Yeni Bir Damga Cihazı Kullanılarak İki Boyutlu Hücre Kültürlerinden Üç Boyutlu Sferoidlerin/Organoidlerin Üretilmesi

Bu çalışma, agaroz kalıplarında mikro kuyular oluşturmak için damga tabanlı bir sistem kullanarak 3D hücre yapıları oluşturmak için uygun maliyetli ve verimli bir metodoloji sunmaktadır. Sistem, tek tip sferoidlerin/organoidlerin oluşumunu teşvik eder, böylece hücre etkileşimlerini iyileştirir. Bu yaklaşım deneysel değişkenliği azaltır ve ilaç testi ve doku mühendisliğindeki uygulamaları destekler.

Üç boyutlu (3D) hücre kültürleri, hücreler ve hücre dışı matris arasında gelişmiş etkileşimleri teşvik ettikleri için, in vivo mikro ortamın geleneksel iki boyutlu (2D) kültürlere göre daha doğru bir temsilini sağlar. Bu çalışma, agaroz kalıplarında mikro kuyular oluşturmak için yenilikçi bir damga tabanlı sistem kullanarak 3D hücre yapıları (sferoidler/organoidler) oluşturmak için verimli, uygun maliyetli ve tekrarlanabilir bir metodoloji geliştirmeyi amaçlamıştır. 6 oyuklu bir plakanın oyuklu başına 663 mikro kuyu üretmek için yeni bir damga kullanıldı ve hücre agregasyonu için ideal bir ortam sağlandı. Birincil domuz pankreas adacık hücreleri, bu mikro kuyulara ekildi ve burada sferoidler/organoidler oluşturmak üzere toplandılar. Kültürler 37 ° C'de% 5 CO₂ altında inkübe edildi ve ortam her 3 günde bir değiştirildi. Sferoid oluşumu periyodik olarak izlendi ve karakterizasyon için örnekler toplandı. Yöntem, deneysel değişkenliği azaltarak, manipülasyonu en aza indirerek ve hücre etkileşimlerini geliştirerek başarılı bir şekilde tek tip ve yüksek kaliteli sferoidler üretti. Agaroz bazlı mikro model kalıpların kullanımı, 3D kültürler için basitleştirilmiş, kontrollü bir ortam sağlayarak standartlaştırılmış ve uygun maliyetli bir çözüm sundu. Bu metodoloji, ilaç testi ve doku mühendisliği uygulamalarını destekleyerek, çeşitli laboratuvar ortamlarında kolayca uygulanabilen 3D hücre kültürü modelleri için pratik ve ölçeklenebilir bir platform sunar.

Son 50 yılda, çok sayıda hücre biyolojisi araştırması, iki boyutlu (2D) kültürlerin, hayvan modellerinde gözlemlenen in vivo koşulları doğru bir şekilde kopyalayamadığını göstermiştir¹. Yapısal olarak, 2D hücre kültürleri, hücrelerin üç boyutlu olarak düzenlenmesine ve in vivo sistemlerde gözlemlenen durumu kopyalamasına izin vermez. Ayrıca, hücresel sinyal yolakları, üç boyutlu (3D) kültürlere kıyasla 2D kültürlerde değiştirilir, bu da 2D kültürleri kullanan belirli ilaç taraması türlerinin neden bu kadar tutarsız olduğunu açıklayabilir². 3D kültür sistemlerinin tanıtılmasıyla hücre kültürü tekniklerinde önemli bir gelişme ortaya çıkmıştır. 3D sistemler, hücresel bileşime ve sitomimariye bağlı olarak karmaşıklık açısından önemli ölçüde değişir. Genel olarak, iki tür yapı üretilir, yani: sferoidler ve organoidler. Sferoidler, normal veya tümör dokularından, embriyoid cisimciklerinden ve hücre dizilerinden elde edilen basit hücre kümeleri olarak tanımlanır. 3D yapıların oluşumu, yapısal destek ve biyokimyasal ipuçları sağlayan hücre dışı matris (ECM) bileşenlerinin aracılık ettiği hücre-hücre etkileşimleri ve sinyal yolları dahil olmak üzere çeşitli faktörlerden etkilenir. Bu elementler, doku organizasyonuna ve işlevine katkıda bulunan etkileşimleri düzenler³. Küresel kültür sistemi ilk olarak 1970'lerin başında, nodüler karsinomların bir modeli olarak V79 Çin hamster akciğer hücre hatları kullanılarak, yapışık olmayan koşullar altında büyüyen ve mükemmel küreler oluşturan tanımlanmıştır⁴. Organoidler, hücre sıralama ve soy spesifikasyonu gibi süreçler yoluyla mekansal olarak sınırlı bir şekilde kendi kendini organize eden ve in vivo gelişimi yansıtan kök veya progenitör hücrelerden türetilen organa özgü hücre tipleri kümeleri olarak tanımlanır⁵.

3D koşullar altında hücreleri kültürlemek için çeşitli mevcut yöntemler ve malzemeler mevcuttur. Şu anda 3D kültürler oluşturmak için kullanılan ana yöntemler şunlardır: 1) asılı damlalar; 2) dönen hücre kültürü ve düşük bağlı plastikler; 3) konik kuyular içeren piramit plakalar; 4) makro gözenekli iskeleler; 5) manyetik boncuklar; ve 6) iskele içermeyen hidrojeller.

Asılı damlalar, iskelesiz 3D kültürler elde etmek için kullanılan yöntemdir. Bu yöntem, kapsamlı taşıma ihtiyacı, düşük üretim verimliliği, küresel geometri ve yüksek kesme kuvvetlerine maruz kalma dahil olmak üzere belirli sınırlamalar sunar. Ayrıca, ortam değiştirme veya bileşik ekleme gibi özel prosedürler zor olabilir ve malzeme kaybına neden olabilir. Ayrıca, literatür raporları, bu yaklaşımı kullanırken bazı hücre hatlarının sıkıca paketlenmiş sferoidler üretemediğini göstermektedir⁶.

Dönen hücre kültürü ve düşük bağlı plastikler, hücrelerin substrata yapışmasını önlemek için kullanılır, bu da onların toplanmasına ve sferoidler oluşturmasına neden olur. Bu işlem, belirli şişeler ve/veya çalkalama/döndürme gerektirir. Bu, büyük ölçekli sferoidler veya organoidler üretimi için en basit yaklaşımlardan biri olmasına rağmen, özel ekipman ihtiyacı, düşük kültür ömrü, sferoidlerde boyut değişimi, hücrelerde mekanik hasar ve düşük verimlilik gibi dezavantajları da vardır⁶.

Konik kuyucuklar içeren piramit plakalar, bazı manipülasyonların sferoid/organoidlerin oluşumunu engelleyebileceği gerçeğine ek olarak, maliyetleri etkileyen ticari olarak temin edilebilen plakalardır⁷.

3D kültürleme için makro gözenekli iskeleler de kullanılır; Bununla birlikte, etkili hücre tohumlama ve homojen dağılımın elde edilmesinde büyük bir engel yatmaktadır. Bu sorun, gözenek boyutlarının hücre penetrasyonu için çok küçük veya hücreleri güvenli bir şekilde tutamayacak kadar büyük olması nedeniyle ortaya çıkar. Bu sorunu ele almak için, bu tekniğin karmaşıklığını ve maliyetini doğrudan etkileyen çeşitli stratejiler 8 araştırılmıştır.

Manyetik boncuk metodolojisi az sayıda sferoid/organoid üretir, yüksek bir maliyete sahiptir ve hücrelerin içinde nanopartikül kalıntıları bırakabilir⁹.

Sferoid yetiştirme sistemleri arasında, iskele içermeyen bir hidrojeli temsil eden yapışkan olmayan agaroz hidrojeller mevcuttur. Bu yaklaşım, 3D yapıların boyutu üzerinde hassas kontrol ve plaka başına bu yapılardan önemli sayıda üretme kapasitesi gibi dikkate değer faydalar sunar. Bu yöntemde, hücreler önceden şekillendirilmiş kuyucuklara sahip bir hidrojel içine sokulur, burada batar ve 3D sferoidlere¹⁰ kendi kendine monte edilirler.

Bu çalışmada, basit, verimli, tekrarlanabilir ve düşük maliyetli bir şekilde bir mikro model kalıbı kullanarak agaroz mikro kuyuları oluşturmak için bir cihaz ve metodoloji sunuyoruz.

Bu damganın, yerçekimi yardımıyla agarozda mikro kuyular oluşturmak için bir kalıp olarak kullanılması, mikro kuyu ve hücresel organizasyon içindeki hücre etkileşimini geliştirmeyi, in vitro olarak basit, verimli, tekrarlanabilir ve düşük maliyetli bir şekilde 3D yapılar (sferoidler / organoidler) üretmeyi, böylece araştırma süresinden ve laboratuvar kaynaklarından tasarruf etmeyi amaçlar.

Bu protokol, Kurumumuz CEUA-FMUSP: 1699/2021 İnsan Araştırmaları Etik Kurulu'nun 8 Eylül 2021'de onaylanan - "Domuz Pankreas adacıklarının İzolasyonu ve Kapsüllenmesi" yönergelerini takip eder ve Hücre ve Moleküler Terapi NUCEL Grubumuzun (www.usp.br/nucel), FAPESP Hibe No. 2016/05311-2, "Kronik-dejeneratif hastalıkların (kanser ve diyabet) tedavisini amaçlayan Rejeneratif Tıp" başlıklı Tematik Projesinin bir parçasıdır.

1. Damga cihazının imalatı

NOT: Bu Damga, NUCEL grubu (https://w3nucel.webhostusp.sti.usp.br/) tarafından özel olarak üretilmiştir. Damga cihazı, hassasiyeti ve gelişmiş üç boyutlu modelleme yetenekleri ile geniş çapta tanınan, referans verilen yazılım kullanılarak geliştirilmiştir.

1. Tasarlanan prototiplerin, sferoidler veya organoidler gibi eşdeğer sayıda üç boyutlu kültürün oluşturulmasını sağlamak için düzenlenmiş 663 mikropin içerdiğinden emin olun. Damganın T6 tepsi yüzeylerindeki stabilitesini sağlamak için, cihazın çevresi boyunca stratejik olarak beş destek noktası yerleştirin.
2. Mikro pimlerin, uzunlukları 1 ila 3 mm arasında değişen, ayarlanabilir boyutlara sahip konik bir tasarıma sahip olduğundan emin olun. Koninin taban çapı 0,7 ile 1,5 mm arasında değişirken, konik açısı 5° ile 10° arasında değişir.
3. Cihazın mikro pimlerin derinliğini tanımlayan "durdurma" yapısının, 10 ila 19 mm arasında ayarlanabilir bir uzunluğa ve 20 ila 40 mm çapa sahip olduğundan ve mikro pimlerin yüzeyi boyunca eşit olarak dağıtıldığından emin olun.
4. Ek olarak, kullanım sırasında pratikliği ve hassasiyeti artırmak için cihazı tek elle kullanıma uygun ergonomik bir tutamağa sahip olacak şekilde tasarlayın.
   NOT: Cihazın büyük ölçekli üretimini kolaylaştırmak için, 3D baskı işlemi için gerekli olan .stl formatındaki dijital dosya sağlanmıştır.
5. Uygun yazılımı kullanarak dilimleyin ve uyumlu bir 3D yazıcı ile yazdırın. Aşağıdaki yazdırma boyutlarını kullanın: X - 68 mm; Y - 120 mm; Z - 150 mm, işlevsellik ve yapısal kalite arasında ideal bir denge sağlar.
6. Cihazın üretimi için, optimum cihaz performansı için temel özellikler olan yüksek çözünürlüğe ve tek tip yüzey kalitesine sahip olması gereken UV ile kürlenebilen polimer reçine ile uyumlu, ışıkla sertleştirilebilir bir 3D yazıcı kullanın.
7. Seçilen 3D yazıcıyla uyumlu yazılımı kullanarak yazdırmak için dijital modeli dilimleyin.

2. Agaroz mikrokuyularının hazırlanması

1. Agaroz çözeltisini hazırlayın.
   1. Saf agaroz tozunu tartın ve %1-2'lik (a/h) bir nihai konsantrasyon elde etmek için 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözün.
   2. Çözeltiyi tamamen eriyene kadar bir mikrodalga veya su banyosunda ısıtın, homojen ve şeffaf olduğundan emin olun.
      NOT: Agarozu bozabileceğinden aşırı ısınmadan veya aşırı yeniden ısıtmadan kaçının. Büyük miktarlarda stok çözeltisi hazırlamayın.
   3. Çözeltinin pipetleme için ideal sıcaklık olan ~ 40 ° C'ye soğumasını bekleyin.
2. Ismarlama damgayı hazırlayın.
   1. Kalıntıları gidermek için damgayı yumuşak kıllı bir sünger ve damıtılmış su ile yıkayın.
   2. Steriliteyi sağlamak için temizlenmiş damgayı 5-10 dakika UV ışığına maruz bırakın.
3. Mikro kuyuları oluşturun.
   1. 40 °C agaroz çözeltisinin ~3 mL'sini 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna dökün/pipetleyin ve 2-3 mm'lik homojen bir derinlik sağlayın.
   2. Agaroz hala sıcakken ısmarlama damgayı kuyunun ortasına yerleştirin.
      NOT: Damga, hizalama ve stabilite sağlayan ve manuel destek ihtiyacını ortadan kaldıran yanal desteklere sahiptir. Her damga, kuyu başına ~ 663 mikro kuyu (~ 2 mm yüksekliğinde) oluşturur. Mikro pimlerde kabarcık olmadığından emin olun; Kabarcıklar oluşursa, onları ortadan kaldırmak için damgayı hafifçe hareket ettirin.
   3. Plakayı hareket ettirmeden agarozun oda sıcaklığında 5-10 dakika katılaşmasına izin verin.
      NOT: Mikrokuyu yapısındaki değişiklikleri önlemek için katılaşma sırasında agarozu rahatsız etmeyin.
   4. Mikro kuyucuklara zarar vermeden vakumu serbest bırakmak için hafif ileri geri hareketlerle damgayı çıkarın.
      NOT: Bu hareket hava girişini kolaylaştırarak jeli deforme etmeden düzgün bir şekilde damganın çıkarılmasını sağlar. Mikro kuyular sağlam kalmalıdır.
   5. Kalıntıları gidermek için mikro kuyuları 3x PBS solüsyonu ile yıkayın.
   6. Mikrobiyal kontaminasyonu ortadan kaldırmak için plakayı 10 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakın.
   7. 3 mL kültür ortamı ekleyin ve plakayı gece boyunca 37 ° C'de bir CO₂ inkübatöründe inkübe edin.
      NOT: Bu inkübasyon, hücre tohumlamasından önce kontaminasyon olmadığını doğrular.

3. Mikro kuyularda hücre tohumlama

1. Hücre süspansiyonunu hazırlayın.
   1. Homojen bir süspansiyon elde etmek için hücreleri tripsinizasyon veya başka bir ayrışma yöntemi ile toplayın.
   2. Hücreleri sayın ve konsantrasyonu mikro kuyu başına istenen sayıya göre ayarlayın.
      NOT: 663 mikro kuyuda mikro kuyu başına 5.000 hücreyi tohumlamak için en az 3.315 × 10⁶ toplam hücre içeren bir süspansiyon hazırlayın. Merkezi nekrozu önlemek ve yeterli besin ve oksijen difüzyonunu sağlamak için hücre konsantrasyonunu optimize edin.
2. Hücreleri tohumlayın.
   1. Hazırlanan hücre süspansiyonunun ~3 mL'sini mikro kuyucukların üzerine pipetleyin ve plakayı hafifçe döndürerek eşit dağılımı sağlayın.
   2. Hücrelerin yerçekimi ile çökelmesine izin verin (~ 10-15 dakika) veya 5 dakika boyunca 100 × g'da hafif santrifüjleme yapın.
      NOT: Hücrelerin mikro kuyularda konsantre olmasını sağlamak için santrifüjleme kullanılabilir.
   3. Plakayı, nemlendirilmiş bir atmosfere sahip 37 ° C'de bir CO₂ inkübatörüne aktarın.

