We thank F. Bouallague and the IBENS animal facility for excellent zebrafish care. Research reported in this publication was supported by the Fondation ARC pour la recherche sur le cancer, grants N&#176; SFI20111203770 and N&#176; PJA 20131200143.

Not: Şekil 1 protokolünün anahat sunar. Enjeksiyon ve Transplantasyon için iğneler hazırlanması 1. Not: İğneler her zaman hazırlanmış ve saklanabilir. modelleme kil bandında, bir Petri kabındaki tutun. tozdan korumak için parafilm çanak mühür. <ol><li> Enjeksiyon iğneleri, bir mikropipet çektirmesi ile (Malzeme listesine bakınız) (filamanın (Malzeme listesine bakınız) olmadan, çap 0.58 mm iç çapı 1.0 mm dışında) cam kılcal çekin. bunlar koryon delmek için daha etkin olarak kısa ve ince iğneler (yaklaşık 5 mm&#39;lik konik bölümü tercih). Not: Enjeksiyon iğneleri tek kullanımlık vardır. </li><li> Hücre Nakli iğne <ol><li> Mikropipet çektirmenin ile (filamanın (Malzeme listesine bakınız) olmadan, çap 0.78 mm iç çapı 1.0 mm dışında) cam kılcal çekin. </li><li> Uiç çapı (hücre çapından biraz daha transplante edilecek) 35 um olduğu noktada iğne ucu kesilmiş bir microforge (malzemelerin listesine bakınız) şarkı. </li><li> Konik 45 ° &#39;lik açı ile bir microgrinder (Malzeme listesine bakınız) ile kılcal kesim ekstremite. </li><li> İsteğe bağlı olarak, microforge kullanılarak iğnenin ucundaki dikenlere çekin. Bunun için, konik ucu ile sıcak tel dokunun ve hızla embriyo nüfuz yardımcı olabilecek bir çengel oluşturarak, uzak çekin. </li><li> eden bir şınngaya bağlanmış bir iğne tutucu iğne monte edin. şırınga kullanarak, bir cam artıkları ortadan kaldırmak ve daha sonra aseton ile üç kez durulama% 2 hidroflorik asit ile iğne üç kez iç yıkayın. Dikkat: hidroflorik asit toksik, eldiven ile, kaputun altında manipüle. Not: hücre nakli iğneler birkaç kez kullanılabilir. </li></ol></li></ol> 2. HazırlıkEnjeksiyon ve Hücre Nakli Yemekleri <ol><li> Isı tam güçte 1 dakika boyunca bir mikrodalga agaroz 0.5 g ihtiva eden 11 orta embriyonun 50 mi embriyo ortamda% 1 agaroz alır. yaklaşık 60 ° C&#39;ye kadar agaroz jeli soğutun ve bir 90 mm Petri kabı 50 ml dökün. özel olarak tasarlanmış kalıp (malzeme listesine bakınız) ya enjeksiyon çanak hatları ile ya da hücre nakli yemeğin kuyuların ile jel yüzeyinde yerleştirin. <ol><li> Agaroz çok sıcak değilse, agaroz kalıp şamandıra gözlemleyin. Agaroz jel ayarlandıktan sonra, forseps ile kalıp (- B Şekil 2A) çıkarın. Not: yemekler birkaç haftaya kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. kurumayı önlemek için, kapalı ıslak kutuda saklayın. </li></ol></li><li> Kullanmadan önce bir 28 ° C inkübatör 30 dakika çanak yerleştirin. </li></ol> Embriyoların ve Enjeksiyon 3. Koleksiyonu <ol><li> Enjeksiyon solüsyonu hazırlanması Not: Aktin bağlama alanımCherry bağlı gibi LifeAct olarak protein 140 (ABP-140) bağlanma maya aktin çıkıntılı etkinliğini analiz etmek için, hücre içinde polimerize aktin görselleştirmek için kullanılır (ABP140 mCherry olarak da adlandırılır). Aday gen (baskın negatif ya da yapısal olarak aktif bir yapı örneğin mRNA veya morfolino oligonükleotitler) fonksiyonunu test etmek için başka bir bileşik ekleyin. (Şekil 3), biz Morfolino oligonükleotidleri kullanılan sonuç tarif edildiği gibi sin1 fonksiyonlarını değerlendirmek. Bir kontrol olarak, sin1 morfolino ama bu kontrol morfolino hedef RNA&#39;yı eşleşmediğini şekilde dizisi boyunca dağıtılmış 5 nükleotidler denk bir morfolino kullanılır. <ol><li> Çözülme sin1 ve 5-uyumsuzluğu kontrol morpholinos (2 mM stok çözeltileri) ve buz üzerinde ABP140 