Biz destek ve yararlı tartışmalar için dantelli ölçümleri ve E. Bamberg katkı J. Garcia-Celma, ben Smirnova ve R. Kaback teşekkür ederim.

1. SSM tabanlı Elektrofizyoloji için bir cihaz ayarlama Detayları da şematik çizimler ve küvetler fotoğraflarını içeren ve 1, 2 kurmak teknik yayınlar, iki verilmiştir. Farklı bir çözüm Döviz yapılandırmaları ve akış protokolleri aynı zamanda yöntemi kağıt 2 tartışılmıştır. Aşağıda bir kaç son gelişmeler ve video sunumu için doğrudan ilgili olan teknik ayrıntıları ekleyin. Valf kontrolü ve veri toplama Arayüz kutusu ticari bir USB dijital çıkış / analog giriş arabirimi (NI USB 6009 National Instruments) ve valf sürücüleri içerir. Bu çözelti akışını kontrol ve veri toplama için sorumludur. Vanalar normalde hızlı vanalar 18 kadar bir gerilim ile tahrik V. Videoda bir 12 V güç kaynağı kullanmak olabilir geçiş için, Ancak 12 ile tahrik V. vardır. &lt;/ P&gt; Vana sürücü devre kartı dört valf çalışabilir. Bu Biyofizik Max Planck Enstitüsü servis tarafından imal edilmiştir. Vanalar ön panelde anahtarı üzerinden bilgisayar veya el ile kontrol edilebilir. İkinci temizlik işlemleri ve yıkama için uygundur. Ölçüm sırasında, arayüz kutusu bir vana kontrolü ve veri toplama yazılımı (surfe 2 R yazılımı, IonGate Biosciences) kullanarak bilgisayar kontrollü olduğunu. 2. Hazırlıklar Bu bölümde bir SSM-tabanlı deney elektrofizyoloji hazırlanması için farklı protokoller bahsedilmiştir. 2.1 SSM oluşumu için Lipid çözüm yapma <ol><li> 25 ul oktadesilamin (Kloroform içerisinde 5 mg / ml) ve bir cam şişe içinde 375 ul Diphytanoylphosphatidylcholine (Kloroform içinde 20 mg / ml) karıştırın. </li><li> Bir döner buharlaştırıcı ve sürekli bir nitrojen gazı akışı kullanılarak, için kloroform buharlaşmasıyaklaşık 30 dakika. </li><li> N-dekan 500 ul ile çalkalayarak cam şişe duvarlarından lipid çıkarın. Nihai lipit konsantrasyonuna 1:60 (w / w) oktadesilamindir ile 15 mg / ml &#39;dir. </li><li> Cam saklama kabı çözüm aktarın. -20 ° C&#39;de lipid çözüm Mağaza </li></ol> Referans elektrotunun 2.2 Klorlama Referans elektrotlar aşınma nedeniyle düzenli aralıklarla klorlu gerekir. <ol><li> Klorlama işleminden önce ince zımpara kullanarak eski gümüşklorid tabakasının dayanağını çıkarın. </li><li> 1 M hidroklorik asit solüsyonu içine bir platin elektrot ile birlikte gümüş tel yerleştirin ve 0,5 mA, 15 dakika boyunca klorlama. Klorlama tamamladıktan sonra, gümüş tel homojen bir koyu gri rengini değiştirir. </li></ol> Poliakrilamid jel köprünün 2.3 hazırlanması <ol><li> 100 mM pH değerinde KPI = 7, 100 mM KCI, 6 ihtiva eden bir çözelti hazırlayın% Acrylamid. </li><li> % 0.3 APS (% 10 Stok) ekleyin ve% 0.6 TEMED ve kısa bir pipet ile çözüm karıştırın. </li><li> Hemen çözelti karıştırıldıktan sonra, boş jel köprü kabına karışım, 30 ul enjekte etmek için bir pipet kullanın. Bu enjeksiyon sırasında hava kabarcıklarını önlemek için önemlidir. </li><li> 20 dakikalık bir inkübasyon süresi sırasında jel polimerize olur. </li><li> Polimerizasyon sonrası jel köprü çözeltisi (100 mM KPI pH 7, 100 mM KCI) depolanır. Jel köprünün ömrünü uzatmak için, çözelti 4 ° C sıcaklıkta saklanır </li></ol> Ölçüm çözümler 2.4 hazırlanması Farklı bileşimin çözümler değiştirilmesi durumunda, SSM çözünenlerin kuvvetli etkileşime bağlı olarak, elektrik eserler oluşturulur. Bu nedenle, solüsyonların hazırlanması için önemli bir adımdır. Çözüm Döviz eserler en aza indirmek için çözüm hazırlık sürecinde aşağıdaki önlemleri alın. <ol><li> Olmayan aktive ve bir partiden çözümler aktive olun, pH ve iyonik kuvvet ayarlayın. </li><li> Yüksek tuz arka plan çözüm Döviz eserler azaltmaya yardımcı olur. </li><li> Iki cilt halinde toplu çözüm bölün. </li><li> Aktive çözeltisine aktive edici bileşik ekleyin. Mümkün olduğunca benzer ozmolarite ve her iki çözüm iyonik gücünü tutmak için olmayan aktifleştirici çözelti içinde bir telafi edici bileşiğin kullanımı. </li><li> Çözümleri 4 ° C&#39;de saklanır ise, sıcaklık hatta küçük farklılıklar eserler üretebilir çünkü tüm çözümler, bir ölçüm başlamadan önce oda sıcaklığına ulaşıldığında emin olun. </li></ol> 3. Bir SSM tabanlı Elektrofizyoloji Deney Burada bir SSM-tabanlı bir deney elektrofizyolojik için tipik bir protokol mevcut. 3.1 SSM Kurulum hazırlanması SSM Kurulum kullanımda değilken tüpleri% 30 etanol ile doldurulur/ Su çözeltisi bakteri büyümesini önlemek için. <ol><li> Küvet monte etmeden önce, borunun ikinci etanolü ortadan kaldırmak için saf su ile yıkama sistemi. Su kapları ile etanol kaplar değiştirin. Yüksek basınç (0.6 ila 1.0 bar) yaklaşık 20-30 ml su ile sistem temiz kullanma. </li><li> PH 7.6 ya da olmayan aktive çözüm bir 100 mM KPI tampon kullanarak temizleme işlemi tekrarlayın. </li><li> Hava kabarcıkları sıvı sistemde kalır emin olun. </li></ol> 3.2 küvet Montaj <ol><li> Referans elektrot bir o-ring takın </li><li> Saklama çözeltisinden jel köprüyü ve referans elektrotu, bağlayın. </li><li> Önceden doldurunuz olmayan aktive tamponu ile çıkış konektörü, bir o-ring takın ve referans elektrot montaj tamamlamak için jel köprü bağlayın. Hava kabarcığı jel köprü ve çıkış çözelti akış yolunun kavşağında olduğunu özel dikkat gösterin. </li><li> Cuve ana parçası Preassembleyaylı kontak pin (amplifikatör bağlantısı), giriş borusu (terminal vana bağlantı), o-ring (SSM için sızdırmazlık) ve vidaları ekleyerek tte. </li><li> Bir cımbız kullanarak, depolama çözümü (etanol içinde 10 mM octadecanethiol) ve sensör çipi çıkarın. </li><li> Bir pipet kullanarak, yakl kalan çözüm yıkayın. Saf etanol, 5 ml. </li><li> Azot gazı altında elektrot kurutun. </li><li> Giriş küvetin ana parçanın menfezi, böylece küvet taban kısmının üzerine doğru bir sensör çipi yerleştirin sensörün dairesel aktif alanına yönlendirilir. </li><li> Sensör çipin aktif alanın lipid çözeltinin 1 ul ekleyin. Altın tabakası tam lipid kapalı olduğundan emin olun. </li><li> Hemen lipid çözeltisi ilave edildikten sonra, önceden monte edilmiş bir ana bölümü ekleyerek küvet kapatın. </li><li> Faraday kafesi içine küvet monte etmeden önce, tüm yüzeyler tamamen kuru olduğundan emin olun. </li><li> Idareterminal valf için yaylı kontak pin ve giriş tüp amplifikatör ect. Daha sonra Faraday kafesi içindeki vida ile küvet düzeltmek. </li><li> Küvet en üstüne çıkış konektörü takın. Son olarak, çıkış konektörü ve referans elektrot için voltaj jeneratörüne çıkış borusuna bağlanabilir. </li><li> Hemen montaj sonra küvet 0,6 barda tamponu ile yıkama sistemi. Bu