QFSM gelişimi, Ulusal Sağlık Enstitüsü, hibe u01 GM06230 tarafından finanse edilmektedir.

Bölüm 1: FSM için floresan etiketli aktin Alınması Gerekli malzemeler: aktin, fluorofor (Alexa, X-rodamin önerilir) saflaştırılmış. G-tampon, ultrasantrifüjdeki <ol><li> , Iyi FSM filmleri satın bir temel bileşeni seçtiğiniz fluorofor aktin uygun etiketleme (ya da diğer hücre iskeleti proteinleri) gerektirir. Biz Alexa fluorophores (488, 568 dalga boylarında) ve aktin yüzeyinde lizin kalıntılarının maruz hedef X-rodamin succinimidyl ester türevleri kullanmanızı öneririz. </li><li> Fluorofor ve uygun dalga boyu seçerken, floresan etiketi yerleştirmek için (cıva ark lambası ve / veya lazerler) mikroskop kurulum uygun filtreler (eksitasyon ve emisyon) ve aydınlatıcı olduğundan emin olun. Biz oto-floresans ve foto-hasarı etkilerini en aza indirmek ve GFP-konjugatları ile uyumluluğu sağlamak için turuncu, kırmızı dalga boyları (560-630 nm) dalga boylarında seçilmesi tavsiye ederiz. </li><li> Saf aktin Sıçan veya Tavuk ait kas dokusu çıkarılan, ancak kas aseton tozu uzun bir ekstraksiyon prosedürü gerektirir. Kas aseton tozu Invitrogen satın alınabilir. Bu protokol etiketleme prosedürü tartışılan, ama burada [1] bulunabilir </li><li> Alternatif olarak, etiketli aktin proteinler Sitoiskelet Inc ve Invitrogen dahil olmak üzere çeşitli satıcılardan satın alabilirsiniz. Özel etiketleme hizmetleri Invitrogen üzerinden de mevcuttur. Saflaştırılmış, non-etiketli aktin (kas ve kasa invaze olmamış aktin) Sitoiskelet Inc satın alınabilir </li><li> Kendi etiketli aktin satın alma ya da hazırlanmak için karar olsun, etiketleme oranı aktinin monomer başına 0,3 ila 0,7 boyalar etrafında bir yerde olduğundan emin olmak istiyorum. Etiketleme oranı çok yüksek, çok düşük bir etiketleme oranı yoksul görünümlü benekler (gürültü düşük sinyal) yol ise, aktin filament ciro kinetiği (ve ilişkili proteinler bağlanarak) etkileyebilir ve mikroenjeksiyon sorunları (aşağıya bakın) neden olabilir. Bu iyi görüntü speckle almak için kritik bir faktör. </li><li> Uzun süreli depolama önce, etiketli aktin çözüm 75.000 az iplik tarafından açıklığa kavuşturulmalıdır - 4 santigrat derece 20 dakika 80.000 xg. Etiketli aktin G-tampon çözelti depolanır ve -80 santigrat derece tutulmalıdır. 2 uL alikotları hazırlanması çok tekrarlanan (çözünmez agregatların yol açar) donma-çözülme zararlı etkilerini azaltmak için tavsiye edilir. (Fluorophores, photobleaching olacak), doğrudan ışığa etiketli aktin çözüm maruz kaçının. Biz uzun süreli depolama için opak mikrosantrifüj tüpleri kullanmanızı öneririz. </li></ol> Bölüm 2: Hücreler ve Mikroenjeksiyon etiketli aktin hazırlanması Gerekli malzemeler: mikroenjeksiyon iğneler, mikroenjektör, microloaders, prewarmed hücre medya, enjeksiyon tampon, buz kovası, mikroskobu (faz halka, 40X faz kontrast hedefi, transjector, iğne çektirmesi, mikromanipülatör) <ol><li> Birçok hücre tipleri için uygun FSM, ancak iyi görüntü speckle almak mikroenjeksiyon işlemi başarısını doğrudan bağlıdır. FSM hücreleri seçerken, hücreler (&gt; 50 um çapında büyük olmalı), yaymak gerekir, kaplama, ve yüzeylerde (veya plastik doku kültürü yemekleri) doğal yapışık. Aynı zamanda hücrenin sitoplazmada çekirdeğinde daha büyük bir alanı kaplar yardımcı olur. Söz konusu kriterlere hücreler mikroenjeksiyon için uygun olduğundan emin olun. Başarılı aday hücre hatları (ancak bunlarla sınırlı değildir) PtK1 [2,3], newt akciğer hücreleri [4] ve Aplysia nöronlar [3]. </li><li> Asitle yıkanmış; Hücreler kare cam lamelleri (hayır 1-1/2 22 x 22 mm) kaplama olmalıdır. Standart substrat kaplama lamel uygulanabilir ve mikroenjeksiyon etkilemez. </li><li> Mikroenjeksiyon iğneler doğru seçimi ucu açılış büyüklüğüne bağlıdır. Genellikle, delik boyutları boyutu çok büyük 3 0.5 um um. Ancak, biz bu aktin enjeksiyon 0,5 ila 1 um arasında optimal bir açılış boyutu gerektirir tavsiye ederiz. Tıkanma sorunları sürekli karşılaşılan, büyük delik boyutları monomerik teslim yanı sıra istenmeyen polimerize aktin filamentler barındırabilir. Mikroenjeksiyon iğneler femtotip mikroenjeksiyon iğne yapmak Eppendorf sistemleri de dahil olmak üzere çeşitli satıcılar aracılığıyla satın alınabilir. Alternatif olarak eğer ticari bir iğne çektirmenin, cam mikroenjeksiyon tüplerin Sutter satın alınan ve şartnameye çekilir. Yeni başlayanlar için, biz 10-20 çekti iğne enjeksiyon işlemine başlamadan önce taraftan olmasını öneriyoruz. </li><li> Aktin ideal enjeksiyon konsantrasyon &#39;(iğne yüklü aktin final konsantrasyon) ug / ul 1,0 - 0,5 arasında aktin monomeri boya,% 40 etiketleme oranı dayalı. Aktinin Alt etiketleme oranı daha yüksek konsantrasyonlarda (1-3 ug / ul) enjekte edilerek telafi edilebilir. Ancak, iğne tıkanma frekansarttırılabilir. Bu, kısmen daha büyük delikleri olan iğneler kullanılarak hafifletilebilir olabilir. Aktin stok konsantrasyonu buz enjeksiyon tampon ekleyerek sulandırılmış olabilir. Buz gibi soğuk ddH2O da hızlı enjeksiyon için sulandırmak için kullanılabilir. Bu noktada tüm çalışma çözümleri buz üzerinde tutulmalıdır. </li><li> Yük 0.5 - 1.0 uL mikroenjektör (dar göstergesi - Hamilton) kullanarak aktin çözüm, ya da alternatif bir Microloader pipet kullanarak. </li><li> Dikkatli bir şekilde, yavaşça çözüm serbest bırakarak, aktin çözüm dağıtmak. Kabarcıklar kaçınılmalıdır, ancak kabarcık çevresindeki aşırı sıvı alarak kolayca silinebilir. </li><li> Aktin çözüm iğne ucu tamamen dinlenme olduğundan emin olun. Her yerde iğne kılcal birlikte aşırı çözüm enjeksiyon akışını bozabilir. </li><li> Şimdi dikkatli bir şekilde enjektör sahibine, iğne ucu ile temas kaçınarak, iğne takmak. Iğne mikroskop sahne tabanına 35-50 derecelik bir açı yapar, böylece tutucu yerleştirin. Alt açıları tercih edilmektedir. </li><li> Ancak yüzey hücreleri banyo medya tatili kadar iğne ucu indirin. </li><li> Şimdi iğne ucu (düşürmeden) doğrudan hedefi merkezi üzerinde duracak şekilde yerleştirin. Iğne ucu hedefi ile uyumlu ise, göz merceği ile parlak bir hale göreceksiniz. Bu iğne ucu sonu. Yavaş yavaş (manipülatör kullanarak) iğne yan tarafında hareketli hale bulmak daha iyi yardımcı olabilir. </li><li> Mikroskop z odak hücreleri net görüntü kadar ayarlayın. Şimdi, nihayet içine yakınsak iğne ucu kadar hale yavaş yavaş daraltır kadar yavaş yavaş ucu alt odaklama (z konum) aynı anda kontrol etmek gerekecektir. Aramak için bir ek özellik iğne mili, doğrusal gölge. Iğne düşürülmesi yavaş yavaş iğne mili tanımlayabilirsiniz. İğne ve hücrelerin sonuna doğru yapıldığı zaman hem de net bir görüntü olmalıdır. Faz halka hafif ayarı, kontrastı artırmak için gerekli olabilir. </li><li> Gezinirken, iğne ucu ve iğne ucunun kırılmasını önleyen hücreleri yukarıda olduğundan emin olun. </li><li> Enjekte hücreleri seçerken, hücreleri serbest kenarları iğne ucu dönük olmalıdır. Bu paralel çalışan daha iğne ucu yerine, bir araya gelecek (çekirdeğin en ince noktasına öncü bulunduğu kalın noktası) hücre azalan eğim sağlayacaktır. </li><li> Iğne basıncı 0,3 ila 0,8 psi ayarlanmış olmalıdır. Aktin çözüm sürekli bir akış içinde sabit bir basınç uygulanan neden olacaktır. </li><li> Ucu çekirdeği (perinükleer bölge, hücre çekirdeği doğrudan aşağıda kalın bir kısmı) bu yüzden bir hücre enjekte etmeye karar verdikten sonra, iğne pozisyonu. </li><li> Yavaş yavaş daha düşük, ve iğne ucu, iğne ucu zarı delinir kadar, aşamalı olarak daha düşük membran karartıcı kadar pozisyonunu yeniden ayarlamak. Iğne tam zarı delinir varsa, bu fark, artık hücre dokunuyor kadar iğne yükseltmek gördüğünüz gibi, hücrenin en kısa sürede, daha parlak görünecektir. Gerçek piercing ve enjekte süreci 0,5-2 saniye sürecektir. </li><li> Doğru yapıldığı zaman çok enjeksiyon hücre kenar hızlı retraksiyonu sonucu ise, hücre şekli değişmeden görünecektir ve bazı durumlarda aslında hücre patlayabilir göreceksiniz. </li><li> (Parlak olmaz) microinjecting zaman hücre değişiklikleri göremiyorsanız, iğne