mCherry mRNA&#39;lar. MRNA 375 ng (75 ng / nihai uL) ve sin1 ya da 5-uyumsuzluğu kontrol morfolino ya da 0.75 ul (0.3 mM nihai) Danieau tampon maddesi (58 mM NaCI, 0.7 mM eklemeKCI, 0.4 mm (3) 2, 5.0 mM HEPES, pH 7.6), 5 ul toplam hacme ulaşmak için, 0.6 mM Ca 4 MgSO. </li></ol></li><li> embriyo Koleksiyon Not: Bu deneysel kurmak için hem donör ve host embriyolar transgenik olan müstakbel prechordal plaka 11 görselleştirmek için goosecoid (GSC) kontrolü destekleyicisi altında GFP ifade. <ol><li> (: GFP gsc) yumurta Tg toplayın. embriyo orta ile dolu bir 90 mm Petri kabı, yaklaşık 80 yumurta yerleştirin ve 28 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol></li><li> Donör Embriyolar enjekte <ol><li> Bir stereomikroskop altında, yavaşça embriyo orta ile dolu bir enjeksiyon çanak satırlara forseps ile toplanan embriyolar sıkın. forseps kullanarak, üste doğru hücrelerle embriyolar yönlendirmek. Embriyolar 4-hücreli sahne (1 saat sonra döllenme) ulaşana kadar 28 ° C&#39;de inkübatör enjeksiyon çanak yerleştirin. </li><li> 2 ul bir enjeksiyon iğnesi yükEnjeksiyon çözeltisi. Bir hava Transjektör için (malzeme listesine bakınız), bir mikro-manipülatör yerleştirilir ve politetrafloroetilen (PTFE) tüp (Malzeme listesine bakınız) ile bağlı bir iğne tutucu (malzeme listesine bakınız) içinde iğneyi (malzeme listesini görmek ). </li><li> yavaşça ince forseps ile ucu dokunarak kılcal açın. Gerekirse, kendi ekstremite kısma açık kılcal kesti. </li><li> iğne ile dört hücrelerden birini girin ve hücre hacmi (2 nl)% 70 doldurmak için hücre içinde çözüm enjekte. 30 embriyolar enjekte edilir. Not: Plazma zarı yumuşak olduğu hücrede iğne alma, zor olabilir. hücre ve yumurta sarısı arasında kavşakta hedefleyen iğne penetrasyonu kolaylaştırır. </li><li> onlar küre sahne (4 saat sonra döllenme) ulaşana kadar 28 ° C inkübatör embriyolar yerleştirin. </li></ol></li></ol> Hücre transplant için Embriyolar 4. hazırlanmasıiyon <ol><li> 200 ul penisilin / streptomisin (malzeme listesine bakınız) (Pen / Strep EM) ile embriyonun orta 20 ml hazırlayın. </li><li> küre aşamasında embriyo dechorionation (4 saat sonra döllenme) Not: Dechorionated embriyolar çok kırılgan ve hava veya plastik ile temas halinde patlayacak. Dolayısıyla agaroz kaplı tabaklara yerleştirilir ve yangın cilalı cam Pasteur pipetler ile transfer edilmesi gerekir. <ol><li> Bir plastik Pasteur pipeti kullanarak, embriyo ortamda% 1 agaroz ile kaplı ve Pen / Strep EM ile dolu iki adet 35 mm Petri kapları içine adım 3.3 enjekte adım 3.2 toplanan konak embriyolar ve donör embriyolar transfer. iki ayrı yemekler ev sahibi embriyolar ve donör embriyolar tutun. </li><li> Elle ince cımbız (malzeme listesine bakınız) ile chorions embriyolar ayıklayın. </li><li> onlar kalkan sahne (6 saat sonra döllenme) ulaşana kadar 28 ° C inkübatör embriyolar yerleştirin. </li></ol></li></ol>5. Hücre Nakli <ol><li> Hücre Nakli Embriyolar düzenleyin. <ol><li> Bir floresan stereomikroskop altında seçin donör embriyolar kalkan (yeşil) içinde ABP140-mCherry (kırmızı) ifade. </li><li> Bir yangın cilalı Pastör pipeti kullanarak, Pen / Strep EM ile dolu hücre nakli plakasının gözenekleri içinde embriyo aktarımı. Komşu satırda bir satırda konak embriyolar ve donör embriyolar yerleştirin. </li><li> bir kirpik kullanarak, dikkatle kalkan up ile embriyolar yönlendirmek. Not: Kalkanın pozisyon GFP tarafından değerlendirilir ya da anatomik olabilir. </li></ol></li><li> Transplantasyon Sistemi Kurulumu. Not: Transplantasyon sistemi mikro sürücü ile donatılmış bir Hamilton şırıngaya (malzeme listesine bakın) PTFE tüp (Malzeme listesine bakınız) ve bir tüp konnektörü (Malzeme listesine bakınız) ile bağlantılı bir iğne tutucu oluşur (listeye bakın Malzemelerin). iğne tutucu3-yollu mikromanipülatör üzerine monte edilir (Malzeme listesine bakınız). <ol><li> eden bir şınngaya bağlanmış bir iğne tutucu kullanılarak,% 70 etanol ile hücre transplantasyonu için iğne yıkayın. iğne içine havayı emerek kuru. Bu toz iğne konik kısmında sıkışmış neden olabileceğinden, esen kuru etmeyin. </li><li> yukarı konik, Hamilton şırınga bağlı iğne tutucu iğne takın. </li></ol></li><li> Kalkan-to-kalkan Hücre Transplantasyonu <ol><li> transplantasyon iğne ile donör embriyo kalkanını girin ve ABP140-mCherry etiketli yaklaşık 10-20 hücreleri hazırlamak. Dikkatle sarısı çizim kaçının. </li><li> ev sahibi embriyo kalkanı içine hücreleri nakli. Tüm ev sahibi embriyolar nakledilen kadar tekrarlayın. </li><li> Bir yangın cilalı Pasteur pipeti ile hasarlı embriyolar çıkarın. 28 ° C inkübatör nakledilen embriyoların yerleştirin ve onları yaklaşık 30 dakika süreyle geri verelim. </li><li> Bir iğne kullanarakBir şırınga bağlı tutucu, su ile hücre nakli iğne durulayın ve modelleme kil bandında bir Petri kabındaki geri yerleştirin. parafilm çanak mühür. </li></ol></li></ol> 6. (İSTEĞE BAĞLI) Tek Hücre Nakli Not: nakli iğne tek bir hücre çizmek zor olacak şekilde embriyo, hücreler birbirine yapışır. Biz kolayca tek prechordal plaka progenitör hücreler nakli için modifiye edilmiş bir protokol geliştirmiştir. Fikir transplantasyon öncesinde hücreleri ayırmak etmektir. İzole prechordal plaka progenitör hücrelerin kimliklerini kaybetme eğilimindedir, çünkü biz genetik Sox32 transkripsiyon faktörü yokluğunda, Düğüm sinyalizasyon yolunun aktive ederek, ileriye dönük prechordal plaka kimlik bunları empoze. Biz bu uyarılmış hücreleri, endojen prechordal plaka progenitör hücrelerin 8 gibi davranır doğruladıktan. Aşağıda tek bir hücre nakli gerçekleştirmek için belirli adımlar vardır. hücre dissociation, kalsiyum içermeyen Ringer 11 embriyolar yerleştirerek bir eksplant kesme ve mekanik olarak karıştırılarak elde edilir. <ol><li> Adım 2.1 yerine Embriyo Orta Kalsiyum içermeyen Ringer% 1 agaroz ile nakli yemek hazırlamak. </li><li> Aşama 3.1 &#39;de, ABP140 mCherry RNA ve sin1 morfolino ilave olarak, 2, 3 (nihai 0.6 ng / | il) Düğüm reseptör Taram-A aktif formunu kodlayan RNA&#39;lar ng ve sox32 karşı morfolino 1.25 ul (stok çözeltisi ekleyin mM, dolayısıyla 0.5 mM nihai). </li><li> Aşama 4, transfer yangın cilalı Pastör pipeti kullanarak Pen / Strep kalsiyumsuz Ringer dolu hücre transplantasyonu için çanak seçilen üç donör embriyolar sonra. ince cımbız ile enjekte hücreleri (ABP140 mCherry etiketli hücreler) içeren bir eksplant teşrih. Hızla embriyoların kalanını atın. </li><li> Hücreler ayırmak kadar bir kirpik ile hafifçe eksplant karıştırın. </li><li> transplantasyon iğne tek bir izole hücre çizinve bir ev sahibi embriyo kalkan içine nakli. </li><li> Bir yangın cilalı Pastör pipeti kullanarak, Pen / Strep EM ile dolu bir agaroz kaplı tabak embriyolar aktarılır. 30 dakika boyunca 28 ° C&#39;de inkübatör içinde embriyo yerleştirin. </li></ol> Montaj 7. Embriyo <ol><li> Görüntüleme Odası <ol><li> Yöntem 1: Bir tarafta 3 mm yüksekliğinde kenarlı 4 delikli (5.5 mm çap), (Şekil 2C - D) ile delinmiş bir plastik slayt (75 x 25 x 0.5 mm) oluşan bir görüntüleme haznesi. siyanoakrilat yapıştırıcı (süper yapıştırıcı) ile arka tarafta bir cam lamel, Tutkal. Not: Deney sonunda, lamel kaldırmak ve zımpara kağıdı ile tutkal artıkları kurtulmak için bir gece suda odasına yerleştirin. </li><li> Yöntem 2: 10 mm delik olan 35 mm Mattek cam alt yemekleri (Malzeme listesine bakınız) kullanın. </li></ol></li><li> embriyo Montaj <ol><li> embriyo ortamda sıcak% 0.2 agaroz 1 ml cam şişe doldurun.