توليد الفيريات / العضيات ثلاثية الأبعاد من مزارع الخلايا ثنائية الأبعاد باستخدام جهاز ختم جديد

تقدم هذه الدراسة منهجية فعالة من حيث التكلفة وفعالة لتوليد هياكل الخلايا ثلاثية الأبعاد باستخدام نظام قائم على الطوابع لإنشاء الآبار الصغيرة في قوالب الاغاروز. يعزز النظام تكوين الكرات / العضيات الموحدة ، وبالتالي تحسين تفاعلات الخلية. يقلل هذا النهج من التباين التجريبي ويدعم التطبيقات في اختبار الأدوية وهندسة الأنسجة.

توفر مزارع الخلايا ثلاثية الأبعاد (3D) تمثيلا أكثر دقة للبيئة المكروية في الجسم الحي من الثقافات التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) ، لأنها تعزز التفاعلات المحسنة بين الخلايا والمصفوفة خارج الخلية. هدفت هذه الدراسة إلى تطوير منهجية فعالة وفعالة من حيث التكلفة وقابلة للتكرار لتوليد هياكل خلوية ثلاثية الأبعاد (كرويات / عضيات) باستخدام نظام مبتكر قائم على الطوابع لإنشاء آبار صغيرة في قوالب الاغاروز. تم استخدام طابع جديد لإنتاج 663 بئر صغير لكل بئر من صفيحة مكونة من 6 آبار ، مما يوفر بيئة مثالية لتجميع الخلايا. تم زرع خلايا جزر البنكرياس الخنازير الأولية في هذه الآبار الصغيرة ، حيث تجمعت لتشكيل كرويات / عضويات. تم تحضين المزارع عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} ، وتم استبدال الوسط كل 3 أيام. تمت مراقبة التكوين الكروي بشكل دوري ، وتم جمع العينات للتوصيف. نجحت الطريقة في إنشاء كفيريات موحدة وعالية الجودة ، مما يقلل من التباين التجريبي ، ويقلل من التلاعب ، ويعزز تفاعلات الخلايا. يوفر استخدام قوالب الأنماط الدقيقة القائمة على الاغاروز بيئة مبسطة وخاضعة للرقابة للثقافات ثلاثية الأبعاد ، مما يوفر حلا موحدا وفعالا من حيث التكلفة. تدعم هذه المنهجية تطبيقات اختبار الأدوية وهندسة الأنسجة ، وتوفر منصة عملية وقابلة للتطوير لنماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد التي يمكن تنفيذها بسهولة في إعدادات المختبرات المختلفة.

على مدار الخمسين عاما الماضية ، أظهرت العديد من تحقيقات بيولوجيا الخلية أن الثقافات ثنائية الأبعاد (2D) تفشل في تكرار الظروف في الجسم الحي التي لوحظت بدقة في النماذج^{الحيوانية 1}. من الناحية الهيكلية ، لا تسمح مزارع الخلايا ثنائية الأبعاد للخلايا بالتنظيم ثلاثي الأبعاد وتكرار الوضع الذي لوحظ في أنظمة in vivo . علاوة على ذلك ، يتم تغيير مسارات الإشارات الخلوية في الثقافات ثنائية الأبعاد مقارنة بالثقافات ثلاثية الأبعاد (3D) ، والتي يمكن أن تفسر على الأرجح سبب تباين أنواع معينة من فحص الأدوية باستخدام الثقافات ثنائية الأبعاد². ظهر تقدم كبير في تقنيات زراعة الخلايا مع إدخال أنظمة الثقافة ثلاثية الأبعاد. تختلف أنظمة 3D اختلافا كبيرا في التعقيد اعتمادا على التركيب الخلوي والهندسة الخلوية. بشكل عام ، يتم إنشاء نوعين من الهياكل ، وهما: الكرويات والعضيات. توصف الكرات الكروية بأنها مجموعات بسيطة من الخلايا التي يتم الحصول عليها من الأنسجة الطبيعية أو السرطانية والأجسام الجنينية وخطوط الخلايا. يتأثر تكوين الهياكل ثلاثية الأبعاد بعوامل مختلفة ، بما في ذلك تفاعلات الخلية والخلية ومسارات الإشارات بوساطة مكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، والتي توفر الدعم الهيكلي والإشارات الكيميائية الحيوية. تنظم هذه العناصر التفاعلات التي تساهم في تنظيم الأنسجة ووظيفتها³. تم وصف نظام الثقافة الكروية لأول مرة في أوائل السبعينيات ، باستخدام خطوط خلايا رئة الهامستر الصينية V79 كنموذج للسرطان العقدي ، الذي ينمو في ظل ظروف غير ملتصقة ويشكل مجالات مثالية⁴. توصف العضيات بأنها مجموعات من أنواع الخلايا الخاصة بالأعضاء المشتقة من الخلايا الجذعية أو السلفية ، والتي تنظم ذاتيا من خلال العمليات ، مثل فرز الخلايا ومواصفات النسب ، بطريقة محدودة مكانيا ، مما يعكس التطور في الجسم الحي ⁵.

تتوفر العديد من الطرق والمواد المتاحة لخلايا الزراعة في ظل ظروف ثلاثية الأبعاد. الطرق الرئيسية المستخدمة حاليا لتوليد ثقافات ثلاثية الأبعاد هي: 1) قطرات معلقة. 2) ثقافة الخلايا الدوارة والبلاستيك منخفض التعلق ؛ 3) صفائح هرمية تحتوي على آبار مخروطية ؛ 4) السقالات الكبيرة التي يسهل اختراقها. 5) الخرز المغناطيسي. و 6) الهلاميات المائية الخالية من السقالات.

القطرات المعلقة هي الطريقة المستخدمة للحصول على ثقافات ثلاثية الأبعاد خالية من السقالات. تقدم هذه الطريقة قيودا معينة ، بما في ذلك الحاجة إلى معالجة واسعة النطاق ، وكفاءة إنتاج منخفضة ، وهندسة كروية ، والتعرض لقوى قص عالية. علاوة على ذلك ، يمكن أن تكون الإجراءات المحددة ، مثل الاستبدال المتوسط أو الإضافة المركبة ، صعبة وقد تؤدي إلى فقدان المواد. علاوة على ذلك ، تشير تقارير الأدبيات إلى أن بعض خطوط الخلايا تفشل في إنتاج كرويات معبأة بإحكام عند استخدام هذا النهج⁶.

تستخدم زراعة الخلايا الدوارة والبلاستيك منخفض الارتباط لمنع الخلايا من الالتصاق بالركيزة ، مما يؤدي إلى تجمعها وتشكيل كرويات. تتطلب هذه العملية قوارير محددة و / أو تحريض / دوران. على الرغم من أن هذا هو أحد أكثر الأساليب مباشرة لإنتاج الكرويات أو العضيات على نطاق واسع ، إلا أنه لا يخلو من عيوب ، مثل الحاجة إلى معدات معينة ، وطول عمر الثقافة المنخفض ، واختلاف الحجم في الكرويات ، والأضرار الميكانيكية للخلايا ، والكفاءة المنخفضة⁶.

الصفائح الهرمية التي تحتوي على آبار مخروطية هي صفائح متوفرة تجاريا تؤثر على التكاليف ، بالإضافة إلى حقيقة أن بعض التلاعبات قد تعيق تكوين الكرويات / العضيات⁷.

تستخدم السقالات الكبيرة التي يسهل اختراقها أيضا للثقافة ثلاثية الأبعاد. ومع ذلك ، تكمن العقبة الرئيسية في تحقيق تلقيح الخلايا الفعال والتوزيع المنتظم. تنشأ هذه المشكلة لأن أحجام المسام قد تكون إما صغيرة جدا لاختراق الخلايا أو كبيرة جدا للاحتفاظ بالخلايا بشكل آمن. لمعالجة هذه المشكلة ، تم استكشاف العديد من الاستراتيجيات⁸ ، والتي تؤثر بشكل مباشر على تعقيد هذه التقنية وتكلفتها.

