Vanderbilt CTSA hibe 1 UL1 RR024975, Ulusal Araştırma Kaynakları, Ulusal Sağlık Enstitüleri için Merkezi tarafından kısmen desteklenir. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, R01 HL 83.839 tarafından finanse edildi; R01 AI 65.744.

Aşağıdaki protokolü için, ilgi hücreleri gibi periferik kan mononükleer hücreleri (hücre) kullanın. Ancak, bu protokol, diğer hücre tipleri ile kullanılabilir . Steril tekniği kullanarak bir doku kültürü kaputun içindeki tahlil gerçekleştirin. 1. Gün: Plaka ve Hücreler Hazırlık <ol><li> ELISPOT plaka çıkarın ve kaputu açın. </li><li> Varsa, aksi takdirde tek iyi pipetleme, kabul edilebilir, çok kanallı pipet kullanarak 1X PBS 150 mcL plaka, 3 kere yıkayın. </li><li> Rezervuarların bir paket çıkarın ve kaputu açın. </li><li> 2 mcg / ml yakalama antikor, anti-insan interferon-γ, 1X PBS 11 mL. Iyi Vortex. Bir rezervuar antikor karışımı aktarın. </li><li> Her biri de çok kanallı kullanarak 100 mcL kaplama çözüm yerleştirin. </li><li> Parafilm plaka sarın. </li><li> Bir gece buzdolabında tabak koyun. Plakalar hafta için iyi. Başparmak kuralı kuyuları sıvı sol hala varsa, plaka kullanılabilir olması. </li></ol> Hücre Hazırlık Sonra 37 PBMC&#39;ler taze hücrelerin sayısı ve geceleme inkübe ° C,% 5 CO 2 ile. Hücre için hücre çözülme gerekli olan, sıvı nitrojen içinde saklanır. Protokol aşağıdaki gibi: <ol><li> 37 neredeyse tamamen çözülmüş kadar ° C su banyosunda hücrelerin cryovial çözülme. </li><li> Hemen R10 medya 5 ml tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 225 x g. az 5 dakika Spin </li><li> R10 medya 5 ml yeniden süspanse edin ve tripan mavi kullanarak canlı hücreleri saymak. </li><li> R10 medya 2 x 10 6 hücre / mL konsantrasyon getir. </li><li> ° C ile% 5 CO 2 37 geceleme dinlendirin. </li></ol> 2. Gün: Plaka Oluşturmaya <ol><li> Örnek kimlik numarası, iyi şartlar, tarih ve etiket plakası kapak. </li><li> Dökümü ve blot yöntemi kullanarak, steril 1x PBS 150 mcL plaka 6 kez yıkayın. Damping ise plaka sıçrama için dikkatli olun. Bu mor plaka kuyu açmak için neden olabilir. </li><li> Her bir kuyunun R20 100 mcL ekleyin. </li><li> 37 ° C&#39;de 1 saat süreyle plaka inkübe edin. </li><li> Plaka kuluçka iken, gece dinlenmiş olan hücreleri saymak. </li><li> 1500 rpm&#39;de 5 dakika boyunca hücre süspansiyonu dönerler. Süpernatantı Durusu ve R10 medya 1mL başına 1x10 6 hücre nihai bir konsantrasyon böylece pelet tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 1 saat inkübasyondan sonra, R20 dökümü ve blot yöntemi kullanarak. Damping ise plaka sıçrama için dikkatli olun. </li><li> Her bir kuyunun 100 mcL (10 5 hücreleri) hücre çözüm ekleyin. Nüsha halinde ilgili kuyulara uygun peptidler ve / veya antijenleri ekleyin. Yeni bir pipet ucu peptid çalışma çözeltisinin içine gitmek her zaman kullanın. Normal peptid konsantrasyonu 10-40 mg / ml. Peptidler değişir bu yana, her araştırmacı, optimum sonuçlar elde etmek için peptidler titre. </li><li> Negatif kontrol kuyularda, sadece hücreleri (peptidler) </li><li> Pozitif kontrol kuyularda, fitohemaglütininle (10 mg / ml; Sigma PHA) ekleyin. </li><li> Gece 37 ° ° C&#39;de% 5 CO 2 (~ 18 saat). </li></ol> 3. Gün: Plaka Geliştirilmesi <ol><li> Dökümü ve blot yöntemi kullanarak 150 mcL 1xPBS plaka 6 kez yıkayın. </li><li> Plaka kanallı pipet kullanarak her bir kuyunun 100 mcL PBS ekleyin. </li><li> 15 dakika boyunca buzdolabında plaka koyun. </li><li> Buzdolabı plakasını alın ve doku kültürü kaputu yerleştirin. </li><li> Biotin antikor çözüm hazırlayın <ul><li> 11mL PBS 0.5 mikrogram / mL biotin antikor (MAB 7-B6-1) ekleyin. </li><li> Vortex iyice karıştırın çözüm. </li><li> Eğer çok kanallı bir çözüm eklemek için planlama, bir rezervuar içine dökün. </li></ul></li><li> Çöp sepeti içine Flicking PBS atın. Damping ise plaka sıçrama için dikkatli olun. </li><li> 100 mcL çözüm her bir kuyunun içine yerleştirin. </li><li> Bir saat boyunca oda sıcaklığında doku kültürü kaputu plaka inkübe edin. </li><li> Dökümü ve