Bu derlemede, Ulusal Sağlık hibe Enstitüleri, AI074420-02, Burroughs Wellcome Araştırmacı Ödülü, BKC için Hirschl&#39;ın Kariyer Bilim Adamı Ödülü ve NSF Biophotonics Bilim ve Teknoloji Merkezi, Kooperatif Sözleşmesi PHY012099, TH UCD Sağlık Sistemi Araştırma Ödülü tarafından desteklenen UCD CTSC NCRR ULRR024146.

Bu yöntem bildirilen araştırma <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1743">Hübner ve ark Bilim 323: 1743-1747 (2009)</a> . 1. Genel bakış HIV hücre-hücre yayılmasını başlangıçta donör hücreleri ve birincil CD4 + T lenfositleri acceptor hücreleri 1,2,3 olarak HIV ile enfekte Jurkat hücreleri kullanılarak tarif edilmiştir. Bu çalışmalarda, virüs sabit hücrelerin antikor boyama ile tespit edildi. Canlı hücrelerde virüs hücreye transfer izlemek için, biz HIV, HIV Gag-iGFP 4 olarak adlandırılan bir rekombinant, bulaşıcı moleküler klon istifade eder. MA ve CA etki alanları arasında Gag protein dahili takılı yeşil floresan proteininin (GFP) taşır. HIV Bu moleküler klon yardımcı virüs için gerek kalmadan enfektivite korur. Bu klon yapılan virüs partikülleri stoichiometrically hücreleri arasındaki viral montaj ve transfer izlemek için güçlü bir floresan bir sinyal sağlayarak, yeşil floresan protein ile yüklenir. Ile birlikte kullanıldığında asal hücre izleme floresan boyalar, alıcı hücreleri girdi donör hücreleri ayrımcılık ve bir HIV virüslü bir T hücre bulaşmamış T hücre 5 transfer görselleştirmek için izin olabilir. Mühürlü bir gaz geçirgen görüntüleme odasında kültüre ise Virolojik sinaps oluşumu ve sonra virüs bir hücreden diğerine transferi canlı hücreler görülebilir. (Gün 1) 2. HIV Gag iGFP hazırlanması Jurkat T Hücreler transfekte <ol><li> Dikkatle 2 x 10 5 ve 8 x 10 5 hücreleri / Jurkat kültür medya (RPMI 1640,% 10 fetal sığır serumu ml arasında konsantrasyonda hücreleri koruyarak insan CD4 + T hücre hattı Jurkat (ATCC, Manassas, VA) hazırlayın . 100 ünite / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin). Başarının Anahtarı: 8 x 10 5 hücre / mL aşan konsantrasyonlarda Jurkat hücreleri Kültür transfeksiyon verimliliğinde bir azalmaya neden olacaktır. Not: aşağıda açıklandığı gibi HIV Gag-iGFP proviral DNA T hücrelerine, bir çoğaltma yetkin insan immün yetmezlik virüsü üretim sonuçları transfeksiyon. Bunun gibi, bütün işlemleri sertifikalı biyogüvenlik düzeyi 2 + veya biyogüvenlik seviye 3 (BL2 + / BL3) doku kültürü odası, sadece eğitimli laboratuar personel tarafından yapılmalıdır. İş görüntüleme tesislerinde bulaşıcı HIV ile yerel kurumsal biyogüvenlik ofisi tarafından onaylanması gerekir. </li><li> Amaxa nucleofection yöntemi (Lonza, Walkersville, MD) kullanarak viral plazmid, HIV Gag-iGFP Jurkats Transfect. 