraction coupling.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 28, 275-283 (2007).</li><li>Ohno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+defects+and+disorders+at+the+neuromuscular+junction.">Genetic defects and disorders at the neuromuscular junction.</a> Brain Nerve. 63, 669-678 (2011).</li><li>Lanner, J. T., Georgiou, D. K., Joshi, A. D., Hamilton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptors:+structure,+expression,+molecular+details,+and+function+in+calcium+release.">Ryanodine receptors: structure, expression, molecular details, and function in calcium release.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).</li><li>Dolphin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+diversity:+multiple+roles+of+calcium+channel+subunits.">Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19, 237-244 (2009).</li><li>Sparrow, J. C., Schock, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initial+steps+of+myofibril+assembly:+integrins+pave+the+way.">The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 293-298 (2009).</li><li>Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dystrophin+glycoprotein+complex:+signaling+strength+and+integrity+for+the+sarcolemma.">The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma.</a> Circ. Res. 94, 1023-1031 (2004).</li><li>Bassett, D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+zebrafish+model+of+muscular+dystrophy.">Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).</li><li>Barresi, R., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystroglycan:+from+biosynthesis+to+pathogenesis+of+human+disease.">Dystroglycan: from biosynthesis to pathogenesis of human disease.</a> J. Cell Sci. 119, 199-207 (2006).</li><li>Emery, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+frequencies+of+inherited+neuromuscular+diseases-a+world+survey.">Population frequencies of inherited neuromuscular diseases-a world survey.</a> Neuromuscul. Disord. 1, 19-29 (1991).</li><li>Nance, J. R., Dowling, J. J., Gibbs, E. M., Bonnemann, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+myopathies:+an+update.">Congenital myopathies: an update.</a> Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 12, 165-174 (2012).</li><li>Bassett, D. I., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+as+a+model+for+muscular+dystrophy+and+congenital+myopathy.">The zebrafish as a model for muscular dystrophy and congenital myopathy.</a> Hum. Mol. Genet. 12, 265-270 (2003).</li><li>Dooley, K., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+a+model+system+for+the+study+of+human+disease.">Zebrafish: a model system for the study of human disease.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 252-256 (2000).</li><li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+myotubularin+function+results+in+T-tubule+disorganization+in+zebrafish+and+human+myotubular+myopathy.">Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy.</a> PLoS Genet. 5, (2009).</li><li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+successful+antioxidant+treatment+in+models+of+RYR1-related+myopathy.">Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy.</a> Brain. 135, 1115-1127 (2012).</li><li>Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5331-5336 (2011).</li><li>Detrich, H. W., Westerfield, M., M, L. I., Zon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+Zebrafish+system.">Overview of the Zebrafish system.</a> Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).</li><li>Nixon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+caveolin-associated+muscle+disease;+caveolin-3+is+required+for+myofibril+organization+and+muscle+cell+patterning.">Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 1727-1743 (2005).</li><li>Schredelseker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta+1a+subunit+is+essential+for+the+assembly+of+dihydropyridine-receptor+arrays+in+skeletal+muscle.">The beta 1a subunit is essential for the assembly of dihydropyridine-receptor arrays in skeletal muscle.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17219-17224 (2005).</li><li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=neb:+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation.">neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis. Model Mech. 5, 389-396 (2012).</li><li>Dowling, J. J., Low, S. E., Busta, A. S., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+MTMR14+is+required+for+excitation-contraction+coupling,+developmental+motor+function+and+the+regulation+of+autophagy.">Zebrafish MTMR14 is required for excitation-contraction coupling, developmental motor function and the regulation of autophagy.