blot yöntemi kullanarak 150μL 1xPBS plaka 6 kez yıkayın. Streptavidin antikor hazırlanmış kadar 6. yıkama, PBS plaka üzerinde bırakın. </li><li> Streptavidin antikor hazırlayın. <ul><li> 11mL PBS (1:2000 dilüsyon) 5.5 μ l Streptavidin antikor (Streptavidin ALP) ekleyin. </li><li> Vortex iyice karıştırın çözüm. </li><li> Eğer çok kanallı bir çözüm eklemek için planlama, bir rezervuar içine dökün. </li></ul></li><li> PBS kuyulardan kalan atın ve plaka kurulayın. </li><li> Streptavidin çözüm her bir kuyunun 100 mcL ekleyin. </li><li> 1 saat oda sıcaklığında doku kültürü kaputu plaka inkübe edin. </li><li> Plakalar PBS dökümü ve blot yöntemi ile 6 kez yıkayın. Renk çözüm yaptık kadar 6. yıkama, plaka PBS bırakın. </li><li> Karanlıkta çalışın. Alkalen fosfataz substrat çözeltisi (Alkalin Fosfataz Yüzey Kit IV BCIP / NBT) hazırlayın: <ul><li> Substrat reaktif 1-11 ml Tris tamponu, iyi vorteks 4 damla ekleyin. Tris tamponu, iyi vorteks substrat reaktif 2 4 damla ekleyin. Tris tamponu, iyi vorteks substrat reaktif 3 4 damla ekleyin. </li></ul></li><li> Kalan PBS atın ve plaka kurulayın. </li><li> Plaka çok kanallı kullanarak her bir kuyu için renk çözüm 100 mcL ekleyin. </li><li> 5 ila 10 dakika renk geliştirdikten sonra ışığı açın. </li><li> Mor lekeler açmak için başlar ve oldukça koyu renk reaktifleri kadar plaka kalmasına izin verin. Bu yerden 5 ila 20 dakika sürer. Bunu yaparken yüksek arka plan neden olabilir, çünkü çok uzun substrat çözeltisi bırakmayacak şekilde dikkatli olun. </li><li> ELISPOT plaka 3 kez musluk suyu ile yıkayın. </li><li> Yaklaşık bir saat veya gece boyunca kurumaya bırakın. </li><li> Elle veya ELISPOT plaka okuyucu ile plaka okuyun. </li><li> Işığa maruz plaka uzak bir kutu içinde saklayın. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar: ELISPOT mikrobiyal antijenlere karşı bağışıklık tepkileri ölçmek için tasarlanmıştır. Her nokta, tek bir yanıt veren hücre ilgi sitokin ifade gösterir. Noktalar elle veya bir ELISPOT plaka okuyucu kullanarak sayılabilir. ELISPOT doğru yapılmış olduğunu Değerlendirme arka plan ilgi sitokin üretimi için negatif kontrol soruşturma ile başlamalıdır. Küçük bir arka plan (mor renkli) olabilir, ancak negatif kontrol kuyularında bir noktalar görmeyi bekliyorum. Tipik olarak, bir de başına beş noktalar ortalamasından daha az olmalıdır. Pozitif kontrol kuyuları tepki doğru olduğunu onaylayın ve hücrelerin antijenik stimülasyon duyarlı olduğunu. Pozitif kontrol kuyularında noktalar k (fiekil 1) bir izdiham nedeniyle derin bir mor arka planı görmek için beklenebilir. Hiçbir beyaz arka plan az olmamalıdır. Pozitif kontrol ve negatif kontrol örnekleri uygun değilse, bir sonra ilgi antijen içeren kuyu güvenebilirsiniz. &quot;Optimal&quot; sonucu yüksek arka plan (kuyu mor), hiçbir noktalar ya da çok az sayıda lekeler, boş merkezi, yetersiz tanımlanmış noktalar veya confluent lekeler yansıması olacaktır. Sorun giderme ipuçları listesi (Tablo 1). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/2221/2221fig1.jpg" /> Şekil 1 ELISPOT plaka bir temsilcisi. Her plaka pozitif kontrol, negatif kontrol ve en az iki kuyularda yapılan faiz peptid içermelidir. Koyu mor bir renk, konfluent hücreleri ve neredeyse hiç beyaz bir arka plan var gördüğünüz gibi C9, C10, D9 ve D10, pozitif kontrol kuyuları vardır. Negatif kontrol kuyuları, G11, G12, H11 ve H12. Bu kuyular mor bir arka plan ve beklendiği gibi herhangi bir noktalar var. Noktalar G7, G8, H7 ve H8, mikrobiyal peptidler hücresel yanıtları göstermek mor lekeler ilgi sitokin ifade eden bir tek duyarlı hücre temsil eder. Tablo 1 <table border="1"><tbody><tr><td> Gözlem </td><td> Olası Sorun </td><td> Olası Çözüm </td></tr><tr><td> Yüksek arka plan </td><td> 1. Membran Her iki taraf da doğru yıkanmış değil 2. Çok sayıda hücre salgılayan sitokin 3. Plaka düzgün kurutulmuş yanlış 4. Aşırı gelişmiş plaka </td><td> 1. Renk gelişimi öncesi ve sonrası, distile su ile zarının her iki taraf yıkayın. Reaktifler zarından plaka taban içine sızabilir ve yıkanıp değilse bu yüksek arka plan neden olabilir. 