ucu kapalı olabilir. &#39;Temiz&#39; düğmesine transjector üzerinde varsa basarak test edebilirsiniz. Açarsanız, bu göz mercekleri ile görülebilir sabit basınç akış önemli ölçüde artacak - dalgalanmalar ve yakındaki enkaz dispersiyon görülebileceği gibi görünecektir. </li><li> Eğer iğne ucu kapalı, böylece ucunun sonuna neden, yeni bir mikroenjeksiyon iğne veya iğne ucu, iğne presler cam lamel karşı ucu kadar iğne hafifçe düşürerek kırmaya teşebbüs eklemek için seçebilirsiniz kırılmasına neden olabilir. Kırılması alan iğne ucu (iğne bir noktaya yakınsama başlar bölümü) alanında 1 / 5 inci daha fazla olmalıdır. </li><li> Her mikroenjeksiyon oturumu (hücre tipine göre değişir) 45 dakika - 20 daha fazla harcama, enjeksiyon ile devam edin. Genel bir kural olarak, kısa oturumları hücreleri üzerindeki stresi en aza indirmek için tavsiye edilir. </li><li> Mikroenjeksiyon bitirdikten sonra, taze prewarmed medya ekleyerek çanak hücre ortamı değiştirmek. Daha sonra hücreler 30 dakika önce bir kuluçka görüntüleme kurtarmak için izin verir. Bu aktin mevcut hücre iskeletinin ağ içine entegre etmek için ayrıca izin verecektir. </li></ol> Bölüm 3: Görüntüleme Odası Montajı Gerekli Malzeme: coverglass, çift taraflı bant, q-ipuçları, forseps, valap, kim, oxyrase, görüntüleme medya, jilet, P200 pi silin.pette, saf etanol <ol><li> Görüntüleme medya prewarming ve Oxyrase 15 uL kısım çözülme başlar. Işıktan ışığa oxyrase korumak için emin olun. Ayrıca, oxyrase photobleaching, etkileri büyük ölçüde azaltacaktır. </li><li> Sıcak plaka düşük sıcaklık ayarı, valap Prewarm. Bir dolgu olarak etkinliğini kaybedecektir valap ısınmasına / yanık bırakmayın. </li><li> Bir coverglass aşağı, temiz ve küçük bir enkaz kaldırmak için saf etanol ile doused bir kimwipe silin. </li><li> Temiz, düz bir yüzey bir platform olarak kullanarak, birbirlerinin üstüne çift taraflı bant iki eşit büyüklükte uzunlukları (2.5 cm uzunluğunda), Stack. Tamamen düz bir düzlem oluşturmak için herhangi bir hava kabarcığı basın. </li><li> Bir jilet kullanarak, her bir şerit genişliği 0.5 cm, böylece uzun ekseni boyunca iki düz şeritler kesti. </li><li> Forseps kullanarak, iki bant şeritler sizin coverglass merkezinde bir boşluk oluşturur, böylece sizin coverglass uzun kenarına her şerit yerleştirin. Cam ile güzel bir mühür bandı üzerine hafifçe bastırın. Bant şeritler coverglass ve lamel arasında yer tutucular olarak hareket edecektir. </li><li> Bir sonraki adıma başlamadan önce valap tamamen sıvılaştırılmış emin olun. </li><li> Medya her 500 uL oxyrase 15 ul ekleyerek, prewarmed görüntüleme medya al. </li><li> Katlama Kimwipes üçgen içine 3 sert kenarları oluşturmak için. Bu sopa bandı için kuru bir yüzey oluşturmak için kullanılır. </li><li> Inkübatör hücreler al. Kullanarak, forseps lamel bir köşe kapmak. Hızla bir kimwipe lamel (hücre yan dokuya dokunmadan, yukarı bakacak şekilde) yerleştirin ve yarı kuru bir yüzey oluşturmak için lamel iki karşıt taraf silmek için katlanmış kimwipe kullanmak (yüzey hücreleri geri kalanı). </li><li> Forseps kullanarak, kuru yüzeylerde iki bant şeritler hizalanmış olduğunu bu nedenle bir köşeye lamel kapmak ve coverglass üzerine yerleştirin. Kapalı iki taraf ve iki açık yarıklar var şimdi dikkat edin. Yakın bir açılış görüntüleme-medya-oxyrase çözüm Yavaşça pipet 200 uL. Önemlisi, herhangi bir hava kabarcıkları getirilmelidir. Böylece tam çözüm hücreleri çeker, çözüm kılcal güçleri tarafından yeni oluşturulan odasına kadar emdi olmalıdır. </li><li> Q-tip dab hızlı yapıştırmayın erimiş valap ile lamel dört köşe kullanma ve lamel stabilize. Farkedeceğiniz anında valap kurur (oda sıcaklığında saniye içinde). </li><li> Şimdi açık taraf (non-teyp tarafı) ile başlayan, bir Q-tip ve fırçalama inme taklit valap ince bir şerit yatıyordu. Kapalı taraf için de tekrarlayın. Böylece kaplama adımları tekrarlayarak mühür takviye valap ceket, yavaş yavaş oluşturmak. Valap lamel merkezinde açık bırakarak, kenarları