MKK Birleşik Krallık&#39;ın Mühendislik ve kişisel Bursu için Fiziksel Bilimler Araştırma Konseyi (EPSRC) Yaşam Bilimleri Arayüz programı sayesinde. Ayrıca Birleşik Krallık&#39;ın Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC) tarafından finansman kabul etmek istiyorum.

Flim numune hazırlama için protokoller konfokal veya geniş alan şiddeti tabanlı floresan mikroskobu için farklılık yok. Veri toplama yani ham verilerden floresans yaşam ayıklanması, veri analizi ana görevi takip eder. Bir kere bu elde edilmiştir, veri yorumlama hipotez doğrulamak veya çürütmek için yardımcı olur. 1. Moleküler rotorlar ile boyanarak hücre <ol><li> In boya yaklaşık 1 mg / ml eriterek bir stok çözelti (10 ml) hazırlamak uygun bir çözücü (BODIPY-C 12 örneğin metanol) 6,7 doğru denge ve bir pipet kullanılarak. </li><li> Lekeli olmak hücreleri (bizim durumumuzda bir model kanser hücre dizisi, HeLa) ~% 80 konfluent kadar% 5 CO 2 atmosferinde 37 ° C&#39;de küvözde, mikroskopi için coverslide alt bir multiwell plaka üzerinde yetiştirilen . </li><li> 10 Ekle - stok solüsyonu 20 ul çok wel büyüyen canlı hücreler içinOpti-MEM ortamı (GIBCO) başına de bir 6-kuyucuklu plak için 4 ml l plakası (SmartSlide 50 mikro-inkübasyon sistemi, Wafergen). Bu iyi bir mikro-molar boya konsantrasyonu verir. </li><li> Boyanması için 10-45 dakika için% 5 CO2 atmosfer ile 37 ° C &#39;de bir inkübatör için çok kuyucuklu plak döner. </li><li> Inkübatör gelen multiwell plaka çıkarın ve fazla boya kaldırmak için 4 ml optik olarak berrak hücreli kültür ortamı (örneğin Opti-MEM) ile hücreleri 3-4 kez yıkayın. </li><li> Mikroskop sahneye multiwell plaka aktarın ve gerektiği gibi görüntüleme için hazırlık, bir sıcaklık kontrolörü /% 5 CO 2 gaz girişine bağlayın. </li></ol> 2. Hücrelerdeki floresan moleküler rotorların flim <ol><li> Mikroskop sahnede örnek yerleştirin ve bir iletim ve floresan hücrelerini tanımlamak için floresan görüntü elde. Kurulum deneysel bir şematik diyagramıdır Şek. 1.Verify olduğu yerlerde Expe gelen floresans kaynaklanmaktadırcted (örneğin, hücre zarı, sitoplazma). Bir floresan emisyon spektrumunu elde edilir, bu durumda, molekül rotor tayfı beklenen boya veya proteinin bir olduğunu doğrulamak. Bir negatif kontrol olarak, resim, bir non-boyanmış ve bu örnek floresan olmadığını kontrol. Bu adım flim için özel olarak gerekli olmamasına rağmen, genel olarak iyi uygulama ve örnek Sence ne olduğunu doğrulamak için yardımcı olur. </li><li> Flim moduna geç - Bu kolayca flüoresan tespiti ışın yolu (Leica TCS SP2 devralma kontrolü yazılımı &quot;ışın yolu ayarı&quot; panelinde &quot;dedektör&quot; düğmesi) bir ayna hareket gerçekleştirilir. Dedektör ulaşan herhangi bir heyecan ışığı bloke etmek için uygun floresans emisyon filtresi floresan algılama beampath olmalıdır. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig1.jpg" /> Şekil 1. Ac kullanarak time-domain flim için deneysel düzenlemeonfocal lazer tarama mikroskobu. <ol start="3"><li> Örnek Tarama ve dedektör sayısı oranı (Becker &amp; Hickl SPC 830 kurulunun satın kontrol yazılımı CFD etiketli siyah bar) artık lazer tekrarlama oranı yaklaşık% 1 (daha olduğunu, Flim satın kontrol bilgisayarı kontrol yeşil çubuk) SYNC kazanım kontrol yazılımı etiketli. Eğer öyleyse, kazık kadar çarpık floresans bozunum eğrileri toplama önlemek için, lazer ışını yolu bir nötral yoğunluk filtresi koyarak örneğin lazer uyarılma yoğunluğu azaltın. </li><li> , Tipik olarak 3-5 dakika süreyle, bir flim görüntü elde tarama durdurmak ve ham veri (3D veri mekansal koordinatları x ve y oluşan &quot;küp&quot;, ve zamandan tasarruf). </li><li> Örneğin TRI-2 14 veya ticari yazılım, floresan görüntüyü göstermek için floresans bozunum analiz yazılımı paketi ham veri, açın. Bu basitçe entegre floresans çürümesi, her, floresans bozunum eğrisi altında kalan alan yanipiksel. </li><li> Üzerine imleci yerleştirerek tipik bir piksel seçin ve o piksel içinde floresans bozunum inceleyin. Pik sayısı 100&#39;ün altında ise, piksel mekansal binning kullanın. Bitişik piksel (örn. 3x3 veya 5x5) ile sayımları, bir yüksek tepe sayısı da elde edilir, böylece, merkezi bir piksel içine eklenir. Bu, bir sonraki aşama için daha yüksek bir istatistiksel doğruluk sağlar. Alternatif olarak, ölçme uzun edinimi süresi (5. adım) için tekrar edilebilir. 30-50dakika için, yaklaşık 10 kat daha yüksek pik sayımı (ve toplam sayıları) elde edilir, ama bu çok uzun far, çünkü örnek hareketi nedeniyle eserler, mikroskop sürüklenme, fototoksisite ve tanıtma tehlikesi çoğu biyolojik örnekler için bir kazanım zamanı olarak photobleaching. </li><li> Küresel bir piksel eşik değerini (piksel çürüme takıldığı üstte) seçin ve görüntüyü tek bir üstel bozulma uygun geçerlidir. Sonuç sonra kodlanmıştır eşiğinin üzerinde her piksel için bir floresan ömrü verirrenk. Her piksel oturması sonucu ile renklendirilir ve bir flim haritası elde edilir. Çeşitli piksel için azaltılmış ki-kare değerleri kontrol edin - 1 civarında (ve yukarı 1.3) iyi bir uyum gösterir. Rastgele sıfır etrafında dağıtılması gerekmektedir gelen artıklar, inceleyin. </li><li> Floresans ömrü histogram belli floresans ömürleri floresans ömrü kendisini karşı ortaya ne sıklıkta araziler. Floresans ömrü dağıtım renk aralığına uyan renk yelpazesi gibi ayarlayın. </li><li> Bir monoexponential uyum yaklaşık 1 bir ki-kare değeri (ve yukarı 1.3) vermezse, ve sıfırdan artıklar sistematik bir sapma olursa, daha gelişmiş bir modeli gereklidir. Örneğin, sonda uygun biri ile de boya miktarı göreceli bir göstergesidir ön-üstel faktörleri veya genlikleri verecektir inç olabilecek iki farklı ortamlar için hesaba, floresans bozunumları bir çift üstel modeli uydurma deneyin çevreMent veya diğer. Alternatif olarak, bir gerilmiş üstel fonksiyonu floresans yaşamların bir dağıtım hesabını vermek uygun olabilir. </li><li> Her bir piksel için floresans ömürleri, pre-üstel faktörleri ve ömrü oranı ve pre-üstel faktörü oranı sonuçları daha sonra renkli kodlanabilir. Her bir piksel ile bir değere göre renkli, ve floresans ömürleri, pre-üstel faktörleri ve bunların oranları nedeniyle kontrast elde edilir. Iyi bir uyum gösterir yaklaşık 1 (en fazla 1.3) - Yine, azaltılmış ki-kare değerleri (renkli kodlanmış ve görüntü haline edilebilir) kontrol edin. Rastgele sıfır etrafında dağıtılması gerekmektedir artıklar, inceleyin. </li><li> Floresans ömrü histogramlar ortalama floresans ömrü değerlerin kolay görselleştirme ve floresans ömrü dağıtımı için tüm görüntüleri eşlik etmelidir. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar Floresans bozunumu için ölçülenMetanol / gliserol karışımlarında viskozite arttırıcı olarak floresan moleküler rotor Şekil &#39;de gösterilmiştir. 2. Floresans bozunur monoexponential, ve floresans ömrü viskozitesi bir fonksiyonu olarak belirgin bir şekilde değişir. Bu metanol içinde yaklaşık 300 ps (viskozite 0.6 cP) den% 95 gliserol (viskozite 950 cP) 3.4 ns artırır. <img alt="Şekil 2." src="/files/ftp_upload/2925/2925fig2.jpg" /> BODIPY-C için Şekil 2. Floresans çürümesi profilleri değişen viskozite metanol / gliserol karışımları 12. 6 Floresans ömür boyu logaritmik kalibrasyon arsa τ karşı floresan moleküler rotor için viskozitesi η Şek. 3. Förster Hoffman denklemi 9 talep olarak düz bir çizgi <img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq1.jpg" alt="Denklem 1" /> k 0 radiativ olduğue sabit bir oranda ve z, x 0 &lt;x &lt;1 ile, sabittir. Iki verimleri hem Serinin <img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq2.jpg" alt="Denklem 2" /> x yerde doğrunun degrade olduğunu. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/2925/2925fig3.jpg" /> Şekil 3. Förster-Hoffmann denklemine uygun BODIPY-C 12 verim düz bir hat için günlük floresans ömrü vs günlük viskoziteli bir arsa. 6 Floresan moleküler rotor ile yaşayan hücrelerin inkübasyonu takiben bir punktat boya dağıtım floresans görüntüleri görülmektedir. Bir meso-sübstitüe BODIPY boya ile inkübe HeLa hücrelerinin Flim görüntü şekil gösterilmektedir. 4. Görüntünün her piksel floresans çürükleri yeterli tek bir üstel bozulma modeli kullanılarak monte edilebilir. Şekil 4. (A) floresans yoğunluğunu ve BODIPY-C 12 ile boyanmış HeLa hücreleri (b) flim görüntüler. Parlak, noktasal bölgelerde diğer bölgelere göre daha kısa bir ömür boyu sergiler. Bu, daha kısa liftime Förster-Hoffmann denkleme göre, punktumlarda daha düşük bir viskoziteye, muhtemelen lipid damlacıkları karşılık gelir. Her bir piksel ile ekstre ömürleri çizdirme ederek, Şek tüm görüntünün bir floresans ömrü çubuk elde edilir. 5. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/2925/2925fig5.jpg" /> Şekil 5. Meso-sübstitüe BODIPY moleküler rotorlar ile boyanmış HeLa hücrelerinin flim görüntüleri floresans yaşamların Histogramlar.

<ol>
	<li>Luby-Phelps, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoarchitecture+and+physical+properties+of+cytoplasm:+Volume,+viscosity.+diffusion,+intracellular+surface+area.">Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: Volume, viscosity. diffusion, intracellular surface area.</a> International Review of Cytology - a Survey of Cell Biology. , 192-1189 (2000).</li><li>Stutts, M. J., Canessa, C. M., Olsen, J. C., Hamrick, M., Cohn, J. A., Rossier, B. C., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+as+a+CAMP-dependent+regulator+of+sodium+channels.">CFTR as a CAMP-dependent regulator of sodium channels.</a> Science. 269, 847-850 (1995).</li><li>Dondorp, A. M., Angus, B. J., Hardeman, M. R., Chotivanich, K. T., Silamut, K., Ruangveerayuth, R., Kager, P. A., White, N. J., Vreeken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+reduced+red+blood+cell+deformability+in+severe+falciparum+malaria.">Prognostic significance of reduced red blood cell deformability in severe falciparum malaria.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 507-511 (1997).</li><li>Haidekker, M. A., Nipper, M., Mustafic, A., Lichlyter, D., Dakanali, M., Theodorakis, E. A., Demchenko, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advanced Fluorescence Reporters in Chemistry and Biology I. Fundamentals and Molecular Design. 8, 267-308 (2010).</li><li>Haidekker, M. A., Theodorakis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment-sensitive+behavior+of+fluorescent+molecular+rotors.">Environment-sensitive behavior of fluorescent molecular rotors.</a> J. Biol. Eng. 4, (2010).</li><li>Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Levitt, J. A., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Rotor+Measures+Viscosity+of+Live+Cells+via+Fluorescence+Lifetime+Imaging.">Molecular Rotor Measures Viscosity of Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 6672-6673 (2008).</li><li>Levitt, J. A., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Chung, P. H., Suhling, K., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-Bound+Molecular+Rotors+Measure+Viscosity+in+Live+Cells+via+Fluorescence+Lifetime+Imaging.">Membrane-Bound Molecular Rotors Measure Viscosity in Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Journal of Physical Chemistry C. 113, 11634-11642 (2009).</li><li>Hungerford, G., Allison, A., McLoskey, D., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Sol-to-Gel+Transitions+via+Fluorescence+Lifetime+Determination+Using+Viscosity+Sensitive+Fluorescent+Probes.">Monitoring Sol-to-Gel Transitions via Fluorescence Lifetime Determination Using Viscosity Sensitive Fluorescent Probes.</a> J. Phys. Chem. B. 113, 12067-12074 (2009).</li><li>Förster, T., Hoffmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Viskosit&#228;tsabh&#228;ngigkeit+der+Fluoreszenzquantenausbeuten+einiger+Farbstoffsysteme.">Die Viskosit&#228;tsabh&#228;ngigkeit der Fluoreszenzquantenausbeuten einiger Farbstoffsysteme.</a> Zeitschrift f&#252;r Physikalische Chemie Neue Folge. 75, 63-76 (1971).</li><li>vandeVen, M., Ameloot, M., Valeur, B., Boens, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pitfalls+and+Their+Remedies+in+Time-Resolved+Fluorescence+Spectroscopy+and+Microscopy.">Pitfalls and Their Remedies in Time-Resolved Fluorescence Spectroscopy and Microscopy.</a> J. Fluores. 15, 377-413 (2005).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Techniques. , (2005).</li><li>O'Connor, D. V., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Time-correlated single-photon counting. , (1984).</li><li>Suhling, K., French, P. M. W., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+fluorescence+microscopy.">Time-resolved fluorescence microscopy.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 4, 13-22 (2005).</li><li>Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J., Carlin, L. M., Keppler, M. D., Ng, T. C., Vojnovic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+time-domain+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+practical+application+to+protein-protein+interactions+using+global+analysis.">Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis.</a> Journal of the Royal Society - Interface. 6, S93-S105 (2009).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Flim yoğunluğu tabanlı floresan görüntüleme üzerinden bazı önemli avantajlar sunuyor. Bu fluorofor konsantrasyon etkileri onları ayırabilirsiniz, çünkü floresan görüntüleme ile gözlemlemek zor veya imkansızdır fotofiziksel olayları rapor edebilirsiniz. Bu görüntüleme flüoresan moleküler rotorlar tarafından intraselüler viskozitesi haritalanması için özellikle yararlıdır. Şek floresans boyunca kolaylıkla, bir kalibrasyon grafiği kullanılarak bir viskoziteye dönüştürülebilir. 3, floresan moleküler rotorların konsantrasyonu bağımsızdır. Flim verileri yorumlamayı güçleştirebilir eserler olabilir. 10 Enstrümantal eserler floresans çürüme başlangıcı üstüne bir zirve olarak görünecek ve kısa bir yıkım zamanı ile karışabilir saçılan ışık, ya sonra küçük bir tepe vardır IRF hangi mikroskop içindeki yansımaları neden olabilir. Bu dağınık ışık eserler gibi tespit edilebilironlar spektral ayrımcılık ile ayırt edilebilir çünkü - onlar heyecan verici ışık ile aynı dalga boyunda her zaman vardır. Hava, ışık 1 nanosaniye 30 cm seyahat eden Hatırlama yansımaları kökeni kesin olarak belirlemek için yardımcı olur. Filtre veya cam floresan de özellikle düşük örnek floresans at, bir dışlayıcı neden olabilir, ancak bu kolay örnek olmadan bir ölçü alınarak tespit edilebilir: Bir çürüme, bu koşullar altında elde edilir, eğer araç nedeniyle ve hiçbir ilgisi yoktur Örnek ile! Diğer taraftan, örnek otofloresans da floresan çürümesine neden olabileceğini unutmayın. Zaman ilişkili tek foton sayımında (TCSPC), süre-genlik çevirici (TAC) Lineer olmayan yoksul nöbete neden olabilir, ancak uyarma engelleme ve örnek üzerine iletilen ışık kaynağından örneğin ortam ışığı, parlayan tarafından tespit edilebilir ve zamanlaması ölçülmesi. Sabit bir arka olmalıdırgörüntünün her pikseline elde edilen. Sabit bir arka plan sapmalar meydana Bölgeler, iyi bir uyum verim asla ve TCSPC kartı parametrelerini ayarlayarak önlenememesi durumunda ölçüm için kaçınılmalıdır. TCSPC biri rezil artifact çok yüksek bir foton yakalama oranı neden olan kazık-up fotondur. 11,12 Bu elektronik zamanlama meşgul olduğu için herhangi bir sonraki fotonlar yok sayarak ve ilk foton işleme, zamanlanmış olan sadece ilk foton yol açar. Floresans ömrü bir kısalma, ve bunu önlemek için en iyi yolu, Pile-up uçları lazer tekrarlama oranı yaklaşık% 1&#39;ini de foton sayısı oranı tutmaktır. Görünüm Uygulamaya bağlı olarak, var flim çeşitli uygulamaları vardır ve her biri kendi avantajları ve dezavantajları vardır. 13 ideal bir floresan mikroskop sahip olacağı tüm boyutlu floresans emissiotek foton hassasiyet, maksimum uzamsal çözünürlük ve minimum alma süresi ile tek bir ölçüm yoğunluğu, konum, kullanım ömrü, dalga boyu ve polarizasyon, n kontur. Orada özellikleri bu eşsiz kombinasyonu ile hiçbir teknoloji şu anda, ve bir inşa etmek enstrümantasyon geliştiriciler için bir sorun olmaya devam etmektedir. Hücre biyolojisinde önemli sorunlara yeni fiziksel tekniklerin uygulanması çoğu zaman beklenmeyen buluşları yolu olduğunu ve hücre biyolojisi için floresans görüntüleme doyurarak yetenekleri yakın olan önce gitmek için uzun bir yol var. Aslında, böyle ömür boyu, spektrum ve polarizasyon gibi yüksek uzaysal çözünürlükte 3D daha hızlı görüntüleme gibi görüntüleme floresan parametrelerini, hücre biyolojisinde yeni yönlerini açığa kesindir.

Floresan moleküler rotorlar ile Örnek Donanım: Ters Leica TCS SP2 konfokal tarama mikroskobu Tutarlı Mira 900 Ti: Bir Verdi V6 pompa lazer veya Hamamatsu PLP-10 470 pikosaniye pulsed diode lazer uyarma kaynağı ile Sapphire femtosecond laser Becker &amp; Hickl SPC 3GHz 830 pansiyon, Pentium IV, Windows XP ile 1GB RAM bilgisayar soğutmalı Becker &amp; Hickl PMC100-01 dedektör kafası Hamamatsu H5773P-01 mikroskop nin X1 noktası üzerine monte photomultipliers, ya da hibrid dedektörler dayalı DCC 100 dedektör kontrol modülü Yazılım: TRI-2 14 veya Becker &amp; Hickl tarafından SPCImage 2.8

fluorescence lifetime imaging of molecular rotors in living cells

Difüzyon genellikle kimyasal tepkimeler veya biyolojik proseslerle önemli bir oran-belirleyen bir adım ve intraselüler olaylar, geniş bir aralıktaki bir rol oynar. Viskozite moleküllerin ve proteinlerin difüzyon etkileyen temel parametrelerden biridir, ve viskozite değişiklikleri hücresel düzeyde hastalık ve arıza bağlantılı olmuştur. 1-3 toplu viskozitesini ölçmek için yöntemler de geliştirilmiş olmakla birlikte, görüntüleme microviscosity bir sorun olmaya devam . Son zamanlarda elde etmek zor oldu kadar bu tek hücre gibi mikroskobik nesnelerin Viskozite haritalar, var. Diğer optik teknikler benzer, bu tahribatsız, minimal invaziv ve canlı hücrelere ve dokulara uygulanabilir, çünkü floresans teknikleri ile Haritalama viskozite avantajlıdır. Floresan moleküler rotorlar floresans süreleri ve bunların mikroçevresinin viskozitesi bir fonksiyonu vardır kuantum verimleri sergilerler. 4,5 Moleküliçi büküm veyaDönme uyarılmış duruma geri asıl durumuna olmayan radyatif sönümü yol açar. Bir viskoz ortam bu ışıksız çürümesine yol erişimi kısıtlayarak, bu rotasyon veya büküm yavaşlatır. Bu floresans kuantum verimi ve floresans ömrü bir artışa yol açar. Floresan moleküler rotor olarak hareket değiştirilmiş hidrofobik BODIPY boyaların Flüoresans Ömrü Görüntüleme (flim) bu prob floresans yaşam ortamlarının microviscosity bir fonksiyonu olduğunu gösteriyor. 6-8 çözücü viskozitesi verimi karşı floresans ömrü bir logaritmik grafikte Förster Hoffman denklemi itaat düz bir çizgi. 9 Bu komplo da viskozite içine floresans ömrü dönüştürmek için bir kalibrasyon grafiği olarak hizmet vermektedir. Modifiye BODIPY floresan moleküler rotor ile yaşayan hücrelerin inkübasyonu takiben, noktasal boya dağıtım floresans görüntüleri görülmektedir. Th elde viskozite değericanlı hücrelerde e punktumlarda yaklaşık 100 kez su daha yüksek olduğu ve hücresel sitoplazmaya taşır. 6,7 Zaman bağımlı floresans anizotropi ölçümler bu büyük microviscosity değerleri ile uyum içinde dönme korelasyon kat verim. Floresans ömrü eşleyerek floresans yoğunluğunu bağımsızdır ve böylece prob konsantrasyonu ve viskozite etkileri ayırma sağlar. Özet olarak, floresan moleküler rotorların flim dayalı hücrelerinde microviscosity eşlemek için pratik ve çok yönlü bir yaklaşım geliştirdik.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells at JoVE.com

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Flüoresans Ömrü Görüntüleme (flim) görüntü ortamı ve spesifik proteinlerin ve canlı hücreler boyaların etkileşimi önemli bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. Floresan moleküler rotor flim canlı hücreler viskozitenin haritalama sağlar.

Yaşayan Hücreler Moleküler Rotorlar arasında Flüoresans Ömrü Görüntüleme

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

fluorescence-lifetime-imaging-of-molecular-rotors-in-living-cells

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

24.9K Görüntüleme.  King's College London. Flüoresans Ömrü Görüntüleme (flim) görüntü ortamı ve spesifik proteinlerin ve canlı hücreler boyaların etkileşimi önemli bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. Floresan moleküler rotor flim canlı hücreler viskozitenin haritalama sağlar.

Video: Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Biyomühendislik

Probing Metabolism and Viscosity of Cancer Cells using Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Viscosity is an important physical property of a biological membrane, as it is one of the key parameters for the regulation of morphological and physiological state of living cells. Plasma membranes of tumor cells are known to have significant alterations in their composition, structure, and functional characteristics. Along with dysregulated metabolism of glucose and lipids, these specific membrane properties help tumor cells to adapt to the hostile microenvironment and develop resistance to drug therapies. Here, we demonstrate the use of fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) to sequentially image cellular metabolism and plasma membrane viscosity in live cancer cell culture. Metabolic assessments are performed by detecting fluorescence of endogenous metabolic cofactors, such as reduced nicotinamide adenine dinucleotide NAD(P)H and oxidized flavins. Viscosity is measured using a fluorescent molecular rotor, a synthetic viscosity-sensitive dye, with a strong fluorescence lifetime dependence on the viscosity of the immediate environment. In combination, these techniques enable us to better understand the links between membrane state and metabolic profile of cancer cells and to visualize the changes induced by chemotherapy.

<meta charset="utf8"></head><body>Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu Kullanarak Kanser Hücrelerinin Metabolizmasını ve Viskozitesini İnceleme

Here, we demonstrate the use of fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) to sequentially image cellular metabolism and plasma membrane viscosity in live cancer cell culture. Metabolic assessments are performed by detecting endogenous fluorescence. Viscosity is measured using a fluorescent molecular rotor.

Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu Kullanarak Kanser Hücrelerinin Metabolizmasını ve Viskozitesini İnceleme

Viscosity is an important physical property of a biological membrane, as it is one of the key parameters for the regulation of morphological and ...

Kanser Araştırmaları

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopy has a high signal-to-background ratio, but it suffers from photobleaching and photodamage of the fluorescent proteins. Label-free techniques such as interference reflection microscopy (IRM) and interferometric scattering microscopy (iSCAT) circumvent the problem of photobleaching but cannot readily visualize single molecules. This paper presents a protocol for combining IRM with a commercial TIRF microscope for the simultaneous imaging of microtubule-associated proteins (MAPs) and dynamic microtubules in vitro. This protocol allows for high-speed observation of MAPs interacting with dynamic microtubules. This improves on existing two-color TIRF setups by eliminating both the need for microtubule labeling and the need for several additional optical components, such as a second excitation laser. Both channels are imaged on the same camera chip to avoid image registration and frame synchronization problems. This setup is demonstrated by visualizing single kinesin molecules walking on dynamic microtubules.

We present a protocol for implementing interference-reflection microscopy and total-internal-reflection-fluorescence microscopy for the simultaneous imaging of dynamic microtubules and fluorescently labeled microtubule-associated proteins.

Dinamik Mikrotübülleri ve İlişkili Proteinleri Görüntülemek için Eşzamanlı Girişim Yansıması ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Biyokimya

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

Hücre içi SNARE mikroskobu Imaging Floresans ömür tarafından kaçakçılığı görüntülenmesi

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism

Cellular metabolism is the process by which cells generate energy, and many diseases, including cancer, are characterized by abnormal metabolism. Reduced nicotinamide adenine (phosphate) dinucleotide (NAD(P)H) and oxidized flavin adenine dinucleotide (FAD) are coenzymes of metabolic reactions. NAD(P)H and FAD exhibit autofluorescence and can be spectrally isolated by excitation and emission wavelengths. Both coenzymes, NAD(P)H and FAD, can exist in either a free or protein-bound configuration, each of which has a distinct fluorescence lifetime-the time for which the fluorophore remains in the excited state. Fluorescence lifetime imaging (FLIM) allows quantification of the fluorescence intensity and lifetimes of NAD(P)H and FAD for label-free analysis of cellular metabolism. Fluorescence intensity and lifetime microscopes can be optimized for imaging NAD(P)H and FAD by selecting the appropriate excitation and emission wavelengths. Metabolic perturbations by cyanide verify autofluorescence imaging protocols to detect metabolic changes within cells. This article will demonstrate the technique of autofluorescence imaging of NAD(P)H and FAD for measuring cellular metabolism.

This protocol describes fluorescence imaging and analysis of the endogenous metabolic coenzymes, reduced nicotinamide adenine (phosphate) dinucleotide (NAD(P)H), and oxidized flavin adenine dinucleotide (FAD). Autofluorescence imaging of NAD(P)H and FAD provides a label-free, nondestructive method to assess cellular metabolism.

Hücresel Metabolizmayı Değerlendirmek için Otofloresan Görüntüleme

Cellular metabolism is the process by which cells generate energy, and many diseases, including cancer, are characterized by abnormal metabolism. Reduced ...

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. Despite their importance, technologies for tracking neuromodulatory events with cellular resolution are just beginning to emerge. Neuromodulators, such as dopamine, norepinephrine, acetylcholine, and serotonin, trigger intracellular signaling events via their respective G protein-coupled receptors to modulate neuronal excitability, synaptic communications, and other neuronal functions, thereby regulating information processing in the neuronal network. The above mentioned neuromodulators converge onto the cAMP/protein kinase A (PKA) pathway. Therefore, in vivo PKA imaging with single-cell resolution was developed as a readout for neuromodulatory events in a manner analogous to calcium imaging for neuronal electrical activities. Herein, a method is presented to visualize PKA activity at the level of individual neurons in the cortex of head-fixed behaving mice. To do so, an improved A-kinase activity reporter (AKAR), called tAKAR&#945;, is used, which is based on F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). This genetically-encoded PKA sensor is introduced into the motor cortex via in utero electroporation (IUE) of DNA plasmids, or stereotaxic injection of adeno-associated virus (AAV). FRET changes are imaged using two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (2pFLIM), which offers advantages over ratiometric FRET measurements for quantifying FRET signal in light-scattering brain tissue. To study PKA activities during enforced locomotion, tAKAR&#945; is imaged through a chronic cranial window above the cortex of awake, head-fixed mice, which run or rest on a speed-controlled motorized treadmill. This imaging approach will be applicable to many other brain regions to study corresponding behavior-induced PKA activities and to other FLIM-based sensors for in vivo imaging.

A procedure is presented to visualize protein kinase A activities in head-fixed, behaving mice. An improved A-kinase activity reporter, tAKAR&#945;, is expressed in cortical neurons and made accessible for imaging through a cranial window. Two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy is used to visualize PKA activities in vivo during enforced locomotion.

In vivo Iki foton floresans ömür boyu görüntüleme mikroskobu kullanarak kafa-sabit davranan fareler Içinde bir aktivite, protein kinaz görselleştirme

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...

Nörobilim

FLIM Tabanlı Metabolik ve Hipoksi Analizi için Çok Hücreli Spheroid Oluşumu

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug therapies&#160;and using bio- and nanosensors in a 3D context. Their ease of production, predictable size, growth, and observed nutrient and metabolite gradients are important to recapitulate the 3D niche-like&#160;cell microenvironment. However, spheroid heterogeneity and variability of their production methods can influence overall cell metabolism, viability, and drug response. This makes it difficult to choose the most appropriate&#160;methodology, considering the requirements in size, variability, needs of biofabrication, and use as in vitro 3D tissue models in stem and cancer cell biology. In particular, spheroid production can influence their compatibility with quantitative live microscopies, such as optical metabolic imaging, fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), monitoring of spheroid&#160;hypoxia with nanosensors, or viability. Here, a number of conventional spheroid formation protocols are presented, highlighting their compatibility with the live widefield, confocal, and two-photon microscopies. The follow-up imaging to analysis&#160;pipeline with multiplexed autofluorescence FLIM and, using various types of cancer and stem cell spheroids, is also presented.

Yazar Spotlight: Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu Kullanarak Metabolik ve Oksijenasyon Analizi için Küresel Oluşum Yöntemlerinin Standardizasyonu

Here, we describe different multicellular spheroid formation methods to perform follow-up multi-parameter live cell microscopy. Using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), cellular autofluorescence, staining dyes, and nanoparticles, the approach for analysis of cell metabolism, hypoxia, and cell death in live three-dimensional (3D) cancer and stem cell-derived spheroids is demonstrated.

Çok Hücreli Sferoidlerin Üretimi ve Çok Parametreli Canlı Hücre Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu (FLIM)

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

Yaşayan Hücreler Moleküler Rotorlar arasında Flüoresans Ömrü Görüntüleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri

Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu Kullanarak Kanser Hücrelerinin Metabolizmasını ve Viskozitesini İnceleme

Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu Kullanarak Kanser Hücrelerinin Metabolizmasını ve Viskozitesini İnceleme

Dinamik Mikrotübülleri ve İlişkili Proteinleri Görüntülemek için Eşzamanlı Girişim Yansıması ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu

Hücre içi SNARE mikroskobu Imaging Floresans ömür tarafından kaçakçılığı görüntülenmesi

Hücresel Metabolizmayı Değerlendirmek için Otofloresan Görüntüleme

In vivo Iki foton floresans ömür boyu görüntüleme mikroskobu kullanarak kafa-sabit davranan fareler Içinde bir aktivite, protein kinaz görselleştirme

Çok Hücreli Sferoidlerin Üretimi ve Çok Parametreli Canlı Hücre Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu (FLIM)

Çok Hücreli Sferoidlerin Üretimi ve Çok Parametreli Canlı Hücre Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu (FLIM)

Çok Hücreli Sferoidlerin Üretimi ve Çok Parametreli Canlı Hücre Floresan Ömür Boyu Görüntüleme Mikroskobu (FLIM)