Name: fluorescence lifetime imaging of molecular rotors in living cells
Uploaded: 2012-02-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells at JoVE.com

MKK은 영국의 공학 및 개인 반지 원정대 물리 과학 연구위원회 (EPSRC) 생명 과학 인터페이스 프로그램을 감사드립니다. 우리는 또한 영국의 생명 공학 및 생물 과학 연구 협의회 (BBSRC)에 의해 자금을 인정하고 싶습니다.

FLIM 샘플 준비를위한 프로토콜 공촛점 또는 넓은 필드 강도 기반의 형광 현미경 분들 다를하지 않습니다. 데이터 수집은 즉 원시 데이터의 형광 수명을 추출, 데이터 분석의 주요 작업은 다음에 있습니다. 일단 이들이 취득되어, 데이터 해석은 가설을 확인하거나 위조하는 데 도움이됩니다. 1. 분자 rotors있는 염색법 세포 <ol><li> 에 염료 약 1 밀리그램 / ML을 해소하여 주식 솔루션 (10 ML)를 준비 적절한 용매 (BODIPY-C 12 예 : 메탄올) 6,7 정확한 균형과 피펫을 사용하여. </li><li> 스테인드있을 세포는 (우리의 경우 모델 암 세포주, HELA) ~ 80 % 합류하기 전까지 5 % CO 2 분위기로 37 ° C에서 인큐베이터에서 현미경을위한 coverslide의 아래쪽으로 multiwell 플레이트에 대한 재배 . </li><li> 10 추가 - 재고 용액 20 μl를 다중 나르는에서 성장하는 살아있는 세포에Opti-MEM 배지 (GIBCO) 당 잘 6 - 잘 접시 4 개 ML에 난 플레이트 (50 SmartSlide 마이크로 인큐베이션 시스템 Wafergen). 이것은 잘에서 마이크로 어금니 염료 농도를 얻을. </li><li> 염색법에 대해 10-45 분를위한 5 % CO 2 분위기로 37 ° C에서 인큐베이터로 멀티 잘 번호판을 반환합니다. </li><li> 인큐베이터에서 multiwell 플레이트를 제거하고 여분의 염료를 제거하는 네 ML 광학적으로 투명 세포 배양 매체 (예 : Opti-MEM)와 세포에게 3-4 회 씻는다. </li><li> 현미경 단계에 multiwell 판을 전송하고 필요에 따라 영상을위한 준비, 온도 컨트롤러 / 5 % CO 2 가스 유입구에 연결합니다. </li></ol> 2. 세포의 형광 분자 rotors의 FLIM <ol><li> 현미경 스테이지에 샘플을 넣고 전송 및 형광 세포를 확인하는 형광 이미지를 구하십시오. 설정 실험의 개략도는 그림에 표시됩니다. 1.Verify 그 위치 expe에서 형광 emanatescted (예 : 세포막, 세포질). 형광 방출 스펙트럼을 확보하고,이 경우에는 분자 로터의 스펙트럼 예상 염료이나 단백질의 있는지 확인합니다. 부정적인 컨트롤로, 이미지가 아닌 스테인드 샘플을하고 형광하지 않는 있는지 확인합니다. 이 단계가 FLIM 위해 특별히 필수는 아니지만, 그것은 일반적으로 좋은 습관이며, 예제는 당신이 그것이 무엇인지 확인하는 데 도움이 않습니다. </li><li> FLIM 모드로 전환 -이 쉽게 형광 검출 빔 경로 (Leica TCS SP2 수집 제어 소프트웨어에서 &quot;빔 경로 설정&quot;패널에서 &quot;외부 검출기&quot;버튼)에서 거울을 이동하여 수행됩니다. 검출기에 도달으로부터 흥미로운 빛을 차단하는 적절한 형광 방출 필터는 형광 검출 beampath에 있어야합니다. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig1.jpg" /> 그림 1. AC를 사용하여 시간 도메인 FLIM위한 실험적 조치onfocal 레이저 현미경 스캐닝. <ol start="3"><li> 샘플을 검사하고 검출기 카운트 속도 (베커 &amp; Hickl SPC 830 보드의 수집 제어 소프트웨어에 CFD 표시된 검은 막대)가 더 이상 레이저 반복 률의 약 1 % (이상 없다는 것을, FLIM 수집을 제어하는​​ 컴퓨터에, 확인 녹색 막대) SYNC 수집 제어 소프트웨어를 분류. 그렇다면 더미 업 변형된 형광 붕괴 곡선을 수집 피하기 위해, 레이저 빔 경로에 중성 농도 필터를 배치하여 예를 들어 레이저 여기 강도를 줄일 수 있습니다. </li><li> 일반적으로 3-5 분 동안 FLIM 이미지를 취득 스캔을 중지하고 원시 데이터 (3D 데이터 공간 좌표를 x와 y로 구성된 &#39;큐브&#39;및 시간) 저장하십시오. </li><li> 예를 TRI-2 14 상용 소프트웨어, 형광 강도 이미지를 표시하려면위한 형광 붕괴 분석 소프트웨어 패키지의 원시 데이터를 엽니다. 이것은 단순히 통합 형광 붕괴이며, 각각에서 형광 붕괴 곡선 아래의 영역을 말한다픽셀. </li><li> 거기에 커서를 배치하여 일반적인 픽셀을 선택하고 해당 픽셀의 형광 붕괴를 검사. 피크 카운트가 100 이하이면 픽셀의 공간적 binning을 사용합니다. 인접 픽셀 (예 : 3x3 또는 5x5)의 카운트가 높은 피크 카운트 거기서 얻은 것입니다 그래야 중심 픽셀에 추가됩니다. 이것은 다음 단계에 대한 높은 통계의 정확도를 제공합니다. 또는 측정은 긴 획득 시간 (5 단계)에 대한 반복 수 있습니다. 30 - 50 분 들면, 약 10 배 이상의 최대 개수 (그리고 총 카운트)이 얻어, 그러나 이것은 너무 오래 멀리 있기 때문에 샘플의 움직임에 의한 유물, 현미경 드리프트, phototoxicity 및 도입의 위험성이 대부분 생물 학적 샘플 수집 시간입니다 photobleaching. </li><li> 글로벌 픽셀 임계값 값 (픽셀의 부패가 장착되는 위에있는)을 선택하고 이미지를 하나의 지수 감쇠 발작을 적용합니다. 결과는 다음으로 인코딩되어 임계값 위의 각 픽셀에 대한 형광 수명을 듭니다색상. 각 픽셀은 적합의 결과로 유색 인종이야, 그리고 FLIM지도가 얻어진다. 다양한 픽셀의 감소 치 제곱 값 체크 - 1 주변 (및 최대 1.3까지) 잘 맞는 나타냅니다. 무작위 제로 주위에 배포해야 해당 residuals을 검사합니다. </li><li> 형광 수명 히스토그램의 특정 형광의 수명은 형광 수명 자체에 비해 발생 빈도 플롯. 형광 수명 분포는 색상 범위로 맞는되는 색상 범위 등의 조정합니다. </li><li> monoexponential 판단 주변 1 기의-제곱 값 (및 최대 1.3까지)를 양보하지 않으며, 제로로부터 residuals의 체계적인 편차가있다면,보다 정교한 모델이 필요합니다. 예를 들어, 탐사선이 적합도 하나 염료의 상대적인 양을 알려주지 사전 지수 요인이나 amplitudes을 낼 것입니다 인치있을 수 있습니다 두 개의 서로 다른 환경에 계좌로, 형광 붕괴로 이중 지수 모델을 맞추려고 시도 둘러 싸다, 표준 또는 기타. 양자 택일로, 뻗어 지수 함수는 형광 수명의 분포 계좌가 적절한 수 있습니다. </li><li> 각 픽셀에 대한 형광 수명, 사전 지수 요인 및 수명 비율과 사전 지수 인자 비율에 대한 결과는 다음 컬러로 인코딩 할 수 있습니다. 각 픽셀은 가치에 따라 컬러이며, 형광 수명, 사전 지수 요인과 그 비율에 따라 명암이 얻어진다. 적합한를 나타내는 1 시경 (및 최대 1.3까지) - 다시 감소 치 제곱 값 (도 컬러 인코딩 및 이미지로 표시할 수 있음) 확인합니다. 무작위 제로 주위에 배포해야합니다 residuals을 검사합니다. </li><li> 형광 평생 histograms 평균 형광 평생 가치를 쉽게 시각화, 그리고 형광 수명 분포에 대한 모든 이미지를 동반해야합니다. </li></ol> 3. 대표 결과 형광 자연 붕괴를 위해 측정메탄올 / 글리세린 섞어으로 점도를 증가시 형광 분자 로터는 그림에 표시됩니다. 2. 형광 붕괴는 monoexponential이며, 형광 수명은 점성 함수로 현저하게 다릅니다. 그것은 메탄올에 약 300 PS (점도 0.6 CP)에서 95 % 글리세롤 (점도 950 CP)의 3.4 NS로 증가합니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig2.jpg" /> BODIPY-C 그림 2. 형광 붕괴 프로필 다양한 점도의 메탄올 / 글리세린 섞어 12 6. 형광 수명의 로그 보정 줄거리는 τ 대 형광 분자 로터에 대한 점성 η는 그림에 표시됩니다. 3. 포스터 호프만 방정식 9 일까지 요구대로 그것은 직선이다 <img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq1.jpg" alt="등식 1" /> K 0 radiativ입니다전자 일정한 속도, 그리고 Z와 x는 0 &lt;X &lt;1, 상수입니다. 양측의 수율에서 모두 로그를 복용 <img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq2.jpg" alt="등식이" /> X 어디는 직선의 기울기이다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig3.jpg" /> 그림 3. 포스터 - 호프만 방정식에 따라 BODIPY-C 12 수확량 직선에 대한 로그 형광 수명 대 로그 점도의 줄거리 6. 형광 분자 로터와 살아있는 세포의 배양에 이어 작은 반점이있는 염료 배포는 형광 이미지에서 관찰된다. meso - 치환 BODIPY 색소를 incubated HELA 세포의 FLIM 이미지는 그림에 표시됩니다. 4. 이미지의 각 픽셀의 형광 붕괴는 적절 하나의 지수 감쇠 모델을 이용하여 장착할 수 있습니다. 그림 4. () 형광 강도 및 BODIPY-C 12 물들일 HELA 세포 (B) FLIM 이미지. 밝고 중단 지역은 다른 지역보다 짧은 수명을 나타냅니다. 이 짧은 liftime는 포스터 - 호프만 방정식에 의하면, puncta의 낮은 점도, 아마도 지질 방울에 해당합니다. 모든 픽셀에서 추출한 수명을하려함으로써, 우리는 그림과 같이 전체 이미지의 형광 수명 히스토그램을 구하십시오. 5. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig5.jpg" /> 그림 5. meso - 치환 BODIPY 분자 rotors 물들일 HELA 세포의 FLIM 이미지에서 형광 수명의 Histograms.