150 10 dakika süreyle santrifüj yoluyla Pelet 5 x 10 6 hücre x g. Süpernatant aspire ve steril fosfat hücrelerin yıkayın tamponlu salin (PBS). Hücreler santrifüj ve üreticinin ek içeren, önceden ısıtılmış nucleofector çözüm V 97 mcL pelet tekrar süspansiyon. Hücre süspansiyonu plazmid endotoksin ücretsiz HIV Gag-iGFP (1 mcg / ml) üç mcL ekleyin ve hafifçe karıştırın. G-18 programı kullanarak, bir küvet ve nucleofect hücre süspansiyonu aktarın. Hemen antibiyotik olmadan prewarmed Jurkat kültür ortamı 3 mL hücrelere aktarın. </li><li> CD4 + hedef hücreleri virolojik sinaps için hazırlamak için, standart bir Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, İsveç) protokolünü kullanarak buffy kat insan periferik kan mononükleer hücreleri edinin. CD4 + T hücreleri, daha sonra olumsuz bir manyetik boncuk izolasyon kiti (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) kullanılarak seçilir. Bu cryogenically donma medya 5 x 10 6 cells/500 mcL (% 90 fetal sığır serum/10% DMSO) hacimde sıvı N2 saklanabilir. Çözülmüş birincil CD4 + T hücrelerinin IL-2 10 adet / ml ile desteklenmiş RPMI% 10 FBS, kültür. </li></ol> (2. Gün) 3. HIV Gag-iGFP ve Floresan Boyalar ile Hedef Hücreler boyanması ile transfekte Jurkats Canlı Hücreler Kurtarma <ol><li> Jurkat hücreleri gecede transfeksiyon kurtarmak için izin verin. Sonra bir Ficoll hypaque yoğunluk gradiyenti malzeme üzerinde santrifüj hücresel enkaz kaldırmak. 1.5 ml, 15 ml konik bir tüp alt Ficoll-Paque koyun. Yavaşça RPMI bir 5 ml hacminde transfekte Jurkats bu degrade malzeme kaplaması. Fren kapalı olarak oda sıcaklığında, 20 dakika boyunca 400 xg&#39;de hücreler santrifüjleyin. Dikkatle bir pipet kullanarak medya / Ficoll arayüzü hücreleri kaldırmak. Yeni bir 15 ml konik tüp aktarabilirsiniz. 10 dakika için 300 xg&#39;de toplam hacmi 15 ml ve santrifüj RMPI ile hücreler sulandırınız. Iyi bir 2 cm (6 sıra plaka) 3 mL Jurkat kültür ortamı pelletini tekrar ve hücrelerin doku kültürü inkübatör dönün. </li><li> Donör hücreleri hedef hücreleri, hücre-hücre transferi deneyleri ayırt etmek için prelabel CD4 + floresan boya ile hedef hücreler. İlköğretim CD4 + T hücreleri bile etiketliKullanmadan önce ing. Biz CellTracker ve CellTrace boyalar (Invitrogen, Carlsbad, CA) ile mükemmel bir başarı etiketleme T hücreleri oldu. Boya konsantrasyonu ve inkübasyon süreleri, özellikle kullanılan boya ve hücre tipine bağlı olarak optimize edilmesi gerekir iken, bir temsilci protokolü izlemektedir. Pelet 4 x 10 6 birincil CD4 + T 10 dakika için 400 xg&#39;de iplik hücreleri. 2 mL PBS 5 ml PBS ve tekrar süspansiyon hücreleri yıkayın. Nihai konsantrasyonu 1.5 mcM CellTracker Orange (CMTMR, Invitrogen, Carlsbad, CA) ve 37 ° C&#39;de 20 dakika inkübe edin. 8 mL komple Jurkat medya ekleyin ve 10 dakika için 400 xg&#39;de santrifüj. 3 ml, 10 adet / ml, IL-2 ve geceleme doku kültürü inkübatörde ile desteklenmiş tam medya hücrelerin tekrar </li></ol> (Gün 3) 4. Canlı Hücre Görüntüleme kullanarak HIV İzleme Hücre-hücre Transfer Gag-iGFP Biz rutin HIV Gag-iGFP transfekte Jurkat hücreler 48 saat sonrası transfeksiyon kullanabilirsiniz. Ancak, 24 saat gibi erken bir sürede başarıyla hücreleri kullanılır, ve 72 saat sonrası transfeksiyon gibi geç. <ol><li> Yaklaşık 48 saat sonrası transfeksiyon, HIV Gag iGFP ifade Jurkats CO ile yıkanmış sayılır 2 bağımsız medya (Invitrogen, Carlsbad, CA), ve canlı hücre görüntüleme medya (CO 2 bağımsız medya,% 10 fetal sığır serumu, yeniden süspanse 1-3 x 10 7 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyon az 100 U / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin, 10 adet / ml, IL-2). </li><li> Benzer bir şekilde, yıkama ve 1-3 x 10 7 hücre / ml canlı hücre görüntüleme medyada bir konsantrasyon etiketli birincil CD4 + T hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Mix HIV Gag-iGFP-transfekte Jurkats birincil CD4 + T hücreleri tedavi doku kültürü, gaz geçirgen, microchamber (Ibidi, Verona, WI) bir 1:2 veya 1:03 oranında ve yük. Örneğin, HIV Gag-iGFP transfekte Jurkats etiketli birincil CD4 + T hücrelerinin yüzde 40 mcL ile 20 mcL karıştırın. Bu karışımı 50 mcL Ibidi odasına yerleştirin ve fişler ile donatıldı mühür. Fişleri, fiş / Ibidi odasına arayüzü ile parafilm sararak sabitleyin. </li></ol> 5. Mikroskopi platformlarda dikkat edilmesi gereken noktalar: dönen disk konfokal görüntüleme Hücreleri ile bir Ibidi görüntüleme odasına yerleştirdikten sonra, derhal cihazı ters bir optik mikroskop (iX71 Olympus, Merkez Vadisi, PA) üzerine monte edin. Ibidi odasında sadece uygun güvenlik kıyafetler giyiyor BL2 + eğitilmiş laboratuvar personeli tarafından mikroskop transfer edilmelidir. Canlı hücre görüntüleme genellikle istikrarlı bir 37 ° C çevre korumak için pahalı inkübasyon odaları kullanmasına rağmen, bu bir T-tipi termokupl ucu ile birlikte basit ve ekonomik bir termostatik ısıtıcı (ASI 400, Nevtek, Williamsville, VA) kullanılarak elde edildi yanına monte Uygun sıcaklık geri bildirim için örnek. CO 2-bağımsız medya CO 2 odasının kullanımı kaçınarak, yüksek hücre canlılığı korumak sağlar bulduk . Oda sıcaklığı dalgalanmalara karşı platformu tampon ve arka plan oda ışığı engellemek için, büyük bir siyah kefen sistemi etrafında yalıtımlı bir hava cebi oluşturarak tüm mikroskop / ısıtıcı kurulum üzerinde bol dökümlü. Bu, sıcaklık değişimi ve ilişkili sıcaklık ile ilgili örnek sürüklenme büyük ölçüde azaltır, ama 30 dakika boyunca örnek montaj önce ön ısıtma gerektirir. 6. Veri Toplama, Transfer ve Görüntü İşleme Görüntüler yüksek sayısal açıklık (NA) büyük ölçüde çözünürlüğünü artırır olarak bir 60x 1.42 NA immersiyon yağı amacı (UPlanApo N, Olympus) kullanılarak alınır. 3D konfokal görüntüler oluşturmak için, tarama aynı anda tarama hızını önemli ölçüde artırmak için&gt; 800 konfokal noktalar kullanan dönen bir disk konfokal birimi (CSU-10, Yokagawa, Japonya) tarafından yapılır. Hızı, CSU-10 photobleaching ve fototoksisite azaltır hızlı, düşük ışık koşullarında görüntüleme izin için çok hassas bir elektron çarparak ücret çiftli cihazı (EMCCD, IXON + 897, Andor Technologies, İrlanda) kamera ile eşleştirilmiş. Iltifat için Floresan ışık kaynağı bir tarafından seçilen istenen dalga boyunda (488 nm) ve lazer güç mikroskop objektif (&lt;1 mW) hemen önce ölçülen dalga boyu çok ArKr iyon gaz lazer (Innova 70C, Tutarlı, Santa Clara) acousto optik ayarlanabilir filtre (AOTF), (Andor Teknolojileri). Daha photobleaching azaltmak ve toplam görüntüleme süresini uzatmak için, hızla AOTF (mikrosaniye) yeni elde edilen bir görüntüyü CCD (15-30 ms maruz) teslim ederken kamera (10-20 ms) devre dışı lazer ışını her zaman kapanır. bilgisayara. Lazer ışığı 405/488/568/647 dört bant dikroik ayna (Semrock, Rochester, NY) ile dönen disk sistemi birleştirilmiştir. Floresans emisyon 525/50 bant geçiren bir filtre tekerlek (Ludl Elektronik Ürünler, Hawthorne, NY) içinde bir filtre (Semrock) süzülür monte bEMCCD kamera ve konfokal dönen disk ünitesi etween. Z-evre (Mad City Labs, Madison, WI) dahil olmak üzere tüm donanım ve satın alma, Andor iQ v1.8 yazılımı tarafından kontrol edilir. 