Biz minnetle, Dr önemli katkılar kabul. John Anderson, Andrew Ana ve bu çalışmanın Shirley Tirrell. Bu çalışma Merkezleri Hastalık Kontrol ve Önleme (U50/CCU116806-01-1) ve ABD Tarım Bakanlığı (58-6615-1-218, CONH00768 ve CONH00773) hibe kısmen desteklenmiştir.

1. Sivrisinek sıralama ve kimlik <ol><li> Aşağıdaki prosedürler canlı sivrisinek ile çalışmak için eğitilmiş personel tarafından adanmış bir biyogüvenlik seviye-2 (BSL-2) laboratuar açık bir laboratuvar tezgahı üzerinde yapılmaktadır. &quot;Soğuk zincir&quot; prosedür boyunca korunur. </li><li> 5 dakika boyunca -20 ° C derin dondurucuda sivrisinek toplama torbası koyarak erişkin sivrisinek canlı anestezisi. Kuru buz içeren bir izolasyonlu konteyner Transfer toplama torbası. Kapağını kapatın ve knock-down tam emin olmak için 1-3 dakika boyunca karbon dioksit sivrisinek maruz. </li><li> Kuru buz bir yatağın üzerine yerleştirilen bir ön-soğutulmuş tavada üzerine anestezi sivrisinek dokunun. Plastik kısmı su bardağı ince forseps ve yerinde kullanarak birbirinden ayrı dişi sivrisinekler. Kapak ve ıslak buz üzerinde yer bardak ile kaplayın. </li><li> Stereo diseksiyon mikroskobu (10-60X zoom) yardımı ile dış sivrisinek morfolojisi dayalı açıklayıcı taksonomik tuşlarını kullanarak türlerin sivrisinek tanımlamak elektronik bir soğuk masaya monte edilebilir. </li><li> Bakır BB içeren 2 ml ek kapaklı şişeleri ≤ 50 bireylerin havuza sivrisinek türü tespit birleştirin. Şişeler, benzersiz bir tanımlayıcı ile etiketlenir. </li><li> Tüm sivrisinekler belirlenmesini takiben, şişeleri etiketli torbalara yerleştirilmiş ve kuru buz içeren plastik bir soğutucu düzenlenecek. </li><li> Sivrisinek havuzları virüs testi kadar -80 ° C derin dondurucuda saklayın. </li></ol> 2. Biyogüvenlik sivrisinek virüs izole etmek için düşünceler <ol><li> Aşağıdaki işlemleri 1 çevreleme bu seviyede çalışmak için eğitilmiş personel tarafından bir biyogüvenlik seviye-3 (BSL-3) laboratuvar yapılmaktadır. Laboratuvar olanakları, ekipman, prosedür ve uygulamaları, kurumsal, eyalet ve federal gözetim ve denetimine tabidir. Aşağıdaki protokoller denemeden önce uygun eğitim ve onay isteyin. </li><li> , Tek kullanımlık önlük, eldiven, yüz kalkanları ve solunum gibi her bir işlem için uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) giyin. </li><li> Çalışma yüzeyleri tamamladıktan prosedürler öncesinde ve sonrasında% 70 alkol ile dezenfekte edin. </li><li> Sınıf II Biyogüvenlik kabini (BSC) hücre kültürleri ve potansiyel olarak bulaşıcı malzeme ele alınır. </li><li> Sivrisinek havuzları bir BSC içine yerleştirilen bir karıştırıcı değirmen homojenize. </li><li> Sivrisinek homojenatlarında sıkı bir aerosol mikrosantrifüj santrifüj. Bu yordamı BSC içinde gerçekleştirilir mümkün değilse işletme ve santrifüj örnekler alınırken, operatör bir maske takmalıdır. </li><li> Pipetler ve BSC (biyogüvenlik kabini) malzeme taşıma pipetlemeyin ipuçları önce otoklav% 10 çamaşır suyu ile ıslatılmış. Tüm laboratuar atık bertarafına kadar önce otoklavlanarak dekontamine. </li></ol> 3. Vero hücrelerinde hazırlanması <ol><li> Çamaşır suyu içeren atık behere konfluent Vero hücreleri (Klon E6) büyük bir doku kültürü balonuna (175 cm 2) Durusu kültür ortamı. </li><li> 5 ml PBS kısım ve hücre tabakası üzerinde ve tüm tek tabaka iyice karşılamak için emin olun balonun kenarları boyunca girdap ekleyerek Vero hücreleri yıkayın. </li><li> Durusu PBS atık behere. </li><li> 2,5 ml tripsin-EDTA ve tüm tek tabaka iyice karşılamak için emin olun hücre tabakası üzerinde girdap ekleyin. </li><li> 37 5 dakika boyunca inkübatörde balon ° C&#39;de,% 5 CO 2. </li><li> Alt yüzeyindeki hücreleri çıkarmak için yavaşça sallamak ve girdap şişesi. Hücreleri kolayca kaydırarak; hücreleri kolayca kaydırarak yoksa ek bir 1-5 dakika inkübe edin. </li><li> 5 Minimal Essential Medya mL (MEM),% 5 fetal sığır serumu (FBS), serolojik pipetlemeyin kullanarak ve pipetlemeyin ekle yukarı ve aşağı hücre kümeleri break up için 10-20 kez. </li><li> Toplam hacmi 22.5 mL için ek bir 15 mL MEM,% 5 FBS ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> 40 küçük doku kültürü şişeleri (25 cm 2) dik iki rafları (20 şişeler / raf) olarak yerleştirin. </li><li> Biyogüvenlik kabini içinde şişelerin bulunduğu raflara yerleştirin ve şişe kapakları önünde yerleştirerek, şişesi kapakları kaldırmak. </li><li> MEM,% 5 FBS serolojik pipetlemeyin kullanarak her balona 4 mL koyun. </li><li> Her balona (~ 01:06 bölme oranı) şişesi kapakları değiştirin 0.5 mL askıya hücreleri koyun. </li><li> Geri kalan hücre süspansiyonu (~ 2.5 mL) içeren orijinal büyük doku kültürü şişesi,% 5 FBS MEM, 50 ml ekleyin ve inkübatör şişeyi geri. Aynı büyük doku kültürü şişesi 5 pasajlar yeniden kullanılabilir ve daha sonra yeni bir balon değiştirmek için set-up olmalıdır. </li><li> Yığınlar halinde tepsiye yerleştirin küçük doku kültürü şişeleri. Medya düzgün flaks alt kapsadığını emin olmak için Swirl tepsi. </li><li> 37 kuvöz küçük şişeler ° C,% 5 CO 2 ve% 80-90 konfluent kadar bir gecede büyümek yerleştirin. </li></ol> 4. Sivrisinek havuzları hazırlanması <ol><li> Sivrisinek havuzları test işlemleri sırasında soğuk tutun. Önceden soğutulmuş kullanın.rafları ve dondurucu karıştırıcı değirmen kasetleri, buz reaktifler ve soğutmalı santrifüj sivrisinek havuzları işleme. </li><li> Yeri tüpler önceden soğutulmuş dondurucu raf sivrisinek içeren ve 1 - 1,5 ml PBS-G sivrisinekler, her tüp. </li><li> Dondurucu karıştırıcı değirmen kaset al. Sonra her kaset içine koyun ve 24 tüplü karıştırıcı değirmen güvenli. </li><li> 4 dakika 25 devir / saniye örnekleri homojenize. Mikser değirmen sivrisinek dokuyu bozan, yüksek hız ve her tüp içinde bir metal BB tüpler sallar. </li><li> 7,000 rpm hızında 6 dakika için borular santrifüjleyin. </li><li> Dondurucu raflar yerleştirmek tüpler Vero hücre içine