<ol>
	<li>Luby-Phelps, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoarchitecture+and+physical+properties+of+cytoplasm:+Volume,+viscosity.+diffusion,+intracellular+surface+area.">Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: Volume, viscosity. diffusion, intracellular surface area.</a> International Review of Cytology - a Survey of Cell Biology. , 192-1189 (2000).</li><li>Stutts, M. J., Canessa, C. M., Olsen, J. C., Hamrick, M., Cohn, J. A., Rossier, B. C., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+as+a+CAMP-dependent+regulator+of+sodium+channels.">CFTR as a CAMP-dependent regulator of sodium channels.</a> Science. 269, 847-850 (1995).</li><li>Dondorp, A. M., Angus, B. J., Hardeman, M. R., Chotivanich, K. T., Silamut, K., Ruangveerayuth, R., Kager, P. A., White, N. J., Vreeken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+reduced+red+blood+cell+deformability+in+severe+falciparum+malaria.">Prognostic significance of reduced red blood cell deformability in severe falciparum malaria.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 507-511 (1997).</li><li>Haidekker, M. A., Nipper, M., Mustafic, A., Lichlyter, D., Dakanali, M., Theodorakis, E. A., Demchenko, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advanced Fluorescence Reporters in Chemistry and Biology I. Fundamentals and Molecular Design. 8, 267-308 (2010).</li><li>Haidekker, M. A., Theodorakis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment-sensitive+behavior+of+fluorescent+molecular+rotors.">Environment-sensitive behavior of fluorescent molecular rotors.</a> J. Biol. Eng. 4, (2010).</li><li>Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Levitt, J. A., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Rotor+Measures+Viscosity+of+Live+Cells+via+Fluorescence+Lifetime+Imaging.">Molecular Rotor Measures Viscosity of Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 6672-6673 (2008).</li><li>Levitt, J. A., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Chung, P. H., Suhling, K., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-Bound+Molecular+Rotors+Measure+Viscosity+in+Live+Cells+via+Fluorescence+Lifetime+Imaging.">Membrane-Bound Molecular Rotors Measure Viscosity in Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Journal of Physical Chemistry C. 113, 11634-11642 (2009).</li><li>Hungerford, G., Allison, A., McLoskey, D., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Sol-to-Gel+Transitions+via+Fluorescence+Lifetime+Determination+Using+Viscosity+Sensitive+Fluorescent+Probes.">Monitoring Sol-to-Gel Transitions via Fluorescence Lifetime Determination Using Viscosity Sensitive Fluorescent Probes.</a> J. Phys. Chem. B. 113, 12067-12074 (2009).</li><li>Förster, T., Hoffmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Viskosit&#228;tsabh&#228;ngigkeit+der+Fluoreszenzquantenausbeuten+einiger+Farbstoffsysteme.">Die Viskosit&#228;tsabh&#228;ngigkeit der Fluoreszenzquantenausbeuten einiger Farbstoffsysteme.</a> Zeitschrift f&#252;r Physikalische Chemie Neue Folge. 75, 63-76 (1971).</li><li>vandeVen, M., Ameloot, M., Valeur, B., Boens, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pitfalls+and+Their+Remedies+in+Time-Resolved+Fluorescence+Spectroscopy+and+Microscopy.">Pitfalls and Their Remedies in Time-Resolved Fluorescence Spectroscopy and Microscopy.</a> J. Fluores. 15, 377-413 (2005).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Techniques. , (2005).</li><li>O'Connor, D. V., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Time-correlated single-photon counting. , (1984).</li><li>Suhling, K., French, P. M. W., Phillips, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+fluorescence+microscopy.">Time-resolved fluorescence microscopy.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 4, 13-22 (2005).</li><li>Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J., Carlin, L. M., Keppler, M. D., Ng, T. C., Vojnovic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+time-domain+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+practical+application+to+protein-protein+interactions+using+global+analysis.">Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis.</a> Journal of the Royal Society - Interface. 6, S93-S105 (2009).</li></ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

