Doğal γH2A ile yaygın kırılgan bölge kırılmalarının yakalanması. X ChIP

Doğal γH2A.X kromatin immünopresipitasyonu (ChIP) yoluyla yaygın kırılgan bölge kırılmalarını tespit etmek için hızlı ve etkili bir yöntem sunuyoruz. Bu yaklaşım, geleneksel γH2A.X ChIP tahlilleriyle ilişkili hem zamanı hem de işçiliği önemli ölçüde azaltırken, sonuçların yüksek tekrarlanabilirliğini ve güvenilirliğini korur.

Ekstrinsik ajanlara maruz kalmanın neden olduğu replikasyon stresi, genomda yapısal dengesizliğe eğilimli olduğu bilinen bölgeler olan ortak kırılgan bölgelerde DNA kırılmalarına yol açabilir. γH2A.X kromatin immünopresipitasyon (ChIP) testi, genotoksisite çalışmalarında güçlü bir araç olarak hizmet eder, çünkü γH2A.X fosforilasyonu, DNA çift iplikli kırılmalar için iyi bilinen bir belirteçtir. Bununla birlikte, geleneksel γH2A.X ChIP tahlilleri genellikle emek yoğundur ve çoklu, zaman alıcı adımlar içerir. Bu çalışmada, γH2A.X ile ilişkili kompleksleri izole etmek için hücre altı fraksiyonlamayı doğal ChIP ile birleştiren basitleştirilmiş ancak etkili bir yöntem sunuyoruz. Bu yaklaşım, gelişmiş özgüllük ve verimlilik ile γH2A.X-kromatin etkileşimlerini analiz etmek için özellikle uygundur. Hücre altı fraksiyonlama kullanılarak, kromatine bağlı olmayan malzemeler etkili bir şekilde uzaklaştırılır ve saflaştırılmış bir kromatin fraksiyonu elde edilir. Hafif koşullar altında müteakip mikrokokal nükleaz (MNaz) sindirimi, γH2A.X ve ilişkili protein kompleksleri arasındaki fizyolojik etkileşimleri korurken kromatin parçalanmasına izin verir. Bu koruma, DNA hasar tepki yollarında yer alan doğal etkileşim ortaklarını incelemek için gereklidir. Bu optimize edilmiş yerel ChIP protokolü, geleneksel γH2A.X ChIP tahlilleriyle ilişkili zamanı ve işçiliği önemli ölçüde azaltır. Kolaylaştırılmış prosedür yalnızca iş akışını basitleştirmekle kalmaz, aynı zamanda yüksek oranda tekrarlanabilir sonuçlar verir, bu da onu birden fazla numunenin yüksek verimli işlenmesinin gerekli olduğu ortamlarda özellikle avantajlı hale getirir. Bu yöntem, DNA hasar bölgelerinin doğru ve verimli bir şekilde tespit edilmesinin kritik olduğu genom stabilitesi, DNA onarımı ve kromatin biyolojisine odaklanan çalışmalarda geniş bir uygulanabilirliğe sahiptir. Optimize edilmiş protokoller ve kolaylaştırılmış adımlar kullanan bu yöntem, gelişmiş hassasiyet ve minimum numune işleme ile hassas bölgelerde DNA hasarının tespit edilmesini sağlar ve bu da onu genom stabilitesi ve DNA hasar tepkisi üzerine çalışmalar için değerli bir araç haline getirir.

Yaygın kırılgan bölgeler (CFS'ler), metafaz sırasında kırılmaya eğilimli her insan kromozomunda bulunan büyük kromozomal bölgelerdir. Replikasyon stresi altında, bu bölgelerdeki replikasyon önemli ölçüde gecikir ve mitotik giriş^1'den önce bunların tamamen tekrarlanması önlenir ve bu da sonuçta sahaya özgü boşluklar ve kırılmalarla sonuçlanır. CFS'ler kromozomal instabilite için sıcak noktalardır ve erken kanser gelişimi sırasında kromozomal yeniden düzenlemelerin önemli bir nedenidir. Genellikle tümörjenik koşullar altında mevcut olan replikasyon stresi, tümör baskılayıcı genlerin kaybına ve topluca kopya sayısı varyasyonu (CNV^{) olarak} adlandırılan onkogenlerin amplifikasyonuna yol açabilir - 2,3,4,5,6. Ek olarak, CFS'ler viral entegrasyona oldukça yatkındır ve kanser gelişimini daha da teşvik eder ^7,8,9,10. Primer tümörlerin pan-kanser analizleri sırasında CFS bölgelerinde tümör baskılayıcı genlerin çoklu homozigot delesyonları tespit edilmiştir. Kanserde en sık etkilenen CFS'ler FRA2F, FRA3B, FRA4F, FRA5H ve FRA16D'dir¹¹. CFS'ler, ekstrinsik kanserojen ajanların varlığında kırılmaya karşı özellikle hassastır¹². Çevresel kirleticilerin zararlı kanserojen etkilerini değerlendirmek için, CFS kırılma oluşumunu ölçmek için hızlı ve güvenilir bir yönteme ihtiyaç vardır.

H2A'nın fosforilasyonu. Ataksi Telenjiektazi ve Rad3 ile İlgili Protein (ATR) veya Ataksi Telenjiektazi Mutasyona Uğramış (ATM) serin kalıntısı 139'daki (γH2A.X) X, sinyal replikasyon çatalının durmasında önemli bir olaydır¹³. γH2A.X, çift iplikli kopma (DSB) oluşumundan¹³ önce durmuş replikasyon çatallarının bir göstergesi olarak hizmet eder ve onarım proteinlerinin durmuş bölgelere verimli bir şekilde alınmasını kolaylaştırmak için uygun bir kromatin ortamı yaratır. Ek olarak, γH2A.X, DSB onarımındaki birincil rolüyle tutarlı olarak, çatal çökmesi ^14,15'in ardından sahaları kırmak için işe alınabilir. Kronik Yorgunluk Sendromu kırılmaları, kanserin ilerlemesini sağlayan kromozomal anormalliklerle yakından ilişkili olduğundan, bu kırılmaların tespit edilmesi, tümör oluşumunun erken evrelerinin anlaşılmasında etkili olabilir. CFS'lerde γH2A.X'in varlığı, genomik instabilitenin erken olaylarını tespit etmek için bir biyobelirteç olarak kullanılabilir. Bu bilgi, potansiyel kanserojenlerin tanımlanmasına ve çeşitli dışsal ajanlara maruz kalmayla ilişkili riskin değerlendirilmesine yardımcı olabilir. γH2A.X kromatin IP (ChIP), ekstrinsik ajanlar tarafından indüklenen CFS'lerde DNA kırılmalarını ölçerek, bu tür ajanların tümörigenezin altında yatan mekanizmalara nasıl katkıda bulunduğuna dair fikir verebilir.

Konvansiyonel ChIP'de (yani, Çapraz bağlı ChIP, X-ChIP), γH2A.X'in hedef DNA dizileri ile ilişkisi, tersinir formaldehit çapraz bağlama ile stabilize edilir. Kromatin daha sonra sonikasyon yoluyla yaklaşık 500 baz çiftinin (bp) parçalarına kesilir ve elde edilen çözelti sedimantasyon 16,17,18 ile döküntülerden arındırılır. Daha sonra temizlenmiş kromatin fraksiyonuna bir ChIP dereceli γH2A.X antikoru eklenir, ardından γH2A.X'e bağlı kromatin bölgeleri 16,17,18 için zenginleştirmek üzere Protein A/G agaroz boncukları eklenir. Bağışıklık kompleksleri (yani, boncuk-antikor-γH2A.X-hedefli DNA kompleksi), spesifik olarak bağlı olmayan DNA parçalarını çıkarmak için sıkı yıkama tamponları ile birçok kez yıkanır 16,17,18. Yıkandıktan sonra, spesifik olarak bağlı DNA, bağışıklık komplekslerinden ayrıştırılır. Formaldehit çapraz bağları daha sonra tersine çevrilir, ardından proteinaz K kullanılarak protein sindirimi yapılır, ardından zenginleştirilmiş DNA saflaştırılır ve konsantre^edilir 16,17,18. γH2A.X ile ilişkili bölgeleri değerlendirmek için PCR, kantitatif PCR (qPCR) veya doğrudan dizileme kullanılır 16,17,18. γH2A.X'in CFS gibi belirli bölgelerdeki doluluğu, o konuma bağlı γH2A.X miktarı ile orantılı olan PCR veya qPCR sinyalinin yoğunluğu ile belirlenir ve bölgeye özgü DNA hasarı ve onarım olayları hakkında bilgi sağlar 16,17,18.

Güçlü bir deneysel yaklaşım olmasına rağmen, X-ChIP'nin birkaç önemli sınırlaması vardır: (i) fiksasyonla ilişkili antikor çökelmesinin verimsizliği nedeniyle, tipik olarak 1 x 10⁷ ila 5 x 10⁷ aralığında çok sayıda hücre gerektirir, bu da deneyin toplam maliyetini artırır¹⁹; (ii) formaldehit çapraz bağlarının tersine çevrilmesi ve müteakip DNA saflaştırılması süreci zaman alıcı ve emek yoğundur, bu da sonuçlarda tutarlılığı ve güvenilirliği korumayı zorlaştırır; ve (iii) küçük işlevsel öneme sahip γH2A.X-DNA etkileşimleri, daha büyük öneme sahip olanlardan ayırt edilemeyebilir, çünkü çapraz bağlama adımı geçici etkileşimleri stabilize edebilir ve biyolojik olarak ilgili olmayabilecek etkileşimlerin saptanmasına yol açabilir¹⁹.

Doğal kromatin immünopresipitasyonu (Native ChIP veya N-ChIP), fizyolojik tuz koşulları altında doğal kromatin bağlamında protein-DNA etkileşimlerini incelemek için kullanılan temel bir biyokimyasal tekniktir. Kromatinin uzamsal ve zamansal organizasyonunu, transkripsiyon faktörü bağlanmasını ve histon modifikasyonlarını aydınlatmada etkili olmuştur. Native ChIP, daha geniş kromatin biyolojisi ve epigenetik alanında uzun süredir devam eden bir role sahiptir ve X-ChIP'ye kıyasla benzersiz avantajlar ve sınırlamalar sağlar. 1980'lerin sonlarında^{tanıtılan bu yöntem20}, kromatinin mikrokokal nükleaz (MNase) ²¹ ile sindirim gibi doğal yapısını koruyan yöntemlerle hücrelerden izole edilmesini içerir. Bu, doğal protein-DNA ve histon-DNA temaslarını korur, bu da Native ChIP'yi doğal kromatin ayarlarında histon modifikasyonlarını ve nükleozom konumlandırmasını incelemek için özellikle uygun hale getirir²². Yüksek çözünürlüklü Yerel ChIP çalışmaları, kromatini tek tek nükleozomlara indirgemek için MNaz sindiriminin kullanıldığını göstermiştir, bu da histon modifikasyonlarının daha yüksek doğrulukla haritalanmasını kolaylaştırır²³. Ayrıca, hiçbir kimyasal çapraz bağlanma söz konusu olmadığından, protein-DNA etkileşimlerini yanlış temsil edebilecek önyargılar veya artefaktlar ortaya çıkma riski en aza indirilir²⁴.

Protein-DNA etkileşimlerini sabitlemek için formaldehit veya diğer çapraz bağlama ajanlarının kullanıldığı X-ChIP'nin aksine, Native ChIP, potansiyel çapraz bağlama artefaktlarından kaçınarak kromatinin daha gerçekçi bir görünümünü sağlar. Bununla birlikte, X-ChIP genellikle DNA ve düzenleyici proteinler²⁵ arasındaki geçici veya dinamik etkileşimleri tespit etmek için daha uygun olsa da, Native ChIP, histonlar veya diğer kromatine bağlı proteinler^26,27 gibi kararlı protein-DNA etkileşimleri için idealdir. Yerel ChIP için belirtilen sınırlamalardan biri, genellikle X-ChIP^25'te çapraz bağlama yoluyla stabilize edilen düşük afiniteli veya geçici bağlanma olaylarını yakalayamamaktır.

Epigenetikte önemli bir çalışma grubu, çeşitli biyolojik ortamlarda histon modifikasyonlarını ortaya çıkarmak için Native ChIP'den yararlanmıştır²⁸. Bu çabalar, gen ekspresyonunu ve kromatin dinamiklerini düzenleyen histon modifikasyonlarının modeli olan histon kodunu tanımlamada çok önemli olmuştur²⁹. Her ne kadar H2A. X, daha az güçlü bir şekilde ilişkili bir bağlayıcı histon, yerel H2A'dır. X ChIP yöntemi embriyonik kök hücrelerde³⁰ adet başarıyla uygulanmıştır. Bu çalışmada, insan 293T hücrelerinde γH2A.X'in Doğal ChIP'sini gerçekleştirmek için bir kromatin ekstraksiyon prosedürünü optimize ettik (Şekil 1). Hidroksiüre ve aphidikolin, DNA replikasyon stresi, hasarı ve genomik kararsızlığı araştırmak için araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır³¹. Bu çalışmada, bu ajanlar hücrelere replikasyon stresini indüklemek ve CFS'de DNA kırılmaları oluşturmak için uygulandı.