kendiliğinden SSM oluşumuna yol açar. </li></ol> 3.3 Ölçüm membran parametreleri SSM kalitesini kontrol etmek için, kapasite ve iletkenlik fonksiyon jeneratörü kullanılarak ölçülür. <ol><li> Fonksiyon jeneratörü kullanarak, iletkenlik ölçmek için 100 mV DC gerilim uygulanır. </li><li> Iletkenlik hesaplayın: Mevcut çürüme membran kondansatör şarj gösterir. Kapasitör sonra tam olarak ölçülen akım verimleri Ohm kanunu kullanarak membran iletkenlik tahsil edilir. Basitlik uğruna biz cu kullanınrrent 1 saniye voltaj sonra iletkenlik G = I / ABD hesaplamak için uygulanan </li><li> Genlik ve kapasite ölçmek için 0,5 Hz frekans zirve için 50 mV tepe bir üçgen AC gerilim uygulanmalıdır. </li><li> Kapasite hesaplayın: elde edilen kare dalga akım genliği kapasitör şarj akımları temsil eder. Kapasite C transfer yüküne eşittir Q = ΔU = 100 mV bölünmesiyle IΔt. (Ben üçgen gerilim fark mevcut olumlu eksi negatif eğim olduğu için ΔU iki kez 50 mV uygulanan gerilimdir.) </li><li> Art arda membran için yaklaşık her 10 dakikada bir elektriksel parametreler izleyin. Sabit değerler ulaşana kadar 30 ila 40 dk. 1-0,6 yaklaşık bar aralığında yüksek basınçta KPI tamponu ile arasında yıkayın. </li><li> SSM kalitesi tahmin: optimal koşulların 0,1-0,2 nS ve 2-3,5 nF aralığında bulunmaktadır. 1 nF altında 0.8 nS ve düşük kapasite üzerinde bir yüksek iletkenlik gösterirSSM doğru oluşmuş olmadığını. 4 nF üzerinde bir yüksek kapasite aktif bölge SSM tarafından tamamen kapalı olmadığını anlamına gelebilir. </li><li> Parametreleri uygun aralık içinde değilse, membran atılmalıdır ve başka SSM taze hazırlanmış bir elektrot çipi kullanılarak hazırlanmıştır. </li></ol> Çözüm Döviz eserler için 3.4 Denetimi Membran parametreleri kontrol edildikten sonra, ölçüm tamponlar çözüm alışverişi eserler için test edilmelidir. <ol><li> Sıvı sistemi için ilgili çözelti kapları yerleştirin. </li><li> Manuel vanalar kullanarak, akışkan sistem hava kabarcıklarını çıkarın. </li><li> Veri toplama yazılımı kullanmak, deneyde kullanmak istediğiniz akış protokolü seçti. </li><li> 0,6 bar basınç ayarlayın ve ölçüm başlar. </li><li> Ayrı mekanik kapak anahtarlama eserler, ideal bir eser akım ölçülmelidir ya da çok SMA olmalıdırbeklenen protein taşıma sinyalleri daha ller. Çözüm Döviz eserler gözlenmesi halinde, deney devam etmeden önce tampon kompozisyon ve / veya hazırlık işlemi optimize etmek için deneyin. </li></ol> 3.5 protein örnek ekleme Ortalama proteoliposomes ya da zar parçalarının -80 ° C&#39;de saklanır Bir ölçüm için yaklaşık 30 ul&#39;lik bir kısım gereklidir. <ol><li> Olmayan bir aktive edici çözeltisi ile SSM durulayın. </li><li> Buz üzerinde protein örnek çözülme. </li><li> Üç 10-saniye sonikasyon döngüleri buz üzerinde 10 sn soğutma aralıklarla dönüştürülebilir. Proteoliposomes banyo sonikatör kullanarak sonicated vardır. Membran parçaları için bir ipucu sonikatör (50W, 30 kHz, 1 mm sonotrode çapı, yoğunluğu% 20, çevrim 0.5) kullanılır. Son Sonication adımdan sonra buz geri örnek koymayın, ancak küvet içinde hemen enjekte. </li><li> Sökün çıkış referans elektrot asse ile birlikte konektörümontajları. </li><li> Bir pipet kullanarak, protein örnek 30 ul aspire ve delik prizine pipet monte edin. </li><li> Atık kaba olmayan aktive yolunda manuel vanasını açın ve küvet hacmi içine proteoliposomes enjekte. Sensör ile küvet hacmi içine hava enjekte dikkat edin. </li><li> Pipet çıkarmadan önce, daha fazla çözüm akışını önlemek için el vanasını kapatın. </li><li> Proteoliposomes 1 ile 2 saat bir inkübasyon süresi için SSM yapışır izin verin. Bu, gece boyunca inkübe etmek de mümkündür. </li></ol> Bir SSM-tabanlı deney 3,6 Genel Prosedür <ol><li> 4 ° C&#39;de saklandığında, zaman içinde ölçüm tamponlar Isınma Tüm ölçüm tamponlar eserler önlemek için ölçüm başlamadan önce oda sıcaklığında olması gerekir. </li><li> Çözümler değiştirirken, ilk olmayan bir tüylenme doku ile çözüm kaplar içindeki tüpler temizleyin, sonra yeni şişe yerleştirin. </li><li> Ölçüm başlamadan önce, değişen işlem evrimleşmiş olabilir hava kabarcıkları, kaldırmak için el vanaları kullanın. </li><li> Sadece bir ölçüm başlamadan önce basıncını ayarlayın. Biz rutin özel valf ve boru yapılandırması, yaklaşık 1.0 ml / sn &#39;lik bir akış hızı sağlar 0.6 barlık bir basınç kullanımı. </li><li> İlk birkaç ölçümler birbiri ardına düz bir yapılabilir ve tepe akımı sabit kalır kadar reddedilmelidir. Solüsyonları pH farklılık varsa, en az 3 dakika arasında bir inkübasyon süresi ölçümlerine başlamadan önce proteoliposomes iç pH değerini ayarlamak için gereklidir. </li><li> Şimdi kurulum ölçüm için hazırdır. Gürültüyü azaltmak için en az 3 ölçüm yapılmış ve ortalaması alınmalıdır. </li></ol> 3.7 Kontrol Ölçümleri Ölçümler bir dizi sırasında bir sinyal özet protein yıkımı veya adsorpsiyon bir kaybı nedeniyle oluşabilir. Her SSM deney i olmalıdıryıkık bir denetim nclude. Bu aynı çözümleri ile tekrarlanan ölçümler yapılır. En az bir özet kontrolü aynı çözeltisi kullanılarak, tek bir ölçüm başında ve deney sonunda biri anlamına gelir. Biz deney en yüksek tepe genlik bekliyoruz koşullar altında yıkık kontrolü yapmak için tavsiye. Bu daha kolay sinyalin özet ölçmek için yapar. Sinyal özet iki özet kontrollerin zirve amplitüdleri arasında bir karşılaştırma ile tayin edilebilir. Elde edilen yüzde değeri hatlarıyla lineer bir zaman bağımlılığı varsayılarak ölçülen sinyallerin düzeltmek için kullanılabilir. 3.8 Artifact kontrolleri Mümkünse deney sonra ilgi inhibe protein, sonuçlarınızı doğrulamak için deneyin. Kalan sinyalleri muhtemelen çözüm Döviz eserler bulunmaktadır. Sinyallerin, daha sonra ölçülen eserler için düzeltilmesi gerekir. <ol><li> Saf 20-30 ml su ve% 30 etanol / 20-30 ml su ile yıkama sistemi. Sistem kullanımda değilken etanolik çözüm bakteri üremesi önler. </li><li> Bu temizleme işleminden sonra, sistemden basıncı serbest bırakmak ve tüm aletleri kapatın. </li><li> Faraday kafesi gelen küvet çıkarın ve bağlantısını kesmek. Küvet tüm parçaları bir banyo sonikatörü kullanılarak, gerekirse su ve saf etanol ile temizlenebilir. </li><li> Saf etanol ile bir cam beher sensör çipi yerleştirin. Banyo sonikatör kullanılarak 2-1 dakika boyunca sonikasyon beher. </li><li> Azot gazı altında sensör çipi kurutun. </li><li> 10 mM&#39;lik bir Octadecanthiol etanolik çözelti içinde ışıktan uzak sensör çipi saklayın. Yaklaşık 30 dakika arasında bir inkübasyon süresinden sonra sensör çipi yeniden kullanım için hazırdır. </li></ol>