inoküle kadar. </li></ol> 5. Sivrisinek havuzu homojenatlarında Vero hücreleri Aşılanması <ol><li> Yeterli confluency ve hücre sağlığını sağlamak için her bir serinin en az bir doku kültür şişelerinde inverted mikroskop altında kontrol edin;% 80-90 kapsama alanı hakkında bekliyoruz. </li><li> Hat kadar her sivrisinek havuzu karşılık gelen üyelik numaraları ile bir raf ve etiket şişeler 20 küçük doku kültürü şişeleri. </li><li> Kapaklar ve atık behere doku kültürü şişeleri medya süzün en gevşetin. Balonuna yeterli medya tamamen kat hücre tek tabaka bırakın. </li><li> Ilgili doku kültürü balona her işlenmiş sivrisinek havuzu süpernatant kısım 100μL. </li><li> Kültür şişesi kapağı yerine takın ve sıkın. </li><li> 35-40 rpm&#39;de 5 dakika (oda sıcaklığı) çalkalamalı kültür şişeler düz yatırın. </li><li> 20 doku kültürü şişeleri BSC bir raf ve yerinde dik pozisyona dönün. </li><li> Bir seferde 3 doku kültürü şişeleri Sır, serolojik bir pipet kullanarak her bir balona 4 mL büyüme ortamı dağıtmak; kapakları yerine. </li><li> Pipet ucu kültür şişelerinde boyun veya dudak temas etmediğinden emin olun. Temas şişesi ile yapılır, gerektiğinde pipet uçları değiştirin. </li><li> 37 inkübe doku kültürü şişeleri ° C,% 5 CO 2. </li></ol> 6. Vero hücreleri virüs büyüme Eleme <ol><li> Ekran, 3-7 gün sonrası aşılama, viral enfeksiyon belirtileri, sitopatik etki (CPE), doku kültürü şişeler inoküle. </li><li> Görme şişeler bükerek, CPE ve / veya kirlenme hücre kültürleri incelemek ve medya inceleyerek balonun altındaki havuzları. Hücrelerin CPE sırasında bozulabilir ya da büyüme, maya, mantar, veya bakteriyel kontaminasyon nedeniyle medya bulutlu görünecektir. </li><li> Ters bir mikroskop altında bulutlu medya sergi hücre kültürleri yeniden inceleyin. Virüsler hücreleri deforme olmaya ve kültür şişeler düşebileceği neden olacaktır. Görünür kirleticiler, örneğin maya, diğer bakteri, mantar ya da ağır sivrisinek enkaz, hücre kültürleri 0.22μM şırınga filtresi sayesinde orijinal sivrisinek havuzu geçerek yeniden test edilmektedir. </li><li> Aseptik serolojik bir pipet kullanarak etiketli cryotubes virüs pozitif hücre kültürleri medya 1-2 mL dağıtılıp. </li><li> Virüs kültürler -80 saklanan ° C uygun tanı testleri ile tespit kadar. </li></ol> 7. Reaktiflerin hazırlanması <ol><li> MEM,% 5 FBS. 4 L gg H 2 0 son bir hacmi 37.6 gr toz MEM eritin. Çözüm medya şişe ve otoklavda 500 ml alikotları içine koyun. Çözüm soğuduğunda, aseptik her bir şişe 26 ml ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu, 5.2 mL L-Glutamine, 5.2 ml anti-biotic/mycotic ve 10.4 ml% 7.5 sodyum bikarbonat ekleyin. 4 ° C saklayınız </li><li> PBS-G. 16 g NaCl, 0,4 g KCI, 2.3 g Na 2 HPO 4, 0.4 g KH 2 PO 4, ve% 0.5 fenol Red 4 ml, 1000 ml dd H 2 0 içine çözülür . 2 N NaOH (gerekirse) 7,1-7,4 pH ayarlayın. Ayrı bir beher, ısı 600 kaynamaya H 2 0 ml. Hot-plate çıkar, 10 gr jelatin ekleyin ve çözülür. PBS çözüm çözünmüş jelatin solüsyonu ekleyin ve 2 L dd H 2 O. ile son ses seviyesini ayarlamak 100 ml solüsyon şişeleri ve otoklav içine koyun. Çözüm soğuduğunda, aseptik olarak 42.8 mL ısı ile inaktive edilmiş tavşan serumu ve 1.4 mL anti-biotic/mycotic ekleyin. 4 ° C saklayınız </li><li> PBS hücre yıkayın. 400 mL gg H 2 O. 50 ml 10X Dulbecco&#39;nun PBS 2 N NaOH ile pH 7.1 &#39;e ayarlayın. Dd H 2 O. ile 500 mL son ses seviyesini ayarlayın 0.2uM vakum filtre ünitesi ile filtre çözüm. 5 ml alikotları 8 ml vidalı kapaklı tüpler içine koyun. 4 ° C saklayınız </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar 4 taksonomik ailelerden gelen virüslerin Dokuz farklı 1997-2010 (Tablo 1) Connecticut eyalet çapında sürekli gözetim sırasında toplanan sivrisinekler kurtarıldı. Bu virüsler Beş insan hastalığı, Batı Nil virüsü ve doğu at ensefaliti virüsü olan en önemli patojenlerin neden olduğu bilinmektedir. Yeni keşifler toplanan sivrisinekler WNV ilk izolasyonKuzey Amerika, 1999 2 2005 4 2000 3 kuzeydoğu ABD&#39;de Potosi virüsün ilk izolasyon, ve New England&#39;da La Crosse virüsünün ilk izolasyon. <table border="1"><tbody><tr><td> Virüs </td><td> Aile </td><td> No izole </td><td> No yerlerde </td><td> No yıl denetliyor </td><td> Insan hastalığı </td><td> Refs. </td></tr><tr><td> Batı Nil virüsü </td><td> Flaviviridae </td><td> 1.002 </td><td> 94 </td><td> 12 </td><td> Orta şiddetli, ateş, ensefalit </td><td> 2,5 </td></tr><tr><td> Doğu at ensefaliti virüsü </td><td> Togaviridae </td><td> 292 </td><td> 41 </td><td> 10 </td><td> Şiddetli, ensefalit </td><td> 6,7 </td></tr><tr><td> Highlands J virüsü </td><td> Togaviridae </td><td> 178 </td><td> 39 </td><td> 11 </td><td> Bilinmiyor </td><td> 6 </td></tr><tr><td> Jamestown Kanyon virüsü </td><td> Bunyaviridae </td><td> 305 </td><td> 74 </td><td> 14 </td><td> Hafif ve orta şiddette, ateş, menenjit </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Potosi virüs </td><td> Bunyaviridae </td><td> 259 </td><td> 76 </td><td> 4 </td><td> Bilinmiyor </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Cache Valley virüs </td><td> Bunyaviridae </td><td> 114 </td><td> 51 </td><td> 8 </td><td> Iki belgelenmiş durumda şiddetli, ateş, nörolojik hastalık Hafif </td><td></td></tr><tr><td> Trivittatus virüs </td><td> Bunyaviridae </td><td> 83 </td><td> 21 </td><td> 11 </td><td> Bilinmiyor </td><td></td></tr><tr><td> La Crosse virüsü </td><td> Bunyaviridae </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> Orta şiddetli, ensefalit </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Flanders virüs </td><td> Rhabdoviridae </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 2 </td><td> Bilinmiyor </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Virüsler Vero hücre kültürü yöntemi ile alanında toplanan sivrisinekler algılandı. Sivrisinekler 1997-2010 Connecticut eyalet çapında gözetim sırasında toplanmıştır.