Yaklaşık 1 x 10⁶ ila 5 x 10⁶ hücreli başlangıç materyali kullanılarak, bu yöntem dört ana aşamaya ayrılabilir: (i) kromatini izole etmek için hücre altı fraksiyonlama, (ii) kromatini parçalamak için mikrokokal nükleaz (MNaz) sindirimi, (iii) immünopresipitasyon ve elüsyon ve (iv) kantitatif PCR (qPCR) ile DNA analizi. Hücre altı fraksiyonlamayı takiben ChIP'nin yürütülmesi çeşitli faydalar sağlar ve çok sayıda çalışmada iyi belgelenmiştir 32,33,34,35. Bu yaklaşım, kromatine bağlı olmayan proteinlerin ve diğer hücresel kalıntıların uzaklaştırılmasına izin vererek, yüksek oranda saflaştırılmış bir kromatin fraksiyonu ile sonuçlanır. İmmünopresipitasyondan önce kromatini izole ederek, hücre altı fraksiyonlama, doğal kromatin etkileşimlerinin korunmasına yardımcı olur ve kromatinle ilişkili olmayan proteinlerden gelen arka plan gürültüsünü azaltır, bu da analiz için yalnızca kromatine bağlı kompleksler tutulduğundan daha spesifik ve güvenilir sonuçlara yol açar. Ayrıca, hücre altı fraksiyonlama, kromatin sindirimi için daha hafif koşullar sağlar, böylece fizyolojik protein-DNA etkileşimlerini korur ve doğal hücresel ortamda kromatin dinamiklerinin daha doğru bir temsilini sunar.

Ekstrinsik ajanların yaygın kırılgan bölge kırılması üzerindeki etkisini ölçmek için γH2AX'in doğal ChIP'sini kullanmak, kanser araştırmaları için önemli bir potansiyele sahiptir. Bu teknik, çevresel kanserojenlere maruz kalmanın neden olduğu DNA hasarının tespit edilmesini sağlayarak, kirleticilerin genomik kararsızlığa ve kanser gelişimine katkıda bulunduğu moleküler mekanizmalar hakkında bilgi sağlar. Bu yöntem, doğal kromatin bağlamını koruyarak, kanserojen maruziyetle ilişkili DNA hasar modellerinin doğru bir şekilde değerlendirilmesini kolaylaştırır, çevresel risklerin değerlendirilmesine ve kirliliğe bağlı tümör oluşumunun incelenmesine yardımcı olur.

1. Hücre toplama

1. Her biri 4 mL tam DMEM ortamı içeren dört adet 6 cm'lik tabağın her birine yaklaşık 5 x 10⁵ HEK 293T hücresi tohumlayın.
2. 24 saat sonra, bir tabağa 2 μL 1 mM Aphidicolin ( Malzeme Tablosuna bakın) stok çözeltisi (0.5 μM'lik nihai konsantrasyon) ve başka bir tabağa 20 μL 1 M hidroksiüre ( Malzeme Tablosuna bakın) stok çözeltisi (5 mM'lik nihai konsantrasyon) ile muamele edin replikasyon stresini indüklemek için. Kontrol görevi görmesi için kalan iki yemeğe DMSO ekleyin.
3. 24 saatlik tedaviden sonra kültür ortamını atın. 6 cm'lik bir plaka tipik olarak %60-70 birleşmede yaklaşık 2 x 10⁶ hücre verir.
4. Her tabağı 2 kez 5 mL buz gibi soğuk 1x PBS ile durulayın. Hücreleri ayırmak için hücre sıyırıcılar kullanın ve hücre süspansiyonunu dört ayrı 1.5 mL tüpe aktarın. Hücre kümelerini ayırmak için bir P1000 pipetle nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
5. Hücreleri 500 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin, ardından süpernatanı atın. Hücreleri buzun üzerine yerleştirin.

2. Hücre altı fraksiyonasyon

1. Hücre peletini 500 μL taze hazırlanmış soğuk Tampon A içinde yeniden süspanse edin ( Tablo 1'e bakın), nazik pipetleme ile hücre kümelerinin tamamen ayrışmasını sağlayın.
2. Lizatları buz üzerinde 5-10 dakika inkübe edin. Hücre lizizinin tamamlandığından emin olmak için lizis ilerlemesini mikroskop altında kontrol edin.
   1. Lizattan küçük bir alikot alın (yaklaşık 5-10 μL) ve temiz bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin. Kirlenmeyi önlemek için bir lamel ile örtün.
   2. Hücreleri veya kalıntıları görselleştirmek için uygun bir büyütme oranına (örn. 20x - 40x) sahip bir ışık mikroskobu kullanın. Sağlam hücreler ve parçalanmış materyal arasında ayrım yapmak için parçalanmamış bir kontrol numunesi ile karşılaştırın.
      NOT: Düzgün bir şekilde parçalanmış bir numune, belirgin hücre ana hatlarına sahip olmayacaktır, yalnızca dağınık kromatin veya hücresel materyale sahip olacaktır. Lizatı net bir şekilde gözlemlemek için odağı ayarlayın. Gerekirse, belirli hücre tipleriyle çalışırken Dounce homojenizatör kullanmak gibi lizis adımı sırasında mekanik kuvvet uygulayın.
3. Hücreler tamamen parçalandıktan sonra 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice atın. Geniş delikli pipet uçları kullanarak çekirdek peletini 500 μL soğuk Tampon A'da yeniden süspanse edin.
   NOT: Geniş delikli uçlar, kesme kuvvetlerini en aza indirmeye ve kromatin gibi hassas numuneleri korumaya yardımcı olur. Standart uçların ucunu keskin bir bıçakla keserek geniş çaplı uçlar yapın.
4. 500 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice atın.
5. Bir inkübatörü önceden 37 °C'ye ısıtın ve bir durdurma tamponu hazırlayın (100 mM EDTA, pH 8.0; Tablo 1).
6. Mikrokokal Nükleaz (MNase, Malzeme Tablosuna bakın) konsantrasyonlarını ve inkübasyon sürelerini önceden optimize edin.
   1. Farklı MNaz konsantrasyonlarını ve inkübasyon sürelerini test etmek için 40 μL test kromatin örneğini birkaç eşit alikota bölün.
   2. Bir dizi MNaz konsantrasyonu kullanın (ör., 0.0625 U, 0.125 U, 0.25 U, 0.5 U, 1 U, 2 U, 4 U, reaksiyon başına 8 U) ve çoklu inkübasyon sürelerini test edin (ör., 2, 5, 10 ve 15 dakika).
   3. Kromatin alikotlarına çeşitli konsantrasyonlarda MNaz içeren MNase Tamponu ( Tablo 1'e bakın) ekleyin ve numuneleri belirtilen süreler boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   4. İstenen inkübasyon süresinden hemen sonra 1/4 hacim durdurma tamponu (nihai konsantrasyon: 20 mM EDTA) ekleyerek reaksiyonu sonlandırın.
   5. Bir fenol / kloroform / izoamil alkol ekstraksiyon yöntemi kullanarak sindirilmiş kromatin örneklerinden DNA'yı izole edin.
   6. Sindirim modellerini görselleştirmek için ekstrakte edilen DNA'yı %1.5'lik bir agaroz jel üzerinde çalıştırın: Yetersiz sindirim, yüksek moleküler ağırlıklı bantlar gösterecektir (Şekil 2, şerit 1-4); aşırı sindirim, bir leke veya çok kısa fragmanlarla sonuçlanacaktır (Şekil 2, şerit 6-8) ve optimal sindirim, net bir nükleozomal merdiven modeli verecektir (Şekil 2, şerit 5, örneğin, mono-, di-, tri-nükleozomlar).
   7. Aşırı sindirim olmadan istenen nükleozomal çözünürlüğü üreten koşulları belirleyin.
      NOT: CaCl₂ , MNaz aktivitesi için bir kofaktör görevi görür. CaCl₂ konsantrasyonunu 1 mM ile 5 mM arasında ayarlayarak sindirimi optimize edin.
7. Geniş delikli uçlarla 5 - 10 kez pipetleyerek sağlam çekirdekleri 100 μL MNase Tamponu ile nazikçe yeniden süspanse edin. Hemen numunelere önceden belirlenmiş miktarda MNase ekleyin (1.25 U MNase / 100 μL MNase Tamponu).
   NOT: Birden fazla numuneyle çalışırken, aşırı sindirimi önlemek için her birini ayrı ayrı sindirin.
8. Tüpleri bir döndürücüye yerleştirin ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Tüpleri hemen buza geri döndürün ve 20 mM'lik bir nihai konsantrasyona EDTA ekleyerek MNase sindirimini sonlandırın ve girdaplama ile karıştırın.
9. Her numuneye 500 μL Tampon B ( Tablo 1'e bakın) ekleyin ve 5x - 10x yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Proteinleri buz üzerinde 5 dakika inkübe ederek çözündürün.
   NOT: Tampon B'deki tuz ve deterjan, zayıf kromatine bağlı proteinleri ayrıştırmaya ve immünopresipitasyon için epitopları açığa çıkarmaya yardımcı olur.
10. Çözünmeyen malzemeyi 4 °C'de 5 dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyerek peletleyin. Berrak süpernatanı, doğal kromatin fraksiyonu olarak etiketlenmiş yeni 1.5 mL tüplere aktarın. Numuneler -80 °C'de saklanabilir veya kromatin parçalanmasının verimliliğini doğrulamak için kullanılabilir.
    NOT: İlgilenilen protein-DNA etkileşimlerini bozabileceğinden, sık sık donma-çözülme döngülerinden kaçının. Mümkün olduğunda donma-çözülme döngülerini en aza indirin.

3. Kromatin parçalanmasının doğrulanması

1. Her numuneden 10 μL süpernatanı yeni bir 1.5 mL tüpe alın. 20 μL damıtılmış su ve 30 μL fenol/kloroform/izoamil alkol (25:24:1) ile karıştırın.
2. Tüpleri sıkıca kapatın ve 15-30 saniye kuvvetlice girdaplayın. 20.000 x g'da (veya santrifüjün maksimum hızında) 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, üç farklı katman gözlenecektir: şeffaf bir üst katman, beyaz bir orta katman ve sarı bir alt katman.
3. 20 μL üst sulu fazı (DNA içeren) dikkatlice yeni bir tüpe aktarın. Saflaştırılmış DNA'yı 100 V'ta 30 dakika boyunca% 1.5 agaroz jel içinde ayırın ve sindirim modellerini görselleştirin. Kromatin fragmanlarının boyutunun esas olarak 200 ila 1000 baz çifti arasında olduğundan emin olun.
   NOT: Uygun kromatin fragman boyutları, doğal ChIP'nin başarısı için çok önemlidir ve enzim birimleri, inkübasyon süresi ve CaCl₂ konsantrasyonu dahil olmak üzere MNaz tedavi koşullarına bağlıdır. MNaz sindirim verimliliği ayrıca hücre tipine ve sayısına göre değişebilir. Şekil 2'de (şerit 5) gösterilen kromatin parçalanma modeli, bu ChIP testi için önerilir.

4. İmmünopresipitasyon

1. Her numuneden 20 μL sindirilmiş kromatini 1.5 mL'lik taze bir tüpe alın ve 180 μL Elüsyon Tamponu ile karıştırın ( Tablo 1'e bakınız). Bu tüpleri Giriş numuneleri olarak etiketleyin ve -20 °C'de saklayın.
2. 400 μL kromatin örneğini ChIP için başka bir 1.5 mL tüpe aktarın.
3. Bir DMSO ile muamele edilmiş, bir Aphidicolin ile muamele edilmiş numuneye ve bir hidroksiüre ile muamele edilmiş numuneye γH2A.X antikoru ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. ChIP testi için negatif bir kontrol olarak DMSO ile muamele edilmiş başka bir numuneye aynı miktarda normal IgG ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın).
   NOT: Burada, 400 μL kromatin için tipik olarak 1 μg primer antikor kullanılır (yani, antikor nihai konsantrasyonu 2.5 μg/mL'dir). Bununla birlikte, farklı γH2A.X antikorları için optimal miktar ampirik olarak belirlenmelidir.
4. ChIP tüplerini 4 °C'de bir döndürücüye yerleştirin ve en az 5 saat veya tercihen gece boyunca inkübe edin.
5. Bu arada, 100 μL ChIP dereceli manyetik Protein A / G boncuklarını ( Malzeme Tablosuna bakın) yeni bir 1.5 mL tüpe alın. Boncukların doğru ölçümünü sağlamak için geniş delikli uçlar kullanın ve yavaşça pipetleyin. Tüpü en az 1 dakika manyetik bir stand üzerine yerleştirin, ardından sıvıyı dikkatlice atın.
6. Boncukları% 0.5 BSA içeren 1 mL 1x PBS'de yeniden süspanse edin. 4 °C'de yaklaşık 4 saat döndürün. Tüpü en az 1 dakika manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve süpernatanı atın.
7. Boncukları %0,5 BSA içeren 1 mL 1x PBS ile tekrar yıkayın. Manyetik boncukları peletlemek için tüpü 1 dakika manyetik standın üzerine yerleştirin, ardından süpernatanı atın.
   NOT: Adım 4.5 ila 4.7, antikorların manyetik boncuklara spesifik olmayan bağlanmasını azaltmak için boncukların ön kaplamasıdır.
8. Önceden kaplanmış boncukları geniş delikli uçlar kullanarak 100 μL Tampon B'de yeniden süspanse edin. Her bir ChIP numune tüpüne 25 μL önceden kaplanmış manyetik boncuk süspansiyonu ekleyin. 4 °C'de 2 saat döndürün.
9. ChIP tüplerini manyetik standın üzerine yerleştirin ve boncuklar tüpün yan tarafına tamamen takılana ve çözelti berraklaşana kadar bekleyin.
10. Manyetik boncukları bozmadan şeffaf süpernatanı atın. Boncukları 1 mL Yıkama Tamponu ile tekrar süspanse edin ( Tablo 1'e bakın) ve 4 °C'de 10 dakika döndürün.
11. Tüpleri manyetik standa geri yerleştirin ve çözelti berraklaşana kadar bekleyin. Yıkama tamponunu atın. Toplam dört yıkama için yıkamayı tekrarlayın.
12. Son yıkamadan sonra yıkama tamponunu atın ve kalan sıvıyı sıkmak için tüpleri 4 °C'de 30 saniye boyunca 400 x g'da kısa bir süre santrifüjleyin. Tüpleri manyetik standa geri yerleştirin ve tüpün altında kalan sıvıyı dikkatlice çıkarın.

5. Elüsyon ve DNA çökelmesi

NOT: Antikor etkinliği farklı partiler arasında farklılık gösterebilir. Western blot analizi ile immünopresipite edilmiş örnekleri kontrol ederek yeni bir antikorun bağlanma afinitesini doğrulamak önemlidir.

1. Aşağıda açıklandığı gibi Western blot (WB) kullanarak ChIP antikorunun aşağı çekme verimliliğini doğrulayın.
   1. Analiz için ChIP örneğinin küçük bir kopyasını alın (yani, genellikle ChIP örneğinin %10'u). Karşılaştırma için Giriş kromatini (ön immünopresipitasyon) ve negatif kontrolü (örneğin, IgG pull-down) dahil edin.
   2. Antikora bağlı boncuklardan proteinleri 20 μL 1x SDS-PAGE yükleme tamponunda ( Malzeme Tablosuna bakınız) 95 ° C'de 5 dakika ısıtarak elde edin.
   3. IP örneklerini, girişi ve kontrolleri %15'lik bir SDS-PAGE jele yükleyin. Jeli çalıştırın.
   4. Proteinleri ıslak veya yarı kuru bir transfer sistemi kullanarak 0.2 μm nitroselüloza ( Malzeme Tablosuna bakın) veya PVDF membranına aktarın.
   5. Spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için membranı oda sıcaklığında 1 saat boyunca TBST'de %5 yağsız süt veya BSA ile ( Tablo 1'e bakın) bloke edin.
   6. Membranı, oda sıcaklığında 1-2 saat veya gece boyunca 4 ° C'de bloke edici tampon içinde seyreltilmiş γH2A.X'e ( Malzeme Tablosuna bakın) karşı birincil antikor ile inkübe edin.
   7. Bağlanmamış antikorları çıkarmak için zarı 3x TBST ile yıkayın. Membranı HRP ile konjuge edilmiş bir ikincil antikor ile ( Malzeme Tablosuna bakınız) oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Fazla ikincil antikorları çıkarmak için zarı tekrar yıkayın.
   8. Kemilüminesan bir substrat kullanarak zarı geliştirin ve sinyali bir görüntüleyici ile görselleştirin. Aşağı çekmenin verimliliğini ve özgüllüğünü değerlendirmek için IP, giriş ve kontrol şeritleri arasındaki sinyal yoğunluğunu karşılaştırın.
      NOT: IP şeridindeki hedef proteine karşılık gelen bir bant, başarılı antikor çekme işlemini doğrular. Bu yaklaşım, ChIP deneyi sırasında hedef proteini yakalamada antikorun etkinliğini değerlendirebilmenizi sağlar.
2. Kalan ChIP numunelerinin her birine 50 μL Elüsyon Tamponu ( Tablo 1'e bakın) ekleyin. Tüpleri bir termomikser üzerine yerleştirin ve oda sıcaklığında 15 dakika çalkalayın.
3. Tüpleri en az 1 dakika boyunca manyetik tutucuya yerleştirin. Elute'u yeni tüplere toplayın. 1x tekrarlayın ve elute'yi aynı tüplerde toplayın.
4. Her ChIP elüsyon örneğine ek 100 μL Elüsyon Tamponu ve her Giriş örneğine 180 μL Elüsyon Tamponu ekleyin.
5. Her numuneye 200 μL fenol/kloroform/izoamil alkol (25:24:1) ekleyin ve kuvvetlice girdap yapın. Numuneleri 20.000 x g'da (veya maksimum hızda) 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
6. Her yeni 1,5 mL santrifüj tüpüne 19 μL 3M sodyum asetat (NaOAc, pH 5.2; Tablo 1'e bakın) ve 2 μL glikojen çözeltisi (20 mg/mL, Malzeme Tablosuna bakın) ekleyin.
7. Santrifüjlemeden sonra, üst sulu tabakayı (yaklaşık 190 μL) NaOAc ve glikojen içeren tüplere dikkatlice aktarın ve girdaplama ile karıştırın.
8. 500 μL% 100 etanol ve girdap ekleyin. Numuneleri -20 °C'de en az 2 saat veya gece boyunca inkübe ederek DNA'yı çökeltin.
9. Tüpleri 20.000 x g'da (veya maksimum hızda) 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Beyaz peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatanı atın. Peleti 1 mL% 70 etanol içinde yeniden süspanse edin ve iyice girdaplayın.
10. Tüpleri 20.000 x g'da (veya maksimum hızda) 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın. Kalan etanolü döndürmek için tüpleri kısaca tekrar santrifüjleyin. Bir P20 pipeti kullanarak etanolü dikkatlice çıkarın. DNA peletlerini 2-3 dakika havayla kurutun.
    NOT: DNA'nın yeniden çözünmesini zorlaştırabileceğinden, peleti aşırı kurutmaktan kaçının.
11. ChIP örnekleri için, DNA'yı 400 μL TE tamponunda yeniden süspanse edin ( Tablo 1'e bakınız). Giriş DNA'sı için, 1000 μL TE tamponunda yeniden süspanse edin. Ayrıştırılan numuneler artık -20°C'de saklanabilir.

6. qPCR ölçümü

1. Her numune için teknik üçlüler içeren ticari bir kit ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanarak qPCR gerçekleştirin. Amplifikasyonun özgüllüğünü sağlamak için erime eğrisi analizi yaparak tek bir spesifik PCR ürününün varlığını doğrulayın³⁶.
2. Veri analizi
   NOT: Bağıl miktar tayin analizinde, test numunesi, bir kontrol numunesine göre bir kat değişikliği olarak ifade edilir (normal saflaştırılmış IgG veya sahte IP kullanılarak immünopresipite edilir). İmmün presipite protein tarafından işgal edilmediği bilinen DNA lokusları (negatif lokus), bilinen, işgal edilmiş, pozitif kontrol DNA lokuslarına kıyasla bu şekilde bir referans gen olarak kullanılabilir³⁶.
   1. Aşağıdaki formülü kullanarak her ChIP için girdi yüzdesini hesaplayın
      %Giriş = 2(-ΔCt [normalleştirilmiş ChIP])
   2. Aşağıdaki formülü kullanarak pozitif lokus için elde edilen ΔCt değerini negatif lokus için ΔCt değerinden çıkararak pozitif lokus ΔCt değerlerini negatif lokusa (ΔΔCt) normalleştirin
      (ΔΔCt = ΔCtpositive - ΔCtnegatif)
   3. Aşağıdaki formülü kullanarak ChIP DNA'daki pozitif lokus dizisinin negatif lokus üzerindeki kat zenginleştirmesini hesaplayın
      Katlama zenginleştirme =2ΔΔCt
      Analiz için kullanılan qPCR primerlerinin dizileri Tablo 2'de verilmiştir. FRA3B ve FRA16D^37'ningenomik organizasyonu Şekil 3A,B'de gösterilmiştir.
3. İstatistiksel analiz
   1. Student'ın eşleştirilmiş t-testini kullanarak sonuçları istatistiksel olarak analiz edin. ≤0.05'lik bir p değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edilir, bu da gözlemlenen farklılıkların rastgele varyasyondan kaynaklanma olasılığının düşük olduğunu gösterir³⁸.

Kromatin fragmanlarının boyutu, antikor bağlanması için DNA bölgelerinin erişilebilirliğini doğrudan etkilediği için Native ChIP'nin başarısı için çok önemlidir. Kromatin parçalanması için optimal MNaz konsantrasyonunu belirlemek için, değişen konsantrasyonlarda MNaz içeren bir dizi mikrosantrifüj tüpü hazırladık (ör., 0.0625 U, 0.125 U, 0.25 U, 0.5 U, 1 U, 2 U, 4 U, reaksiyon başına 8 U) ve 40 μL izole çekirdek. Her reaksiyon, bir dizi kromatin fragman ...

Çevre kirliliği, insan kanserlerine önemli bir katkıda bulunur. Birçok kirletici kanserojendir, yani kanser gelişimine yol açan genetik hasara neden olabilirler^40,41. Bununla birlikte, belirli bir maddenin tümörjenik olup olmadığını belirlemek zorlu bir iştir. Kanserojen potansiyeli belirlemek için hızlı, güvenilir ve uygun maliyetli bir yöntem, bilim adamlarının çevresel kirleticileri verimli bir şekilde t...

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Bu çalışma, Güney Çin Üniversitesi'nin başlangıç fonu tarafından desteklendi.