ısı blokunda 42 ° C&#39;de tutun. </li><li> Floresan stereomikroskop altında, kırmızı nakledilen hücrelerin yeşil etiketli prospektif prechordal plaka (yani kırmızı nakledilen hücrelerin yeşil prospektif prechordal plaka içindedir, ve hayvan kutup doğru göç başlamıştır) bir parçası olduğu bir embriyo seçin. </li><li> Bir yangın cilalı Pastör pipeti ile agaroz çözeltisi içine seçilen bir embriyo transferi. pipetle embriyo orta fazlalığı atın. agaroz ile pipet embriyo çizmek ve agaroz bir damla yatırılması, görüntüleme odasında embriyo transferi. agaroz ayarlanır önce, bir kirpik ile embriyo yönlendirmek. dik bir mikroskop ile görüntüleme için yukarı muhtemel prechordal plaka yerleştirin veya bir ters mikroskop ile görüntüleme için cam alt. Agaroz odasının yanındaki kuyuda başka embriyo monte etmeden önce (oda sıcaklığına bağlı olarak yaklaşık 1 dakika) ayarlanır kadar bekleyin. Not: Bir görüntüleme chamber 4 kuyu içeren 4 embriyolar kadar montaj sağlar. </li><li> agaroz ayarlandığında, kurumasını önlemek için Pen / Strep EM ile odasını doldurun. </li></ol></li></ol> 8. Canlı Görüntüleme <ol><li> 40X su daldırma uzun menzilli lensi kullanın. GFP görüntü GFP ve mCherry (uygun filtre setleri kullanın:; uyarma BP 470/40, ışın ayırıcı FT 510 ve emisyon BP 540/50 MCherry için: uyarma BP 578/21, ışın ayırıcı FT 596 ve emisyon LP 641 / 75). Görüntü dinamiklerini optimize etmek için poz süresini ayarlayın. </li><li> plaka tüm hücreler görüntü için (ektoderm) prospektif prechordal plaka üzerinde bir kaç mikron başlayan ve (sarısında) prospektif prechordal plaka altında birkaç mikron biten, z-yığınları kazanır. 2 um z-adım kullanın. satın alma hızını optimize etmek için, z-yığınlarının arasında yerine kare arasında renkleri geçiş. Bu yeşil ve kırmızı görüntüler arasında hafif farklılıklara yol açabilir, ancak kesin co beri bir sorun değil: Notyeşil ve kırmızı sinyaller arasındaki -localization gereklidir. Işık daha fazla görüntüleme süresi ve maruziyeti azaltmak için, yeşil yalnızca bir kez prechordal plaka progenitör hücreleri tanımlamak için yeterlidir her 5 kez puan elde edilebilir. </li><li> çıkıntı sıklığını ve yönünü analiz etmek gereklidir iki dakikalık bir zaman aralığı içinde 4 embriyolar, görüntü gibi ayarları kullanma. çıkıntı ömür boyu analizi için, yüksek zaman çözünürlüğü elde etmek için 30 saniye zaman aralığını azaltmak. % 80 epiboly% 60 epiboly görüntü. </li></ol> 9. Hücre Dinamiği Analizi <ol><li> ImageJ 4D görüntüleri yüklemek Not: edinimi için kullanılan yazılıma bağlı olarak, görüntüler farklı biçimlerde saklanır (görüntü başına bir dosya, z-yığınının başına bir dosya, bütün deney için bir dosya). Bazı ImageJ Eklentiler 4D yığınları açmak için online olarak hazırdır. Bizim verilerimiz z-yığınının başına bir dosya olarak saklanır. Veri kümesi büyük olduğundan, bunun sadece bir kısmını (bazı tim açmak için uygun olabilire noktaları, ya da z-yığını veya 8-bit bir Subpart) ... görüntüleri dönüştürülür. Biz talep üzerine dağıtmak için mutlu olurdu ki, bunu yapmak için bir ısmarlama ImageJ eklenti kullanmak. </li><li> Yönlendirme ve analizi Hücre çıkıntıların sıklığı <ol><li> prospektif prechordal plaka göçün ana yönünü belirlemek için GFP görüntüleri kullanın. Hücre çıkıntılar açı ölçümleri için bir referans