<ol>
	<li>Chosewood, L. C., Wilson, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2007).</li><li>Anderson, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+West+Nile+virus+from+mosquitoes,+crows,+and+a+Cooper's+hawk+in+Connecticut.">Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut.</a> Science. 286, 2331-2333 (1999).</li><li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolations+of+Potosi+virus+from+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae)+collected+in+Connecticut.">Isolations of Potosi virus from mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in Connecticut.</a> J Med Entomol. 42, 875-881 (2005).</li><li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+genetic+variant+of+La+Crosse+virus+(Bunyaviridae)+isolated+from+New+England.">A new genetic variant of La Crosse virus (Bunyaviridae) isolated from New England.</a> Am J Trop Med Hyg. 75, 491-496 (2006).</li><li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Vossbrinck, C. R., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+West+Nile+virus+in+Connecticut,+USA:+a+five+year+analysis+of+mosquito+data+1999-2003.">Epidemiology of West Nile virus in Connecticut, USA: a five year analysis of mosquito data 1999-2003.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 4, 360-378 (2004).</li><li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Tirrell-Peck, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+isolations+of+eastern+equine+encephalitis+and+highlands+J+viruses+from+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae)+during+a+1996+epizootic+in+southeastern+Connecticut.">Multiple isolations of eastern equine encephalitis and highlands J viruses from mosquitoes (Diptera: Culicidae) during a 1996 epizootic in southeastern Connecticut.</a> J Med Entomol. 35, 296-302 (1998).</li><li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eastern+equine+encephalitis+virus+in+mosquitoes+and+their+role+as+bridge+vectors.">Eastern equine encephalitis virus in mosquitoes and their role as bridge vectors.</a> Emerg Infect Dis. 16, 1869-1874 (2010).</li><li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Armstrong, P. M., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolations+of+Jamestown+Canyon+virus+(Bunyaviridae:+Orthobunyavirus)+from+field-collected+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae)+in+Connecticut,+USA:+a+ten-year+analysis,+1997-2006.">Isolations of Jamestown Canyon virus (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) from field-collected mosquitoes (Diptera: Culicidae) in Connecticut, USA: a ten-year analysis, 1997-2006.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 8, 175-188 (2008).</li><li>Beaty, B. J., Calisher, C. H., Shope, R., Lennette, E. H., Lennette, D. A., Lennette, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11.">Chapter 11.</a> Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections. , 189-212 (1995).</li><li>Karabatsos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> International Catalogue of Arboviruses Including Certain Other Viruses of Vertebrates. , (1985).</li><li>Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+west+nile+virus+from+human+clinical+specimens,+field-collected+mosquitoes,+and+avian+samples+by+a+TaqMan+reverse+transcriptase-PCR+assay.">Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay.</a> J Clin Microbiol. 38, 4066-4071 (2000).</li><li>Lambert, A. J., Martin, D. A., Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+North+American+eastern+and+western+equine+encephalitis+viruses+by+nucleic+acid+amplification+assays.">Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays.</a> J Clin Microbiol. 41, 379-385 (2003).</li></ol>