kapalı olmalıdır. </li><li> Hücrelerin ezmek için değil, dikkatli olmak, herhangi bir kalıntı ortamı çıkarmak için ddH2O Q-ucu kullanarak lamel merkez kısmına hafifçe temizleyin. Saf etanol ile temizlik adımı tekrarlayın. </li><li> Artık tamamen kapalı görüntüleme odası, görüntüleme speckle için optimize olacaktır. Tamamen kapalı bir muhafaza hızlı photobleaching fluorophores önleyecektir. </li></ol> Bölüm 4: Görüntüleme hücreleri Gerekli malzemeler: 6.7 mikron piksel, Yüksek sayısal diyafram, yağ daldırma planı Apochromatic hedefleri (60X 100X, faz ya da DIC) ile ters widefield mikroskop, mecury lamba, uygun filtreler, soğutmalı CCD kamera. Titreşim tablosu. Görüntüleme yazılımı. <ol><li> 37 derece için mikroskop sahne Prewarm. Yeni tamamlanan görüntüleme odasına yerleştirin ve görüntüleme önce stabilize etmek için sıcaklık 10-15 dakika bekleyin. </li><li> Parlak alan hücrelerin odaklanarak başlatın ve sonra doğru floresan ayarlarını değiştirir enjekte hücreleri bulmak. Photobleaching azaltmak için floresan maruz kalma süresini en aza indirmek için deneyin. </li><li> Enjekte edilen hücrelerin sağlıklı önde gelen kıvrımlı kenarları bakın. Aşırı enjekte edilen hücrelerin (patladı hücreleri) geri çekilir ve pürüzlü kenarlar ile karakterize, çok sayıda filopodia benzer olacak - bu hücrelerin görüntüleme önlemek. </li><li> Toplama ayarları etiketli aktin hücre tipi, kalitesi ve mikroskop bileşenleri bağlıdır. Ancak, pozlama ayarları 2 saniye daha fazla olması gerektiğini ve kareler arasındaki zaman aralığı 5 ile 10 saniye arasında ayarlanabilir olmalıdır. Tipik bir zaman serisi için boyları (görüntülü hücre başına) herhangi bir yerde 10 ila 30 dakika arasında değişebilir ve photobleaching etkileri sınırlıdır. Kamera ayarları Kazanç gürültü sinyali artırmak için açılabilir. </li><li> Ideal özellikleri bir sonraki komşu speckle çapları speckle her ~ 2 aralıklı speckle olmalıdır speckle. Bu aktin yapısının optimal mekansal ve zamansal örnekleme garanti. Epitel hücreleri için, benekli aktin ağ benek eşit dışında yayılmış, homojen görünecektir. Yoğun stres lifleri veya lamellipodia özelliği hücre hatlarıayırt edilebilir, ancak bir noktalı / benekli görünüme sahip. Pozlama ayarları benekli en iyi görüntü almak için ayarlanabilir olmalıdır. </li><li> Aşırı microinjected hücrelerin ayrık olarak görünmüyor sık ​​donatılı benekler var. Stres elyaf ve lamellipodia noktalı görünümünü kaybedersiniz. </li><li> Altı microinjected hücreleri uzak (&gt; 10 benekler dışında) ve dağınık rastgele görünen benekler içeren, mercek ile çok loş görünecektir. Stres elyaf ve lamellipodia bu hücrelerin ayırt edilemez. </li><li> &#39;Iyi&#39; elde etmek için Anahtar filmleri odaklanmayı sürdürürken speckle. Bu akışı ve ciro ölçümleri speckle içeren sonrası analizi için özellikle önemlidir. Bu nedenle kantitatif analiz kalitesini geçen zaman süresi için odak kilitleme bağlıdır. Görüntü düzlemi oldukça ince ise özellikle zor olabilir. Diğer faktörler mikroskop sistemi istikrar, özellikle sahne konut ve görüntüleme odası bağlıdır. Kontrast-tabanlı odaklama, görüntü aralığı uzunlukları bu özelliği karşılamak için yeterli olup olmadığı kullanılabilir. Diğer seçenekler, güvenilir ve gerçek zamanlı odak ayarlamaları sağlar bir yakın-kızılötesi tabanlı odaklama sistemi satın içerir. Nikon, Olympus ve ASI bu teklifleri bulabilirsiniz. </li></ol> Bölüm 5: qFSM analizi Bu bölümde ayrıntılı olarak ele değil, ancak analiz yazılımı bilgi burada [5] bulunabilir. Yazılım yükleme isteklerini web sitemizi (lccb.scripps.edu) yapılabilir. Konu Başlıkları: <ul><li> Gürültü kalibrasyon </li><li> Algılama speckle </li><li> Kaba hareket görüntü korelasyonu tabanlı izleme melez bir yaklaşım kullanarak Takip, bireysel benekler ayrıntılı hareket alanları ve tek bir parçacık izleme speckle. </li><li> Hesaplama sırasında yoğunluk dalgalanmaları polimer montaj ve demontaj oranları görünüm ve ortadan kaybolma olayları speckle. </li></ul>

<ol>
	<li>Waterman-Storer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+speckle+microscopy+(FSM)+of+microtubules+and+actin+in+living+cells.">Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).</li><li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells.">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305, 1782-1786 (2004).</li><li>Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-dependent+contractile+responses+in+the+neuronal+growth+cone+are+independent+of+classical+peripheral+retrograde+actin+flow.">Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow.</a> Neuron. 40, 931-944 (2003).</li><li>Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-wavelength+fluorescent+speckle+microscopy+reveals+coupling+of+microtubule+and+actin+movements+in+migrating+cells.">Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells.</a> J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).</li><li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics.">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Başarıyla speckle görüntüler elde etmek için birkaç anahtar faktör çok önemlidir, ancak iyi benekler floresan etiketli aktin kalitesi ile başlar ve biter. Etiketli protein kendisi çözünür ve agrega ücretsiz olmalıdır 0,7 0,4 çevresinde aktin monomeri, boya, yüksek bir etiketleme oranı, benekler ve ayrık parlak görünmesini sağlayacaktır. Aynı derecede önemli olan mikroenjeksiyon işlemi. Normal hücre homeostazının sağlamak için (ve hayatta kalma), hücreler tanıtan etiketli protein konsa...

Enjeksiyon tampon (IB) 50 mM potasyum glutamat 0.5 M MgCl2 (EK 2A) -20 ° C&#39;de 2 yıla kadar saklama kapasitesi &nbsp; G-buffer 2 mM Tris ⋅ Cl, pH 8.0 (EK-2A) 0.2 mM CaCl2 (EK 2A) Kullanmadan hemen önce ekleyin: 0.2 mM ATP (100 mM tarifi görmek) 2-mercaptoethanol 0.5 mM 1 gün öncesine kadar 4 Mağaza ° C

live cell imaging of f-actin dynamics via fluorescent speckle microscopy (fsm)

Bu protokolde Floresan kullanımı PtK1 hücreleri aktin dinamiklerinin yüksek çözünürlüklü görüntü yakalamak için Mikroskopi (FSM) speckle açıklar. FSM eşsiz bir avantajı canlı hücrelerin içinde F-aktin ağ hareketini ve ciro kinetiği (montaj / demontaj) yakalamak için yeteneğidir. Bu teknik, bilgisayar vizyonu yazılım (qFSM) ile eşleştirilmiş, F-aktin dinamiklerinin kantitatif ölçümler çıkarmada yararlıdır. Biz seçimi, mikroenjeksiyon ve canlı hücrelerin floresan aktin probları görselleştirme açıklar. Daha da önemlisi, benzer işlemler, diğer macomolecular meclisleri görselleştirmek için geçerli. FSM mikrotübül, ara filamentler, ve yapışma kompleksleri için kanıtlanmıştır.

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM at JoVE.com

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Seçimi, mikroenjeksiyon ve görüntüleme floresan ile F-aktin floresan etiketli (FSM) mikroskopi speckle.

Floresan üzerinden F-aktin Dynamics Canlı Hücre Görüntüleme speckle Mikroskopi (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

live-cell-imaging-f-actin-dynamics-via-fluorescent-speckle-microscopy

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

15.9K Görüntüleme.  Scripps Institute. Seçimi, mikroenjeksiyon ve görüntüleme floresan ile F-aktin floresan etiketli (FSM) mikroskopi speckle.

Video: Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

Üç boyutlu Matrix floresan etiketli Proteinler ifade Geçiş Hücreler Canlı hücre Görüntüleme

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Biyomühendislik

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Gelişim Biyolojisi

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskopi Verilerinin uzay-zamansal Görüntü Korelasyon Spektroskopisi nicel T Hücreleri kortikal Aktin Akışı

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor individual reactions live in well-controlled conditions. To do so, live single-filament experiments have emerged over the past 20 years, mostly using total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and have provided a trove of key results. In 2011, in order to further expand the possibilities of these experiments and to avoid recurring problematic artifacts, we introduced simple microfluidics in these assays. This study details our basic protocol, where individual actin filaments are anchored by one end to the passivated coverslip surface, align with the flow, and can be successively exposed to different protein solutions. We also present the protocols for specific applications and explain how controlled mechanical forces can be applied, thanks to the viscous drag of the flowing solution. We highlight the technical caveats of these experiments and briefly present possible developments based on this technique. These protocols and explanations, along with today&#39;s availability of easy-to-use microfluidics equipment, should allow non-specialists to implement this assay in their labs.

We present protocols for simple actin filament microfluidic assays, in combination with fluorescence microscopy, that allow one to accurately monitor individual actin filaments in real-time while sequentially exposing them to different protein solutions.