4. 3D hücre kültürlerinin bakımı

1. Kültür ortamını değiştirin.
   1. Ortamı her 2-3 günde bir değiştirin, eski ortamın %50'sini çıkarın ve yeni ortam ekleyin.
      NOT: Dehidrasyonu önlemek için mikro kuyucukların kültür periyodu boyunca su altında kaldığından emin olun.
2. 3D kültürlerin oluşumunu izleyin.
   1. 3D yapılar tamamen oluşana ve kompakt hale gelene kadar kültürlemeye devam edin (örneğin, birincil pankreas adacık kültürleri için 2-3 gün).
      NOT: Daha uzun bir oluşum süresi gerektiren kültürler için, her 2-3 günde bir kısmi ortam değişiklikleri gerçekleştirin.

5. 3D yapıların toplanması ve karakterizasyonu

1. Sferoidleri/organoidleri toplayın.
   1. Eski ortamı çıkarın ve sıkıştırmayı veya ayrıştırmayı önlemek için geniş çaplı veya kesilmiş bir pipet ucu kullanarak güçlü pipetleme yoluyla 3D yapıları toplayın.
      NOT: Agregaları deforme etmeden yerinden çıkarmak için kuvvetli pipetleme kontrol edilmelidir.
2. Analiz için hazırlanın.
   1. Toplanan sferoidleri/organoidleri hemen kullanın veya ileride analiz etmek üzere düzeltin.
      NOT: Sferoidlerin birlikteliği ve stabilitesi hücre tipine, oluşum süresine ve kültür koşullarına bağlıdır. Ayrışmayı önlemek için dikkatli olmak çok önemlidir.

Bu çalışmada kullanılan hücre kültürü, domuz pankreas adacıklarından elde edilmiştir. Bu çalışmada kullanılan adacık preparatı, dithizone boyamaya dayalı olarak %80 ± %5 saflığa ve canlı hücrelerde floresein diasetat veya ölü hücrelerde propidyum iyodür tespitine dayalı olarak %>80 adacık hücresi canlılığına sahipti (Canlı/Ölü floresan yöntemi). Domuz pankreas adacık hazırlığının en az %80 saf (örneğin ditizon boyama ile) ve %>80 oranında ca...

Literatürde çeşitli 3D kültür protokolleri bulunmasına rağmen, Wassmer ve ^ark.13 tarafından yapılan bir çalışmada, pankreas adacıkları kullanılarak 3D yapılar oluşturmak için çeşitli metodolojiler test edilmiştir. Yazarlar, yerli adacıkların ve kendi kendine toplanan sferoidlerin boyut ve şekil açısından önemli ölçüde heterojenlik sergilediğini ve diğer yöntemler kullanılarak elde edilenlerden daha büyük olduğunu gözlemledile...

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Zizi de Mendonça (Tıp Fakültesi, São Paulo Üniversitesi, Brezilya) tarafından sağlanan mükemmel teknik yardım için özellikle minnettarız. Bu çalışma, aşağıdaki Brezilya araştırma kuruluşlarından alınan hibelerle desteklenmiştir: BNDES 09.2.1066.1, CAPES (PVE süreç numarası 88881.068070/2014-01), CNPq (hibe numaraları 457601/2013-2, 401430/2013-8 ve INCT-Regenera numarası 465656/2014-5), FAPESP (Tematik proje numarası 2016/05311-2), FINEP 01.08.06.05 ve Bilim ve Teknoloji Bakanlıkları (MCTI) ve Sağlık (MS-DECIT).