نشكر J. جارسيا لسيلما، أنا سميرنوفا وR. Kaback من أجل التبرع لقياسات المزركشة وE. بامبرج للحصول على الدعم ومناقشات مفيدة.

<ol>
	<li>Seifert, K., Fendler, K., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+transport+by+ion+translocating+membrane+proteins+on+solid+supported+membranes.">Charge transport by ion translocating membrane proteins on solid supported membranes.</a> Biophys. J. 64, 384-391 (1993).</li><li>Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSM-based+electrophysiology.">SSM-based electrophysiology.</a> Methods. 46, 97-103 (2008).</li><li>Garcia-Celma, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+activation+of+the+melibiose+permease+MelB+immobilized+on+a+solid-supported+membrane.">Rapid activation of the melibiose permease MelB immobilized on a solid-supported membrane.</a> Langmuir. 24, 8119-8126 (2008).</li><li>Mager, T., Rimon, A., Padan, E., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+mechanism+and+pH+regulation+of+the+Na+/H++antiporter+NhaA+from+Escherichia+coli:+an+electrophysiological+study.">Transport mechanism and pH regulation of the Na+/H+ antiporter NhaA from Escherichia coli: an electrophysiological study.</a> J. Biol. Chem. 286, 23570-23581 (2011).</li><li>Zhou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charge+translocation+during+cosubstrate+binding+in+the+Na+/proline+transporter+of+E.coli.">Charge translocation during cosubstrate binding in the Na+/proline transporter of E.coli.</a> J. Mol. Biol. 343, 931-942 (2004).</li><li>Ganea, C., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transporters:+charge+translocation+and+mechanism.">Bacterial transporters: charge translocation and mechanism.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1787, 706-713 (2009).</li><li>Schulz, P., Werner, J., Stauber, T., Henriksen, K., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G215R+mutation+in+the+Cl-/H+-antiporter+ClC-7+found+in+ADO+II+osteopetrosis+does+not+abolish+function+but+causes+a+severe+trafficking+defect.">The G215R mutation in the Cl-/H+-antiporter ClC-7 found in ADO II osteopetrosis does not abolish function but causes a severe trafficking defect.</a> PLoS ONE. 5, e12585 (2010).</li><li>Schulz, P., Dueck, B., Mourot, A., Hatahet, L., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+ion+channels+on+solid+supported+membranes.">Measuring ion channels on solid supported membranes.</a> Biophys. J. 97, 388-396 (2009).</li><li>Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+LacY.">Electrophysiological characterization of LacY.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 7373-7378 (2009).</li><li>Garcia-Celma, J. J., Ploch, J., Smirnova, I., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineating+electrogenic+reactions+during+lactose/H++symport.">Delineating electrogenic reactions during lactose/H+ symport.</a> Biochemistry. 49, 6115-6121 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