1,2-1,9 etrafında ikinci 3D görüntü yığınlarının satın alma hızını en üst düzeye çıkarmak için, hücre çifti hemen alan EMCCD kamera kayıt bölgesi kırpmak. Ayrıca, bazı bilgiler z pahasına, 0,45-0,75 mikron arasında büyük bir z adım satın alma hızlandırmak için kullanılır. Bu koşullar altında Görüntüleme 6 saate kadar sürebilir sürekli 20-60 dakika segmentleri kullanarak minimum photobleaching. Toplamda, her bir veri parçası genellikle 5-20 GB, on binlerce görüntü alınır alanı kaplar. Büyük veri dosyaları taşıma ve analizi kolaylaştırmak için, her bir satın alma seti Andor iQ v1.8 yazılımı kullanarak 1 Gb TIFF görüntü dosyası kesimleri olarak parçalanır ve ihraç edilmesi gerekiyor. Burada, birçok mükemmel yazılım paketleri Metamorph, Volocity ve ImageJ (biz onun varyasyon Fiji öneririz) gibi görüntü analizi için kullanılabilir. Iki floresan belirteçlerinin izlenebilir zaman, biz aynı anda bir satın alma düşürmeden her ikisi de rekor &quot;split screen modu.&quot; Her iki işaretleri, bir seferde iki farklı ArKr lazer çizgileri (genellikle 488 ve 568 nm) heyecan duyuyoruz. EMCCD kamera iki farklı görüntü ayıran bir görüntü splitter (OptoSplit II, Cairn, Kent, UK) önce doğrudan yerleştirilebilir. Her görüntü daha sonra bağımsız bir kez &quot;bölünmüş ekran&quot; etkisi yaratmak kamera floresan filtreleri (Semrock) ve öngörülen yan yana süzülür. Bu daha sonra manuel kırpma ve daha sonra görüntü işleme görüntü hizalayarak gerektirecektir. 7. Görüntü İşleme ve Veri Analizi dikkat edilmesi gereken noktalar Biz genellikle Volocity (Perkin Elmer, Waltham, MA), Macintosh bilgisayarlarda (Apple, Inc.) Görüntü analizi gerçekleştirmek. Dönen disk lazer konfokal mikroskobu görüntüleri ilk sonra Volocity ile deconvolved, photobleaching için doğru yoğunluğu ayarlanır. Gag puncta yoğunluğu ölçüm ve izleme Volocity Niceleme modülü ile yapılır. Önceden oluşmuş bir sinaps göre hareket hesaplanması gereken görüntü setleri için, otomatik bir izleme algoritması, tüm dizi boyunca sinaptik düğmesine izler istihdam edilmektedir. Otomatik parça seçme yazılımı tarafından tanımlanan faiz bölgelerin Elle muayene, yazılım, istenilen nesneyi doğru takip doğrulamak için yapılmalıdır. Çevredeki nesnelerin kontrastı çok zayıf nesneler için, manuel izleme-kare bir çerçeve temelinde yapılabilir. Volocity yazılım paketi, istenilen nesneleri içinde XYZ konumu, hacmi ve entegre sinyal ihracat sağlar. Sinaptik düğmeye merkezine hareketleri normalleştirilmesi izlenen nesnenin sinaps ve hız mesafe hesaplanır. 8. Temsilcisi Sonuçlar Karıştırma 10 ila 15 dakika içinde bir birincil CD4 kalarak HIV Gag-iGFP ifade Jurkat hücreleri + T hücreleri görselleştirmek mümkün olmalıdır. Görüntüleme bu konjugatları, bir synaspe sonra hedef hücreleri enfekte hücrelerin yanı sıra Gag puncta hareketlerini değerlendirmek. Sinaps oluşur birinin kısa bir süre sonra hedef hücre içine Gag iGFP puncta hareket gözlemleyebiliriz.