2. De her bir hücre sayısını azaltın, bu optimizasyon gerekecektir 3. Okumadan önce plaka uzun Kuru 4. Gelişmekte olan zamanı azaltın </td></tr><tr><td> Çok az lekeler / Spotlar yok </td><td> 1. Salgılayan sitokin / ilgi protein, yeterli hücre 2. Doğru hücreler uyarılır olun 3. L inkübe hücreleryeterli ong veya uyarıcı cevap vermek için zaman alabilir 4. Yetersiz renk gelişimi 5. Yeterince birincil ya da ikincil antikoru </td><td> 1. Hücre sayısını artırın. Bu optimizasyon gerekecektir 2. Ayrıca olumlu bir stimülasyon kontrol sitokin / ilgi protein ifadesi neden olacak bildiğiniz bir uyarıcı - 3. Hücre inkübasyon süresi artırın veya dolaylı yöntemi (uyarıcı tedavi ile ön hücreleri) kullanabilirsiniz 4. Havai bir mikroskop ile renk gelişimini izlemek ve gelişmekte olan reaktiflerin doğru saklanır ve aktivite kayıp değil sağlamak 5. Birincil ve / veya sekonder antikor konsantrasyonu artırılması gerekmektedir. Bu optimizasyon gerektirir. </td></tr><tr><td> Boş Alanları </td><td> 1. Membran önceden tedavi edilmezse 2. Membran bazı aşamada kuruduktan 3. Hücreler dengesiz dağıtılmış </td><td> 1. Emin olun zarı yeterince% 70 etanol (membranlar bu tedarikçi ile kontrol gerekmez) ile ön işlem. Daha sonra PBS 3X ile iyice yıkayın 2. Membran kuru değildir olun 3. Kuyulara pipetleme önce iyi bir homolog hücre süspansiyonu hücreler yavaşça karıştırınız olun </td></tr><tr><td> Boş Merkezi </td><td> 1. Yıkama hasar </td><td> 1. Otomatik yıkama (ya da pipetleme) Akış hızı çok yüksek olabilir. Daha yumuşak bir yıkama prosedürü ihtiyacınız var </td></tr><tr><td> Yanlış Pozitif </td><td> 1. Sekonder antikor agrega 2. Hücreler hala membran 3. Hücre kültürü kirlenmesine </td><td> 1. Filtre ikincil antikor 2. Tüm hücreleri sekonder antikoru inkübasyon önce PBS Tween 20 ile membran yıkanır olun. Membran sol hücreler düzensiz şekilli noktalar verecektir 3. Reaktifler steril ve mümkün olduğunca temiz tutun. Hücre kültürü tekniği steril olduğundan emin olun. Bir medya negatif kontrol çalıştırarak yanlış pozitif olup olmadığını kontrol edin. Plaka hareket için, <a href="http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&amp;rid=11457#7">yetersiz tanımlanmış noktalar</a> </td></tr><tr><td> Konfluent Spotlar </td><td> 1. Zavallı kaplama, çok fazla antikor 2. Uzun süreli hücre kültürü 3. Hücreleri üzerinde uyarılmış </td><td> 1. Primer antikor konsantrasyonunu azaltacak 2. Hücrelerin ne kadar uzun süre inkübe edilir, daha fazla sitokin / protein salgılanır. Bu birleştirme ve ayırt edilemez hale başlayacak büyük noktalar neden olacaktır. 3. Hücre kültürü adım inkübasyon süresi azaltın. Aşırı stimülasyon sitokin / hücre tarafından salgılanan protein bir sürü neden olacaktır. Bu birleştirme ve ayırt edilemez hale başlayacak noktalar üretecektir. Kısa bir zaman miktarı için, kültür ortamı veya kültür uyarıcı miktarını azaltın </td></tr><tr><td> Yeteri kadar Tanımlı Spotlar </td><td> 1. Membran önişlemden (membran gerektiriyorsa, tedarikçi ile kontrol) 2. Hücre inkübasyon sırasında Plaka hareketi </td><td> 1. Membran, etanol ya da bu bulanık, kötü tanımlı noktalar yol açabilir önceden tedavi edilmelidir. Okuyucu bu ayırt etmek zor olacak 2. Taşındı hücrelerin birden fazla spot yaratacaktır plaka hücre inkübasyon sırasında taşımak için izin vermeyin. İnkübasyon sırasında açılmayacaktır adanmış bir inkübatör kullanmak. Plak hücreler ekledikten sonra dokunmayın </td></tr><tr><td> Pozitif Kontrol kuyuları düşük. </td><td> 1. Azgelişmişlik - oda sıcaklığına getirilmelidir henüz Streptavidin-ALP ve / veya BCIP / NBT çözümleri kullanarak bir sonucu olabilir </td><td> 1. Reaktifler kuyulardan eklemeden önce oda sıcaklığına getirin </td></tr><tr><td> Yoğunluk lekelerin zor onları ölçmek için yapar </td><td> 1. Çok sayıda hücre kuyulara ilave edildi </td><td> 1. Ayrı lekelerin oluşumuna neden olacaktır hücre optimal sayısını belirlemek için hücre dilüsyonları (yani, 1 de ortalama x 10 6, 5 x 10 5, 1 x 10 5, 5 x 10 4, 1 x 10 4 hücreleri) </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>Dosanjh, D. P., Hinks, T. S., Innes, J. A., Deeks, J. J., Pasvol, G., Hackforth, S., Varia, H., Millington, K. A., Gunatheesan, R., Guyot-Revol, V., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+diagnostic+evaluation+of+suspected+tuberculosis.">Improved diagnostic evaluation of suspected tuberculosis.</a> Ann Intern Med. 148, 325-336 (2008).</li><li>Sung, H. K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+abdominal+tuberculosis+by+T-cell+based+assays+on+peripheral+blood+and+peritoneal+fluid+mononuclear+cells.">Diagnosis of abdominal tuberculosis by T-cell based assays on peripheral blood and peritoneal fluid mononuclear cells.</a> Journal of Infection. 59, 409-415 (2009).</li><li>Kim, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+Central+Nervous+System+Tuberculosis+by+T-Cell-Based+Assays+on+Peripheral+Blood+and+Cerebrospinal+Fluid+Mononuclear+Cells.">Diagnosis of Central Nervous System Tuberculosis by T-Cell-Based Assays on Peripheral Blood and Cerebrospinal Fluid Mononuclear Cells.</a> Clinical and Vaccine Immunology. , 1356-1362 (2008).</li><li>Drake, W. P., Dhason, M. S., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Vadivelu, S., Hajizadeh, R., Newman, L. S., Kalams, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+recognition+of+Mycobacterium+tuberculosis+ESAT-6+and+KatG+peptides+in+systemic+sarcoidosis.">Cellular recognition of Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 and KatG peptides in systemic sarcoidosis.</a> Infect Immun. 75, 527-530 (2007).</li><li>Allen, S. S., Evans, W., Carlisle, J., Hajizadeh, R., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Pride, D. T., Johnson, J. E., Drake, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+dismutase+A+antigens+derived+from+molecular+analysis+of+sarcoidosis+granulomas+elicit+systemic+Th-1+immune+responses.">Superoxide dismutase A antigens derived from molecular analysis of sarcoidosis granulomas elicit systemic Th-1 immune responses.</a> Respir Res. 25, 36-36 (2008).</li><li>Mutsvangwa, J., Millington, K. A., Chaka, K., Mavhudzi, T., Cheung, Y. B., Mason, P. R., Butterworth, A. E., Corbett, E. L., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+recent+Mycobacterium+tuberculosis+transmission+in+the+setting+of+high+HIV+and+TB+burden.">Identifying recent Mycobacterium tuberculosis transmission in the setting of high HIV and TB burden.</a> Thorax. 65, 315-320 (2010).</li><li>Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+IFN-gamma+Elispot+assay+in+HIV+vaccine+research.">The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research.</a> Nat Protoc. 4, 461-469 (2009).</li><li>Chaudhary, N., Staab, J. F., Marr, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthy+human+T-Cell+Responses+to+Aspergillus+fumigatus+antigens.">Healthy human T-Cell Responses to Aspergillus fumigatus antigens.</a> PLoS One. 5, e9036-e9036 (2010).</li><li>Manigold, T., Mori, A., Graumann, R., Llop, E., Simon, V., Ferr, S. M., Valdivieso, F., Castillo, C., Hjelle, B., Vial, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+differentiated,+resting+gn-specific+memory+CD8++T+cells+persist+years+after+infection+by+andes+hantavirus.">Highly differentiated, resting gn-specific memory CD8+ T cells persist years after infection by andes hantavirus.</a> PLoS Pathog. 6, e1000779-e1000779 (2010).</li><li>Ndongala, M. L., Kamya, P., Boulet, S., Peretz, Y., Rouleau, D., Tremblay, C., Leblanc, R., C&#244;t&#233;, P., Baril, J. G., Thomas, R., V&#233;zina, S., Boulassel, M. R., Routy, J. P., S&#233;kaly, R. P., Bernard, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+function+of+HIV-specific+T-cell+responses+with+increasing+time+from+infection.">Changes in function of HIV-specific T-cell responses with increasing time from infection.</a> Viral Immunol. 2, 159-168 (2010).</li></ol>

ELISPOT testi insanlarda bağışıklık yanıtlarını izlemek için en önemli ve en yaygın olarak kullanılan testlerin biri olarak ortaya çıktı ve diğer türlerin bir çeşitlilik vardır. ELISPOT testi ile, bağışıklık hücre frekansları hücre popülasyonlarının genişleme veya manipülasyon olmadan tek hücre düzeyinde ölçülebilir. ELISPOT testinin yaygın enfeksiyon, kanser, alerji ve otoimmün hastalıklar da dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda antijen spesifik bağışıklık yanıtlar?...

A. Medya hazırlanması <img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsA.jpg" alt="Malzeme A" /> Tris Buffer B. Hazırlık <ol><li> GKD 2 O 800 ml, 1 L beher ekleyin . </li><li> Tris 12 gram ölçün ve beher ekleyin. </li><li> Behere: magnezyum klorür hekzahidrat 0.12 gram (6H 2 O MgCl 2) ekleyin. </li><li> Otomatik karıştırma plaka üzerinde manyetik karıştırma çubuğu ile karıştırın. </li><li> Bir kez 9,5 pH, çözünmüş. </li><li> 1000ml için o kadar getirerek, GKD 2 O 200 ml beher ekleyin. </li><li> 0.22 mikron filtre ile çözüm Filtresi. </li></ol> ELISPOT analiz için gerekli olan C Malzemeler: <img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsb.jpg" alt="Malzeme Yatak" />