Tek Aktin Filamentlerin ve Demetlerin Montaj Dinamiğini İncelemek için Mikroakışkanlar ve Floresan Mikroskobu Kullanma

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

Biyokimya

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

Hücre içi SNARE mikroskobu Imaging Floresans ömür tarafından kaçakçılığı görüntülenmesi

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial cells regulate permeability of the endothelium, and many studies have indicated the important contribution of the actin cytoskeleton to determining junctional integrity1-5. A cortical actin belt is thought to be important for the maintenance of stable junctions1, 2, 4, 5. In contrast, actin stress fibers are thought to generate centripetal tension within endothelial cells that weakens junctions2-5. Much of this theory has been based on studies in which endothelial cells are treated with inflammatory mediators known to increase endothelial permeability, and then fixing the cells and labeling F-actin for microscopic observation. However, these studies provide a very limited understanding of the role of the actin cytoskeleton because images of fixed cells provide only snapshots in time with no information about the dynamics of actin structures5. 
Live-cell imaging allows incorporation of the dynamic nature of the actin cytoskeleton into the studies of the mechanisms determining endothelial barrier integrity. A major advantage of this method is that the impact of various inflammatory stimuli on actin structures in endothelial cells can be assessed in the same set of living cells before and after treatment, removing potential bias that may occur when observing fixed specimens. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) are transfected with a GFP-&beta;-actin plasmid and grown to confluence on glass coverslips. Time-lapse images of GFP-actin in confluent HUVEC are captured before and after the addition of inflammatory mediators that elicit time-dependent changes in endothelial barrier integrity. These studies enable visual observation of the fluid sequence of changes in the actin cytoskeleton that contribute to endothelial barrier disruption and restoration. 
Our results consistently show local, actin-rich lamellipodia formation and turnover in endothelial cells. The formation and movement of actin stress fibers can also be observed. An analysis of the frequency of formation and turnover of the local lamellipodia, before and after treatment with inflammatory stimuli can be documented by kymograph analyses. These studies provide important information on the dynamic nature of the actin cytoskeleton in endothelial cells that can used to discover previously unidentified molecular mechanisms important for the maintenance of endothelial barrier integrity.

Microscopic imaging of live endothelial cells expressing GFP-actin allows characterization of dynamic changes in cytoskeletal structures. Unlike techniques that use fixed specimens, this method provides a detailed assessment of temporal changes in the actin cytoskeleton in the same cells before, during, and after various physical, pharmacological, or inflammatory stimuli.

GFP-Aktin ifade Canlı Endotel Hücreleri Aktin Sitoiskelet Çalışması

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

Biyoloji

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

Bir nanometre Hassasiyet Floresans Görüntüleme (Fiona)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes depend on the advances of growth cones that located at the tips of neurites. Axonal growth cones generate driving forces by sensing their local microenvironment and modulating cytoskeletal dynamics and actin-adhesion coupling (clutch coupling). Decades of research have led to the identification of guidance molecules, their receptors, and downstream signaling cascades for regulating neuronal migration and axonal guidance; however, the molecular machineries required for generating forces to drive growth cone advance and navigation are just beginning to be elucidated. At the leading edge of neuronal growth cones, actin filaments undergo retrograde flow, which is powered by actin polymerization and actomyosin contraction. A clutch coupling between F-actin retrograde flow and adhesive substrate generates traction forces for growth cone advance. The present study describes a detailed protocol for monitoring F-actin retrograde flow by single speckle imaging. Importantly, when combined with an F-actin marker Lifeact, this technique can quantify 1) the F-actin polymerization rate and 2) the clutch coupling efficiency between F-actin retrograde flow and the adhesive substrate. Both are critical variables for generating forces for growth cone advance and navigation. In addition, the present study describes a detailed protocol of traction force microscopy, which can quantify 3) traction force generated by growth cones. Thus, by coupling the analyses of&#160;single speckle imaging and traction force microscopy, investigators can monitor the molecular mechanics underlying growth cone advance and navigation.

To advance, growth cones must exert traction forces against the external environment. The generation of traction forces is dependent on actin dynamics and clutch coupling. The present study describes methods for analyzing actin dynamics, clutch coupling and traction forces for growth cone advance.

Büyüme Konisi İlerlemesi için Actin Dynamics, Debriyaj Kavrama ve Çekiş Kuvveti Analizleri

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...

Nörobilim

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.

Floresan üzerinden F-aktin Dynamics Canlı Hücre Görüntüleme speckle Mikroskopi (FSM)

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler