Fare Retinasının Kriyoseksiyonu ve İmmün Boyanması

Fare retinal kriyoseksiyonlarının hazırlanması ve fotoreseptörler üzerinde immün boyama yapılması için bir protokol tanımlanmıştır. Bu makale, araştırmacıların iyi korunmuş morfoloji ve yüksek kaliteli immün boyama sonuçları ile fare retinal donmuş kesitlerini tutarlı bir şekilde üretmelerini sağlar.

Doku kesiti ve immünohistokimya, hayvan modelleri kullanılarak retina hastalıklarının histolojik ve patolojik çalışmalarında temel tekniklerdir. Bu yöntemler, doku morfolojilerinin ayrıntılı olarak incelenmesini ve doku içindeki spesifik proteinlerin lokalizasyonunu mümkün kılar ve bu da hastalık süreçleri ve mekanizmaları hakkında değerli bilgiler sağlar. Fareler bu amaç için en yaygın kullanılan modeldir. Bununla birlikte, fare gözbebekleri küçük ve fare retinaları son derece hassas dokular olduğundan, fare gözbebeklerinden yüksek kaliteli retina kesitleri ve immün boyama görüntüleri elde etmek tipik olarak zordur. Bu çalışma, fare retinalarının kriyoseksiyonu ve immünohistokimyanın gerçekleştirilmesi için geliştirilmiş bir protokolü tanımlamaktadır. Bu protokolün önemli bir noktası, göz küresinin korneanın çıkarılması, lens çıkarılması ve gömülmesi işlemleri sırasında gözbebeklerinin deformasyonunu önleyen bir süper yapıştırıcı tabakası ile kaplanmasını içerir. Bu adım, retina morfolojilerinin bütünlüğünün iyi korunmasını sağlar. Bu protokol, tutarlı bir şekilde yüksek kaliteli retina kesitleri üretmek ve mükemmel immün boyama sonuçları elde etmek için kritik teknik hususları ve optimizasyon stratejilerini vurgular.

Kriyoseksiyon ve immünohistokimya (IHC), biyomedikal araştırmalarda, özellikle retina¹ gibi karmaşık biyolojik yapıların incelenmesi için vazgeçilmez tekniklerdir. Bu gelişmiş metodolojiler, retinanın karmaşık hücresel bileşimini ve moleküler organizasyonunu anlamanın ayrılmaz bir parçasıdır. Araştırmacılara retina işlevselliğini ve patolojisini ayrıntılı bir düzeyde araştırma yeteneği sağlayarak, bu alandaki bilgiyi ilerletmek için kritik olan içgörüler sunarlar.

Kriyoseksiyon, retina dokusunun morfolojik bütünlüğünün korunmasında hayati bir rol oynar. Retinanın hassas yapısının bozulmadan kalmasını sağlayarak, bölümlerin sonraki immünofloresan çalışmalarında yüksek doğruluk ve güvenilirlikle kullanılmasına izin verir. Parafin gömme gibi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, kriyoseksiyon, hem doku morfolojisini hem de antijenisiteyi daha iyi koruduğu için önemli avantajlara sahiptir ve bu da onu immünohistokimyasal boyama için özellikle uygun hale getirir². Donmuş kesit tekniği, bir dizi karmaşık dokuyu ve hatta ince hücresel yapıları³ incelemek için yaygın olarak benimsenmiştir ve mimarilerinin hassas analizlerini sağlar.

IHC, dokulardaki spesifik proteinlerin lokalizasyonunun görselleştirilmesine izin veren güçlü ve çok yönlü bir laboratuvar tekniğidir. Bu teknik, teşhis, hastalık izleme ve biyolojik araştırmalar için yaygın olarak kullanıldığı hem klinik hem de araştırma ortamlarında bir mihenk taşı haline gelmiştir. Bir IHC deneyinin başarısı, büyük ölçüde titiz numune hazırlamaya, dokunun dikkatli bir şekilde ele alınmasına ve immün boyama koşullarının hassas kontrolüne bağlıdır. Protokoldeki küçük değişiklikler, sonuçların kalitesini büyük ölçüde etkileyebilir ve standardizasyon ve optimizasyonun önemini vurgular¹.

Kriyoseksiyon ve IHC birleştirildiğinde, retina içindeki çeşitli proteinlerin uzamsal dağılımını, ekspresyon seviyelerini ve hücresel etkileşimlerini keşfetmek isteyen araştırmacılar için benzersiz avantajlar sunar. Bu metodolojiler, retina gelişimi, işlevi ve hastalığının altında yatan moleküler mekanizmaların ayrıntılı olarak araştırılmasına izin verir. Bu tür bilgiler, yaşa bağlı makula dejenerasyonu, diyabetik retinopati ve retinitis pigmentosa dahil olmak üzere retina bozukluklarının incelenmesinde özellikle değerlidir. Bu durumların patofizyolojisini aydınlatarak, kriyoseksiyon ve IHC, potansiyel biyobelirteçlerin tanımlanmasına ve yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesine katkıda bulunur.

Kullanışlılığına rağmen, fare retinalarıyla çalışmak benzersiz zorluklar sunar. Fareler, insanlara genetik benzerlikleri ve iyi karakterize edilmiş retina yapıları nedeniyle oftalmik araştırmalarda hayvan modelleri olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, fare retina dokusunun küçük boyutu ve hassas doğası nedeniyle yüksek kaliteli kriyoseksiyonlar elde etmek doğası gereği zordur. Bu çalışma, fare retinalarında kriyoseksiyon ve IHC gerçekleştirme için ayrıntılı bir metodoloji sağlamak, kritik teknik hususları vurgulamak ve bu zorlukların üstesinden gelmek için optimizasyon stratejileri sunmak için sunmaktadır. Araştırmacılar, bu teknikleri geliştirerek, retina biyolojisi ve patolojisi çalışmalarını ilerleterek tutarlı ve yüksek kaliteli sonuçlar elde edebilirler.

Prosedür, Araştırmada Hayvanların Kullanımı için Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği tarafından belirlenen yönergelere bağlı kalmıştır. Sichuan İl Halk Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nden (IACUC) onay alındı. Bu protokol için iki ila üç aylık ve 25-30 g ağırlığındaki erkek C57Bl / 6J fareleri kullanıldı. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın kapsamlı bir listesi Malzeme Tablosunda verilmiştir.

1. Reaktif hazırlama

1. 1x PBS tamponu
   1. Bir ölçek kullanarak 8 g NaCl, 1.42 g Na₂HPO₄, 0.42 g KH₂PO₄ ve 0.2 g KCl tartın. Bunları bir behere aktarın ve bileşenleri çözmek için uygun miktarda çift damıtılmış su (ddH₂O) ekleyin. Çözeltiyi 1 L'lik hacimsel bir şişeye dökün ve hacmi ddH₂O ile 1 L'ye ayarlayın.
2. % 4 Paraformaldehit (PFA) çözeltisi
   1. 8 mL 1x PBS tamponu içeren 15 mL'lik konik bir tüpe 0.4 g PFA tozu ve 15 μL 1 M NaOH ekleyin. PFA tozunu tamamen çözmek için tüpü 60 °C'ye ayarlanmış bir su banyosuna yerleştirin. Son hacmi 1x PBS ile 10 mL'ye ayarlayın.
3. IHC engelleme çözümü
   1. 1 mL normal eşek serumu, 20 μL %20 NaN₃, 200 μL %20 Triton X-100 ve 18.78 mL 1x PBS tamponunu birleştirin. İyice karıştırın.
4. % 30 sükroz çözeltisi
   1. 15 g sükrozu 40 mL 1x PBS tamponunda çözün. Hacmi 1x PBS tamponu ile 50 mL'ye ayarlayın ve tamamen eriyene kadar karıştırın.
5. IHC ikincil antikor çözeltisi
   1. Hazırlanan engelleme tamponunu kullanarak Alexa Fluor 488-konjuge keçi tavşan antikorunu 1:300 oranında ve DAPI'yi 1:2.000 oranında seyreltin.

2. Fare göz küresi kriyoseksiyonu

1. Göz küresi diseksiyonu
   1. 3 aylık bir C57Bl / 6 fareyi (yaklaşık 25 g) 15 μL / g vücut ağırlığında bir dozda% 2 Tribromoetanolün intraperitoneal enjeksiyonu yoluyla uyuşturun. Servikal çıkık kullanarak fareyi feda edin (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek).
   2. Göz küresinin üst tarafını sklera üzerinde mavi bir işaretleyici ile işaretleyin (Şekil 1A). Makas kullanarak gözbebeklerini çıkarın.
   3. Göz küresi yüzeyinde kan varsa, tüy bırakmayan bir mendil kullanarak nazikçe silin. Diseksiyon mikroskobu altında, gözbebeklerine bağlı ekstraoküler kasları dikkatlice çıkarın.
2. Fiksasyon
   1. Diseke edilen gözbebeklerini 1 mL% 4 PFA içeren 2 mL yuvarlak tabanlı bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Gözbebeklerini 10 dakika sabitleyin. Daha sonra, gözbebeklerini ters çevrilmiş 3 veya 6 cm'lik bir Petri kabına aktarın.
   2. Diseksiyon mikroskobu altında, ince forseps ve oftalmik makas kullanarak kornea üzerinde küçük bir kesi (yaklaşık 1-2 mm) yapın. Buz üzerinde ek 2 saatlik bir sabitleme için gözbebeklerini %4 PFA solüsyonuna geri yerleştirin (Şekil 1B).
3. Kriyo koruma
   1. Sabitleyiciyi çıkarın ve gözbebeklerini 1x PBS tampon çözeltisi ile üç kez yıkayın. Göz kürelerini 4 ° C'de kriyoproteksiyon için 1 mL %30 sükroz çözeltisi içeren 2 mL yuvarlak tabanlı bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Gözbebeklerinin tüpün dibine yerleşmesine izin verin veya gece boyunca bırakın.
4. Göz küresinin kaplanması
   1. Bir göz küresini, kornea tarafı yukarı bakacak şekilde ters çevrilmiş bir Petri kabına aktarın. Tüy bırakmayan bir mendil kullanarak korneadaki fazla solüsyonu kurulayın. 2-3 cm'lik bir tenis ipi parçasını 0,2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde bulunan yapıştırıcıya (siyanoakrilatlardan oluşan) batırın, ardından hızlı bir şekilde çıkarın.
   2. Diseksiyon mikroskobu altında, tenis ipinin bir ucunu artık süper yapıştırıcı ile nemli korneanın merkezine tutturun. Tutkalın 10-20 saniye katılaşmasına izin verin. Tenis ipinin diğer ucunu kavrayın ve göz küresini süper yapıştırıcı ile doldurulmuş 200 μL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne daldırın, böylece skleranın yaklaşık 1 saniye boyunca tamamen daldırıldığından emin olun.
   3. Göz küresini hızlı bir şekilde çıkarın ve PBS'ye daldırın (Şekil 1C). Sklera yüzeyindeki yapıştırıcı hemen katılaşacaktır.
5. Korneanın çıkarılması
   1. Tüy bırakmayan bir mendil kullanarak katılaşmış tutkalın yüzeyindeki fazla PBS'yi kurulayın. Diseksiyon mikroskobu altında, takılı tenis ipini tutarken korneayı oftalmik makasla çıkarın.
6. Katıştırma
   1. Forseps kullanarak, lensi vizör lastiğinden dikkatlice çıkarın. Tüy bırakmayan bir mendil şeridi ile vizör lastiği içinde sıkışan fazla sakaroz solüsyonunu emdirin. Vizör lastiğini, optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği ile doldurulmuş bir gömme kalıba aktarın.
   2. Vizör lastiğini tamamen OCT ile doldurun. Vizör lastiğini, gömme kalıbın yan duvarına bakacak şekilde konumlandırın ve sagital düzlemin kalıbın tabanına paralel olduğundan emin olun. Sklera üzerindeki mavi işareti referans olarak kullanın. Vizör lastiğini içeren gömme kalıbını -80 °C'lik bir dondurucuya aktarın (Şekil 1D). Vizör lastiği beş dakika içinde donacaktır.
7. Kriyoseksiyon
   1. Donmuş vizör lastiğini -20 °C'ye ayarlanmış bir kriyostata aktarın ve 30 dakika boyunca hazne içinde dengelenmesine izin verin. Vizör lastiğini 12 μm kalınlığında bölümlere ayırın. Bölümleri daha sonra kullanmak üzere pozitif yüklü cam kızaklara monte edin.

3. İmmünohistokimyasal boyama

1. Pişirme
   1. Dondurulmuş bölümleri slaytlara yerleştirin ve dokunun slayta düzgün yapışmasını sağlamak için 37 °C fırında 30-60 dakika pişirin.
2. Yıkama
   1. Bir PAP kalemi kullanarak, slayttaki bölümlerin etrafına bir daire çizin. Slaytı 1x PBS tamponu içeren bir Coplin kavanozuna daldırın. Coplin kavanozunu yavaş bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve OCT bileşiğini çıkarmak için bölümleri 2 × 10 dakika yıkayın.
3. Engelleme ve geçirgenlik
   1. Slaytı yatay olarak bir nem odasına yerleştirin. Blokaj solüsyonunu daire içine alınmış bölümlere ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca blokaj ve geçirgenliğe izin verin.
4. Birincil antikor inkübasyonu
   1. Engelleme solüsyonunu slayttan dikkatlice aspire edin. Bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş birincil antikoru bölümlere ekleyin. Antikorun hedef antijene en iyi şekilde bağlanmasını sağlamak için nem odasındaki bölümleri gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
5. İkincil antikor inkübasyonu
   1. Birincil antikor solüsyonunu aspire edin ve slaytı 2 × 10 dakika boyunca 1x PBS ile iki kez yıkayın. DAPI ile karıştırılmış ve bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş uygun ikincil antikoru ekleyin.
   2. İkincil antikor bağlanmasına ve DAPI ile karşı boyamaya izin vermek için bölümleri oda sıcaklığında karanlık bir nem odasında 1 saat inkübe edin.
6. Montaj
   1. İkincil antikor solüsyonunu aspire edin ve slaytı 1x PBS ile 2 × 10 dakika durulayın. Slaytta kalan PBS'yi silmek için bir Kimwipe kullanın.
   2. Bölümlere uygun miktarda antifade montaj ortamı uygulayın ve üzerlerini bir lamel ile örtün. Floresansı korumak ve foto ağartmayı önlemek için monte edilen numuneleri karanlıkta 4 °C'de saklayın.

4. Görüntüleme

1. Lazer taramalı konfokal mikroskop kullanarak immün boyalı retina bölümlerinden floresan sinyalleri alın. Net ve belirgin floresan sinyallerini yakalamak için optimum çözünürlük ve hassasiyet ayarlarını yapın.
2. Deneyde kullanılan floroforların belirli dalga boylarını tespit etmek için uygun filtrelerin kullanıldığından emin olun.

Yukarıda özetlenen protokolü takiben, 1 aylık vahşi tip C57Bl / 6J farelerinin gözleri% 4 PFA'da sabitlendi. Sabit numuneler daha sonra OCT'ye gömüldü ve kriyoseksiyona tabi tutuldu. Kesitler bir anti-PDE6B antikoru ile immün olarak boyandı ve çekirdekleri etiketlemek için DAPI ile karşı boyandı. PDE6B, çubuk fotoreseptör hücrelerinde⁴ spesifik olarak eksprese edilen bir fototransdüksiyon proteinidir. Geleneksel protokollerle karşılaştırıl...

Fiksasyon çözeltisinin bileşimi, fiksasyon ve kriyoproteksiyon süresi ve gömme yöntemleri dahil olmak üzere doku kesitlerinin kalitesini etkileyen bir dizi faktör⁵. Göz küresini fareden enüklee ederken, göz küresine bağlı göz dışı kasları ve diğer bağ dokusunu çıkarmak önemlidir. Düzgün bir şekilde çıkarılmazsa, bu dokular göz yuvasından çıkarılması sırasında göz küresinin deformasyonuna neden olabilir ve potansiyel olarak ...

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çatışması yoktur.

Bu araştırma projesi, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82371059 (HZ), 82102470 (JW)), Sichuan Bilim ve Teknoloji Programı (2023JDZH0002 (HZ)) tarafından desteklenmiştir.