enzyme-linked immunospot assay (elispot):  quantification of th-1 cellular immune responses against microbial antigens

Adaptif bağışıklık hücre içi patojenlerin temizlenmesi için önemli bir bileşenidir. İnsanlarda bu tepkileri algılamak ve ölçmek için yeteneği önemli bir tanı aracıdır. Enzyme-linked immünospot assay (ELISPOT), transplantasyon ile HIV enfeksiyonu olanlar gibi bağışıklık sistemi baskılanmış popülasyonları ve steroid kullanımı da dahil olmak üzere, mikrobiyal antijenlere karşı hücresel immün yanıtları belirlemeye kabiliyetini popülerlik kazanıyor. Bu test spesifik mikrobiyal antijenlere karşı bağışıklık yanıtları yanı sıra, bu yanıtları karakter Th1 veya Th2 ayırt ölçmek için kapasitesine sahiptir. ELISPOT inflamasyon site ile sınırlı değildir. Bu onun yeteneği yanı sıra periferik kan, bronkoalveoler lavaj, beyin omurilik sıvısı ve assit olarak aktif katılımı siteleri içinde bağışıklık yanıtlarını değerlendirmek için çok yönlüdür. Tek veya birden fazla antijene karşı bağışıklık yanıtlarını tespiti mümkündür yanı sıra mikrobiyal proteinler içinde belirli epitoplar. Bu testte, zamanla bağışıklık yanıtlarını tespiti yanı sıra konak T hücreleri tarafından tanınır antijenleri ayrımlar kolaylaştırır. Çift renkli ELISPOT testleri aynı anda iki sitokinlerin ifade tespiti için kullanılabilir. Bu teknik için yeni uygulamalar ekstrapulmoner tüberküloz tanısı yanı sıra otoimmün hastalıklar bulaşıcı antijenlerin katkısının araştırılması.

Watch this Scientific Journal Video about Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens at JoVE.com

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptif bağışıklık idiyopatik hastalıklar mikrobik hedeflerin belirlenmesi, enzim bağlı immünospot testinin kullanımı yapılabilir.