olarak alır. Bu referans yönü görüntünün bir tarafına paralel olacak şekilde, yığın döndürün. </li><li> Bir hücre izleyin. Seç açı aracı. Her kare ve her çıkıntı için, çıkıntı ve referans yönü (Şekil 3A) arasındaki açıyı ölçmek için açı aracını kullanın. (Klavyede basın veya M) değeri saklamak için ölçün / Analiz komutunu kullanın. bir txt dosyası olarak sonuçları kaydedin. Bir sonraki hücreye ile tekrarlayın. </li><li> histogramlar olarak R ve arsa açısı dağılımı veri almak. Farklı koşullar karşılaştırmak için Kolmogorov-Smirnov testi (R ks.test) kullanın. Not: açı aracı klasik istatistiksel testler ve dairesel değil testlerin kullanımına izin veren, 0 ° ve 180 ° arasını kapsayan değerler sağlar. </li><li> Bu veri seti ile, dakikada hücre başına uzantı sayısı emisyon frekansı hesaplayabilir. Kullanım Student t-testi (R t.test) farklı koşullar karşılaştırmak için. </li></ol></li><li> Hücre Çıkıntılar ömür boyu analizi <ol><li> Her hücre ve her çıkıntı, ölçü çıkıntı süresi (çıkıntı kareler arasında mevcut x zaman aralığıdır sırasında kare sayısı) için. </li><li> Farklı koşullar karşılaştırmak için R. Kullanım Student T-testi (R t.test) veri almak. Not: Diğer göç özellikleri hücre göçü karakterize etmek amacıyla analiz ilginç olabilir. Bu hız, yön ve sebat ölçümleri veya hücre morfolojisi, hücre parçaları içerir. Bazı ticari yazılım uygulamaları bu özellikleri ölçmek için kullanılabilir, ancak açık kaynak yazılım başvurunun çok sayıdaÖrneğin morphodynamics 12 analiz etmek ADAPT olarak katyonlar ve ImageJ eklentileri de mevcuttur, diper göç 14 sırasında hücre sınırlarını izlemek için hücre yörüngeleri ve yön kalıcılık 13, CellTrack bakmak için. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Charras, G., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+influences+of+the+extracellular+environment+on+cell+migration.">Physical influences of the extracellular environment on cell migration.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 813-824 (2014).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+cell+migration:+A+multiscale+tuning+model.">Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model.</a> Journal of Cell Biology. 188 (1), 11-19 (2010).</li><li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Dang, I., Gorelik, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+signalling+to+the+Arp2/3+complex+steers+cell+migration.">Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration.</a> Nature. , (2013).</li><li>Dumortier, J. G., David, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TORC2+Component,+Sin1,+Controls+Migration+of+Anterior+Mesendoderm+during+Zebrafish+Gastrulation.">The TORC2 Component, Sin1, Controls Migration of Anterior Mesendoderm during Zebrafish Gastrulation.</a> Plos One. 10, e0118474 (2015).</li><li>Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+things:+cell+fates+and+cell+movements+during+early+embryogenesis+of+zebrafish.">Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish.</a> BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).</li><li>Ulrich, F., Concha, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slb/Wnt11+controls+hypoblast+cell+migration+and+morphogenesis+at+the+onset+of+zebrafish+gastrulation.">Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation.</a> Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).</li><li>Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+mesendoderm+migration+relies+on+an+intrinsic+directionality+signal+transmitted+through+cell+contacts.">Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 1-6 (2012).