<ol>
	<li>Blanco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+level+of+coreceptor-independent+HIV+transfer+induced+by+contacts+between+primary+CD4+T+cells.">High level of coreceptor-independent HIV transfer induced by contacts between primary CD4 T cells.</a> J Biol Chem. 279, 51305-51314 (2004).</li><li>Sourisseau, M., Sol-Foulon, N., Porrot, F., Blanchet, F., Schwartz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+human+immunodeficiency+virus+replication+in+mobile+lymphocytes.">Inefficient human immunodeficiency virus replication in mobile lymphocytes.</a> J Virol. 81, 1000-1012 (2007).</li><li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced,+actin-dependent+synapse.">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J Exp Med. 199, 283-293 (2004).</li><li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)+Gag+localization+and+oligomerization+monitored+with+live+confocal+imaging+of+a+replication-competent,+fluorescently+tagged+HIV-1.">Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1.</a> J Virol. 81, 12596-12607 (2007).</li><li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+video+microscopy+of+HIV+transfer+across+T+cell+virological+synapses.">Quantitative 3D video microscopy of HIV transfer across T cell virological synapses.</a> Science. 323, 1743-1747 (2009).</li></ol>

Biz burada, hücre-hücre HIV transferi görselleştirmek için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Laboratuar ve diğerleri &#39;tarafından yapılan son araştırma, HIV baskın modu T hücreleri arasında yayılmış olabileceğini düşündürmektedir. Burada anlatılan yöntemi HIV rekombinant formu istihdam temel yapısal protein, Gag genetik olarak kodlanmış olan yeşil floresan protein etiketi taşıyan Gag iGFP, HIV adı verilen. Çünkü her virüs parçacık üretilen GFP yüksek düzeyde, HIV Bu çoğaltma yetkili klonu, gerçek zamanlı olarak bireysel virüs partikülleri takip etmek için araştırmacılar sağlar. Bu virüs, HIV montaj ve hücre-hücre transferi ile ilgili çalışmalarda özellikle yararlı olacaktır. HIV hücre-hücre transferi ile transferi oldukça verimlidir. Üç saat boyunca ko-kültür, biz rutin akış sitometri ile değerlendirilen virüs birincil T hücrelerinin% 20-30 transfer bakın. Benzer verimliliği niteliksel canlı hücre görüntüleme sırasında görülür. Viral bulaşmış T hücrelerinin hemen eş-kültür başladıktan sonra bulaşmamış birincil T hücreleri ile sinaps oluşturarak başlar. İlginç, değil tüm ilköğretim T hücreleri lazer cımbız (yayınlanmamış gözlemler, GM) ile zorla etkileşimleri rağmen, HIV ile enfekte Jurkat hücreleri ile etkileşim yeteneğine sahiptir. HIV Gag-iGFP şüphesiz hücre-hücre transferi, in vitro ve in vivo hem de en duyarlı T hücre alt grupları belirlemek için yararlı olacaktır.

<table><tbody><tr><td>Jurkat T Cells</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leukocyte buffy coats from whole blood</td><td>New York Blood Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector System and Solution V</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Maxi Prep Kits</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HIV Gag-iGFP plasmid</td><td>Chen Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD4+ T Cell Isolation Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celltracker/CellTrace Dyes</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-Independent Media</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging Chambers</td><td>Ibidi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX-71 Inverted Microscope</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PlanApo N 1.42NA 60X oil objective</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Innova 70C ArKr ion gas laser</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSU-10 Nipkow-type spinning disk confocal unit</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 dichroic beamsplitter</td><td>Semrock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>525/50 bandpass filter</td><td>Semrock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iXon+ 897 electron-multiplied charged coupled devise camera</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ASI 400 Thermostatic Heater</td><td>Nevtek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing cell-to-cell transfer of hiv using fluorescent clones of hiv and live confocal microscopy

Kaynaştırma sevdikleri proteinler yeşil flüoresan protein, biyologlar, floresan video mikroskopi kullanılarak karmaşık hücresel süreçleri yaşayan çalışma yeteneğine sahip. Insan immün yetmezlik virüsü hücre-hücre iletim sırasında insan immün yetmezlik virüsü çekirdek protein hareketlerini izlemek için, HIV bulaşıcı bir moleküler klon bağlamında Gag protein, HIV Gag-iGFP denilen GFP etiketli. Biz viral klon video konfokal mikroskopi kullanılarak bu çalışma. Aşağıdaki görüntülenmiştir deneyde, bir insan T hücre hattı HIV Gag-iGFP transfect ve biz floresan etiketli bulaşmamış CD4 + T hücreleri virüs için hedef hücreler olarak hizmet etmek için kullanır. Hücrelerarası yapılar arasında kolayca viral üretim ve nakliye takip edebilirsiniz farklı floresan etiketleri kullanarak virolojik sinaps denir. Basit gaz geçirgen görüntüleme odaları, bize gün dakika canlı konfokal mikroskobu ile sinaps gözlemlemek için izin verir. Bu yaklaşımlar, bir hücreden diğerine hareket gibi viral proteinleri izlemek için kullanılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy at JoVE.com

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Bu görüntülenmiştir deney canlı konfokal görüntüleme deneyleri için HIV floresan moleküler klon kullanan için bir rehber.

HIV ve Live Konfokal Mikroskop Floresan Klonlar kullanılarak HIV görselleştirme Hücre-hücre Transferi

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

visualizing-cell-to-cell-transfer-hiv-using-fluorescent-clones-hiv

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.4K Görüntüleme.  Mount Sinai School of Medicine. Bu görüntülenmiştir deney canlı konfokal görüntüleme deneyleri için HIV floresan moleküler klon kullanan için bir rehber.

Video: Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, the LTR is also responsive to cellular activation states and to the local chromatin activity where the integration has occurred. This can result in high HIV-independent activity, and has restricted the usefulness of LTR-based reporter to mark HIV positive cells 1,2,3. Here, we constructed an expression lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, numerous HIV DNA sequences that include the Rev-response element and HIV splicing sites 4,5,6. The vector was incorporated into a lentiviral reporter virus, permitting highly specific detection of replicating HIV in living cell populations. The activity of the vector was measured by expression of the green fluorescence protein (GFP). The application of this vector as reported here offers a novel alternative approach to existing methods, such as in situ PCR or HIV antigen staining, to identify HIV-positive cells. The vector can also express therapeutic genes for basic or clinical experimentation to target HIV-positive cells.

We have developed a lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, the Rev-response element (RRE) that can regulate reporter gene expression in an HIV-1 Tat- and Rev-dependent fashion. The vector permits the specific detection of replicating HIV in living cells via the expression of GFP.

Yeşil Floresan Protein ifade Rev-bağımlı lentiviral Vector kullanarak HIV-1 Olumlu Hücreler Özgül İşareti

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

Dinamik Etkileşimler 3D Yapısal Analiz için karşılıklı Mikroskopi

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Biyomühendislik

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

Alphaherpes Virüs İleriye Taşıma ve Değişken Canlı Hücre Görüntüleme

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in determining outcomes that range from clearance to chronic persistent infections. We describe here a method for assessing the spatial and quantitative relationships between immune effector (E) virus-specific CD8+ T cells and infected targets (T) that combines in situ tetramer (IST) staining to detect virus-specific CD8+ T cells and in situ hybridization (ISH) to detect viral-RNA+ cells in the tissues where the battle between immune defenses and infection takes place. The combination of IST staining and ISH, abbreviated ISTH, enables visualization and mapping of the locations of immune effector cells and targets, and facile determination of E:T ratios.  These parameters in turn can then be used to determine the relationships between spatial proximity, and the timing and magnitude of the immune response that predict outcomes in early infection.

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A technique combining in situ tetramer staining and in situ hybridization (ISTH) enables visualization, mapping and analysis of the spatial proximity of virus-specific CD8+ T cells to their virus-infected targets, and determination of the quantitative relationships between these immune effectors and targets to infection outcomes.

Aynı zamanda Virüs CD8 + T Hücreleri ve virüsle enfekte olan hücreleri görselleştirin için bir Tekniği In situ</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

Biyoloji

In Situ Hücresel Kriyotomografi için Elektron Mikroskobu Izgaralarının Hazırlanması

Sample Preparation for In Situ Cryotomography of Mammalian Cells

In situ cellular cryotomography is a powerful technique for studying complex objects in their native frozen-hydrated cellular context, making it highly relevant to cellular biology and virology. The potential of combining cryotomography with other microscopy modalities makes it a perfect technique for integrative and correlative imaging. However, sample preparation for in situ cellular tomography is not straightforward, as cells do not readily attach and stretch over the electron microscopy grid. Additionally, the grids themselves are fragile and can break if handled too forcefully, resulting in the loss of imageable areas. The geometry of tissue culture dishes can also pose a challenge when manipulating the grids with tweezers. Here, we describe the tips and tricks to overcome these (and other) challenges and prepare good-quality samples for in situ cellular cryotomography and correlative imaging of adherent mammalian cells. With continued advances in cryomicroscopy technology, this technique holds enormous promise for advancing our understanding of complex biological systems.

Yazar Spotlight: Gelişmiş Kriyoelektron Tomografisi için Izgara Hazırlığını Optimize Etme 

This method provides an accessible and flexible protocol for the preparation of electron microscopy (EM) grids for in situ cellular cryotomography and correlative light and electron microscopy (CLEM).

Memeli Hücrelerinin İn Situ Kriyotomografisi için Numune Hazırlama

In situ cellular cryotomography is a powerful technique for studying complex objects in their native frozen-hydrated cellular context, making it highly ...

Biyokimya

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is responsible for the proteasomal degradation of host restrictive factors and the subsequent viral gene activation. ICP0 contains a canonical nuclear localization sequence (NLS). It enters the nucleus immediately after de novo synthesis and executes its anti-host defense functions mainly in the nucleus. However, later in infection, ICP0 is found solely in the cytoplasm, suggesting the occurrence of a nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. Presumably ICP0 translocation enables ICP0 to modulate its functions according to its subcellular locations at different infection phases. In order to delineate the biological function and regulatory mechanism of ICP0 nuclear-to-cytoplasmic translocation, we modified an immunofluorescent microscopy method to monitor ICP0 trafficking during HSV-1 infection. This protocol involves immunofluorescent staining, confocal microscope imaging, and nuclear vs. cytoplasmic distribution analysis. The goal of this protocol is to adapt the steady state confocal images taken in a time course into a quantitative documentation of ICP0 movement throughout the lytic infection. We propose that this method can be generalized to quantitatively analyze nuclear vs. cytoplasmic localization of other viral or cellular proteins without involving live imaging technology.

ICP0 undergoes nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. The molecular mechanism of this event is not known. Here we describe the use of confocal microscope as a tool to quantify ICP0 movement in HSV-1 infection, which lays the groundwork for quantitatively analyzing ICP0 translocation in future mechanistic studies.

Herpes Simplex Virüsü 1 protein immünfloresan Confocal mikroskobu tarafından nükleer-için-sitoplazmik Translocation zamansal Analizi

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

Floresan Mikroskobu ile Çoklu Nesiller boyunca Canlı Memeli Hücrelerinde Plazmid Çoğaltma İzlenmesi

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform

HIV-1 causes a chronic infection that affects more than 37 million people worldwide. People living with human immunodeficiency virus (HIV) experience comorbidity related to chronic inflammation despite antiretroviral therapy. However, these inflammatory signaling has not been fully characterized. The role of early entry events on the activation of cellular signaling events and downstream gene expression has not been captured at the single-cell level. Here the authors describe a method that applies principles of live-cell fluorescence microscopy to an automated single-cell platform that cultures and images cells over user-customized time courses, allowing for high-throughput analysis of dynamic cellular processes. This assay can track single-cell live fluorescence microscopy of early events that immediately follow HIV-1 infection, notably the influx of calcium that accompanies exposure to the virus and the development of productive infection using a fluorescent reporter virus. MT-4 cells are loaded with a calcium-sensitive dye and cultured in isolated pens on a nanofluidic device. The cultured cells are infected with an HIV-1 reporter virus (HIV-1 NLCI). A fluorescence microscope positioned above the nanofluidic device measures calcium influx over an 8-min time course following acute HIV-1 exposure. HIV-1 productive infection is measured in those same cells over a 4-day interval. Imaging data from these time courses are analyzed to define virus-host receptor interactions and signaling pathway dynamics. The authors present an integrated, scalable alternative to traditional imaging methods using a novel optofluidic platform capable of single-cell sorting, culturing, imaging, and software automation. This assay can measure the kinetics of events under various conditions, including cell type, agonist, or antagonist effect, while measuring an array of parameters. This is the first established method for nanofluidic high-throughput longitudinal single-cell culture and imaging: This technique can be broadly adapted to study cellular signaling kinetics and dynamic molecular interactions.

Here, we present a protocol in which single cells are monitored for acute events and productive HIV-1 infection on a nanofluidic device. Imaging data define virus-host receptor interactions and signaling pathway dynamics. This is the first method for nanofluidic high-throughput longitudinal single-cell culture and imaging to study signaling kinetics and molecular interactions.

Multiparametre Optofluidik Platform Kullanılarak Kalsiyum Akını ve HIV-1 Enfeksiyonunun Tek Hücreli Karakterizasyonu

HIV-1 causes a chronic infection that affects more than 37 million people worldwide. People living with human immunodeficiency virus (HIV) experience ...

HIV ve Live Konfokal Mikroskop Floresan Klonlar kullanılarak HIV görselleştirme Hücre-hücre Transferi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Yeşil Floresan Protein ifade Rev-bağımlı lentiviral Vector kullanarak HIV-1 Olumlu Hücreler Özgül İşareti

Dinamik Etkileşimler 3D Yapısal Analiz için karşılıklı Mikroskopi

Alphaherpes Virüs İleriye Taşıma ve Değişken Canlı Hücre Görüntüleme

Aynı zamanda Virüs CD8 + T Hücreleri ve virüsle enfekte olan hücreleri görselleştirin için bir Tekniği In situ

Memeli Hücrelerinin İn Situ Kriyotomografisi için Numune Hazırlama

Memeli Hücrelerinin İn Situ Kriyotomografisi için Numune Hazırlama

Memeli Hücrelerinin İn Situ Kriyotomografisi için Numune Hazırlama

Herpes Simplex Virüsü 1 protein immünfloresan Confocal mikroskobu tarafından nükleer-için-sitoplazmik Translocation zamansal Analizi

Floresan Mikroskobu ile Çoklu Nesiller boyunca Canlı Memeli Hücrelerinde Plazmid Çoğaltma İzlenmesi

Multiparametre Optofluidik Platform Kullanılarak Kalsiyum Akını ve HIV-1 Enfeksiyonunun Tek Hücreli Karakterizasyonu