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 2668-2681 (2010).</li><li>Schredelseker, J., Dayal, A., Schwerte, T., Franzini-Armstrong, C., Grabner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proper+restoration+of+excitation-contraction+coupling+in+the+dihydropyridine+receptor+beta1-null+zebrafish+relaxed+is+an+exclusive+function+of+the+beta1a+subunit.">Proper restoration of excitation-contraction coupling in the dihydropyridine receptor beta1-null zebrafish relaxed is an exclusive function of the beta1a subunit.</a> J. Biol. Chem. 284, 1242-1251 (2009).</li><li>Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+generation+of+transgenic+zebrafish+which+reliably+express+GFP+in+whole+muscles+or+the+whole+body+by+using+promoters+of+zebrafish+origin.">High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin.</a> Dev. Biol. 192, 289-299 (1997).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-sense+mutations+in+the+dihydropyridine+receptor+beta1+gene,+CACNB1,+paralyze+zebrafish+relaxed+mutants.">Non-sense mutations in the dihydropyridine receptor beta1 gene, CACNB1, paralyze zebrafish relaxed mutants.</a> Cell Calcium. 39, 227-236 (2006).</li><li>Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevation+of+intracellular+calcium+in+smooth+muscle+causes+endothelial+cell+generation+of+NO+in+arterioles.">Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 6529-6534 (1997).</li><li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=accordion,+a+zebrafish+behavioral+mutant,+has+a+muscle+relaxation+defect+due+to+a+mutation+in+the+ATPase+Ca2++pump+SERCA1.">accordion, a zebrafish behavioral mutant, has a muscle relaxation defect due to a mutation in the ATPase Ca2+ pump SERCA1.</a> Development. 131, 5457-5468 (2004).</li><li>van Eeden, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+somite+formation+and+patterning+in+the+zebrafish,+Danio+rerio.">Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 153-164 (1996).</li><li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+dag1+mutant:+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies.">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 1712-1725 (2011).</li><li>Leuranguer, V., Papadopoulos, S., Beam, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+calcium+channel+beta1a+subunits+in+triad+junctions+in+skeletal+muscle.">Organization of calcium channel beta1a subunits in triad junctions in skeletal muscle.</a> J. Biol. Chem. 281, 3521-3527 (2006).</li><li>Capote, J., Bolanos, P., Schuhmeier, R. P., Melzer, W., Caputo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+transients+in+developing+mouse+skeletal+muscle+fibres.">Calcium transients in developing mouse skeletal muscle fibres.</a> J. Physiol. 564, 451-464 (2005).</li><li>Adams, B. A., Tanabe, T., Mikami, A., Numa, S., Beam, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramembrane+charge+movement+restored+in+dysgenic+skeletal+muscle+by+injection+of+dihydropyridine+receptor+cDNAs.">Intramembrane charge movement restored in dysgenic skeletal muscle by injection of dihydropyridine receptor cDNAs.</a> Nature. 346, (1990).</li><li>Sakowski, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+study+motor+neurons+from+zebrafish+embryos+and+larvae+in+culture.">A novel approach to study motor neurons from zebrafish embryos and larvae in culture.</a> J. Neurosci. Methods. 205, 277-282 (2012).</li><li>Nakano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+GPI-anchored+proteins+is+essential+for+surface+expression+of+sodium+channels+in+zebrafish+Rohon-Beard+neurons+to+respond+to+mechanosensory+stimulation.">Biogenesis of GPI-anchored proteins is essential for surface expression of sodium channels in zebrafish Rohon-Beard neurons to respond to mechanosensory stimulation.</a> Development. 137, 1689-1698 (2010).</li><li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+deletion+of+lysine+7+expands+the+clinical,+histopathological+and+genetic+spectrum+of+TPM2-related+myopathies.">Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies.</a> Brain. 136, 508-521 (2013).</li><li>Schredelseker, J., Shrivastav, M., Dayal, A., Grabner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Ca2+-conducting+Ca2++channels+in+fish+skeletal+muscle+excitation-contraction+coupling.">Non-Ca2+-conducting Ca2+ channels in fish skeletal muscle excitation-contraction coupling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5658-5663 (2010).</li></ol>

Yazarlar çatışan çıkarları beyan ederim.

Zebra balığı vivo 25,27,28 kas gelişimi ve işlevi çalışmak için güçlü bir omurgalı model sistem. Onlar da insan kas hastalıkları 14,15,20,29 modelleme için değerli bir varlık olarak ortaya çıkmıştır. Büyük atılımlar kas fonksiyonu ve kas hastalığı çalışma için zebrafish uygulanmasını ve kullanımını geliştirmek için alınmış olsa da, davranışsal ve fonksiyonel genetik, morfolojik, övgü daha derinlemesine analiz sağlayacak araçları g...

İskelet kası motilite için gerekli kasılma kuvvetleri üreten sorumlu son derece özel bir dokudur. Daralma içi mağazalardan 1,2 kalsiyum serbest elektrik sinyalleri dönüştüren eksitasyon-kasılma (EC) bağlantı olarak bilinen bir süreç yoluyla başlatılır. Hücre içi kalsiyum bırakma kuvvetinin kısaltmak ve oluşturmak için sarkomerinde geçirir. Nöromüsküler kavşak iletimi 3, AK kaplin 4,5 ve aktin-miyozin bağımlı kasılmalar 6 aracılık sorumlu moleküler makinelerin çok özel bileşenler yoğun araştırma devam eden konu olmaya devam etmektedir. Ayrıca, daralma 7,8 ve miyofiberde oluşan ve hücre-dışı matris 7,9 arasında sinyal olduğu mediate sırasında kas membranı stabilize proteini, tespit edilmiştir ve ayrıntılı olarak incelenmiştir. Kas yapısı a için önemli olan bir dizi genlerde mutasyonlarnd fonksiyonu (insan iskelet kası hastalıklarının nedeni olarak tanımlanmıştır <a href="http://www.musclegenetable.org/" target="_blank">http://www.musclegenetable.org/</a> ). Klinik ve histopatolojik özelliklere dayanarak iskelet miyopatilerde ve kas distrofilerinde gibi genel olarak sınıflandırılabilir Bu hastalıklar, kas güçsüzlüğü, yaşam boyu sakatlık ve erken mortalite 10,11 ile ilişkilidir. Zebra balığı insan iskelet kası hastalıkları 8,12,13 modelleme ve eğitim için olağanüstü bir sistem olduğu kanıtlanmıştır. Bu, yeni gen mutasyonları 8 doğrulamak hastalığın patofizyolojisi 14,15 yeni yönlerini tanımlamak ve yeni tedavi yaklaşımları 15,16 tanımlamak için istihdam edilmiştir. Insan kas hastalığı incelemek için Zebra balığı gücü yavrular, kas yapısı ve fonksiyonu, Zebra balığı embriyo optik netlik ve gelişmekte olan zebra genetik ve farmakolojik manipülasyon kolaylığı hızlı gelişme çok sayıda ilgilidirbalık 17. Biz ve diğerleri 12,18,19 son zamanlarda gelişen zebrafish myofibers hızlı ve verimli izolasyonu için basit bir teknik geliştirdik. Bu yöntem, tüm embriyo analiz edilmesi için daha fazla ayrıntılı olarak myofibers incelenmesini sağladı. Bu teknik, yeni geliştirilmiş hastalık modellerinde 21 doğrulama çalışmalarının bir kısmı olarak önemli histopatolojik özelliklerinin tanımlanması için protein alt hücresel lokalizasyonu 20 hem de karakterizasyonu için istifade edilmiştir. Ayrıca, izole myofibers ayrıca canlı görüntüleme ve elektrofizyolojik çalışmalar 22, kas fonksiyonlarının temel yönleri sorgulama için izin teknikleri kullanılabilir. Sonraki analitik deneyler iki örnekleriyle birlikte miyofiberde oluşan izolasyon için özel bir protokol, bu yazının geri kalan bölümlerinde ayrıntılı.

<table><tbody><tr><td>24-well culture plate</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Invitrogen Gibco</td><td>70011</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Independent medium</td><td>Invitrogen Gibco</td><td>18045</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type II</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004186</td><td>Lot 41H12764</td></tr><tr><td>Collagenase Type IV</td><td>Worthington Biochemical</td><td>L5004188</td><td></td></tr><tr><td>8% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Sheep serum</td><td>Sigma</td><td>S3772</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Fischerbrand</td><td>12-545-82 12CIR-1D</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m Filter</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m Filter</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold antifade reagent</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&amp;alpha;-Actinin antibody</td><td>Sigma</td><td>A5044</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RYR antibody</td><td>Abcam</td><td>34C</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-21425</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petri dish</td><td>Fischerbrand</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Fischerbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Caffeine</td><td>Sigma</td><td>C0750</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of embryonic and larval zebrafish skeletal myofibers from dissociated preparations

Zebra balığı iskelet kası fonksiyonunu keşfetmek için ve insan kas hastalıklarının araştırılmasında değerli bir model sistem olduğu kanıtlanmıştır. Özellikle bütün embriyolar, kas fonksiyonu için sorumlu karmaşık ve ince yapılı protein ortam görselleştirme, Zebra balığı iskelet kasının in vivo analizi tarafından sunulan birçok avantajlara rağmen, sorunlu olabilir. Bu engel Zebrafish iskelet kası (60 mikron) ve sarkomerinde daha küçük boyutu küçük boyutu kaynaklanmaktadır. Burada tarif ve zebra balığı embriyolar ve larva iskelet myofibers izole etmek için basit ve hızlı bir yöntem ortaya koymaktadır. Biz de kas yapısını ve fonksiyonunu analiz için yararlıdır sonrası hazırlama tekniklerini göstermek protokollerini içerir. Özellikle, biz detay iskelet kas proteinlerinin sonraki immünositokimyasal yerelleştirme ve canlı hücre kalsiyum görüntüleme yoluyla uyarılan kalsiyum sürümü kalitatif analizi. Genel olarak, bu videozebra balığı madde iskelet myofibers izolasyonu ve karakterizasyonu, kas yapısı ve fonksiyonu, sayısız sonraki çalışmalar için bir oluk sağlayan bir teknik için, doğrudan ve etkili bir yöntem sağlar.

Myofibers floresan immün (Şekil 2) Myofibers beklenen floresan etiketleme modelini gösteren resimler başarılı izole edilmesi ve sonra kaplama immunohistokimyasal. Myofibers anti-riyanodin reseptörü (1:100) (Şekil 2A) ya da anti-α-aktinin (1:100) (Şekil 2B) ya da antikorları ile etiketlenmiş ve sırasıyla üçlü ve Z-bandın immün ortaya edilmiştir. Kullanılan ikincil antikorlar, Alexa Fluor 555 (1:500) idi. Görün...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations at JoVE.com

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Zebra balığı iskelet kası bozuklukları insan modellemek için ortaya çıkan bir sistemdir. Biz embriyonik ve larva zebrafish iskelet kası myofibers izole etmek için hızlı ve etkili bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, tek bir iskelet kas lifi morfolojisi çalışma için uygun olan yüksek yoğunluklu miyofiberde oluşan hazırlama, protein hücre içi lokalizasyonu ve kas fizyolojisi verir.

Disosiye Müstahzarlar gelen Embriyonik ve larval Zebra balığı İskelet myofibers Analizi

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

analysis-embryonic-larval-zebrafish-skeletal-myofibers-from

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K Görüntüleme.  University of Michigan.  Zebra balığı iskelet kası bozuklukları insan modellemek için ortaya çıkan bir sistemdir. Biz embriyonik ve larva zebrafish iskelet kası myofibers izole etmek için hızlı ve etkili bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, tek bir iskelet kas lifi morfolojisi çalışma için uygun olan yüksek yoğunluklu miyofiberde oluşan hazırlama, protein hücre içi lokalizasyonu ve kas fizyolojisi verir. 

Video: Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Gelişim Biyolojisi

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many myopathies affecting skeletal muscle function can be quickly and easily assessed in zebrafish over the first few days of embryogenesis. By 24 hr post-fertilization (hpf), wildtype zebrafish spontaneously contract their tail muscles and by 48 hpf, zebrafish exhibit controlled swimming behaviors. Reduction in the frequency of, or other alterations in, these movements may indicate a skeletal muscle dysfunction. To analyze swimming behavior and assess muscle performance in early zebrafish development, we utilize both touch-evoked escape response and locomotion assays.
Touch-evoked escape response assays can be used to assess muscle performance during short burst movements resulting from contraction of fast-twitch muscle fibers. In response to an external stimulus, which in this case is a tap on the head, wildtype zebrafish at 2 days post-fertilization (dpf) typically exhibit a powerful burst swim, accompanied by sharp turns. Our method quantifies skeletal muscle function by measuring the maximum acceleration during a burst swimming motion, the acceleration being directly proportional to the force produced by muscle contraction.
In contrast, locomotion assays during early zebrafish larval development are used to assess muscle performance during sustained periods of muscle activity. Using a tracking system to monitor swimming behavior, we obtain an automated calculation of the frequency of activity and distance in 6-day old zebrafish, reflective of their skeletal muscle function. Measurements of swimming performance are valuable for phenotypic assessment of disease models and high-throughput screening of mutations or chemical treatments affecting skeletal muscle function.

Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function.

Dokunmatik uyarılmış Yanıt ve Hareket Deneyleri kullanarak Zebra balığı kas Performans ve fonksiyonunu değerlendirmek için

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical strain. Skeletal joints are subjected to dynamic mechanical loading. Finite element analysis (FEA) is a computational method, frequently used in engineering that can predict how a material or structure will respond to mechanical input. By dividing a whole system (in this case the zebrafish jaw skeleton) into a mesh of smaller 'finite elements', FEA can be used to calculate the mechanical response of the structure to external loads. The results can be visualized in many ways including as a 'heat map' showing the position of maximum and minimum principal strains (a positive principal strain indicates tension while a negative indicates compression. The maximum and minimum refer the largest and smallest strain). These can be used to identify which regions of the jaw and therefore which cells are likely to be under particularly high tensional or compressional loads during jaw movement and can therefore be used to identify relationships between mechanical strain and cell behavior. This protocol describes the steps to generate Finite Element models from confocal image data on the musculoskeletal system, using the zebrafish lower jaw as a practical example. The protocol leads the reader through a series of steps: 1) staining of the musculoskeletal components, 2) imaging the musculoskeletal components, 3) building a 3 dimensional (3D) surface, 4) generating a mesh of Finite Elements, 5) solving the FEA and finally 6) validating the results by comparison to real displacements seen in movements of the fish jaw.

Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw.

Zebra balığı Çeneli Biyomekanik Araştırma Sonlu Elemanlar Modelleri Bina

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, the muscle stem cell is activated and undergoes cell proliferation to generate a pool of myoblasts, which subsequently differentiate to form new muscle fibers. In many muscle wasting conditions, including muscular dystrophy and ageing, this process is impaired resulting in the inability of muscle to regenerate. The process of muscle regeneration in zebrafish is highly conserved with mammalian systems providing an excellent system to study muscle stem cell function and regeneration, in muscle wasting conditions such as muscular dystrophy. Here, we present a method to examine muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. The first step involves the use of a genotyping platform that allows the determination of the genotype of the larvae prior to eliciting an injury. Having determined the genotype, the muscle is injured using a needle stab, following which polarizing light microscopy is used to determine the extent of muscle regeneration. We therefore provide a high throughput pipeline which allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Skeletal muscle regeneration is driven by tissue resident muscle stem cells, which are impaired in many muscle diseases such as muscular dystrophy, and this results in the inability of muscle to regenerate. Here, we describe a protocol that allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Kas Hastalığının Zebra Balığı Modellerinde Kas Yenilenmesinin İncelenmesi

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish with fluorescently-marked plasma membranes can be scanned in a confocal laser scanning microscope in order to determine the volume of muscle tissue and the number of muscle fibers present. Efficient approaches for the measurement of cell number and size in live animals over time are described and validated against more arduous segmentation methods. Methods are described that permit the control of muscle electrical, and thus contractile, activity. Loss of skeletal muscle contractile activity greatly reduced muscle growth. In larvae, a protocol is described that allows reintroduction of patterned electrical-evoked contractile activity. The described methods minimize the effect of inter-individual variability and will permit analysis of the effect of electrical, genetic, drug, or environmental stimuli on a variety of cellular and physiological growth parameters in the context of the living organism. Long-term follow-up of the measured effects of a defined early-life intervention on individuals can subsequently be performed.

Optical clarity is a major advantage for cell biological and physiological work in zebrafish. Robust methods for measurement of cell growth in individual animals are described that permit novel insights into how growth of skeletal muscle and neighboring tissues are integrated with whole body growth.

Değiştirilmiş elektriksel aktiviteye maruz kalan bireysel canlı zebra balıklarında iskelet kası büyümesinin gerçek zamanlı ve tekrarlanan ölçümü

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart 

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Zebra balığı Embriyonik Kalp Dissected, immün

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Biyoloji

Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of myosin heavy chain (MyHC) isoforms has emerged as a finer discriminator of fiber-type. Type I, type IIA, type IIX and type IIB fibers can now be identified with precision based on their MyHC profile; however, manual analysis of these data can be slow and down-right tedious. In this regard, rapid, accurate assessment of fiber-type composition and morphology is a very desirable tool. Here, we present a protocol for state-of-the-art immunohistochemical staining of MyHCs in frozen sections obtained from mouse hindlimb muscle in concert with a novel semi-automated algorithm that accelerates analysis of fiber-type and fiber morphology. As expected, the soleus muscle displayed staining for type I and type IIA fibers, but not for type IIX or type IIB fibers. On the other hand, the tibialis anterior muscle was composed predominantly of type IIX and type IIB fibers, a small fraction of type IIA fibers and little or no type I fibers. Several image transformations were used to generate probability maps for the purpose of measuring different aspects of fiber morphology (i.e., cross-sectional area (CSA), maximal and minimal Feret diameter). The values obtained for these parameters were then compared with manually-obtained values. No significant differences were observed between either mode of analysis with regards to CSA, maximal or minimal Feret diameter (all p &#62; 0.05), indicating the accuracy of our method. Thus, our immunostaining analysis protocol may be applied to the investigation of effects on muscle composition in many models of aging and myopathy.

Immunohistochemical staining of myosin heavy chain isoforms has emerged as the state-of-the-art discriminator of skeletal muscle fiber-type (i.e., type I, type IIA, type IIX, type IIB). Here, we present a staining protocol along with a novel semi-automated algorithm that facilitates rapid assessment of fiber-type and fiber morphology.

Fare kas iskelet morfoloji ve Fiber türü kompozisyon yarı otomatik analizi

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

Tıp

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Zebra balığı Larva kas fonksiyonu değerlendirmek için daralma sırasında Kuvvet Ölçümü

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the zebrafish cardiovascular tissues have been limiting in studying their electrophysiological properties. Previous methods have been described for dissection of zebrafish hearts and isolation of ventricular cardiac myocytes. However, the isolation of zebrafish atrial and vascular myocytes for electrophysiological characterization was not detailed. This work describes new and modified enzymatic protocols that routinely provide isolated juvenile and adult zebrafish ventricular and atrial cardiomyocytes, as well as vascular smooth muscle (VSM) cells from the bulbous arteriosus, suitable for patch-clamp experiments. There has been no literary evidence of electrophysiological studies on zebrafish cardiovascular tissues isolated at embryonic and larval stages of development. Partial dissociation techniques that allow patch-clamp experiments on individual cells from larval and embryonic hearts are demonstrated.

The present protocol describes the acute isolation of viable cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval, and embryonic zebrafish (Danio rerio), suitable for electrophysiological studies.

Kardiyak ve Vasküler Düz Kas Hücrelerinin Elektrofizyolojik Çalışmalar İçin Yetişkin, Genç, Larva ve Embriyonik Zebra Balıklarından İzolasyonu

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...