<ol>
	<li>Seifert, K., Fendler, K., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+transport+by+ion+translocating+membrane+proteins+on+solid+supported+membranes.">Charge transport by ion translocating membrane proteins on solid supported membranes.</a> Biophys. J. 64, 384-391 (1993).</li><li>Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSM-based+electrophysiology.">SSM-based electrophysiology.</a> Methods. 46, 97-103 (2008).</li><li>Garcia-Celma, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+activation+of+the+melibiose+permease+MelB+immobilized+on+a+solid-supported+membrane.">Rapid activation of the melibiose permease MelB immobilized on a solid-supported membrane.</a> Langmuir. 24, 8119-8126 (2008).</li><li>Mager, T., Rimon, A., Padan, E., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+mechanism+and+pH+regulation+of+the+Na+/H++antiporter+NhaA+from+Escherichia+coli:+an+electrophysiological+study.">Transport mechanism and pH regulation of the Na+/H+ antiporter NhaA from Escherichia coli: an electrophysiological study.</a> J. Biol. Chem. 286, 23570-23581 (2011).</li><li>Zhou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+translocation+during+cosubstrate+binding+in+the+Na+/proline+transporter+of+E.coli.">Charge translocation during cosubstrate binding in the Na+/proline transporter of E.coli.</a> J. Mol. Biol. 343, 931-942 (2004).</li><li>Ganea, C., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transporters:+charge+translocation+and+mechanism.">Bacterial transporters: charge translocation and mechanism.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1787, 706-713 (2009).</li><li>Schulz, P., Werner, J., Stauber, T., Henriksen, K., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G215R+mutation+in+the+Cl-/H+-antiporter+ClC-7+found+in+ADO+II+osteopetrosis+does+not+abolish+function+but+causes+a+severe+trafficking+defect.">The G215R mutation in the Cl-/H+-antiporter ClC-7 found in ADO II osteopetrosis does not abolish function but causes a severe trafficking defect.</a> PLoS ONE. 5, e12585 (2010).</li><li>Schulz, P., Dueck, B., Mourot, A., Hatahet, L., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+ion+channels+on+solid+supported+membranes.">Measuring ion channels on solid supported membranes.</a> Biophys. J. 97, 388-396 (2009).</li><li>Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+LacY.">Electrophysiological characterization of LacY.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 7373-7378 (2009).</li><li>Garcia-Celma, J. J., Ploch, J., Smirnova, I., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineating+electrogenic+reactions+during+lactose/H++symport.">Delineating electrogenic reactions during lactose/H+ symport.</a> Biochemistry. 49, 6115-6121 (2010).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

1. SSM-tabanlı elektrofizyoloji avantajları geleneksel yöntemlere göre SSM tabanlı elektrofizyoloji elektrofizyolojik araç değerli bir araç olarak kendini kanıtlamıştır. Bu kongre elektrofizyoloji, yani yama kelepçe ve gerilim kelepçe yöntemleri, uygulanamaz durumlarda özellikle yararlıdır: Apart birkaç nadir istisnalar dışında bakteriyel nakil nedeniyle bakterilerin küçük boyutu ve bu nedenle gerilim kelepçe veya yama kelepçe yöntemleri kullanılarak incelenmiştir edilemez Bu memeli hücrelerinde veya oositlerde ifade etmek zordur. Ama aynı zamanda fizyolojik ilgili memeli nakil incelenebilir. Bu durumda SSM tabanlı elektrofizyoloji hücre içi membranlardan ve nedeniyle sağlamlık ve otomasyon potansiyelinin ilaç keşfi tarama uygulamaları için taşıyıcılar için cazip. Şeffaf SSM-basedUsing geleneksel elektrofizyoloji, zaman çözülmesi karakterizasyonuorters zordur. Nakil cirosu düşük olduğu için bir &#39;dev yama&#39; ya da &#39;tam hücre&#39; yapılandırma gereklidir, bir çözüm değişim deneyde bir doğal düşük zaman çözünürlüğe sahip olan. Komplikasyon fotolitik yüzey sürümü kullanılarak aşılabilir. Bununla birlikte, yüzeyler arasında sadece sınırlı sayıda bu yaklaşım için uygundur. Burada SSM&#39;de hızlı çözüm Döviz keyfi maddeleri kullanarak yüksek zaman çözünürlüğü ile elektrofizyolojik çalışmalar yapmak için eşsiz bir fırsat sunuyor. 2. Sınırlamalar ve kritik adımlar Yama kelepçe ve voltaj-kıskaç teknikleri aksine, SSM-tabanlı elektrofizyoloji potansiyel bir uygulamak için kullanılamaz. Transporter karakterizasyonu bu nedenle membran potansiyeli güvenmeyin modları taşıma ile sınırlıdır. Genel olarak, SSM tabanlı elektrofizyoloji (Elektrojenik) taşıyıcı türüne ilişkin herhangi bir sınırlama vardır. Ama gerilim clbağlayıcı proteinler gibi hücre içi bileşenleri protein işlevleri için ise amfi veya yama kelepçe yöntemleri, avantajları olabilir. Çözüm Döviz büyük eser akımları oluşturursa Sınırlamalar, ortaya çıkabilir. Alt tabaka lipofilik bileşiklerin durumunda olduğu gibi, SSM ile güçlü bir etkileşim meydana gelir. Artefaktı kontroller ölçülen sinyallerin düzeltmek için kullanılabilir. Tüm ölçüm tampon Ayrıca yüksek tuz arka plan eserler azaltmak için kullanılabilir. Ancak durumlarda, insan yapımı büyüklüğü protein sinyali ile karşılaştırılabilir olduğu, bu obje ikinci protein ilişkili sinyal izole etmek için hemen hemen imkansızdır. Neyse ki, yüksek eserler bir optimize edilmiş bir çözüm karşılığında sıradışı. Bir SSM tabanlı elektrofizyoloji deney başarılı gerçekleşmesi için kritik olan birkaç adım vardır. Protein numunesinin hazırlanması en önemli bir parçasıdır. Proteoliposomes kullanıldığında, emin olun reconsAnayasasının süreci yeterli LPR bir temiz, tekrarlanabilir örnek verir ve taşıyıcı doğru şekilde aydınlatmaktadır. Antikorlar olup olmadığını LPR bir ELISA deneyle dondurma kırık elektron mikroskobu ve yönünü kontrol edilebilir. Sadece protein inkübe için en iyi parametreleri gösteren bir SSM kullanın. Protein enjeksiyonu bir başka önemli bir adımdır. Sonikasyon önemlidir ve hava kabarcıkları enjeksiyon sırasında kaçınılmalıdır. Hava kabarcıkları, sensör çip adsorbe protein örnek kaldırır, çünkü örnek inkübasyondan sonra ölçümler kendisi kritik bir öneme sahiptir. Bu nedenle her zaman çözüm değiştirdikten sonra hava kabarcıklarını çıkarmak. Yine de bir sinyal özet oluşabilir. Olası bir sinyal özet düzeltmek için, bu deney sırasında yıkık kontrolleri gerçekleştirmek için gereklidir. 3. İhtisas Sistemleri SSM-Kur, uygulamaya göre değiştirilebilir. Ayrıca tburada mevcut tamamen farklı, son derece uzmanlaşmış kurulumları vardır. PH degrade altında örneğin asimetrik koşullar altında protein sinyalleri ölçmek için olasılığı vardır. Üçüncü bir çözüm içinde ve proteoliposomes dışında asimetrik tampon kompozisyonlar kurmak, dinlenme çözüm, ortaya konulmak zorundadır ve bu bir çift değişim yapılandırma gerektirir. Burada olmayan aktive ve dinlenme çözümleri arasında geçiş ek bir üç yollu vana gereklidir. Biz terminal kapak eksik, ancak küvet farklı bir türü kullanılarak bir alternatif akım yolu geliştirilen sistemin zaman çözünürlüğü artırmak için. Burada aktive olan ve olmayan aktive çözüm kavşak SSM önünde 3 mm, küvet içinde yer almaktadır. Bu kurulum iyi hızlı ulaşım süreçlerinin kinetik analizi için uygundur. Bu 2 msn gibi düşük bir zaman çözünürlüğü mümkün olduğu gösterilebilir. Ticari fully otomatik sistemler ilaç tarama için daha yüksek verim amaçlayan mevcuttur. Bir hareketli birim çözümler toplar ve standart bir mikrotiter levha formatında 96-yuvalı plakalar içinde sensör yüzeye enjekte eder.

Burada Elektrojenik membran proteinlerin karakterizasyonu için sağlam bir destek zar (SSM) dayalı yeni bir elektrofizyolojik yaklaşım göstermektedir. Katı destek, bir cam slayt, sensör çipi üzerinde ince bir altın tabakası oluşur. Hidrofilik altın yüzey, bir alcanethiol reaktif tiyol grubuna bağlamak için kullanılır. Daha sonra, selfassembly bir fosfatidilkolinin monolyer en SSM oluşumunu tamamlar. Zar proteinlerinin Elektrojenik tepkisini ölçmek için, proteoliposomes veya zar parçaları SSM (Şekil 1) ile absorbe edilir. Membran ve SSM içeren protein daha sonra bir kapasitif olarak birleştirilmiş zar sistemi oluşturur. Bu nedenle, protein ihtiva eden membran şarj translokasyon SSM ile kapasitif kuplaj ile tespit edilebilir. Bu yöntem yalnızca geçici akımlar verir. Akım tepe sabit taşıma aktivitesini temsil eder. Zamana bağlı taşıyıcı currents devre analizi ile yeniden olabilir. Sensör çipi bir küvet sistemi (Şekil 2) içine monte edilir. Küvet 17 ul silindirik bir küvet hacmi (o-ring ile net ses monte). Bir yaylı kontak pin amplifikatör için temas oluşturur. Bir çıkış konektörü ana kısmının üstüne vidalanır ve referans elektrot, klorlanmış bir gümüş tel taşır. Küvet bir Faraday kafesi olarak monte edilir. Bu, hızlı bir çözelti değişimi (Şekil 3) karşılık olarak membran proteini taşınma aktivitesi sağlamak için kullanıldığı, bir sıvı yolu, bağlanır. Tek bir çözüm değişimi protokolü iki çözüm, bir aktive edici olmayan ve bir aktive edici bir çözüm, gereklidir. Akış bir arayüz kutusu üzerinde bir bilgisayar veya el anahtarları üzerinde bir vana kontrol yazılımı kullanarak basınçlı hava ile kontrol edilir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Waterbath Sonicator</td><td>Bandelin</td><td>RK 52 H</td><td></td></tr><tr><td>Tip Sonicator</td><td>Hielscher Ultrasonics GmbH</td><td>UP50H</td><td></td></tr><tr><td>2-way valve</td><td>NResearch, West Caldwell, USA</td><td>NR225T011</td><td></td></tr><tr><td>Terminal valve</td><td>NResearch, West Caldwell, USA</td><td>NR225T031</td><td></td></tr><tr><td>Manometer</td><td>Greisinger electronics</td><td>GDH 14 AN</td><td></td></tr><tr><td>Faraday cage</td><td>Max Planck Institute of Biophysics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuvette</td><td>Max Planck Institute of Biophysics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 ml solution containers</td><td>Kartell</td><td>1623</td><td></td></tr><tr><td>O-rings</td><td>Seal Science Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronix</td><td>TDS 1002</td><td></td></tr><tr><td>Reference electrode</td><td>Max Planck Institute of Biophysics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Function generator</td><td>Max Planck Institute of Biophysics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubings</td><td>SAINT-GOBAIN Performance Plastics</td><td>AAC00006</td><td></td></tr><tr><td>Sensor chip</td><td>Fraunhofer Institut f&amp;#252;r Schicht und Oberfl&amp;#228;chentechnik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Interface box</td><td>Max Planck Institute of Biophysics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Keithley</td><td>427</td><td></td></tr><tr><td>Manual cog</td><td>Vygon GmbH</td><td>876</td><td></td></tr><tr><td>USB analog-to-digital converter</td><td>National Instruments</td><td>6009</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Regeants&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>1,2&amp;#8209;Diphytanoyl-sn-glycero-3-Phosphatidylcholine</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850356</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide/Bis-acrylamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3574</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose </td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol </td><td>Sigma Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolut</td><td>VWR AnalaR NORMAPUR</td><td>603-002-00-5</td><td></td></tr><tr><td>Natural E. coli lipids polar extract</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>100600</td><td>for LacY reconstitution</td></tr><tr><td>n-Decane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D901</td><td></td></tr><tr><td>Octadecanethiol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O1858</td><td></td></tr><tr><td>Octadecylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74750</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Merck</td><td>1049360500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylenediamine</td><td>BIO RAD</td><td>1610801</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Lactose monohydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L8783</td><td></td></tr></tbody></table>

introduction to solid supported membrane based electrophysiology

Biz mevcut elektrofizyolojik yöntem altın kaplamalı sensör çipi ve üstüne bir fosfatidilkolinin tek tabaka üzerinde kimyasal olarak bir octadecanethiol tabakası oluşan sağlam bir desteklenen membran (SSM) dayanmaktadır. Bu meclis referans elektrot, bir klorlu gümüş tel içeren bir küvet sisteme monte edilir. Membran fragmanları ya da ilgi membran proteini içeren proteoliposomes adsorpsiyonu sonra, hızlı bir çözüm değişimi membran proteini taşıma etkinliği indüklemek için kullanılır. Tek bir çözüm değişimi protokolü iki çözüm, bir aktive edici olmayan ve bir aktive edici bir çözüm, ihtiyaç vardır. Akış, bir Faraday kafesi içinde basınçlı hava ve bir valf ve boru sistemi ile kontrol edilir. Elektrojenik taşımacılık faaliyetinin kinetik SSM ve proteoliposomes veya membran parçaları arasında kapasitif bağlantı yoluyla elde edilir. Bir yöntem olup, bu nedenle, sadece transien verimlerit akımları. Akım tepe sabit taşıma aktivitesini temsil eder. Zamana bağlı taşıyıcı akımları devre analizi ile yeniden olabilir. Bu yöntem özellikle yama kelepçe veya gerilim kelepçe yöntemlerle incelenmiştir edilemez hücre içi zarlar, gelen prokaryotik taşıyıcılar veya ökaryot taşıyıcılar için uygundur.

Şimdiye kadar, SSM-tabanlı elektrofizyoloji çoğunlukla prokaryotik kökenli 20&#39;den fazla taşıyıcılar, örneğin MELB 3, 4 ve NhaA PutP 5 (6 özetlenmektedir) karakterize etmek için kullanıldı. Ama aynı zamanda hücre içi zarlar ökaryotik taşıyıcılar, örneğin ClC7 7 hem de iyon kanalları, nikotinik asetilkolin reseptörü 8 araştırılmıştır örn. Burada 5 9 bir LPR, 10 Lacy odaklı dışarı en az% 85 sağ tarafı ile proteoliposomes kullanarak Escherichia coli Lacy şeker / H + kotransportuna bir örnek ölçümleri olarak sunuyoruz. Bu taşıyıcı protein asgari bir kinetik model giden ana adımları odaklanın. 1. Wild tip Lacy Elektrofizyolojik karakterizasyonu İlk adım, farklı pH değerinde ölçülmesi ile Elektrojenik Reaksiyon genel bir karakterizasyonu ( <strong<html> &gt; Şekil 4), substrat konsantrasyonları (Şekil 5) ve alt tabakalar. Teknik doğrulamak için, literatürde verilen K M ve pKa değerleri yeniden üretildi. Lacy arasında pH bağımlılığı iki farklı Elektrojenik reaksiyon gösterir. PH 5 ila pH 8.5 arasında, aynı zamanda, kapasitif birleştiğinde akımı arttıkça şekil değiştirir. Asidik pH değerinin, sadece hızlı bir reaksiyon Elektrojenik kalır değerleri ise alkalin koşullar altında, kararlı durum taşıma görülmektedir. Biz taşıyıcı akımları (Şekil 6) yeniden oluşturmak için devre analizi kullanılan hızlı Elektrojenik reaksiyonlardan kararlı durum sinyalleri ayırt etmek. PH 7 &#39;de tek fazlı sinyali iki fazlı olur. Bu aynı zamanda iki farklı Elektrojenik tepkiler olduğunu gösterir. Transfer yük (sinyallerinin integrali) tahmin edilen, iki reaksiyon yaklaşık% 6 ve taşıma döngüsünün toplam electrogenicity% 94 vardır. Elektrojenik reaksiyonların ove_step &quot;&gt; 2. Atama Lacy bir reaksiyon döngüsünde belirli adımlar için iki Elektrojenik reaksiyonları atamak için, E325A dantelli varyant (Şekil 7) ölçüldü. Bu varyant sadece laktoz Döviz gösterir ama çünkü proton sürümü inhibisyonunun, tüm aktif taşıma modları için eksiktir. Lacy E325A bir sinyal hızlı geçici temsil eder ve tüm ölçülen pH değerleri için sabittir. Sinyalin şekli ve büyüklüğü, asidik koşullar altında Lacy vahşi tip bir sinyal benzer. Ayrıca biz kapasitif birleştiğinde sistemlerinde ölçülen hızlı geçici akımlar için karakteristik olan azalan tepe akımı, sonra küçük bir negatif faz gözlemlemek. Laktoz bağlayıcı ve serbest Elektrojenik olmadığı için, hızlı geçici laktoz bağlayıcı ardından bir Elektrojenik yapısal geçiş ile ilişkili olmalıdır. Bu proton bırakma adım hızı limiti olduğu bilinmektedirlaktoz konsantrasyonu farkı motorlu taşıma modunda Lacy ciro için ng. Proton serbest tercih edilir, çünkü bu durumda biz, alkali pH ile taşıma hızı bir artış bekliyoruz. Bu, kararlı durum nakil Lacy vahşi tip sinyal korelasyon için geçerlidir. Üstelik sadece iç pH dantelli en kararlı durum taşıma (yayınlanmamış) etkilediğini pH degrade ölçümü ile gösterilebilir. Bu nedenle büyük Elektrojenik reaksiyon proton serbest adıma atanabilir. 3. Kinetik analizi için ölçüm Taşıma oranları ve kapalı Elektrojenik reaksiyonların belirlenmesi sonra yaklaşık 4.5 msn, yüksek zaman çözünürlüğü ile SSM Kurulum kullanılarak belirlenmiştir. Bir reaksiyon sinyal hakim Bu, koşullar altında mümkündür. Bu durumda hız sabitleri, tekrarlanan bir en küçük kareler de kullanılarak sinyallerin zaman çözünürlüğü göz önünde bulundurularak, geçici akımlar türetilebilir<html> evrişim algoritması (Şekil 8). Belirlenen hız sabitleri hem de önerilen minimum kinetik model (Şekil 9) nihayet taşıyıcı kinetik simülasyonu için kullanılmıştır. Simüle eğrileri ek olarak kinetik model kanıtlıyor SSM verileri yeniden. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig1.jpg" alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig1highres.jpg"/> Şekil 1. SSM hakkında proteoliposomes adsorpsiyonu geometrisi. SSM bir sensör çipi, yapısal bir altın kaplı cam slayt oluşur. Membran proteinlerinin Elektrojenik reaksiyonları ölçmek için, proteoliposomes veya membran parçaları SSM için emilirler. Iki geo-zar, bir kapasitif akuple sistemi oluşturur. Sadece geçici akımlar tespit edilir nedeni budur. tp_upload/50230/50230fig2highres.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. SSM küvet sensör çipi ve referans elektrot taşır. Sensör çipi küvet taban ve küvet kafası arasında sıkışmış. Referans elektrot, bir poliakrilamid jel tuz köprüsü tarafından akış yolu izole edilir. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig3.jpg" alt="Şekil 3," fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig3highres.jpg"/> Şekil 3,. SSM Kur sıvı Yolu ve Elektrik Devre. Tek bir çözüm değişim protokolü sadece olmayan bir aktive (NA) ve bir aktive (A) çözümü gereklidir. Akışı iki 2 yollu vana (V1) ve bir uç kapak (V2) tarafından kontrol edilir. Olmayan aktive ve aktive çözümleri arasında Terminal vana anahtarları, küvet ve bir atık kabı (W) için başka bir çözüm için çözümlerden birini yönetiyor. Sensör çipi (SSM), yükseltici (I / U) bağlanmıştır<html> referans elektrot (AgCl) harici elektrik devresindeki fonksiyon jeneratörü (F) bağlıyken. Bir bilgisayar (PC) ve bir arayüz kutusu kapak operasyonu ve veri toplama için kullanılır. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig4.jpg" alt="Şekil 4," fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig4highres.jpg"/> Şekil 4. Aktive edici çözelti 100 mM laktoz içerirken, farklı pH değerlerinde, 100 mM laktoz konsantrasyonunda atlar sonra yabani tip Lacy proteoliposomes ile ölçülmüştür geçici akımlar. Olmayan aktifleştirici çözelti 100 mM glukoz içermektedir. Bütün çözeltiler, 1 mM DTT, belirtilen pH&#39;da 100 mM potasyum fosfat tamponu içinde hazırlanmıştır. Bu ölçüm koşulları ile ilgili ayrıntılı bilgileri ve aşağıdaki rakamlar 9 ve 10 bakınız. <html> ftp_upload/50230/50230fig5highres.jpg &quot;/&gt; Şekil 5,. Ortalama Normalize Tepe akımları farklı konsantrasyonlarda ve pH değerlerinde laktoz konsantrasyonunda atlar sonra yabani tip Lacy proteoliposomes ile ölçüldü. K M değerleri hiperbolik uyan elde edilir. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig6.jpg" alt="Şekil 6," fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig6highres.jpg"/> 6 Şekil. Taşıyıcı akımların İmar. Geçici akımlar (A) taşıyıcı akımları (B) yeniden oluşturmak için kullanılan pH 8.5 (mavi iz) ve pH 5.2 (kırmızı iz) de 100 mM laktoz konsantrasyonu atlar sonra vahşi tip Lacy proteoliposomes ile ölçüldü. PH 5.2 de hızlı bir Elektrojenik tepkime meydana pH 8.5 sürekli cirosu görülmektedir. Bu, açık bir şekilde yeniden akımı (B) &#39;de görülmektedir. files/ftp_upload/50230/50230fig7.jpg &quot;alt =&quot; Şekil 7 &quot;fo: içerik-width =&quot; 4in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/50230/50230fig7highres.jpg &quot;/&gt; Şekil 7. Geçici akım pH 5.2 100 mM laktoz konsantrasyonu atlamadan sonra E325A Lacy proteoliposomes ile ölçüldü. Bu Lacy varyant taşıma döngüsünün proton serbest adımda inhibe ve bu nedenle ulaşım eksikliği olduğunu. Gözlenen küçük negatif bileşeni kapasitif olarak bağlı sistemler ölçülür hızlı geçici akımlar için karakteristik olan ve hızlı bir reaksiyon Elektrojenik sonra membran kapasitans deşarj neden olur. Bu zaman sabiti π0 sistemi (Şekil 1) kapasitans ve iletkenlikleri tarafından belirlenir. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig8.jpg" alt="Şekil 8," fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig8highres.jpg"/> Şekil 8. Vahşi tip Lacy proteoliposomes ile ölçülen geçici akımlar aftepH 5.2 de r farklı laktoz konsantrasyonu atlar. Bu koşullar altında herhangi bir kararlı durum ulaşım görülen, ancak laktoz üzerine bir Elektrojenik yapısal geçiş bağlama edilir. Kesikli bir çizgi, sistemin zaman çözünürlüğü temsil transfer fonksiyonunu gösterir. Ilave verilere bir hiperbolik oturuş gözlenen oranı sabit Kobs gelen hız sabitleri ve kapalı belirlenmesi gösterir. Gözlemlenen hız sabiti, tekrarlanan bir en küçük kareler ters evrişim algoritması 10 ile geçici akımlar tespit edildi. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig9.jpg" alt="Şekil 9," fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig9highres.jpg"/> 9 Şekil. Lacy. İki Elektrojenik adımların reaksiyon döngüsü için bir kinetik model tespit ve SSM ölçümleri ile karakterize edilebilir. Tepki olarak toplam yük deplasman ~% 94 temsil eden güçlü Elektrojenik tepkidöngüsü sadece nötr ve temel pH değerlerinde görülmektedir. Bu proton serbest adım (mavi ok) atanabilir. Yabani tip Lacy devamlı bir devir inhibe edildiğinde bir zayıf Elektrojenik aşamasında asidik pH&#39;ta görülmektedir. Biz reaksiyon döngüsünde toplam yük deplasman 6% temsil laktoz bağlama, üzerine bir Elektrojenik yapısal geçiş için bu tepki atanmış.

Watch this Scientific Journal Video about Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology at JoVE.com

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

Burada Elektrojenik membran nakil karakterizasyonu için uygulamaları odaklı sağlam desteklenen membranlar dayalı bir elektrofizyolojik yöntem mevcut.

Elektrofizyoloji Tabanlı Katı Desteklenen Membran Giriş

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

introduction-to-solid-supported-membrane-based-electrophysiology

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

15.0K Görüntüleme.  Max Planck Institute of Biophysics. Burada Elektrojenik membran nakil karakterizasyonu için uygulamaları odaklı sağlam desteklenen membranlar dayalı bir elektrofizyolojik yöntem mevcut.

Video: Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

Applying Microfluidics to Electrophysiology

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the microfluidic brain slice device is discussed including how the device docks to standard perfusion chambers and the technique of passive pumping which is used to deliver boluses of neuromodulators to the brain slice.  By simplifying the device design, we are able to achieve a practical solution to the current unmet electrophysiology need of applying multiple neuromodulators across multiple regions of the brain slice.  This is achieved by substituting the standard coverglass substrate of the perfusion chamber with a thin microfluidic device bonded to the coverglass substrate.  This was then attached to the perfusion chamber and small holes connect the open-well of the perfusion chamber to the microfluidic channels buried within the microfluidic substrate.  These microfluidic channels are interfaced with ports drilled into the edge of the perfusion chamber to access and deliver stimulants.  This project represents how the field of microfluidics is transitioning away from proof-of concept device demonstrations and into practical solutions for unmet experimental and clinical needs.

Elektrofizyoloji için Mikroakiskan uygulama

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the ...

Biyoloji

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can be used for many different studies, such as the characterization of membrane-active peptides, the reconstitution of ion channels or investigations on how changes in lipid bilayer properties alter the function of bilayer-spanning channels.  Here, we show how to form a planar bilayer and how to isolate small patches from the bilayer, and in a second video  will also demonstrate a procedure for using gramicidin channels to determine changes in lipid bilayer elastic properties.   We also demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. Here, we demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Elektrofizyoloji Deneyler Yapay Bilayers hazırlanması

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Measuring the Induced Membrane Voltage with Di-8-ANEPPS

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell membrane, resulting in a voltage across the membrane. This voltage, termed the induced membrane voltage (also induced transmembrane voltage, or induced transmembrane potential difference) and denoted by &Delta;&Phi;, exists only as long as the external field is present. If the resting voltage is present on the membrane, the induced voltage superimposes (adds) onto it. By using one of the potentiometric fluorescent dyes, such as di-8-ANEPPS, it is possible to observe the variations of &Delta;&Phi; on the cell membrane and to measure its value noninvasively. di-8-ANEPPS becomes strongly fluorescent when bound to the lipid bilayer of the cell membrane, with the change of the fluorescence intensity proportional to the change of &Delta;&Phi;. This video shows the protocol for measuring &Delta;&Phi; using di-8-ANEPPS and also demonstrates the influence of cell shape on the amplitude and spatial distribution of &Delta;&Phi;.

External electric field induces a voltage on the membrane of a cell, termed the induced membrane voltage (&Delta;&Phi;). By using the potentiometric dye di-8-ANEPPS, it is possible to measure the &Delta;&Phi; noninvasively. This video shows the protocol for measuring &Delta;&Phi; using di-8-ANEPPS.

Di-8-ANEPPS ile İndüklenmiş Membran Gerilim Ölçme

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell ...

Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where the stimulus applied depends in real-time on the response of the system. Recent applications range from the implementation of virtual reality systems for studying motor responses both in mice1 and in zebrafish2, to control of seizures following cortical stroke using optogenetics3. A key advantage of closed-loop techniques resides in the capability of probing higher dimensional properties that are not directly accessible or that depend on multiple variables, such as neuronal excitability4 and reliability, while at the same time maximizing the experimental throughput. In this contribution and in the context of cellular electrophysiology, we describe how to apply a variety of closed-loop protocols to the study of the response properties of pyramidal cortical neurons, recorded intracellularly with the patch clamp technique in acute brain slices from the somatosensory cortex of juvenile rats. As no commercially available or open source software provides all the features required for efficiently performing the experiments described here, a new software toolbox called LCG5 was developed, whose modular structure maximizes reuse of computer code and facilitates the implementation of novel experimental paradigms. Stimulation waveforms are specified using a compact meta-description and full experimental protocols are described in text-based configuration files. Additionally, LCG has a command-line interface that is suited for repetition of trials and automation of experimental protocols.

Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board.

Gerçek zamanlı Elektrofizyoloji: Probe Nöronal Dynamics ve Ötesi Kapalı çevrim Protokolleri Kullanma

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

Nörobilim

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Modeling Biological Membranes with Circuit Boards and Measuring Electrical Signals in Axons: Student Laboratory Exercises

This is a demonstration of how electrical models can be used to characterize biological membranes. This exercise also introduces biophysical terminology used in electrophysiology. The same equipment is used in the membrane model as on live preparations. Some properties of an isolated nerve cord are investigated: nerve action potentials, recruitment of neurons, and responsiveness of the nerve cord to environmental factors.

This is a demonstration of how biological membranes can be understood using electrical models. We also demonstrate procedures for recording action potentials from the ventral nerve cord of the crayfish for student orientated laboratories.

Devre Biyolojik Membranlar Modelleme ve Aksonlar Elektrik Sinyalleri Ölçme: Öğrenci Laboratuvar Egzersizler

This is a demonstration of how electrical models can be used to characterize biological membranes. This exercise also introduces biophysical terminology ...

Murine Short Axis Ventricular Heart Slices for Electrophysiological Studies

Murine cardiomyocytes have been extensively used for in vitro studies of cardiac physiology and new therapeutic strategies. However, multicellular preparations of dissociated cardiomyocytes are not representative of the complex in vivo structure of cardiomyocytes, non-myocytes and extracellular matrix, which influences both mechanical and electrophysiological properties of the heart. Here we describe a technique to prepare viable ventricular slices of adult mouse hearts with a preserved in vivo like tissue structure, and demonstrate their suitability for electrophysiological recordings. After excision of the heart, ventricles are separated from the atria, perfused with Ca2+-free solution containing 2,3-butanedione monoxime and embedded in a 4% low-melt agarose block. The block is placed on a microtome with a vibrating blade, and tissue slices with a thickness of 150-400 &#181;m are prepared keeping the vibration frequency of the blade at 60-70 Hz and moving the blade forward as slowly as possible. Thickness of the slices depends on the further application. Slices are stored in ice cold Tyrode&#39;s solution with 0.9 mM Ca2+ and 2,3-butanedione monoxime (BDM) for 30 min. Afterwards, slices are transferred to 37 &#176;C DMEM for 30 min to wash out the BDM. Slices can be used for electrophysiological studies with sharp electrodes or micro electrode arrays, for force measurements to analyze contractile function or to investigate the interaction of transplanted stem cell-derived cardiomyocytes and host tissue. For sharp electrode recordings, a slice is placed into a 3 cm cell culture dish on the heating plate of an inverted microscope. The slice is stimulated with a unipolar electrode, and intracellular action potentials of cardiomyocytes within the slice are recorded with a sharp glass electrode.

Here, we describe the preparation of viable ventricular slices from adult mice and their use for sharp electrode action potential recordings. These multicellular preparations provide a preserved in vivo like tissue structure, which makes them a valuable model for electrophysiological and pharmacological studies in vitro.

Elektrofizyolojik Çalışmalar İçin Murin Kısa Eksenli Ventriküler Kalp Dilimleri

Murine cardiomyocytes have been extensively used for in vitro studies of cardiac physiology and new therapeutic strategies. However, multicellular ...

Tıp

Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood flow triggers a signaling cascade resulting in vasodilation thereby alleviating mechanical stress on the vascular wall. The pattern of shear stress is also well known to be a critical factor in the development of atherosclerosis with laminar shear stress being atheroprotective and disturbed shear stress being pro-atherogenic. While we have a detailed understanding of the various intermediate cell signaling pathways, the receptors that first translate the mechanical stimulus into chemical mediators are not completely understood. Mechanosensitive ion channels are critical to the response to shear and regulate shear-induced cell signaling thereby controlling the production of vasoactive mediators. These channels are among the earliest activated signaling components to shear and have been linked to shear-induced vasodilation through promoting nitric oxide production (e.g., inwardly rectifying K+ [Kir] and transient receptor potential [TRP] channels) and endothelium hyperpolarizing factor (e.g., Kir and calcium-activated K+ [KCa] channels) and shear-induced vasoconstriction through an undetermined mechanism that involves piezo channels. Understanding the biophysical mechanism by which these channels are activated by shear forces (i.e., directly or through a primary mechano-receptor) could provide potential new targets to resolve the pathophysiology associated with endothelial dysfunction and atherogenesis. It is still a major challenge to record flow-induced activation of ion channels in real time using electrophysiology. The standard methods to expose cells to well-defined shear stress, such as the cone and plate rheometer and closed parallel plate flow chamber do not allow real time study of ion channel activation. The goal of this protocol is to describe a modified parallel plate flow chamber that allows real time electrophysiological recording of mechanosensitive ion channels under well-defined shear stress.

The goal of this protocol is to describe a modified parallel plate flow chamber for use in investigating real time activation of mechanosensitive ion channels by shear stress.

Iyi tanımlanmış kayma stres altında tek hücreli Iyon akımları elektrofizyolojik kayıtlar

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions under various membrane lipid compositions. Among them, the droplet interface bilayer has gained popularity; however, the large membrane size hinders the recording of low electrical background noise. We have established a contact bubble bilayer (CBB) method that combines the benefits of planar lipid bilayer and patch-clamp methods, such as the ability to vary the lipid composition and to manipulate the bilayer mechanics, respectively. Using the setup for conventional patch-clamp experiments, CBB-based experiments can be readily performed. In brief, an electrolyte solution in a glass pipette is blown into an organic solvent phase (hexadecane), and the pipette pressure is maintained to obtain a stable bubble size. The bubble is spontaneously lined with a lipid monolayer (pure lipids or mixed lipids), which is provided from liposomes in the bubbles. Next, the two monolayer-lined bubbles (~50 &#181;m in diameter) at the tip of the glass pipettes are docked for bilayer formation. Introduction of channel-reconstituted liposomes into the bubble leads to the incorporation of channels in the bilayer, allowing for single-channel current recording with a signal-to-noise ratio comparable to that of patch-clamp recordings. CBBs with an asymmetric lipid composition are readily formed. The CBB is renewed repeatedly by blowing out the previous bubbles and forming new ones. Various chemical and physical perturbations (e.g., membrane perfusion and bilayer tension) can be imposed on the CBBs. Herein, we present the basic procedure for CBB formation.

Here, we present a protocol for the formation of lipid bilayers using a contact bubble bilayer method. A water bubble is blown into an organic solvent, whereby a monolayer is formed at the water-oil interface. Two pipettes are manipulated to dock the bubbles to form a bilayer.

Lipid Bilayer deneyler ile iletişim balonu Bilayers yama-Clampers için

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...

Patch Clamp Electrophysiology

Neuron cell membranes are populated with ion channels that control the movement of charge into and out of the cell, thereby regulating neuron firing. One extremely useful technique for investigating the biophysical properties of these channels is called patch clamp recording. In this method, neuroscientists place a polished glass micropipette against a cell and apply suction to form a high resistance seal. This process isolates a small &#8220;patch&#8221; of membrane that contains one or more ion channels. Using an electrode within the micropipette, researchers can &#8220;clamp&#8221; or control the electrical properties of the membrane, which is important for analysis of channel activity. The electrode also allows for changes in the voltage across the membrane, or the flow of ions through the membrane, to be recorded. This video begins with an overview of the principles behind patch clamp electrophysiology, an introduction to the necessary equipment, and descriptions of the various patch configurations, including whole cell, cell-attached, perforated, inside-out, and outside-out patches. Next, the key steps of a typical whole-cell patch clamp experiment are outlined, in which a current-voltage (IV) curve is generated. Finally, applications of patch clamp recording are provided to demonstrate how the biophysical properties of ion channels, cell excitability, and neuroactive compounds are evaluated in neurophysiology labs today.

Patch Clamp Electrophysiology: Principle &amp; Applications

Neuron cell membranes are populated with ion channels that control the movement of charge into and out of the cell, thereby regulating neuron firing. One ...