Enzim-linked immünospot Testi (ELISPOT): Th-1 Mikrobiyal antijenlere karşı hücresel immün cevaplar Kantitasyonu

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

enzyme-linked-immunospot-assay-elispot-quantification-th-1-cellular

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

34.7K Görüntüleme.  Vanderbilt University School of Medicine. Adaptif bağışıklık idiyopatik hastalıklar mikrobik hedeflerin belirlenmesi, enzim bağlı immünospot testinin kullanımı yapılabilir.

Video: Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

Human Papillomavirüs Roman T hücre epitopları Karakterizasyonu için interferon-γ Enzim bağlı immünospot Assay Kullanımı

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified concurrent distribution of more than two components within biofilms because: 1)&#160;selection of fluorescent dyes having minimal spectral overlap is complicated, and 2)&#160;quantification of multiple fluorochromes poses a multifactorial problem. Objectives: Report a methodology to quantify and compare concurrent 3-dimensional distributions of three cellular/extracellular components of biofilms grown on relevant substrates. Methods: The method consists of distinct, interconnected steps involving biofilm growth, staining, CLSM imaging, biofilm structural analysis and visualization, and statistical analysis of structural parameters. Biofilms of Streptococcus mutans (strain UA159) were grown for 48 hr on sterile specimens of Point 4 and TPH3 resin composites. Specimens were subsequently immersed for 60 sec in either Biot&#232;ne PBF (BIO) or Listerine Total Care (LTO) mouthwashes, or water (control group; n=5/group). Biofilms were stained with fluorochromes for extracellular polymeric substances, proteins and nucleic acids before imaging with CLSM. Biofilm structural parameters calculated using ISA3D image analysis software were biovolume and mean biofilm thickness. Mixed models statistical analyses compared structural parameters between mouthwash and control groups (SAS software; &#945;=0.05). Volocity software permitted visualization of 3D distributions of overlaid biofilm components (fluorochromes). Results: Mouthwash BIO produced biofilm structures that differed significantly from the control (p&#60;0.05) on both resin composites, whereas LTO did not produce differences (p&#62;0.05) on either product. Conclusions: This methodology efficiently and successfully quantified and compared concurrent 3D distributions of three major components within S. mutans biofilms on relevant substrates, thus overcoming two challenges to simultaneous assessment of biofilm components. This method can also be used to determine the efficacy of antibacterial/antifouling agents against multiple biofilm components, as shown using mouthwashes. Furthermore, this method has broad application because it facilitates comparison of 3D structures/architecture of biofilms in a variety of disciplines.

A protocol for the concurrent quantification and comparison of three cellular and extracellular components within biofilms is presented. The methodology involves the use of confocal laser scanning microscopy, biofilm structural analysis and visualization software, and statistical analysis software.

Hücresel ve Biyofilmler Ekstrasellüler Bileşenleri Eşzamanlı Kantitasyonu

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

Sığırlarda Efektör ve hafıza T Hücre Yanıtları değerlendirilmesi için uzun vadeli kültürlü İnterferon-γ Enzim-linked immünospot Testi Uygulaması

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Enzim-linked Lektin Testi tarafından Grip Nöraminidaz İnhibisyon antikor titreleri Ölçme

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Geliştirme ve doğrulama vericiyi bir tek molekül dijital enzim bağlı Immunosorbent Assay insan Interferon-α için dizi

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

Timus bağlı ve timus bağımsız immünglobulin izotip yanıt Immunosorbent Assay enzim bağlı kullanarak farelerde karakterizasyonu

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

En iyi duruma getirilmiş Interferon-gamma ELISpot tahlil ölçü birimi T hücre yanıtları sonrasi hipererjik eskiden şiling şimdi domuz modelinde

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Ana bilgisayar-patojen yanıt ve aşı etkinliği farelerde değerlendirilmesi

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic öldürme tahlil bakteriyel patojenlere karşı immünolojik yanıt değerlendirmek için

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...