</li><li>Gritsman, K., Talbot, W. S., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+signaling+patterns+the+organizer.">Nodal signaling patterns the organizer.</a> Development. 127 (5), 921-932 (2000).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (29), (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration,+protrusions,+and+fluorescence+intensities.">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).</li><li>Gorelik, R., Gautreau, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+unbiased+analysis+of+directional+persistence+in+cell+migration.">Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration.</a> Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).</li><li>Sacan, A., Ferhatosmanoglu, H., Coskun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellTrack:+An+open-source+software+for+cell+tracking+and+motility+analysis.">CellTrack: An open-source software for cell tracking and motility analysis.</a> Bioinformatics. 24 (14), 1647-1649 (2008).</li><li>Tahinci, E., Symes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+functions+of+Rho+and+Rac+are+required+for+convergent+extension+during+Xenopus+gastrulation.">Distinct functions of Rho and Rac are required for convergent extension during Xenopus gastrulation.</a> Developmental biology. 259 (2), 318-335 (2003).</li><li>Zhang, T., Yin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stat3-Efemp2a+modulates+the+fibrillar+matrix+for+cohesive+movement+of+prechordal+plate+progenitors.">Stat3-Efemp2a modulates the fibrillar matrix for cohesive movement of prechordal plate progenitors.</a> Development. 141 (22), 4332-4342 (2014).</li><li>Riedl, J., Crevenna, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nature methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li><li>Burkel, B. M., Von Dassow, G., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin.">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (11), 822-832 (2007).</li><li>Yoo, S. K., Deng, Q., Cavnar, P. J., Wu, Y. I., Hahn, K. M., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+protrusion+and+polarity+by+PI3K+during+neutrophil+motility+in+live+zebrafish.">Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish.</a> Developmental cell. 18 (2), 226-236 (2010).</li><li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis.">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental biology. 393 (2), 209-226 (2014).</li><li>Johnson, H. W., Schell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+IP3+3-kinase+is+an+F-actin-bundling+protein:+role+in+dendritic+targeting+and+regulation+of+spine+morphology.">Neuronal IP3 3-kinase is an F-actin-bundling protein: role in dendritic targeting and regulation of spine morphology.</a> Molecular biology of the Cell. 20 (24), 5166-5180 (2009).</li><li>Yi, J., Wu, X. S., Crites, T., Hammer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+retrograde+flow+and+actomyosin+II+arc+contraction+drive+receptor+cluster+dynamics+at+the+immunological+synapse+in+Jurkat+T+cells.">Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu protokol, in vivo olarak, canlı görüntüleme hücre transplantasyonu ile kimerik embriyo oluşturulmasını birleştirerek hücre göçü bir aday genin rolünü araştırmak için kolay bir yol sunar. mozaik embriyoların Yaratılış Bir hücrenin dinamiklerini incelenmesi sitoplazmik uzantıları analiz etmek onun konturu görselleştirme gerektirir. böylece iyi bir görsel kontrast sunan, çevre - ya da farklı etiketli - Bu bir başka etikets...