Vero hücre kültürü testi virüs bir çeşitlilik için ekran alan toplama sivrisinekler için etkili bir yöntem olarak hizmet vermektedir. Bu özellikle hedef bir veya bir kaç ilgi virüslerin moleküler yöntemler tezat. Ayrıca, Vero hücre kültürü tahlil eşit değilse, RT-PCR 7 daha hassas ve gelecek çalışmalar için referans koleksiyonu saklanır virüs izolatları ile bize sunuyor bulduk . Bununla birlikte, hücre kültürü sistemleri, birçok durumda uygun olmayabilir. Bu yaklaşım, ek ma...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif / ekipman Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog Numarası </th></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 16140 </td></tr><tr><td> Anti-biotic/mycotic </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 15240 </td></tr><tr><td> Sodyum bikarbonat, NaHCO 3,% 7.5 Soln. </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 25080 </td></tr><tr><td> L-Glutamine 200mm 100x </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 25030 </td></tr><tr><td> Toz gerekli minimum orta (MEM) </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 11700 </td></tr><tr><td> 10X Dulbecco&#39;nun Kullanıcı PBS </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 14080 </td></tr><tr><td> Tripsin-EDTA </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 15400 </td></tr><tr><td> Tavşan serumu </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 16120 </td></tr><tr><td> Vero Hücreleri (Klon E6) </td><td> ATCC </td><td> CRL-1586 </td></tr><tr><td> Küçük doku kültürü matara, havalandırmalı kapakları, 25 cm 2 </td><td> Falcon - Becton Dickinson </td><td> 353112 </td></tr><tr><td> Büyük doku kültürü matara, havalandırmalı kapakları, 175 cm 2 </td><td> Falcon - Becton Dickinson </td><td> 353108 </td></tr><tr><td> Bakır kaplı BB, 4.5 mm </td><td> Crosman </td><td> 0767 </td></tr><tr><td> Mikser Mill </td><td> Retsch </td><td> MM300 </td></tr><tr><td> Isopack dondurucu raflar </td><td> Eppendorf </td><td> 022510240 </td></tr></tbody></table>