تولد منهجية الخرز المغناطيسي عددا صغيرا من الكرويات / العضيات ، ولها تكلفة عالية ، وقد تترك بقايا الجسيمات النانوية داخل الخلايا⁹.

من بين أنظمة زراعة الأجسام الكروية ، تتوفر هيدروجيل الاغاروز غير اللاصق ، والذي يمثل هيدروجيل خال من السقالات. يوفر هذا النهج فوائد ملحوظة ، مثل التحكم الدقيق في حجم الهياكل ثلاثية الأبعاد والقدرة على توليد عدد كبير من هذه الهياكل لكل لوحة. في هذه الطريقة ، يتم إدخال الخلايا في هيدروجيل مع آبار مسبقة التشكيل ، حيث تغرق وتتجمع ذاتيا في كرويات ثلاثية الأبعاد¹⁰.

في هذه الدراسة ، نقدم جهازا ومنهجية لتوليد آبار الاغاروز الصغيرة باستخدام قالب micropattern بطريقة بسيطة وفعالة وقابلة للتكرار ومنخفضة التكلفة.

يهدف استخدام هذا الطابع كقالب لتوليد الآبار الصغيرة في agarose ، بمساعدة الجاذبية ، إلى تعزيز تفاعل الخلايا داخل الميكروWell والتنظيم الخلوي ، وتوليد هياكل ثلاثية الأبعاد (كرويات / عضويات) في المختبر بطريقة بسيطة وفعالة وقابلة للتكرار ومنخفضة التكلفة ، وبالتالي توفير وقت البحث والموارد المختبرية.

يتبع هذا البروتوكول إرشادات لجنة أخلاقيات البحث البشري التابعة لمؤسستنا CEUA-FMUSP: 1699/2021 ، المعتمدة في 8 سبتمبر 2021 - "عزل وتغليف جزر البنكرياس الخنازيرية" وهو جزء من المشروع المواضيعي لمجموعة العلاج الخلوي والجزيئي NUCEL (www.usp.br/nucel) ، منحة FAPESP رقم 2016 / 05311-2 ، بعنوان: "الطب التجديدي الذي يهدف إلى علاج الأمراض التنكسية المزمنة (السرطان والسكري)".

1. تصنيع جهاز الطوابع

ملاحظة: هذا الطابع مصنوع خصيصا من قبل مجموعة NUCEL (https://w3nucel.webhostusp.sti.usp.br/). تم تطوير جهاز الطوابع باستخدام البرنامج المشار إليه ، المعترف به على نطاق واسع بدقته وقدرات النمذجة ثلاثية الأبعاد المتقدمة.

1. تأكد من أن النماذج الأولية المصممة تحتوي على 663 ميكرو دبوس مرتبة لتمكين توليد عدد مكافئ من الثقافات ثلاثية الأبعاد ، مثل الكرويات أو العضيات. لضمان ثبات الختم على أسطح درج T6 ، ضع خمس نقاط دعم بشكل استراتيجي على طول محيط الجهاز.
2. تأكد من أن الميكروبينات ذات تصميم مخروطي بأبعاد قابلة للتعديل ، يتراوح طولها من 1 إلى 3 مم. يتراوح قطر قاعدة المخروط بين 0.7 و 1.5 مم ، بينما تتراوح زاوية الاستدقاق من 5 درجات إلى 10 درجات.
3. تأكد من أن هيكل "التوقف" للجهاز ، الذي يحدد عمق الميكروبينات ، له طول قابل للتعديل من 10 إلى 19 مم وقطره من 20 إلى 40 مم ، مع توزيع الميكروبوسات بشكل موحد عبر سطحه.
4. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتصميم الجهاز بحيث يكون له مقبض مريح ، مناسب للتشغيل بيد واحدة ، لتعزيز التطبيق العملي والدقة أثناء الاستخدام.
   ملاحظة: لتسهيل إنتاج الجهاز على نطاق واسع ، يتم توفير الملف الرقمي بتنسيق .stl ، وهو ضروري لعملية الطباعة ثلاثية الأبعاد.
5. ما عليك سوى تقطيعه باستخدام البرنامج المناسب وطباعته باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد متوافقة. استخدم أبعاد الطباعة التالية: X - 68 مم ؛ Y - 120 مم ؛ Z - 150 مم ، مما يضمن توازنا مثاليا بين الوظائف والجودة الهيكلية.
6. لتصنيع الجهاز ، استخدم طابعة ثلاثية الأبعاد قابلة للمعالجة الضوئية ، وهي متوافقة مع راتنج البوليمر القابل للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية والذي يجب أن يكون له دقة عالية وتشطيب سطح موحد ، وهي خصائص أساسية لأداء الجهاز الأمثل.
7. قم بتقطيع النموذج الرقمي للطباعة باستخدام برنامج متوافق مع الطابعة ثلاثية الأبعاد المحددة.

2. تحضير آبار الاغاروز الصغيرة

1. تحضير محلول الاغاروز.
   1. قم بوزن مسحوق الاغاروز النقي وقم بإذابه في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 1-2٪ (وزن / حجم).
   2. سخني المحلول في الميكروويف أو الحمام المائي حتى يذوب تماما ، مع التأكد من أنه متجانس وشفاف.
      ملاحظة: تجنب ارتفاع درجة الحرارة أو إعادة التسخين المفرط ، لأن ذلك قد يؤدي إلى تدهور الاغاروز. لا تقم بإعداد كميات كبيرة من محلول المخزون.
   3. اترك المحلول يبرد إلى ~ 40 درجة مئوية ، وهي درجة الحرارة المثالية لسحب العينات.
2. تحضير الختم المخصص.
   1. اغسل الختم بإسفنجة ذات شعيرات ناعمة وماء مقطر لإزالة البقايا.
   2. قم بتعريض الختم الذي تم تنظيفه للأشعة فوق البنفسجية لمدة 5-10 دقائق لضمان العقم.
3. تشكيل الآبار الصغيرة.
   1. صب / ماصة ~ 3 مل من محلول الاغاروز 40 درجة مئوية في كل بئر من صفيحة 6 آبار ، مما يضمن عمقا موحدا يبلغ 2-3 مم.
   2. ضع الختم المصنوع خصيصا في وسط البئر بينما لا يزال الاغاروز دافئا.
      ملاحظة: يحتوي الطابع على دعامات جانبية تضمن المحاذاة والثبات ، مما يلغي الحاجة إلى الدعم اليدوي. يخلق كل طابع ~ 663 بئر صغير (~ 2 مم في الارتفاع) لكل بئر. تأكد من عدم وجود فقاعات على الميكروبينات ؛ إذا تشكلت الفقاعات ، حرك الختم برفق للقضاء عليها.
   3. اترك الاغاروز يتجمد لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة دون تحريك اللوحة.
      ملاحظة: لا تزعج الاغاروز أثناء التصلب لتجنب الاختلافات في هيكل الميكروويل.
   4. قم بإزالة الختم بحركات لطيفة ذهابا وإيابا لتحرير المكنسة الكهربائية دون إتلاف الآبار الصغيرة.
      ملاحظة: تسهل هذه الحركة دخول الهواء ، مما يسمح بإزالة الختم بسلاسة دون تشويه الجل. يجب أن تظل الآبار الصغيرة سليمة.
   5. اغسل الآبار الصغيرة 3x بمحلول PBS لإزالة البقايا.
   6. قم بتعريض اللوحة للأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق للقضاء على التلوث الميكروبي.
   7. أضف 3 مل من وسط الاستزراع واحتضان اللوحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
      ملاحظة: تتحقق هذه الحضانة من عدم وجود تلوث قبل تلقيح الخلايا.