FLIM는 강도 기반의 형광 이미징 이상의 몇 가지 주요 이점을 제공합니다. 그것이 형광단 농도 효과에서 그들을 분리할 수 있기 때문에 그것은 형광 강도 이미징에 의해 관찰하기 어렵거나 불가능 photophysical 이벤트에 대한 리포트를 작성할 수 있습니다. 이것은 이미징 형광 분자 rotors하여 세포내 점도를 매핑에 특히 유용합니다. 그림과 같이 형광 수명은 쉽게, 보정 그래프를 사용하여 점도로 변환할 수 있습니다. 3, 형광 분자 rotors의 농도가 독립. FLIM의 데이터 해석을 복잡 수 유물이있을 수 있습니다. 10 경음악 유물은 형광 부패의 시작 부분 위에 피크로 표시되며 짧은 붕괴 시간과 혼동 수 있습니다 흩어진 빛, 또는 이후에 작은 피크를 포함 IRF는 어떤 현미경 내부 반사에 의해 발생할 수 있습니다. 이 흩어져 빛이 유물은 같은 확인할 수 있습니다그들이 스펙트럼 차별로 구분할 수 있기 때문에 - 그들은 흥미로운 빛이 같은 파장에 항상있다. 공중에, 라이트는 1 nanosecond에서 30 센티미터 여행 것을 외우는 건 반사의 출처를 정확히 파악할 수 있도록 도와줍니다. 필터 혹은 유리 형광은 또한 특히 낮은 샘플 형광에서 유물을 일으킬 수 있지만, 이것은 쉽게 샘플없이 측정을 복용하여 확인하실 수 있습니다 부패가 이런 상황에서 얻은 것입한다면, 그것은 악기에 의한이며 아무 상관이 없어 샘플로! 반면에, 샘플 autofluorescence 또한 형광 부패에 기여할 수 있습니다. 시간이 서로 관련 단일 광자의 계산에서는 (TCSPC), 타임 - 투 - 진폭 컨버터 (TAC)가 아닌 linearities는 가난한 면에서 발생할 수 있으나, 여기를 차단하고 샘플로 전송 광원의 예 : 주위 조명, 빛나는하여 확인할 수 있습니다 그리고 타이밍을 측정. 상수 배경이 있어야이미지의 각 픽셀에 취득. 일정한 배경에서 편차가 발생 지역은 잘 맞는가 나올 않을 것이며 그들이 TCSPC 카드에 대한 매개 변수를 조정하여 제거될 수 없다면 측정을 위해 피해야한다. TCSPC의 한 악명높은 유물이 너무 높이 광자 검출 률에 의해 발생되는 더미 업 광자입니다. 11,12 이것은 전자가 바쁜시기이기 때문에 후속 광자를 무시하고 최초로 광자를 처리, 시간 초과되는 첫 번째 광자로 안내합니다. 형광 수명의 단축, 그리고 이것을 방지하는 최선의 방법으로 연쇄 충돌 리드는 레이저 반복 율이 1 % 정도의 광자 개수 율을 유지하는 것입니다. 시야 응용 프로그램에 따라이 FLIM의 다양한 구현이 있으며, 각각은 장점과 단점이 있습니다. 13 이상적인 형광 현미경 획득 것이 전체 다차원 형광 emissio가단일 광자 감도, 최대 공간 해상도 및 최소 획득 시간과 단일 측정의 강도, 위치, 평생, 파장과 편광의 N 곡선. 이 기능이 독특한 조합을 가진 기술은 현재는 없으며, 하나를 구축하는 계기 개발자를위한 도전 남아있다. 세포 생물학에서 중요한 문제에 대한 새로운 물리 기술의 응용 프로그램은 종종 예상치 못한 발견의 경로이며, 우리는 세포 생물학을위한 형광 이미징의 포화 기능을 가까이에 위치하기 전에 갈 길이가 있습니다. 실제로, 그러한 수명, 스펙트럼 및 편광뿐만 아니라 높은 공간적 해상도에서 3D로보다 빠르게 영상과 같은 이미징 형광 파라미터는, 세포 생물학의 새로운 측면을 나타내기 위해 특정 수 있습니다.