detection of infectious virus from field-collected mosquitoes by vero cell culture assay

Sivrisinekler Batı Nil virüsü, dang virüs ve chickungunya virüs gibi önemli insan patojenleri de dahil olmak üzere bir dizi farklı virüsler iletir. Bu virüslerin çoğu endemik aralıklarında yoğunlaştı ve yeni bölgeler için genişletilmiş, bu tehditlere yanıt vermek için, etkin bir gözetim ve kontrol programları gerektiren var. Virüs etkinliğini izlemek için bir strateji endemik sitelerinden çok sayıda sivrisinek toplama ve viral enfeksiyon için test içerir. Bu makalede, biz nasıl işleneceğini süreci tanımlamak ve Vero hücre kültürü yöntemi ile bulaşıcı bir virüs için sivrisinek alanında toplanan ekran. Sivrisinekler tuzak konumu ve türlerine göre sıralanır ve ≤ 50 bireyler içeren havuza gruplandırılmıştır. Pooled örnekleri karıştırıcı değirmen ve sulu faz konfluent Vero hücre kültürlerinde (Klon E6) üzerine inoküle kullanarak tamponlu salin içinde homojenize edilir. Hücre kültürleri 3-7 sonrası aşılama ve hücre kültüründe yetişen herhangi bir virüs uygun tanı testleri tarafından belirlenen gün sitopatik etki izlenir. Bu yaklaşımın kullanılması, Connecticut, ABD toplanan sivrisinekler 9 farklı virüsler izole var, ve bunlar arasında, 5 insan hastalığa neden olduğu bilinmektedir. Bu virüsler Üç (Batı Nil virüsü, Potosi virüs ve La Crosse virüsü), Kuzey Amerika ya da 1999 yılından bu yana New England bölgesi için yeni kayıtlar temsil eder. Geniş bir çeşitlilik virüs tespit yeteneği hem sivrisinek nüfus yılında kurulan ve yeni çıkan virüslere izlenmesi için kritik öneme sahiptir.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay at JoVE.com

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Biz süreci için bir metodu tanımlar ve ekran alanında toplanan Vero hücre kültürü yöntemi ile virüs bir çeşitliliğe sivrisinekler. Bu tekniği kullanılarak, Connecticut toplanan sivrisinek 4 taksonomik ailelerden gelen 9 farklı virüsler tespit ettik.