3. بذر الخلايا في الآبار الصغيرة

1. تحضير تعليق الخلية.
   1. اجمع الخلايا عن طريق التربسين أو طريقة تفكك أخرى للحصول على تعليق متجانس.
   2. عد الخلايا واضبط التركيز وفقا للرقم المطلوب لكل ميكروبئر.
      ملاحظة: لزرع 5,000 خلية لكل بئر صغير في 663 بئر صغير ، قم بإعداد معلق يحتوي على ما لا يقل عن 3.315 × 10⁶ خلايا إجمالية. تحسين تركيز الخلية لمنع النخر المركزي ولضمان انتشار المغذيات والأكسجين الكافي.
2. بذر الخلايا.
   1. الماصة ~ 3 مل من تعليق الخلية المحضرة فوق الآبار الصغيرة ، مما يضمن التوزيع المتساوي عن طريق تدوير اللوحة برفق.
   2. اسمح للخلايا بالاستقرار بالجاذبية (~ 10-15 دقيقة) أو إجراء طرد مركزي لطيف عند 100 × جم لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: يمكن استخدام الطرد المركزي لضمان تركيز الخلايا في الآبار الصغيرة.
   3. انقل اللوحة إلى حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ عند 37 درجة مئوية مع جو رطب.

4. صيانة مزارع الخلايا ثلاثية الأبعاد

1. استبدل وسط الاستزراع.
   1. قم بتغيير الوسط كل 2-3 أيام ، وإزالة 50٪ من الوسط القديم وإضافة وسط جديد.
      ملاحظة: تأكد من بقاء الآبار الصغيرة مغمورة طوال فترة الاستزراع لمنع الجفاف.
2. مراقبة تشكيل الثقافات ثلاثية الأبعاد.
   1. استمر في الاستزراع حتى يتم تشكيل الهياكل ثلاثية الأبعاد بالكامل وضغطها (على سبيل المثال ، 2-3 أيام لثقافات جزر البنكرياس الأولية).
      ملاحظة: بالنسبة للثقافات التي تتطلب وقتا أطول للتكوين ، قم بإجراء تغييرات جزئية في الوسط كل 2-3 أيام.

5. جمع وتوصيف الهياكل ثلاثية الأبعاد

1. اجمع الكرويات / العضيات.
   1. قم بإزالة الوسيط القديم وجمع الهياكل ثلاثية الأبعاد عبر سحب العينات القوية باستخدام طرف ماصة عريض القطر أو مقطوع لمنع الضغط أو التفكيك.
      ملاحظة: يجب التحكم في سحب العينات القوي لإخراج الركام دون تشويهها.
2. استعد للتحليل.
   1. استخدم الكرويات / العضيات التي تم جمعها على الفور أو قم بإصلاحها لتحليلها في المستقبل.
      ملاحظة: يعتمد ارتباط الكرويات واستقرارها على نوع الخلية ووقت التكوين وظروف الزراعة. توخي الحذر ضروري لتجنب الانفصال.

اشتقت زراعة الخلايا المستخدمة في هذه الدراسة من جزر البنكرياس الخنازيرية. كان مستحضر الجزيرة المستخدم في هذه الدراسة يحتوي على نقاء 80 ± 5٪ بناء على تلطيخ ديثيزون ، و >80٪ من صلاحية خلايا الجزيرة بناء على الكشف عن ثنائي أسيتات الفلوريسين في الخلايا الحية أو يوديد البروبيدي...

على الرغم من وجود العديد من بروتوكولات الثقافة ثلاثية الأبعاد في الأدبيات ، إلا أن دراسة أجراها Wassmer et ^al.13 اختبرت العديد من المنهجيات لتوليد هياكل ثلاثية الأبعاد باستخدام جزر البنكرياس. لاحظ المؤلفون أن الجزر الكروية الأصلية والكرويات المجمعة ذاتيا أظهرت ت...

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

نحن ممتنون بشكل خاص للمساعدة الفنية الممتازة التي قدمتها Zizi de Mendonça (كلية الطب، جامعة ساو باولو، البرازيل). تم دعم هذا العمل من خلال منح من وكالات البحث البرازيلية التالية: BNDES 09.2.1066.1 ، CAPES (رقم عملية PVE 88881.068070 / 2014-01) ، CNPq (أرقام المنح 457601/2013-2 ، 401430/2013-8 ، ورقم INCT-Regenera 465656/2014-5) ، FAPESP (رقم المشروع المواضيعي 2016/05311-2) ، FINEP 01.08.06.05 ووزارتي العلوم والتكنولوجيا (MCTI) والصحة (MS-DECIT).