형광 분자 rotors과 샘플 하드웨어 : 거꾸로 Leica TCS SP2 공촛점 스캐닝 현미경 일관된 미라 900 티 : 베르디 V6 펌프 레이저 또는 하마 마츠 PLP-10 470 picosecond 펄스 다이오드 레이저 여기 소스와 사파이어의 femtosecond 레이저 베커 &amp; Hickl SPC 3GHz의 830 보드, 펜티엄 IV, Windows XP와 1기가바이트 램 컴퓨터 냉각 베커 &amp; Hickl PMC100-01 검출기 헤드는 하마 마츠 H5773P-01 현미경의 X1 포트에 장착된 photomultipliers, 또는 하이브리드 탐지기에 기초 DCC 100 탐지기 제어 모듈 소프트웨어 : TRI-2 14 베커 &amp; Hickl하여 SPCImage 2.8

fluorescence lifetime imaging of molecular rotors in living cells

보급은 종종 화학 반응 또는 생물 학적 과정에 중요한 속도 - 결정 단계이며, 세포내 이벤트 광범위한 역할을 담당하고 있습니다. 점성은 분자와 단백질의 확산에 영향을 미치는 주요 매개 변수 중 하나이며, 점도의 변화가 세포 수준에서 질병 및 장애로 연결되었습니다. 1-3 대량 점도를 측정하는 방법이 잘 개발되어 있지만, 이미징 microviscosity는 과제 남아 . 최근 얻을 힘들었 때까지 같은 단일 세포와 같은 미세한 물체의 점성지도는 있습니다. 기타 광학 기술과 유사, 그것이 비 파괴적인, 최소한 침략이며 생활 세포와 조직에 적용할 수 있기 때문에 형광 기술과 매핑 점도는 유리입니다. 형광 분자 rotors는 형광 수명과 microenvironment의 점성 함수가 양자 수율을 나타냅니다. 4,5 분자내 왜곡하고 있군요 또는회전은 흥분 상태 뒤쪽에서 바닥 상태로 비 발광 붕괴로 이어집니다. 점성 환경이 아닌 발광 붕괴 경로에 대한 액세스를 제한하는이 회전하거나 트위스트 느려집니다. 이것은 형광 양자 수율 및 형광 수명의 증가로 이어집니다. 형광 분자 rotors 역할 수정된 소수성 BODIPY 염료의 형광 수명 이미징 (FLIM)는 이러한 프로브의 형광 수명 자신의 환경 microviscosity의 함수임을 보여줍니다. 6-8에게 용매 점도 수확량 대 형광 수명의 대수 음모를 포스터 호프만 방정식을 따르는 직선 9.이 음모는 점도에 형광 수명을 변환하는 보정 그래프로 제공합니다. 수정된 BODIPY 형광 분자 로터와 살아있는 세포의 부화 후, 작은 반점이있는 염료 배포는 형광 이미지에서 관찰된다. 회에서 얻어진 점도 값살아있는 세포에서 전자 puncta는 약 100 배 물이보다 높은과 세포 세포질의입니다. 6,7 시간 해결 형광 이방성 측정이 큰 microviscosity 가치와 계약에 회전 상관 시간을 얻을 수 있습니다. 형광 수명을 매핑하는 것은 형광 강도의 독립적이며, 따라서 프로브 농도와 점성 효과의 분리가 가능합니다. 요약에서 우리는 형광 분자 rotors의 FLIM을 바탕으로 세포의 microviscosity를 매핑하기위한 실용적이고 다양한 접근 방식을 개발했습니다.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells at JoVE.com

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

형광 수명 이미징 (FLIM)는 이미지 환경과 특정 단백질과 생활 세포에있는 염료의 상호 작용에 핵심 기술로 부상하고있다. 형광 분자 rotors의 FLIM은 살아있는 세포의 점도 매핑 있습니다.

생활 세포의 분자 Rotors의 형광 수명 이미징

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

fluorescence-lifetime-imaging-of-molecular-rotors-in-living-cells

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

24.9K 조회수.  King's College London. 형광 수명 이미징 (FLIM)는 이미지 환경과 특정 단백질과 생활 세포에있는 염료의 상호 작용에 핵심 기술로 부상하고있다. 형광 분자 rotors의 FLIM은 살아있는 세포의 점도 매핑 있습니다.

비디오: Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

microfluidic 비말 플랫폼 형광 검출 방법

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

연구

생체공학

Probing Metabolism and Viscosity of Cancer Cells using Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Viscosity is an important physical property of a biological membrane, as it is one of the key parameters for the regulation of morphological and physiological state of living cells. Plasma membranes of tumor cells are known to have significant alterations in their composition, structure, and functional characteristics. Along with dysregulated metabolism of glucose and lipids, these specific membrane properties help tumor cells to adapt to the hostile microenvironment and develop resistance to drug therapies. Here, we demonstrate the use of fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) to sequentially image cellular metabolism and plasma membrane viscosity in live cancer cell culture. Metabolic assessments are performed by detecting fluorescence of endogenous metabolic cofactors, such as reduced nicotinamide adenine dinucleotide NAD(P)H and oxidized flavins. Viscosity is measured using a fluorescent molecular rotor, a synthetic viscosity-sensitive dye, with a strong fluorescence lifetime dependence on the viscosity of the immediate environment. In combination, these techniques enable us to better understand the links between membrane state and metabolic profile of cancer cells and to visualize the changes induced by chemotherapy.

<meta charset="utf8"></head><body>Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy를 사용한 암세포의 대사 및 점도 조사

Here, we demonstrate the use of fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) to sequentially image cellular metabolism and plasma membrane viscosity in live cancer cell culture. Metabolic assessments are performed by detecting endogenous fluorescence. Viscosity is measured using a fluorescent molecular rotor.

Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy를 사용한 암세포의 대사 및 점도 조사

Viscosity is an important physical property of a biological membrane, as it is one of the key parameters for the regulation of morphological and ...

암 연구학

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopy has a high signal-to-background ratio, but it suffers from photobleaching and photodamage of the fluorescent proteins. Label-free techniques such as interference reflection microscopy (IRM) and interferometric scattering microscopy (iSCAT) circumvent the problem of photobleaching but cannot readily visualize single molecules. This paper presents a protocol for combining IRM with a commercial TIRF microscope for the simultaneous imaging of microtubule-associated proteins (MAPs) and dynamic microtubules in vitro. This protocol allows for high-speed observation of MAPs interacting with dynamic microtubules. This improves on existing two-color TIRF setups by eliminating both the need for microtubule labeling and the need for several additional optical components, such as a second excitation laser. Both channels are imaged on the same camera chip to avoid image registration and frame synchronization problems. This setup is demonstrated by visualizing single kinesin molecules walking on dynamic microtubules.

We present a protocol for implementing interference-reflection microscopy and total-internal-reflection-fluorescence microscopy for the simultaneous imaging of dynamic microtubules and fluorescently labeled microtubule-associated proteins.

동시 간섭 반사 및 전체 내부 반사 형광 현미경 검사 이미징 동적 미세 소관 및 관련 단백질

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

생화학

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

면역학 및 감염병학

Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism

Cellular metabolism is the process by which cells generate energy, and many diseases, including cancer, are characterized by abnormal metabolism. Reduced nicotinamide adenine (phosphate) dinucleotide (NAD(P)H) and oxidized flavin adenine dinucleotide (FAD) are coenzymes of metabolic reactions. NAD(P)H and FAD exhibit autofluorescence and can be spectrally isolated by excitation and emission wavelengths. Both coenzymes, NAD(P)H and FAD, can exist in either a free or protein-bound configuration, each of which has a distinct fluorescence lifetime-the time for which the fluorophore remains in the excited state. Fluorescence lifetime imaging (FLIM) allows quantification of the fluorescence intensity and lifetimes of NAD(P)H and FAD for label-free analysis of cellular metabolism. Fluorescence intensity and lifetime microscopes can be optimized for imaging NAD(P)H and FAD by selecting the appropriate excitation and emission wavelengths. Metabolic perturbations by cyanide verify autofluorescence imaging protocols to detect metabolic changes within cells. This article will demonstrate the technique of autofluorescence imaging of NAD(P)H and FAD for measuring cellular metabolism.

This protocol describes fluorescence imaging and analysis of the endogenous metabolic coenzymes, reduced nicotinamide adenine (phosphate) dinucleotide (NAD(P)H), and oxidized flavin adenine dinucleotide (FAD). Autofluorescence imaging of NAD(P)H and FAD provides a label-free, nondestructive method to assess cellular metabolism.

세포 대사를 평가하기 위한 자가형광 이미징

Cellular metabolism is the process by which cells generate energy, and many diseases, including cancer, are characterized by abnormal metabolism. Reduced ...

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. Despite their importance, technologies for tracking neuromodulatory events with cellular resolution are just beginning to emerge. Neuromodulators, such as dopamine, norepinephrine, acetylcholine, and serotonin, trigger intracellular signaling events via their respective G protein-coupled receptors to modulate neuronal excitability, synaptic communications, and other neuronal functions, thereby regulating information processing in the neuronal network. The above mentioned neuromodulators converge onto the cAMP/protein kinase A (PKA) pathway. Therefore, in vivo PKA imaging with single-cell resolution was developed as a readout for neuromodulatory events in a manner analogous to calcium imaging for neuronal electrical activities. Herein, a method is presented to visualize PKA activity at the level of individual neurons in the cortex of head-fixed behaving mice. To do so, an improved A-kinase activity reporter (AKAR), called tAKAR&#945;, is used, which is based on F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). This genetically-encoded PKA sensor is introduced into the motor cortex via in utero electroporation (IUE) of DNA plasmids, or stereotaxic injection of adeno-associated virus (AAV). FRET changes are imaged using two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (2pFLIM), which offers advantages over ratiometric FRET measurements for quantifying FRET signal in light-scattering brain tissue. To study PKA activities during enforced locomotion, tAKAR&#945; is imaged through a chronic cranial window above the cortex of awake, head-fixed mice, which run or rest on a speed-controlled motorized treadmill. This imaging approach will be applicable to many other brain regions to study corresponding behavior-induced PKA activities and to other FLIM-based sensors for in vivo imaging.

A procedure is presented to visualize protein kinase A activities in head-fixed, behaving mice. An improved A-kinase activity reporter, tAKAR&#945;, is expressed in cortical neurons and made accessible for imaging through a cranial window. Two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy is used to visualize PKA activities in vivo during enforced locomotion.

생체 내 2 광자 형광 평생 이미징 현미경 을 사용하여 머리 고정 행동 마우스에서 단백질 키나제 활동을 시각화

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...

신경과학

FLIM 기반 대사 및 저산소증 분석을 위한 다세포 스페로이드 형성

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug therapies&#160;and using bio- and nanosensors in a 3D context. Their ease of production, predictable size, growth, and observed nutrient and metabolite gradients are important to recapitulate the 3D niche-like&#160;cell microenvironment. However, spheroid heterogeneity and variability of their production methods can influence overall cell metabolism, viability, and drug response. This makes it difficult to choose the most appropriate&#160;methodology, considering the requirements in size, variability, needs of biofabrication, and use as in vitro 3D tissue models in stem and cancer cell biology. In particular, spheroid production can influence their compatibility with quantitative live microscopies, such as optical metabolic imaging, fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), monitoring of spheroid&#160;hypoxia with nanosensors, or viability. Here, a number of conventional spheroid formation protocols are presented, highlighting their compatibility with the live widefield, confocal, and two-photon microscopies. The follow-up imaging to analysis&#160;pipeline with multiplexed autofluorescence FLIM and, using various types of cancer and stem cell spheroids, is also presented.

저자 스포트라이트: Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy를 사용한 대사 및 산소화 분석을 위한 스페로이드 형성 방법 표준화

Here, we describe different multicellular spheroid formation methods to perform follow-up multi-parameter live cell microscopy. Using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), cellular autofluorescence, staining dyes, and nanoparticles, the approach for analysis of cell metabolism, hypoxia, and cell death in live three-dimensional (3D) cancer and stem cell-derived spheroids is demonstrated.

다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

생활 세포의 분자 Rotors의 형광 수명 이미징

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

microfluidic 비말 플랫폼 형광 검출 방법

Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy를 사용한 암세포의 대사 및 점도 조사

Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy를 사용한 암세포의 대사 및 점도 조사

동시 간섭 반사 및 전체 내부 반사 형광 현미경 검사 이미징 동적 미세 소관 및 관련 단백질

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

세포 대사를 평가하기 위한 자가형광 이미징

생체 내 2 광자 형광 평생 이미징 현미경 을 사용하여 머리 고정 행동 마우스에서 단백질 키나제 활동을 시각화

다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)

다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)

다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)