Vero Hücre Kültür Testi ile Alan toplanan Sivrisinekler Enfeksiyon Virüs Algılama

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

detection-infectious-virus-from-field-collected-mosquitoes-vero-cell

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.3K Görüntüleme.  The Connecticut Agricultural Experiment Station. Biz süreci için bir metodu tanımlar ve ekran alanında toplanan Vero hücre kültürü yöntemi ile virüs bir çeşitliliğe sivrisinekler. Bu tekniği kullanılarak, Connecticut toplanan sivrisinek 4 taksonomik ailelerden gelen 9 farklı virüsler tespit ettik.

Video: Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection. ATSs are derived from cDNA clones of mosquito-borne RNA viruses (genus Alphavirus; family Togaviridae). The Alphavirus genus contains about 30 different mosquito-borne virus species. Alphaviruses are enveloped viruses and contain single-stranded RNA genomes (~11.7 Kb). Alphaviruses transcribe a subgenomic mRNA that encodes the structural proteins of the virus required for encapsidation of the genome and maturation of the virus. Alphaviruses are usually highly lytic in vertebrate cells, but persistently infect susceptible mosquito cells with minimal cytopathology. These attributes make them excellent tools for gene expression in mosquito vectors. The most common ATSs in use are derived from Sindbis virus (SINV). The broad species tropism of SINV allows for infection of insect, avian, and mammalian cells8. However, ATSs have been derived from other alphaviruses as well9,10,20. Foreign gene expression is made possible by the insertion of an additional viral subgenomic RNA initiation site or promoter. ATSs in which an exogenous gene sequence is positioned 5' to the viral structural genes is used for stable protein expression in insects. ATSs, in which a gene sequence is positioned 3' to the structural genes, is used to trigger RNAi and silence expression of that gene in the insect.
ATSs have proven to be valuable tools for understanding vector-pathogen interactions, molecular details of viral replication and maintenance infectious cycles3,4,11,19,21. In particular, the expression of fluorescent and bioluminescent reporters has been instrumental tracking the viral infection in the vector and virus transmission5,14-16,18. Additionally, the vector immune response has been described using two strains of SINV engineered to express GFP2,9.
Here, we present a method for the production of SINV containing a fluorescent reporter (GFP) from the cDNA infectious clone. Infectious, full-length RNA is transcribed from the linearized cDNA clone. Infectious RNA is introduced into permissive target cells by electroporation. Transfected cells generate infectious virus particles expressing the GOI. Harvested virus is used to infect mosquitoes, as described here, or other host species (not shown herein). Vector competence is assessed by detecting fluorescence outside the midgut or by monitoring virus transmission7. Use of a fluorescent reporter as the GOI allows for convenient estimation of virus spread throughout a cell culture, for determination of rate of infection, dissemination in exposed mosquitoes, virus transmission from the mosquito and provides a rapid gauge of vector competence.

Methods for using alphavirus transducing systems to express fluorescent reporters in vitro and in adult mosquitoes are described. This technique may be adapted to express any protein of interest in lieu of or in addition to a reporter.

Alphavirus uyum Sistemi: Sivrisinek Vektörler Enfeksiyon görselleştirme için Araçlar

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different downstream patient-to-patient transmission potentials, and require very different patient treatments. Thus, recent Zika outbreaks make it urgent to develop tools that rapidly discriminate these viruses in patients and trapped mosquitoes, to select the correct patient treatment, and to understand and manage their epidemiology in real time.
Unfortunately, current diagnostic tests, including those receiving 2016 emergency use authorizations and fast-track status, detect viral RNA by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), which requires instrumentation, trained users, and considerable sample preparation. Thus, they must be sent to &#34;approved&#34; reference laboratories, requiring time. Indeed, in August 2016, the Center for Disease Control (CDC) was asking pregnant women who had been bitten by a mosquito and developed a Zika-indicating rash to wait an unacceptable 2 to 4 weeks before learning whether they were infected. We very much need tests that can be done on site, with few resources, and by trained but not necessarily licensed personnel.
This video demonstrates an assay that meets these specifications, working with urine or serum (for patients) or crushed mosquito carcasses (for environmental surveillance), all without much sample preparation. Mosquito carcasses are captured on paper carrying quaternary ammonium groups (Q-paper) followed by ammonia treatment to manage biohazards. These are then directly, without RNA isolation, put into assay tubes containing freeze-dried reagents that need no chain of refrigeration. A modified form of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification with target-specific fluorescently tagged displaceable probes produces readout, in 30 min, as a three-color fluorescence signal. This is visualized with a handheld, battery-powered device with an orange filter. Forward contamination is prevented with sealed tubes, and the use of thermolabile uracil DNA glycosylase (UDG) in the presence of dUTP in the amplification mixture.

Current multiplexed diagnostics to detect Zika, chikungunya, and dengue viruses require complex sample preparation and expensive instrumentation, and are difficult to use in low resource environments. We show a diagnostic that uses isothermal amplification with target-specific strand displaceable probes to detect and differentiate these viruses with high sensitivity and specificity.

Çoğaltılmış izotermal amplifikasyon Zika, Chikungunya ve dang 1 tespit etmek için teşhis platformu dayalı

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

Biyokimya

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Zika Virüs Bulaşıcı hücre kültürü sistemine ve<em&gt; İn Vitro</emİnterferonların&gt; profilaktik etkisi

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Zika Virüsü Kullanan Aedes aegypti Sivrisineklerinde Vektör Yetkinlik Analizleri

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public health. Once ingested, the viruses must overcome the mosquito midgut barrier to reach the hemolymph, from where they might potentially spread to the salivary glands. When a mosquito bites, these viruses are spread to new vertebrate hosts. Similarly, the mosquito may pick up different viruses. In general, only a tiny portion of viruses may enter the salivary glands via the gut. The transmission efficiency of these viruses to the glands is be affected by the two physical barriers found in different mosquito species: midgut barriers and salivary glands barriers. This protocol presents a method for virus detection in salivary glands of Aedes aegypti&#39;s&#160;following oral feeding and intrathoracic injection infection. Furthermore, determining whether the guts and/or salivary glands hinder viral spread can aid in the risk assessments of MBVs transmitted by Aedes aegypti.

This methodology, which included oral feeding and intrathoracic injection infection, could effectively assess the influence of midgut and/or salivary gland barriers on arbovirus infection.

Yetişkin Sivrisineklerde Oral Beslenme ve Mikroenjeksiyon ile Deneysel Viral Enfeksiyon

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and potentially Guillain-Barr&#233; syndrome in adults. Research on ZIKV to understand the disease mechanisms is important to facilitate vaccine and treatment development. The method of quantifying viruses is crucial and fundamental in the field of virology. The focus forming assay (FFA) is a virus quantification assay that detects the viral antigen with antibodies and identifies the infection foci of cells using the peroxidase immunostaining technique. The current study describes the virus propagation and quantification protocol using both 24-well and 96-well (high throughput) formats. Compared with other similar studies, this protocol has further described foci size optimization, which can serve as a guide to expand the use of this assay for other viruses. Firstly, ZIKV propagation is performed in Vero cells for 3 days. The culture supernatant containing ZIKV is harvested and quantitated using the FFA. Briefly, the virus culture is inoculated onto Vero cells and incubated for 2-3 days. Foci formation is then determined after optimized staining processes, including cell fixation, permeabilization, blocking, antibody binding, and incubation with peroxidase substrate. The stained virus foci are visualized using a stereo microscope (manual counting in 24-well format) or software analyzer (automated counting in 96-well format). The FFA provides reproducible, relatively fast results (3-4 days) and is suitable to be used for different viruses, including non-plaque-forming viruses. Subsequently, this protocol is useful for the study of ZIKV infection and could be used to detect other clinically important viruses.

The present protocol describes the propagation of Zika virus (ZIKV) in Vero African green monkey kidney cells and the quantification of ZIKV using cell-based colorimetric immunodetection methods in 24-well and 96-well (high throughput) formats.

