التشريح بالتبريد والتلوين المناعي لشبكية العين في الفأر

يتم وصف بروتوكول لإعداد استئصال شبكية الفئران بالتبريد وإجراء التلوين المناعي على المستقبلات الضوئية. تمكن هذه المقالة الباحثين من إنتاج أقسام مجمدة لشبكية العين باستمرار مع مورفولوجيا محفوظة جيدا ونتائج تلطيخ مناعي عالية الجودة.

يعد تقطيع الأنسجة والكيمياء المناعية من التقنيات الأساسية في الدراسات النسيجية والمرضية لأمراض الشبكية باستخدام النماذج الحيوانية. تتيح هذه الطرق إجراء فحوصات مفصلة لأشكال الأنسجة وتوطين بروتينات معينة داخل الأنسجة ، والتي توفر رؤى قيمة حول عمليات وآليات المرض. الفئران هي النموذج الأكثر استخداما لهذا الغرض. ومع ذلك ، نظرا لأن مقل عيون الفأر صغيرة وشبكية العين الفئرانية هي أنسجة حساسة للغاية ، فإن الحصول على أقسام شبكية عالية الجودة وصور تلطيخ مناعي من مقل عيون الفأر عادة ما يكون أمرا صعبا. تصف هذه الدراسة بروتوكولا محسنا لاستئصال شبكية الفئران بالتبريد وإجراء الكيمياء المناعية. تتضمن النقطة الأساسية في هذا البروتوكول طلاء مقلة العين بطبقة من الغراء الفائق ، مما يمنع تشوه مقل العيون أثناء عمليات إزالة القرنية واستخراج العدسة وتضمينها. تضمن هذه الخطوة الحفاظ على سلامة أشكال الشبكية بشكل جيد. يسلط هذا البروتوكول الضوء على الاعتبارات الفنية الهامة واستراتيجيات التحسين لإنتاج أقسام الشبكية عالية الجودة باستمرار وتحقيق نتائج ممتازة في التلوين المناعي.

يعد التشريح بالتبريد والكيمياء المناعية (IHC) من التقنيات التي لا غنى عنها في البحوث الطبية الحيوية ، خاصة لدراسة الهياكل البيولوجية المعقدة مثل شبكية^{العين 1}. هذه المنهجيات المتقدمة جزء لا يتجزأ من فهم التركيب الخلوي المعقد والتنظيم الجزيئي لشبكية العين. إنها توفر للباحثين القدرة على التحقيق في وظائف الشبكية وعلم الأمراض على مستوى مفصل ، مما يوفر رؤى ضرورية لتطوير المعرفة في هذا المجال.

يلعب التشريح بالتبريد دورا حيويا في الحفاظ على السلامة المورفولوجية لأنسجة الشبكية. يضمن بقاء البنية الدقيقة لشبكية العين سليمة ، مما يسمح باستخدام الأقسام في دراسات الفلورسنت المناعي اللاحقة بدقة وموثوقية عالية. بالمقارنة مع الطرق الأخرى ، مثل تضمين البارافين ، فإن القطع بالتبريد له مزايا كبيرة لأنه يحافظ بشكل أفضل على كل من مورفولوجيا الأنسجة والمستضدية ، مما يجعله مناسبا بشكل خاص للتلوين الكيميائي المناعي². تم اعتماد تقنية القسم المجمد على نطاق واسع لدراسة مجموعة من الأنسجة المعقدة وحتى الهياكل الخلوية الدقيقة³ ، مما يتيح إجراء تحليلات دقيقة لبنيتها.

IHC هي تقنية معملية قوية ومتعددة الاستخدامات تسمح بتصور توطين بروتينات معينة داخل الأنسجة. أصبحت هذه التقنية حجر الزاوية في كل من الإعدادات السريرية والبحثية ، حيث يتم استخدامها على نطاق واسع للتشخيص ومراقبة الأمراض والتحقيقات البيولوجية. يعتمد نجاح تجربة IHC بشكل كبير على التحضير الدقيق للعينة ، والتعامل الدقيق مع الأنسجة ، والتحكم الدقيق في حالات التلوين المناعي. يمكن أن تؤثر الاختلافات الصغيرة في البروتوكول بشكل كبير على جودة النتائج ، مما يؤكد أهمية التوحيد القياسي والتحسين¹.

عند الجمع بين التشريح بالتبريد و IHC يوفر مزايا لا مثيل لها للباحثين الذين يسعون إلى استكشاف التوزيع المكاني ومستويات التعبير والتفاعلات الخلوية للبروتينات المختلفة داخل شبكية العين. تسمح هذه المنهجيات بإجراء تحقيقات مفصلة في الآليات الجزيئية التكمن وراء تطور الشبكية ووظيفتها ومرضها. هذه الأفكار ذات قيمة خاصة في دراسة اضطرابات الشبكية ، بما في ذلك الضمور البقعي المرتبط بالعمر ، واعتلال الشبكية السكري ، والتهاب الشبكية الصباغي. من خلال توضيح الفيزيولوجيا المرضية لهذه الحالات ، يساهم التشريح بالتبريد و IHC في تحديد المؤشرات الحيوية المحتملة وتطوير استراتيجيات علاجية جديدة.

على الرغم من فائدته ، فإن العمل مع شبكية العين يمثل تحديات فريدة. تستخدم الفئران على نطاق واسع كنماذج حيوانية في أبحاث طب العيون نظرا لتشابهها الجيني مع البشر وبنية شبكية العين المميزة جيدا. ومع ذلك ، فإن الحصول على عمليات الاستئصال بالتبريد عالية الجودة أمر صعب بطبيعته بسبب صغر حجم أنسجة شبكية الفأر وطبيعتها الحساسة. توفر هذه الدراسة منهجية مفصلة للتقطيع بالتبريد وإجراء IHC على شبكية العين ، مع تسليط الضوء على الاعتبارات الفنية الهامة وتقديم استراتيجيات التحسين لمواجهة هذه التحديات. من خلال تحسين هذه التقنيات ، يمكن للباحثين تحقيق نتائج متسقة وعالية الجودة ، وتعزيز دراسة بيولوجيا الشبكية وعلم الأمراض.

التزم الإجراء بالمبادئ التوجيهية التي وضعتها جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون لاستخدام في البحث. تم الحصول على الموافقة من اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) التابعة للمستشفى الشعبي لمقاطعة سيتشوان. تم استخدام ذكور الفئران C57Bl / 6J ، الذين تتراوح أعمارهم بين شهرين وثلاثة أشهر ووزنهم 25-30 جراما ، لهذا البروتوكول. وترد قائمة شاملة بالكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.

1. إعداد الكاشف

1. 1x PBS المخزن المؤقت
   1. تزن 8 جم من كلوريد الصوديوم ، و 1.42 جم من Na₂HPO₄ ، و 0.42 جم من KH₂PO₄ ، و 0.2 جم من KCl باستخدام مقياس. انقلها إلى دورق وأضف كمية مناسبة من الماء المقطر المزدوج (ddH₂O) لإذابة المكونات. صب المحلول في قارورة حجمية سعة 1 لتر واضبط مستوى الصوت على 1 لتر مع ddH₂O.
2. محلول بارافورمالدهايد (PFA) بنسبة 4٪
   1. أضف 0.4 جم من مسحوق PFA و 15 ميكرولتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 8 مل من 1x PBS عازلة. ضع الأنبوب في حمام مائي مضبوطة على 60 درجة مئوية لإذابة مسحوق PFA تماما. اضبط مستوى الصوت النهائي إلى 10 مل باستخدام 1x PBS.
3. حل حجب IHC
   1. اجمع بين 1 مل من مصل الحمير العادي ، و 20 ميكرولتر من 20٪ NaN₃ ، و 200 ميكرولتر من 20٪ Triton X-100 ، و 18.78 مل من 1x PBS المخزن المؤقت. تخلط جيدا.
4. محلول السكروز 30٪
   1. قم بإذابة 15 جم من السكروز في 40 مل من 1x PBS المخزن المؤقت. اضبط مستوى الصوت على 50 مل باستخدام 1x PBS المؤقت واخلطه حتى يذوب تماما.
5. محلول الأجسام المضادة الثانوية IHC
   1. تمييع الجسم المضاد للماعز المترافق Alexa Fluor 488 بنسبة 1: 300 و DAPI بنسبة 1: 2,000 باستخدام المخزن المؤقت للحجب المعد.

2. التشريح بالتبريد مقلة العين

1. تشريح مقلة العين
   1. تخدير فأر C57Bl / 6 البالغ من العمر 3 أشهر (حوالي 25 جم) عن طريق الحقن داخل الصفاق من 2٪ ثلاثي البروم الإيثانول بجرعة 15 ميكرولتر / غرام من وزن الجسم. التضحية بالفأر باستخدام خلع عنق الرحم (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا).
   2. ضع علامة على الجانب العلوي من مقلة العين بعلامة زرقاء على الصلبة (الشكل 1 أ). قم بإزالة مقل العيون باستخدام المقص.
   3. في حالة وجود أي دم على سطح مقلة العين ، امسحه برفق باستخدام منديل خال من النسالة. تحت مجهر تشريح ، قم بإزالة العضلات خارج العين المرتبطة بمقل العيون بعناية.
2. تثبيت
   1. انقل مقل العيون المقطوعة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق دائري القاع سعة 2 مل يحتوي على 1 مل من 4٪ PFA. إصلاح مقل العيون لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، انقل مقل العيون إلى طبق بتري مقلوب مقاس 3 أو 6 سم.
   2. تحت مجهر تشريح ، قم بعمل شق صغير (حوالي 1-2 مم) على القرنية باستخدام ملقط دقيق ومقص للعيون. ضع مقل العيون مرة أخرى في محلول PFA بنسبة 4٪ لمدة ساعتين إضافيتين من التثبيت على الجليد (الشكل 1 ب).
3. الحماية بالتبريد
   1. قم بإزالة المثبت وغسل مقل العيون ثلاث مرات باستخدام محلول عازلة 1x PBS. انقل مقل العيون إلى أنبوب طرد مركزي دقيق دائري القاع سعة 2 مل يحتوي على 1 مل من محلول السكروز بنسبة 30٪ للحماية بالتبريد عند 4 درجات مئوية. اسمح لمقل العيون بالاستقرار في قاع الأنبوب أو اتركها طوال الليل.
4. طلاء مقلة العين
   1. انقلي مقلة العين إلى طبق بتري مقلوب بحيث يكون جانب القرنية متجها لأعلى. امسح المحلول الزائد من القرنية باستخدام منديل خال من النسالة. اغمس قطعة 2-3 سم من خيط التنس في الغراء (المكون من سيانواكريلات) الموجود في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.2 مل ، ثم قم بإزالته بسرعة.
   2. تحت مجهر تشريح ، قم بإرفاق أحد طرفي خيط التنس بالغراء الفائق المتبقي في وسط القرنية الرطبة. اترك الغراء يتجمد لمدة 10-20 ثانية. أمسك الطرف الآخر من خيط التنس واغمس مقلة العين في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 200 ميكرولتر مملوء بالغراء الفائق ، مما يضمن غمر الصلبة بالكامل لمدة 1 ثانية تقريبا.
   3. قم بإزالة مقلة العين بسرعة واغمرها في PBS (الشكل 1C). سوف يتجمد الغراء الموجود على سطح الصلبة على الفور.
5. إزالة القرنية
   1. امسح PBS الزائد على سطح الغراء المتصلب باستخدام منديل خال من النسالة. تحت مجهر تشريح ، قم بإزالة القرنية بمقص العين أثناء الإمساك بخيط التنس المرفق.
6. تضمين
   1. باستخدام الملقط ، قم باستخراج العدسة بعناية من واقية العين. امتص أي محلول سكروز زائد محاصر داخل منظار العين بشريط من المناديل الخالية من النسالة. انقل واقية العين إلى قالب تضمين مملوء بمركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT).
   2. املأ واقية العين بالكامل ب OCT. ضع واقية العين بحيث تواجه الجدار الجانبي لقالب التضمين ، مع التأكد من أن المستوى السهمي مواز لأسفل القالب. استخدم العلامة الزرقاء على الصلبة كمرجع. انقل قالب التضمين الذي يحتوي على واقية العين إلى فريزر -80 درجة مئوية (الشكل 1 د). سيتم تجميد كوب العين في غضون خمس دقائق.
7. التقطيع بالتبريد
   1. انقل كوب العين المجمد إلى ناظم البرد على -20 درجة مئوية واتركه يتوازن داخل الغرفة لمدة 30 دقيقة. قسم كوب العين بسمك 12 ميكرومتر. قم بتركيب الأقسام على شرائح زجاجية موجبة الشحنة للاستخدام اللاحق.

3. تلطيخ كيميائي مناعي

1. الخبز
   1. ضع الأجزاء المجمدة على شرائح واخبزها في فرن 37 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة لضمان التصاق الأنسجة بشكل صحيح بالشريحة.
2. غسل
   1. باستخدام قلم PAP ، ارسم دائرة حول الأقسام الموجودة على الشريحة. اغمر الشريحة في جرة Coplin تحتوي على 1x PBS buffer. ضع برطمان كوبلن على شاكر بطيء واغسل الأقسام لمدة 2 × 10 دقائق لإزالة مركب OCT.
3. الحجب والنفاذية
   1. ضع الشريحة أفقيا في غرفة الرطوبة. أضف محلول الحجب إلى الأقسام المحاطة بدائرة واسمح بالحظر والنفاذية في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
4. حضانة الأجسام المضادة الأولية
   1. استنشق محلول الحظر بعناية من الشريحة. أضف الجسم المضاد الأساسي المخفف في محلول المانع إلى الأقسام. احتضان الأقسام في غرفة الرطوبة عند 4 درجات مئوية طوال الليل لضمان الارتباط الأمثل للجسم المضاد بالمستضد المستهدف.
5. حضانة الأجسام المضادة الثانوية
   1. استنشق محلول الأجسام المضادة الأساسي واغسل الشريحة مرتين باستخدام 1x PBS لمدة 2 × 10 دقائق. أضف الجسم المضاد الثانوي المناسب ، الممزوج ب DAPI ، ومخفف في محلول الحظر.
   2. احتضان الأقسام في غرفة رطوبة داكنة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة للسماح بربط الأجسام المضادة الثانوية والتلوين المضاد باستخدام DAPI.
6. تصاعد
   1. قم بشفط محلول الأجسام المضادة الثانوية واشطف الشريحة باستخدام 1x PBS لمدة 2 × 10 دقائق. استخدم Kimwipe لمسح أي PBS متبقي على الشريحة.
   2. ضع كمية مناسبة من وسيط التثبيت المضاد للبهتان على الأقسام وقم بتغطيتها بغطاء غطاء. قم بتخزين العينات المركبة عند 4 درجات مئوية في الظلام للحفاظ على التألق ومنع التبييض الضوئي.

4. التصوير

1. احصل على إشارات مضان من أقسام الشبكية الملطخة بالمناعة باستخدام مجهر متحد البؤر بالمسح بالليزر. اضبط الإعدادات للحصول على الدقة والحساسية المثلى لالتقاط إشارات مضان واضحة ومميزة.
2. تأكد من استخدام المرشحات المناسبة للكشف عن الأطوال الموجية المحددة للفلوروفورات المستخدمة في التجربة.

باتباع البروتوكول الموضح أعلاه ، تم تثبيت عيون الفئران البرية C57Bl / 6J البالغة من العمر شهرا واحدا في 4٪ PFA. ثم تم تضمين العينات الثابتة في OCT وقطعها بالتبريد. تم تلطيخ الأقسام بجسم مضاد مضاد ل PDE6B وتم تلطيخها باستخدام DAPI لتسمية النوى. PDE6B هو بروتين نقل ضوئي يتم التعبير عنه على...

يؤثر عدد من العوامل على جودة أقسام الأنسجة ، بما في ذلك تكوين محلول التثبيت ، ووقت التثبيت والحماية من التبريد ، وطرق التضمين⁵. عند استئصال مقلة العين من الفأر ، من الضروري إزالة العضلات خارج العين والأنسجة الضامة الأخرى المرتبطة بمقلة العين. إذا لم تتم إزال?...

ليس لدى المؤلفين أي تعارض للإفصاح عنه.

تم دعم هذا المشروع البحثي من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82371059 (HZ) ، 82102470 (JW)) ، وبرنامج سيتشوان للعلوم والتكنولوجيا (2023JDZH0002 (HZ)).