Çok hücreli organizmalarda, hücre göçü bu doku ve organların içine hücreleri organizasyonunu sağlayan embriyonun gelişimi için ve doku homeostazında (yara iyileşmesi) ve bağışıklık yer alır erişkin yaşamda, hem esastır. Bu fizyolojik fonksiyonlara ek olarak, hücre göçü, kanser metastazı, dahil olmak üzere, özellikle de çeşitli patolojik durumlarda, katılır. Hücre göçü düz yüzeylere hücre hareketlerini sağlayan moleküler mekanizmaların genel bir anlayış sağlayarak, yıllardır in vitro analiz edilmiştir. Vivo Bununla birlikte, hücreler daha karmaşık bir çevre tarafından karşı karşıya kalırlar. Açık bir şekilde taşıma kılavuz hücreleri ya da salgılanan kemokinler, komşu gibi hücre dışı matris olarak bir organizma içindeki geçiş dış işaretlere etkilenebilir geçmiş yıllarda ortaya çıkan ve bu tarif edilmiştir ne değişebilir hücre göçü tahrik mekanizmaları &lt;em&gt; in vitro 1,2. Vivo hücre göçü temin eden mekanizmaların in vitro çalışmalar ile karşılaştırıldığında, esas olarak, çünkü artan teknik zorluk, şimdiye kadar daha az ilgi görmüştür. In vivo özellikle hücre göçü analizi göç hücrelere doğrudan optik erişim gerektiren, benzersiz hücreleri etiketlemek için teknikler kendi dinamiklerini ve morfolojisi yanı sıra kazanç veya fonksiyon kaybını görmek için aday genlerin rolü test etmek için yaklaşımlar. Şimdiye kadar, bu özellikleri barındıran bir kaç model sistemler vivo hücre göçü 3 incelemek için kullanılmıştır. Biz son zamanlarda vivo hücre göçü 4,5 yılında kontrolünde aday genlerin fonksiyonunu değerlendirmek için yeni bir uygun model sistem olarak erken Zebra balığı embriyolarının prospektif prechordal plaka göç kullanılır. (Aynı zamanda, ön mesendoderm olarak da bilinir) Aday prechordal plakası Gast başlangıcında oluşturan hücrelerin bir grup olduğuEmbriyonun sırt tarafında rulation. Gastrulasyon sırasında bu grup topluca Notokordun için prechordal plaka, bir mesendodermal kalınlaşma, anterior oluşturur ve nöral plakayı altta yatan, embriyo 6-8 hayvan kutup doğru göç eder. Posterior kısmı muhtemelen mezoderm 9 kafa katkıda iken prechordal plaka ön kısmı, kuluçka bezinin yol açacaktır. dış gelişme ve balık embriyo optik berraklık sayesinde, hücre göçü, doğrudan ve kolay bir yapı görülür. Hücre nakli mozaik embriyoların 10 hızlı ve kolay yaratılması için izin veren çok güçlü bir tekniktir. İzole hücrelerin etiketleme nakledilen hücrelerin sonuçlarında floresan sitoskeletal belirteçleri ifade, morfolojisi ve dinamikleri olan kolaylıkla görülebilir. kayıp veya fonksiyon kazancı bu birleştiren izinlerin bir kutu hücre özerk fonksiyonların analizi yaklaşımlarıdidate geni. Sunulan protokol in vivo 5 hücre göçü ve aktin dinamiklerini kontrol TORC2 bileşeni sin1 işlevini değerlendirildi açıklamaktadır. Sonuçlar belirtilen ve daha fazla ele alındığı gibi Ancak, in vivo olarak, hücre göçü kontrol herhangi bir aday genin potansiyel implikasyonları analiz etmek için kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="679">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:323px;">Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58&#160;mm)</td>
			<td style="width:71px;">Harvard Apparatus</td>
			<td align="right" style="width:119px;">300085</td>
			<td style="width:167px;">standard thickness</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm)</td>
			<td style="width:71px;">Harvard Apparatus</td>
			<td align="right">300085</td>
			<td>thin-walled</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>10&#160;000&#160;units penicillin and 10&#160;mg streptomycin per ml</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">fine tweezers</td>
			<td style="width:71px;">Dumont Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
			<td>5F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">glass bottom dishes</td>
			<td style="width:71px;">MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Air transjector</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Micro-forge</td>
			<td style="width:71px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Microgrinder</td>
			<td style="width:71px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">EG-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Micromanipulator (for injection)</td>
			<td style="width:71px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">MN-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:323px;">Micromanipulator (for cell transplantation)</td>
			<td style="width:71px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">Leica Micromanipulator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Hammilton Syringe</td>
			<td style="width:71px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">IM-9B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:323px;">Micropipette puller</td>
			<td style="width:71px;">David Kopf Instruments</td>
			<td style="width:119px;">Model 720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:323px;">Transplantation mold</td>
			<td style="width:71px;">Adapative Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">PT-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Needle holder</td>
			<td style="width:71px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">HI-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Tube connector</td>
			<td style="width:71px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">CI-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">PTFE tubing</td>
			<td style="width:71px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">CT-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing in vivo cell migration using cell transplantations and time-lapse imaging in zebrafish embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Sunulan teknik vivo hücre göçü kontrol, sin1, Tor karmaşık 2 (TORC2) çekirdek bileşenlerinden biri rolünü analiz etmek için kullanıldı. hücre nakli kullanımı izole hücreler ve hücre özerk etkilerinin analizi etiketleme izin verir. Film S1 nakledilen prechordal plaka progenitör hücrelerin göçünü gösteriyor. ABP140 ile Aktin etiketleme aktin zengin sitoplazmik uzantıların kolay görüntüleme sağlar. Biz onların sıklığını ve yönünü ö...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos at JoVE.com