1. مزايا الكهربية المستندة إلى SSM بالمقارنة مع الطرق التقليدية وقد ثبت الكهربية المستندة إلى SSM نفسها كأداة قيمة من مربع الأدوات الكهربية. انها مفيدة بشكل خاص في الحالات التي لا يمكن فيها تطبيق اتفاقية الكهربية، وهي المشبك التصحيح وطرق المشبك الجهد، و: وبصرف النظر عن بعض الاستثناءات النادرة نقل البكتيرية لا يمكن التحقيق باستخدام المشبك الجهد أو أساليب المشبك التصحيح بسبب صغر حجم البكتيريا، ولأن أنها صعبة للتعبير في خلايا الثدييات أو البويضات. ولكن أيضا من الناحية الفسيولوجية نقل الثدييات ذات الصلة يمكن التحقيق. في هذه الحالة الكهربية المستندة إلى SSM جذابة للنقل من أغشية الخلايا وللتطبيقات الفحص في اكتشاف المخدرات بسبب متانة وقدرته على التشغيل الآلي. SSM-basedUsing التقليدية الكهربية، والوقت توصيف حل من TRANSPorters يمثل تحديا. منذ دوران ناقلات منخفضة A &#39;التصحيح العملاقة&#39; أو مطلوب التكوين &#39;خلية كاملة &quot;، والتي يكون لها القرار وقت منخفضة بطبيعتها في تجربة تبادل الحلول. ويمكن التغلب على المضاعفات باستخدام الإفراج الركيزة التحلل الضوئي. ومع ذلك، هي مناسبة فقط لعدد محدود من ركائز لهذا النهج. هنا تبادل حل سريع في SSM يوفر فرصة فريدة لإجراء دراسات الكهربية مع قرار الأوان باستخدام ركائز التعسفي. 2. القيود والخطوات الحاسمة وعلى النقيض من المشبك التصحيح وتقنيات المشبك الجهد، لا يمكن الكهربية المستندة إلى SSM استخدامها لتطبيق المحتملة. ولذلك يقتصر توصيف نقل لنقل وسائط التي لا تعتمد على غشاء المحتملة. بشكل عام، الكهربية المستندة إلى SSM لا يوجد لديه قيود تتعلق بنوع الناقل (كهربي). ولكن CL الجهديمكن أن أساليب المشبك أمبير أو التصحيح لديها مزايا، إذا كانت هناك حاجة مكونات داخل الخلايا مثل البروتينات ملزمة حصول على وظائف البروتين. يمكن أن تنشأ القيود، إذا تبادل حل يخلق تيارات قطعة أثرية كبيرة. يحدث هذا عندما يتفاعل بقوة مع الركيزة SSM مثل في حالة مركبات محبة للدهون. ضوابط قطعة أثرية يمكن استخدامها لتصحيح الإشارات المقاسة. خلفية عالية من الملح علاوة على ذلك في جميع مخازن قياس يمكن استخدامها للحد من القطع الأثرية. ولكن في حالات، حيث حجم قطعة أثرية مشابه لإشارة البروتين، فإنه يكاد يكون من المستحيل عزل إشارة ذات صلة البروتين من القطع الأثرية. لحسن الحظ، والتحف عالية غير عادية في تبادل حل الأمثل. هناك بعض الخطوات التي تعتبر بالغة الأهمية لتحقيق النجاح في تجربة الكهربية المستندة إلى SSM. إعداد نموذج البروتين هو الجزء الأكثر أهمية. إذا تم استخدام proteoliposomes، تأكد من أن reconsعملية titution غلة نظيفة، عينة استنساخه من LPR كافية ونقل هو المنحى في الطريق الصحيح. وLPR يمكن فحصها من قبل تجميد كسر المجهر الإلكتروني والتوجه تجربة ELISA إذا كانت الأجسام المضادة المتاحة. لا تستخدم سوى SSM مما يدل على المعلمات الأمثل لاحتضان العينة البروتين. حقن هذا البروتين هو خطوة حاسمة أخرى. صوتنة ضروري وينبغي تجنب فقاعات الهواء أثناء الحقن. بعد مرور فترة الحضانة عينة القياسات نفسها هي الحاسمة، لأن فقاعات الهواء سيزيل عينة بروتين كثف من رقاقة الاستشعار. لذلك دائما إزالة فقاعات الهواء بعد تغيير الحلول. ومع ذلك يمكن أن يحدث المتهدمة إشارة. لتصحيح ممكن المتهدمة إشارة، فإنه من الضروري لإنجاز الضوابط المتهدمة أثناء التجربة. 3. الأنظمة المتخصصة يمكن تعديل الإعداد SSM وفقا لتطبيقه. وعلاوة على ذلك رهنا مختلفة تماما الاجهزة درجة عالية من التخصص المتاحة،. هناك إمكانية لقياس إشارات البروتين في ظل ظروف غير متكافئة، على سبيل المثال في إطار التدرج درجة الحموضة. لإنشاء التراكيب العازلة غير المتكافئة داخل وخارج proteoliposomes حل ثالثا، الحل يستريح، لابد من عرضه وهذا يتطلب تكوين Exchange مزدوجة. هنا لا بد من وضع صمام ثلاثي إضافية التبديل بين حلول غير تفعيل ويستريح. لزيادة دقة الوقت للنظام وضعنا مسارا تدفق البديلة تفتقر إلى صمام محطة، ولكن باستخدام نوع مختلف من كفيت. هنا يقع على تقاطع تفعيل وحل غير تفعيل داخل كفيت، 3 ملم أمام SSM. هذا الإعداد هو مناسبة تماما لتحليل الحركية من عمليات النقل السريعة. ويمكن أن يتبين من ذلك أن القرار وقت منخفضة تصل إلى 2 ميللي ثانية هو ممكن. و التجاريةمع ully تتوفر النظم الآلية تهدف إلى إنتاجية أعلى بكثير لفحص المخدرات. وحدة منقولة بجمع الحلول ويحقن لهم على سطح جهاز الاستشعار في لوحات 96 بئر في شكل وحة microtiter القياسية.

نحن هنا لشرح نهج الكهربية جديدة تقوم على غشاء الصلبة المدعومة (SSM) لتوصيف البروتينات الغشاء كهربي. يتكون دعم قوي من طبقة رقيقة من الذهب على شريحة زجاجية، ورقاقة الاستشعار. يتم استخدام سطح ماء الذهب لربط مجموعة ثيول من كاشف alcanethiol. بعد ذلك، selfassembly من monolyer فسفاتيديل اكتمال تشكيل SSM. لقياس ردود فعل كهربي من بروتينات الغشاء، وكثف proteoliposomes أو شظايا الغشاء إلى SSM (الشكل 1). البروتين تحتوي على غشاء وSSM ثم تشكيل نظام غشاء جانب capacitively. ولذلك، إزفاء المسؤول في البروتين تحتوي على غشاء يمكن الكشف عنها بواسطة اقتران بالسعة عن طريق SSM. هذه الطريقة تعطي فقط تيارات عابرة. يمثل الحالي ذروة نشاط النقل ثابتة. الساعة تعتمد مكعب نقلrrents يمكن بناؤها بواسطة تحليل الدوائر. هي التي شنت على رقاقة الاستشعار في نظام كفيت (الشكل 2). كفيت لديها حجم كفيت اسطواني من 17 ميكرولتر (الحجم الصافي مع O-حلقة شنت). A دبوس الاتصال الربيع يخلق الاتصال إلى مكبر للصوت. هو مشدود موصل منفذ إلى الجزء العلوي من الجزء الرئيسي ويحمل الإلكترود المرجعي، سلك الفضة المكلورة. هي التي شنت كفيت في قفص فاراداي. توصيله إلى مسار السائل، والذي يستخدم للحث على نشاط النقل من البروتين غشاء ردا على تبادل حل سريع (الشكل 3). في حل واحد تبادل بروتوكول حلين، يطلب من واحد غير تفعيل وتنشيط حل واحد،. يتم التحكم في تدفق بواسطة الهواء المضغوط باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة صمام على الكمبيوتر أو التبديل دليل على واجهة مربع.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Waterbath Sonicator</td><td>Bandelin</td><td>RK 52 H</td><td></td></tr><tr><td>Tip Sonicator</td><td>Hielscher Ultrasonics GmbH</td><td>UP50H</td><td></td></tr><tr><td>2-way valve</td><td>NResearch, West Caldwell, USA</td><td>NR225T011</td><td></td></tr><tr><td>Terminal valve</td><td>NResearch, West Caldwell, USA</td><td>NR225T031</td><td></td></tr><tr><td>Manometer</td><td>Greisinger electronics</td><td>GDH 14 AN</td><td></td></tr><tr><td>Faraday cage</td><td>Max Planck Institute of Biophysics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuvette</td><td>Max Planck Institute of Biophysics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 ml solution containers</td><td>Kartell</td><td>1623</td><td></td></tr><tr><td>O-rings</td><td>Seal Science Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronix</td><td>TDS 1002</td><td></td></tr><tr><td>Reference electrode</td><td>Max Planck Institute of Biophysics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Function generator</td><td>Max Planck Institute of Biophysics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubings</td><td>SAINT-GOBAIN Performance Plastics</td><td>AAC00006</td><td></td></tr><tr><td>Sensor chip</td><td>Fraunhofer Institut f&amp;#252;r Schicht und Oberfl&amp;#228;chentechnik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Interface box</td><td>Max Planck Institute of Biophysics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Keithley</td><td>427</td><td></td></tr><tr><td>Manual cog</td><td>Vygon GmbH</td><td>876</td><td></td></tr><tr><td>USB analog-to-digital converter</td><td>National Instruments</td><td>6009</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Regeants&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>1,2&amp;#8209;Diphytanoyl-sn-glycero-3-Phosphatidylcholine</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850356</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide/Bis-acrylamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3574</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose </td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol </td><td>Sigma Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolut</td><td>VWR AnalaR NORMAPUR</td><td>603-002-00-5</td><td></td></tr><tr><td>Natural E. coli lipids polar extract</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>100600</td><td>for LacY reconstitution</td></tr><tr><td>n-Decane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D901</td><td></td></tr><tr><td>Octadecanethiol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O1858</td><td></td></tr><tr><td>Octadecylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74750</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Merck</td><td>1049360500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylenediamine</td><td>BIO RAD</td><td>1610801</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Lactose monohydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L8783</td><td></td></tr></tbody></table>

introduction to solid supported membrane based electrophysiology

وتستند هذه الطريقة الكهربية التي نعرضها على غشاء بدعم الصلبة (SSM) تتألف من طبقة octadecanethiol chemisorbed على الذهب المطلي رقاقة الاستشعار وأحادي الطبقة فسفاتيديل على القمة. هي التي شنت هذه الجمعية في نظام كفيت يحتوي على الإلكترود المرجعي، سلك الفضة المكلورة. بعد امتصاص شظايا غشاء أو proteoliposomes يحتوي على بروتين غشاء من الفائدة، يتم استخدام تبادل حل سريع للحث على نشاط النقل من البروتين الغشاء. في حل واحد تبادل بروتوكول حلين، وهناك حاجة واحدة غير تفعيل وتنشيط حل واحد،. يتم التحكم في تدفق بواسطة الهواء المضغوط ونظام صمام والأنابيب داخل قفص فاراداي. يتم الحصول على حركية ونشاط النقل كهربي عبر اقتران بالسعة بين SSM وproteoliposomes أو شظايا غشاء. الأسلوب، وبالتالي، ينتج transien فقطر التيارات. يمثل الحالي ذروة نشاط النقل ثابتة. التيارات الوقت نقل تعتمد يمكن بناؤها بواسطة تحليل الدوائر. يناسب هذا الأسلوب وخاصة بالنسبة للنقل بدائية النواة أو نقل حقيقية النواة من أغشية الخلايا، والتي لا يمكن التحقيق من قبل المشبك التصحيح أو أساليب المشبك الجهد.

حتى الآن، تم استخدام الكهربية المستندة إلى SSM لتوصيف أكثر من 20 الناقلون، معظمهم من أصول بدائية النواة، على سبيل المثال ميلب 3، NhaA 4 و 5 PutP (تلخيصها في 6). ولكن أيضا نقل حقيقية النواة من أغشية الخلايا، على سبيل المثال ClC7 7 وكذلك القنوات الأيونية، على سبيل المثال تم التحقيق مستقبلات أستيل النيكوتينيك 8. هنا نقدم كمثال على قياسات السكر / H + cotransporter لاسي من الإشريكية القولونية باستخدام proteoliposomes مع الجانب الأيمن لا يقل عن 85٪ من التوجه لاسي في LPR من 5 9، 10. ونحن نركز على الخطوات الرئيسية المؤدية إلى الحد الأدنى من نموذج الحركية من هذا البروتين النقل. 1. توصيف الكهربية من لاسي wildtype الخطوة الأولى هي توصيف العام للرد فعل كهربي عن طريق قياس قيم درجة الحموضة مختلفة ( <strong<html> &gt; الشكل 4)، وتركيزات الركيزة (الشكل 5) وركائز. للتحقق من صحة هذه التقنية، واستنسخت K M والقيم PK بالنظر في الأدب. اعتماد الرقم الهيدروجيني للاسي يظهر اثنين من ردود الفعل كهربي مختلفة. الزيادات الحالية إلى جانب capacitively بين درجة الحموضة ودرجة الحموضة 8.5 5، ولكن أيضا إلى تغيير شكله. تحت ظروف قلوية ويلاحظ نقل حالة مستقرة، في حين أن الرقم الهيدروجيني الحمضية القيم فقط يبقى رد فعل كهربي السريع. لتمييز الإشارات حالة مستقرة من ردود فعل كهربي سريع استخدمنا تحليل الدوائر لإعادة بناء التيارات نقل (الشكل 6). في درجة الحموضة 7 يصبح إشارة الطور ثنائي الطور. هذا يشير ايضا الى ان هناك نوعان من ردود الفعل كهربي مختلفة. يقدر من تهمة نقل (يتجزأ من الإشارات)، وردود الفعل لهما حوالي 6٪ و 94٪ من electrogenicity الإجمالية للدورة النقل. ove_step &quot;&gt; 2. التنازل عن ردود فعل كهربي لتعيين اثنين من ردود فعل كهربي إلى خطوات معينة في دورة رد فعل من لاسي، تم قياس متغير لاسي E325A (الشكل 7). هذا البديل لا يظهر الا تبادل اللاكتوز ولكن منقوصة لجميع وسائل النقل النشط، وذلك بسبب تثبيط إطلاق بروتون. إشارة من E325A اسي يمثل عابر سريع وثابت لجميع قيم الرقم الهيدروجيني قياس. الشكل والسعة للإشارة مشابه لإشارة من wildtype لاسي في ظل الظروف الحمضية. وبالإضافة إلى ذلك نلاحظ مرحلة سلبية صغيرة بعد انخفاض الذروة الحالية، والذي هو سمة لتيارات عابرة السريع في نظم قياس جانب capacitively. لأن اللاكتوز ملزمة والإفراج ليس كهربي، وسريع عابر يجب ربط مع الانتقال بتكوين جزئي كهربي بعد اللاكتوز ملزمة. ومن المعروف أن الخطوة الافراج بروتون هو معدل limitiنانوغرام للدوران لاسي في الانحدار وضع اللاكتوز تركيز النقل مدفوعة. في هذه الحالة نحن نتوقع زيادة في معدل النقل مع درجة الحموضة القلوية، لأنه يفضل إطلاق بروتون. هذا هو الحال بالنسبة لنقل حالة مستقرة ترتبط إشارة من wildtype المزركشة. وعلاوة على ذلك يمكن أن تظهر من قبل قياس درجة الحموضة التدرج الا ان درجة الحموضة الداخلية يؤثر على نقل حالة مستقرة من لاسي (غير منشورة). ولذلك يمكن تعيين رد فعل كهربي كبير إلى الخطوة الافراج البروتون. 3. قياسات لتحليل الحركية بعد التعرف على ردود فعل كهربي داخل وخارج أسعار النقل تم تحديد باستخدام الإعداد SSM مع قرار الأوان من حوالي 4.5 ميللي ثانية. هذا ممكن فقط في ظل ظروف، عندما يهيمن رد فعل واحد إشارة. في هذه الحالة يمكن أن تستمد الثوابت معدل من التيارات عابرة تحت النظر في القرار وقت من الإشارات باستخدام تكرارية المربعات الصغرى دي<html> خوارزمية الإلتواء (الشكل 8). الثوابت معدل العزم وكذلك الحد الأدنى من نموذج الحركية المقترح (الشكل 9) واستخدمت أخيرا لمحاكاة حركية نقل. منحنيات محاكاة إنتاج البيانات SSM وهو ما يثبت بالإضافة إلى ذلك النموذج الحركية. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig1.jpg" alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig1highres.jpg"/> الشكل 1. الامتزاز هندسة proteoliposomes على SSM. ويتكون SSM على رقاقة الاستشعار، والذهب منظم المغلفة شريحة زجاجية. لقياس ردود فعل كهربي من بروتينات الغشاء، وكثف proteoliposomes أو شظايا الغشاء إلى SSM. الأغشية اثنين من تشكيل نظام يقترن capacitively. هذا هو السبب في الكشف عن تيارات عابرة فقط. tp_upload/50230/50230fig2highres.jpg &quot;/&gt; الشكل 2. وSSM كفيت يحمل رقاقة الاستشعار والإلكترود المرجعي. محصورة رقاقة الاستشعار بين قاعدة كفيت ورئيس كفيت. يتم عزل القطب المرجع من مسار تدفق بواسطة مادة هلامية جسر الملح بولكرلميد. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig3.jpg" alt="الشكل (3)" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig3highres.jpg"/> الشكل (3). المسار السوائل والدائرة الكهربائية من إعداد SSM. في البروتوكول تبادل حل واحد ومطلوب واحد فقط غير المفعل (NA) وتفعيل واحد (A) حل. يتم التحكم في تدفق من قبل اثنين من الصمامات 2 في اتجاه (V1) وصمام محطة واحدة (V2). رموز تبديل صمام محطة بين الحلول غير تفعيل وتنشيط وتوجيه واحدة من الحلول لكفيت والحل الآخر إلى حاوية النفايات (W). يتم توصيل رقاقة الاستشعار (SSM) إلى مكبر للصوت (I / U)،<html> في حين يتم توصيل القطب المرجعي (أجكل) إلى وظيفة مولد (F) في الدائرة الكهربائية الخارجية. ويستخدم جهاز الكمبيوتر (PC) ومربع واجهة للتشغيل صمام والحصول على البيانات. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig4.jpg" alt="الشكل 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig4highres.jpg"/> الشكل 4. تيارات عابرة يقاس مع proteoliposomes لاسي من النوع البري بعد 100 ملي اللاكتوز يقفز تركيز على قيم درجة الحموضة مختلفة. الحل غير تفعيل الواردة الجلوكوز 100 ملم بينما يحتوي الحل تفعيل 100 ملي اللاكتوز. تم إعداد جميع الحلول في 100 ملي العازلة الفوسفات البوتاسيوم في درجة الحموضة المشار إليه مع 1 ملي DTT. للحصول على تفاصيل من شروط القياس في هذا والأرقام التالية يرجى الرجوع إلى 9 و 10. <html> ftp_upload/50230/50230fig5highres.jpg &quot;/&gt; الشكل 5. بلغ متوسط ​​التيارات الذروة تطبيع قياس مع proteoliposomes لاسي من النوع البري بعد يقفز تركيز اللاكتوز بتركيزات مختلفة وقيم درجة الحموضة. ويتم الحصول على القيم K M من نوبات القطعي. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig6.jpg" alt="الشكل (6)" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig6highres.jpg"/> الشكل (6). إعادة الإعمار من التيارات نقل. التيارات عابر (A) استخدامها لإعادة بناء التيارات نقل (B) تم قياس مع proteoliposomes لاسي من النوع البري بعد 100 ملي اللاكتوز يقفز تركيز في درجة الحموضة 8.5 (تتبع الأزرق) ودرجة الحموضة 5.2 (التتبع الحمراء). في الرقم الهيدروجيني لوحظ 8.5 دوران مستمر بينما عند pH 5.2 حدوث رد فعل كهربي سريع. ويلاحظ هذا بشكل واضح في التيار أعيد بناؤها (B). files/ftp_upload/50230/50230fig7.jpg &quot;بديل =&quot; الشكل 7 &quot;FO: محتوى العرض =&quot; 4IN &quot;FO: SRC =&quot; / files/ftp_upload/50230/50230fig7highres.jpg &quot;/&gt; الرقم 7. الحالية عابرة يقاس مع E325A proteoliposomes لاسي بعد ملي اللاكتوز الانتقال تركيز 100 في درجة الحموضة 5.2. هذا البديل لاسي هو تحول دون في خطوة الافراج بروتون من دورة النقل وبالتالي النقل التي تعاني من نقص. المكون السلبية الصغيرة احظ هو سمة للتيارات عابرة السريع في نظم قياس جانب capacitively ويسببه تصريف السعة غشاء بعد رد فعل كهربي سريع. يتم تحديد وقت لها π0 مستمرة من جانب السعة والمواصلة للنظام (الشكل 1). <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig8.jpg" alt="الرقم 8" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig8highres.jpg"/> الرقم 8. تيارات عابرة يقاس مع proteoliposomes لاسي من النوع البري بعد عملية الشراءويلاحظ R مختلفة يقفز تركيز اللاكتوز في درجة الحموضة 5.2. في ظل هذه الظروف لا نقل حالة مستقرة، ولكن انتقال متعلق بتكوين كهربي على اللاكتوز ملزمة. يظهر خط متقطع وظيفة النقل التي تمثل القرار وقت للنظام. وأقحم يظهر عزم وإيقاف ثوابت معدل من الملاحظ kobs ثابت معدل مع نوبة القطعي للبيانات. تم تحديد ثابت المعدل المرصود من التيارات عابرة مع تكرارية المربعات الصغرى deconvolution خوارزمية 10. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig9.jpg" alt="الرقم 9" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig9highres.jpg"/> الشكل 9. يمكن التعرف على نموذج الحركية للدورة رد فعل من لاسي. خطوتين كهربي وتتميز القياسات SSM. رد فعل كهربي بقوة يمثلون ~ 94٪ من إجمالي النزوح تهمة في رد فعللوحظ دورة إلا عند قيم الرقم الهيدروجيني محايدة والقاعدية. يمكن أن تسند إلى خطوة الإفراج البروتون (السهم الأزرق). ويلاحظ وجود خطوة كهربي ضعيف في درجة الحموضة الحمضية عندما يتم تحول دون دوران مستمر من النوع البري لاسي. نحن تعيين هذا رد فعل على عملية انتقال بتكوين جزئي كهربي على اللاكتوز ملزم، وهو ما يمثل 6٪ من إجمالي النزوح تهمة في دورة التفاعل.

Watch this Scientific Journal Video about Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology at JoVE.com

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

هنا نقدم طريقة الكهربية يعتمد على الأغشية الصلبة معتمدة مع التركيز على تطبيقاتها لتوصيف نقل غشاء كهربي.

مقدمة إلى صلب غشاء المعتمدة واستنادا الكهربية

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

introduction-to-solid-supported-membrane-based-electrophysiology

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

15.0K Views.  Max Planck Institute of Biophysics. هنا نقدم طريقة الكهربية يعتمد على الأغشية الصلبة معتمدة مع التركيز على تطبيقاتها لتوصيف نقل غشاء كهربي.

Video: Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

Applying Microfluidics to Electrophysiology

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the microfluidic brain slice device is discussed including how the device docks to standard perfusion chambers and the technique of passive pumping which is used to deliver boluses of neuromodulators to the brain slice.  By simplifying the device design, we are able to achieve a practical solution to the current unmet electrophysiology need of applying multiple neuromodulators across multiple regions of the brain slice.  This is achieved by substituting the standard coverglass substrate of the perfusion chamber with a thin microfluidic device bonded to the coverglass substrate.  This was then attached to the perfusion chamber and small holes connect the open-well of the perfusion chamber to the microfluidic channels buried within the microfluidic substrate.  These microfluidic channels are interfaced with ports drilled into the edge of the perfusion chamber to access and deliver stimulants.  This project represents how the field of microfluidics is transitioning away from proof-of concept device demonstrations and into practical solutions for unmet experimental and clinical needs.

تطبيق على microfluidics لالكهربية

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can be used for many different studies, such as the characterization of membrane-active peptides, the reconstitution of ion channels or investigations on how changes in lipid bilayer properties alter the function of bilayer-spanning channels.  Here, we show how to form a planar bilayer and how to isolate small patches from the bilayer, and in a second video  will also demonstrate a procedure for using gramicidin channels to determine changes in lipid bilayer elastic properties.   We also demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. Here, we demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

إعداد طبقات ثنائية الاصطناعي للتجارب الكهربية

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Measuring the Induced Membrane Voltage with Di-8-ANEPPS

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell membrane, resulting in a voltage across the membrane. This voltage, termed the induced membrane voltage (also induced transmembrane voltage, or induced transmembrane potential difference) and denoted by &Delta;&Phi;, exists only as long as the external field is present. If the resting voltage is present on the membrane, the induced voltage superimposes (adds) onto it. By using one of the potentiometric fluorescent dyes, such as di-8-ANEPPS, it is possible to observe the variations of &Delta;&Phi; on the cell membrane and to measure its value noninvasively. di-8-ANEPPS becomes strongly fluorescent when bound to the lipid bilayer of the cell membrane, with the change of the fluorescence intensity proportional to the change of &Delta;&Phi;. This video shows the protocol for measuring &Delta;&Phi; using di-8-ANEPPS and also demonstrates the influence of cell shape on the amplitude and spatial distribution of &Delta;&Phi;.

External electric field induces a voltage on the membrane of a cell, termed the induced membrane voltage (&Delta;&Phi;). By using the potentiometric dye di-8-ANEPPS, it is possible to measure the &Delta;&Phi; noninvasively. This video shows the protocol for measuring &Delta;&Phi; using di-8-ANEPPS.

قياس الفولتية المستحثة الأغشية مع ثنائي ANEPPS - 8

Placement of a cell into an external electric field causes a local charge redistribution inside and outside of the cell in the vicinity of the cell ...

Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where the stimulus applied depends in real-time on the response of the system. Recent applications range from the implementation of virtual reality systems for studying motor responses both in mice1 and in zebrafish2, to control of seizures following cortical stroke using optogenetics3. A key advantage of closed-loop techniques resides in the capability of probing higher dimensional properties that are not directly accessible or that depend on multiple variables, such as neuronal excitability4 and reliability, while at the same time maximizing the experimental throughput. In this contribution and in the context of cellular electrophysiology, we describe how to apply a variety of closed-loop protocols to the study of the response properties of pyramidal cortical neurons, recorded intracellularly with the patch clamp technique in acute brain slices from the somatosensory cortex of juvenile rats. As no commercially available or open source software provides all the features required for efficiently performing the experiments described here, a new software toolbox called LCG5 was developed, whose modular structure maximizes reuse of computer code and facilitates the implementation of novel experimental paradigms. Stimulation waveforms are specified using a compact meta-description and full experimental protocols are described in text-based configuration files. Additionally, LCG has a command-line interface that is suited for repetition of trials and automation of experimental protocols.

Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board.

في الوقت الحقيقي الكهربية: استخدام البروتوكولات ذات الحلقات المغلقة للتحقيق العصبية حيوية وما بعدها

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

Neuroscience

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت Heterologously في خلايا الثدييات

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Modeling Biological Membranes with Circuit Boards and Measuring Electrical Signals in Axons: Student Laboratory Exercises

This is a demonstration of how electrical models can be used to characterize biological membranes. This exercise also introduces biophysical terminology used in electrophysiology. The same equipment is used in the membrane model as on live preparations. Some properties of an isolated nerve cord are investigated: nerve action potentials, recruitment of neurons, and responsiveness of the nerve cord to environmental factors.

This is a demonstration of how biological membranes can be understood using electrical models. We also demonstrate procedures for recording action potentials from the ventral nerve cord of the crayfish for student orientated laboratories.

النمذجة الأغشية البيولوجية مع لوحات الدوائر الكهربائية وقياس الاشارات في محاور عصبية : تمارين مختبر طالبة

This is a demonstration of how electrical models can be used to characterize biological membranes. This exercise also introduces biophysical terminology ...

Murine Short Axis Ventricular Heart Slices for Electrophysiological Studies

Murine cardiomyocytes have been extensively used for in vitro studies of cardiac physiology and new therapeutic strategies. However, multicellular preparations of dissociated cardiomyocytes are not representative of the complex in vivo structure of cardiomyocytes, non-myocytes and extracellular matrix, which influences both mechanical and electrophysiological properties of the heart. Here we describe a technique to prepare viable ventricular slices of adult mouse hearts with a preserved in vivo like tissue structure, and demonstrate their suitability for electrophysiological recordings. After excision of the heart, ventricles are separated from the atria, perfused with Ca2+-free solution containing 2,3-butanedione monoxime and embedded in a 4% low-melt agarose block. The block is placed on a microtome with a vibrating blade, and tissue slices with a thickness of 150-400 &#181;m are prepared keeping the vibration frequency of the blade at 60-70 Hz and moving the blade forward as slowly as possible. Thickness of the slices depends on the further application. Slices are stored in ice cold Tyrode&#39;s solution with 0.9 mM Ca2+ and 2,3-butanedione monoxime (BDM) for 30 min. Afterwards, slices are transferred to 37 &#176;C DMEM for 30 min to wash out the BDM. Slices can be used for electrophysiological studies with sharp electrodes or micro electrode arrays, for force measurements to analyze contractile function or to investigate the interaction of transplanted stem cell-derived cardiomyocytes and host tissue. For sharp electrode recordings, a slice is placed into a 3 cm cell culture dish on the heating plate of an inverted microscope. The slice is stimulated with a unipolar electrode, and intracellular action potentials of cardiomyocytes within the slice are recorded with a sharp glass electrode.

Here, we describe the preparation of viable ventricular slices from adult mice and their use for sharp electrode action potential recordings. These multicellular preparations provide a preserved in vivo like tissue structure, which makes them a valuable model for electrophysiological and pharmacological studies in vitro.

الفئران قصيرة محور البطين شرائح القلب للدراسات الكهربية

Murine cardiomyocytes have been extensively used for in vitro studies of cardiac physiology and new therapeutic strategies. However, multicellular ...

Medicine

Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood flow triggers a signaling cascade resulting in vasodilation thereby alleviating mechanical stress on the vascular wall. The pattern of shear stress is also well known to be a critical factor in the development of atherosclerosis with laminar shear stress being atheroprotective and disturbed shear stress being pro-atherogenic. While we have a detailed understanding of the various intermediate cell signaling pathways, the receptors that first translate the mechanical stimulus into chemical mediators are not completely understood. Mechanosensitive ion channels are critical to the response to shear and regulate shear-induced cell signaling thereby controlling the production of vasoactive mediators. These channels are among the earliest activated signaling components to shear and have been linked to shear-induced vasodilation through promoting nitric oxide production (e.g., inwardly rectifying K+ [Kir] and transient receptor potential [TRP] channels) and endothelium hyperpolarizing factor (e.g., Kir and calcium-activated K+ [KCa] channels) and shear-induced vasoconstriction through an undetermined mechanism that involves piezo channels. Understanding the biophysical mechanism by which these channels are activated by shear forces (i.e., directly or through a primary mechano-receptor) could provide potential new targets to resolve the pathophysiology associated with endothelial dysfunction and atherogenesis. It is still a major challenge to record flow-induced activation of ion channels in real time using electrophysiology. The standard methods to expose cells to well-defined shear stress, such as the cone and plate rheometer and closed parallel plate flow chamber do not allow real time study of ion channel activation. The goal of this protocol is to describe a modified parallel plate flow chamber that allows real time electrophysiological recording of mechanosensitive ion channels under well-defined shear stress.

The goal of this protocol is to describe a modified parallel plate flow chamber for use in investigating real time activation of mechanosensitive ion channels by shear stress.

التسجيلات الكهرولوجية للتيارات الأيونية أحادية الخلية تحت ضغط القص المحدد جيداً

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood ...

Immunology and Infection

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions under various membrane lipid compositions. Among them, the droplet interface bilayer has gained popularity; however, the large membrane size hinders the recording of low electrical background noise. We have established a contact bubble bilayer (CBB) method that combines the benefits of planar lipid bilayer and patch-clamp methods, such as the ability to vary the lipid composition and to manipulate the bilayer mechanics, respectively. Using the setup for conventional patch-clamp experiments, CBB-based experiments can be readily performed. In brief, an electrolyte solution in a glass pipette is blown into an organic solvent phase (hexadecane), and the pipette pressure is maintained to obtain a stable bubble size. The bubble is spontaneously lined with a lipid monolayer (pure lipids or mixed lipids), which is provided from liposomes in the bubbles. Next, the two monolayer-lined bubbles (~50 &#181;m in diameter) at the tip of the glass pipettes are docked for bilayer formation. Introduction of channel-reconstituted liposomes into the bubble leads to the incorporation of channels in the bilayer, allowing for single-channel current recording with a signal-to-noise ratio comparable to that of patch-clamp recordings. CBBs with an asymmetric lipid composition are readily formed. The CBB is renewed repeatedly by blowing out the previous bubbles and forming new ones. Various chemical and physical perturbations (e.g., membrane perfusion and bilayer tension) can be imposed on the CBBs. Herein, we present the basic procedure for CBB formation.

Here, we present a protocol for the formation of lipid bilayers using a contact bubble bilayer method. A water bubble is blown into an organic solvent, whereby a monolayer is formed at the water-oil interface. Two pipettes are manipulated to dock the bubbles to form a bilayer.

دهن بلير التجارب مع بليرس فقاعة الاتصال للتصحيح--كلامبيرس

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...

Patch Clamp Electrophysiology

Neuron cell membranes are populated with ion channels that control the movement of charge into and out of the cell, thereby regulating neuron firing. One extremely useful technique for investigating the biophysical properties of these channels is called patch clamp recording. In this method, neuroscientists place a polished glass micropipette against a cell and apply suction to form a high resistance seal. This process isolates a small &#8220;patch&#8221; of membrane that contains one or more ion channels. Using an electrode within the micropipette, researchers can &#8220;clamp&#8221; or control the electrical properties of the membrane, which is important for analysis of channel activity. The electrode also allows for changes in the voltage across the membrane, or the flow of ions through the membrane, to be recorded. This video begins with an overview of the principles behind patch clamp electrophysiology, an introduction to the necessary equipment, and descriptions of the various patch configurations, including whole cell, cell-attached, perforated, inside-out, and outside-out patches. Next, the key steps of a typical whole-cell patch clamp experiment are outlined, in which a current-voltage (IV) curve is generated. Finally, applications of patch clamp recording are provided to demonstrate how the biophysical properties of ion channels, cell excitability, and neuroactive compounds are evaluated in neurophysiology labs today.

Patch Clamp Electrophysiology: Principle &amp; Applications

Neuron cell membranes are populated with ion channels that control the movement of charge into and out of the cell, thereby regulating neuron firing. One ...