Virüs Yayılımı ve Hücre Bazlı Kolorimetrik Miktar Tayini

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, several traits are typically characterized using molecular assays to aid in epidemiological studies. These traits include species identification, insecticide resistance, parasite infection status, and host preference. Since populations of the Anopheles gambiae complex are morphologically indistinguishable, a polymerase chain reaction (PCR) is traditionally used to identify species. Once the species is known, several downstream assays are routinely performed to elucidate further characteristics. For instance, mutations known as KDR in a para gene confer resistance against DDT and pyrethroid insecticides. Additionally, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) or Plasmodium parasite DNA detection PCR assays are used to detect parasites present in mosquito tissues. Lastly, a combination of PCR and restriction enzyme digests can be used to elucidate host preference (e.g., human vs. animal blood) by screening the mosquito bloodmeal for host-specific DNA. We have developed a multi-detection assay (MDA) that combines all of the aforementioned assays into a single multiplex reaction genotyping 33SNPs for 96 or 384 samples at a time. Because the MDA includes multiple markers for species, Plasmodium detection, and host blood identification, the likelihood of generating false positives or negatives is greatly reduced from previous assays that include only one marker per trait. This robust and simple assay can detect these key mosquito traits cost-effectively and in a fraction of the time of existing assays.

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Sıtma verici Sivrisinekler için bir çok algılama Deneyi

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Biyoloji

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female Anopheles mosquitoes are transmitted to humans via mosquito bites during blood feeding. The presence of sporozoites in the mosquito salivary glands thus defines mosquito infectiousness. To determine whether an Anopheles mosquito carries Plasmodium sporozoites, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method has been the standard tool to detect the Plasmodium circumsporozoite protein (CSP), the major surface protein of the sporozoites. In this method, the head along with the thorax of each mosquito is separated from the abdomen, homogenized, and subjected to a sandwich ELISA to detect the presence of CSP specific to Plasmodium falciparum and each of the two subtypes, VK210 and VK247, of Plasmodium vivax.This method has been used to study malaria transmission, including the seasonal dynamics of mosquito infection and the species of the major malaria vectors in the study sites.

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

This protocol describes a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to detect salivary gland sporozoites in mosquitoes. Using easily available monoclonal antibodies, the method enables cost-effective, high-throughput detection of mosquitoes carrying Plasmodium falciparum or Plasmodium vivax. The method is suitable for malaria transmission research, including vector surveys.

Enzime Bağlı İmmünosorbent Testi Kullanılarak Anofel Sivrisineklerinde Plasmodium Sporozoitlerin Tespiti

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female ...

Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two main categories of these new mosquito-associated viruses are &#34;mosquito-borne viruses (MBVs)&#34; and &#34;mosquito-specific viruses (MSVs)&#34;. These novel viruses might be pathogenic to both vertebrates and mosquitoes, or they could just be symbiotic with mosquitoes. Entity viruses are essential to confirm the biological characters of these viruses. Thus, a detailed protocol has been described here for virus isolation and amplification from field-collected mosquitoes. First, the mosquito samples were prepared as supernatants of mosquito homogenates. After centrifugation twice, the supernatants were then inoculated into either mosquito cell line C6/36 or vertebrate cell line BHK-21 for virus amplification. After 7 days, the supernatants were collected as the P1 supernatants and stored at -80 &#176;C. Next, P1 supernatants were passaged twice more in C6/36 or BHK-21 cells while the cell status was being checked daily. When cytopathogenic effect (CPE) on the cells was discovered, these supernatants were collected and used to identify viruses. This protocol serves as the foundation for future research on mosquito-associated viruses, including MBVs and MSVs.

Numerous novel virus-like sequences have been found in mosquitoes due to the extensive use of sequencing technologies. We provide an effective procedure for isolating and amplifying viruses using vertebrate and mosquito cell lines, which might serve as the basis for future studies on mosquito-associated viruses, including mosquito-borne and mosquito-specific viruses.

Sahada Toplanan Sivrisineklerden Sivrisinek İlişkili Virüs İzolasyonu

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two ...

An In Vitro Assay to Examine the Antibody-Dependent Enhancement of Viral Infection

Source: Valiant, W. G., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/57371">A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates an assay to measure antibody-dependent enhancement (ADE) of Dengue virus infection using Zika Virus Convalescent Serum. The assay uses Dengue reporter viral particles (RVPs) encoding a green fluorescent protein. Serum antibodies against the Zika Virus cross-react with RVPs to form a complex. The bound antibodies enhance RVP uptake by cells expressing the Fc receptor, which is detected using flow cytometry.

Viral Enfeksiyonun Antikora Bağlı Artışını İncelemek İçin Bir İn Vitro Test

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Day 1
NOTE: Perform all the steps ...