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

analyzing-vivo-cell-migration-using-cell-transplantations-time-lapse

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

7.6K Görüntüleme.  IBENS, Institut de Biologie de l'École Normale Supérieure. Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration. 

Video: Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Time-lapse aydınlık stereomikroskobi ile Zebra balığı Larva Doku Onarım yakalama

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Gelişim Biyolojisi

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Photoconvertible PSmOrange Sistemi kullanılarak GFP transgenik zebrafish hücreleri izleme

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Canlı Zebra balığı Embriyolarında Biosense Motor Nöron Membranı Potansiyeli

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

Geliştirme gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çoklu foton zaman atlamalı görüntüleme: nöral Crest hücrelerde geçirme Zebra balığı embriyo görselleştirme

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

Kültür Drosophila Egg Chambers Time-Lapse filmler kullanarak yerel hücresel ve doku ölçeklerde Actomyosin dinamikleri Analizi

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its permeability, thereby allowing different molecules to be introduced to the cell. In this paper, electroporation is used to introduce plasmids to ependymoglial cells, which line the ventricular zone of the adult zebrafish telencephalon. A fraction of these cells shows stem cell properties and generates new neurons in the zebrafish brain; therefore, studying their behavior is essential to determine their roles in neurogenesis and regeneration. The introduction of plasmids via electroporation enables long-term labeling and tracking of a single ependymoglial cell. Furthermore, plasmids such as Cre recombinase or Cas9 can be delivered to single ependymoglial cells, which enables gene recombination or gene editing and provides a unique opportunity to assess the cell&#8217;s autonomous gene function in a controlled, natural environment. Finally, this detailed, step-by-step electroporation protocol is used to obtain successful introduction of plasmids into a large number of single ependymoglial cells.

Presented here is an electroporation method for plasmid DNA delivery and ependymoglial cell labeling in the adult zebrafish telencephalon. This protocol is a quick and efficient method to visualize and trace individual ependymoglial cells and opens up new possibilities to apply electroporation to a broad range of genetic manipulations.

Yetişkin Zebrafish Telencephalon Plazmid DNA In Vivo Teslim için Elektroporasyon Yöntemi

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Tüm Zebrabalığı Embriyolarının Uzun Zaman Atlamalı Konfokal Mikroskobu için Katmanlı Montaj Yöntemi

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Brainbow ve Time-lapse Konfokal Görüntüleme kullanarak Yaşayan Zebrabalıklarında Gelişen Beyni Görselleştirme

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Analiz

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler