In Vitro Down Sendromu Nörogenezinin İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücreler Kullanılarak Modellenmesi

Bu protokol, DS insan iPSC'leri kullanılarak Down sendromu (DS) bozulmuş nörojenezini özetlemek için bir metodolojinin ana hatlarını çizmektedir. Protokol, Down sendromunda bozulmuş nörogenezin nedeni olarak bifazik hücre döngüsü defektini tanımladı. DS ile ilişkili anormal nörojenezin altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaları anlamak için sağlam bir platform sağlar.

Kromozom 21'in fazladan bir kopyasının neden olduğu Down sendromu (DS), zihinsel engelliliğin önde gelen bir nedenidir. Bu zihinsel engelliliğe katkıda bulunan en önemli faktörlerden biri, fetal aşamalardan itibaren gözlenen bozulmuş nörojenezdir. Bu nörogelişimsel anormallikleri incelemek için, DS hastalarından elde edilen hücreler kullanılarak üretilen insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC'ler) değerli ve ilgili bir model sağlar. Burada, DS fetal evrelerinde gözlenen DS ile bozulmuş nörojenezi özetlemek için kapsamlı bir protokol tanımlanmıştır. Bu protokol, kromozom 21'in üç kopyasına sahip bir çift DS-hiPSC ve kromozom 21'in iki kopyasına sahip izogenik euploid hiPSC'leri kullanır. Daha da önemlisi, burada tarif edilen protokol, DS ile bozulmuş nörojenezi özetlemekte ve bifazik hücre döngüsü defektinin, yani nörojenik fazın erken fazında DS nöral progenitör hücrelerinin (NPC) proliferasyonunun azalmasının ardından nörojenik fazın geç fazında DS NPC'nin artmış proliferasyonunun DS bozulmuş nörojenezin nedeni olduğunu bulmuştur. Nörojenik aşamanın geç fazında DS NPC'nin artan proliferasyonu, hücre döngüsünden çıkışın gecikmesine yol açarak DS NPC'lerden post-mitotik nöronların üretiminin azalmasına neden olur. Bu protokol, hiPSC'lerin bakımı, nörojenik aşamada bifazik hücre döngüsü defekti gösteren nöral soylara farklılaşmaları ve ardından DS hücrelerinde azalmış nöral farklılaşmanın doğrulanması için ayrıntılı adımlar içerir. Araştırmacılar, bu metodolojiyi izleyerek, DS'nin nörogelişimsel koşullarını taklit eden ve trizomi 21'in neden olduğu beyin gelişimindeki spesifik değişiklikleri keşfetmelerini sağlayan sağlam bir deneysel sistem oluşturabilirler.

Down sendromu (DS) veya trizomi 21, en yaygın kromozomal anormalliktir ve zihinsel engelliliğin (ID) önde gelen ^nedenidir1. DS fetal gelişim sırasında bozulmuş nörogenez, DS^2'de zihinsel engelliliğin nedenlerinden biridir. İnsan DS fetal çalışmaları, beyin ağırlığı ve hacminde bir azalma, nöronların azalması, astrositlerin ^3,4 artması ve II. ve IV.^{katmanlarda nöronların} anormal dağılımı ^5,6 olduğunu göstermektedir. Ek olarak, kortikal gelişimin ikinci aşaması, yani laminasyonun ortaya çıkışı, DS^7'de hem gecikmiş hem de düzensizdir.

DS'deki nörogelişim kusurları çoğunlukla Ts65Dn, Ts1Rhr ve Ts1cje⁸ gibi DS'nin fare modelleri kullanılarak incelenmiştir. Bununla birlikte, bu fare modelleri, fareler ve insanlar arasındaki fizyolojik ve gelişimsel farklılıklar^{nedeniyle DS} çalışmalarında gözlemlenen çeşitli fenotipleri tam olarak özetleyemedi 9 ^{ve bu} da başarısız klinik çalışmalara¹⁰ yol açtı. İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerin^11,12 icadı, doğrudan DS'li bireylerden türetilen hücreleri kullanarak Down sendromu nörolojik bozukluğunu modelleme fırsatı sağladı. Bununla birlikte, insan iPSC'lerini kullanarak DS nörogelişimsel kusurları modellemeye yönelik daha önceki girişimler tutarsız sonuçlarla karşılaştı ve DS fetal beyin bölümlerinde^gözlenen nörogelişimsel kusurları tam olarak açıklayamadı 13,14,15,16. Örneğin, Shi ve arkadaşları tarafından yayınlanan bir rapor, DS ile ilişkili Alzheimer fenotiplerini bulmuş, ancak öploid kontrollere kıyasla DS nörojenezinde bir fark olmadığını bildirmiştir¹⁵. Benzer şekilde, Weick ve ark. öploid kontrollere kıyasla DS'de sinaptik aktivitenin azaldığını, ancak normal nörojenez olduğunu bildirmiştir¹⁶. Bununla birlikte, bu yayınlarda bildirilen DS'deki normal nörogenez, DS fetal beyin bölümlerinden elde edilen gözlemlerle tutarlı değildi. Daha sonra, Hibaoui ve ark. DS'de nörojenezin azaldığını bildirdi, bu da DS fetal beyin bölümü^14'ten yapılan gözlemle tutarlıydı. Bununla birlikte, bu rapor ve yakın tarihli bir başka rapor, DS NPC'lerin azalmış proliferasyonunu DS^14,17'deki azalmış nörojenezin nedeni olarak tanımlamıştır. Bununla birlikte, DS NPC'lerin sadece azalmış proliferasyonu, DS fetal beyin gelişimi sırasında artmış astroglial hücreleri ve gecikmiş laminasyon oluşumunu açıklayamadı.

Yakın zamanda yayınlanan çalışmada, azalmış nörojenezi gösteren bir insan iPSC tabanlı DS bozukluğu nörojenez modeli geliştirilmiştir. Bu model, DS'deki bozulmuş nörojenezin, nörojenik aşama (nöral progenitör hücrelerin pluripotent kök hücrelerden üretildiği aşama) sırasındaki bifazik hücre döngüsü kusurlarına bağlı olduğunu buldu. Nörojenik evredeki ilk faz sırasında, DS NPC'ler, izojenik öploid nöral hücrelere kıyasla daha az proliferasyon sergiler, bunu nörojenik evre^18'in geç fazında izojenik öploid hücrelere kıyasla DS NPC'lerin artmış proliferasyonu izler.

Bu yazıda, Down sendromu hiPSC'lerinin ve izojenik euploid hiPSC'lerinin kortikal nöronlara farklılaşması için adım adım ayrıntılı bir protokol tanımlanmıştır. Bu yöntemin genel amacı, DS ile ilişkili nörojenez kusurlarını modellemeye odaklanarak, bir çift DS hiPSC'yi ve izojenik öploid hiPSC'lerini kortikal nöronlara ayırmak için ayrıntılı, adım adım bir protokol sağlamaktır. Bu protokol, DS bozukluğuna neden olan nörojeneze neden olan anormalliklerin altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için sağlam ve tekrarlanabilir bir sistem sunmak üzere tasarlanmıştır.

Bu protokolün geliştirilmesinin ardındaki mantık, gelişimsel nörobiyoloji ilkelerini kullanarak pluripotent kök hücrelerin kortikal nöronlara farklılaşmasına izin vermek ve böylece hastalık/bozukluğa bağlı olarak ortaya çıkan fenotiplerin tanımlanmasına izin vermektir. Sırasıyla Ca⁺⁺ kanalındaki veya NOTCH yolundaki kusurlar nedeniyle ortaya çıkan hastalık fenotiplerini maskeleyebilen cAMP veya DAPT gibi bileşiklerden kaçınarak iPSC'lerin nöral farklılaşmasına minimalist bir yaklaşım benimsemeyi amaçladı. Benzer şekilde, nörojenezi güçlendirerek diğer nörolojik hastalıkla ilişkili fenotipleri maskeleyebilen Askorbik asit, BDNF ve GDNF kullanımından da kaçınılmıştır.

Bu tekniğin alternatif yöntemlere göre avantajları, DS fetal beyin kesitlerinde gözlenen nörolojik fenotiplerin sağlam bir şekilde rekapitülasyonunu sağlamasında yatmaktadır. Fare modelleriyle karşılaştırıldığında, insan iPSC tabanlı sistem, türler arası farklılıkları ortadan kaldırarak, insana özgü nörogelişimsel süreçleri incelemek için daha uygun bir model^sağlar9 ancak şimdiye kadar DS fetal aşamalarında gözlemlenen DS bozulmuş nörojenezi özetlemekte başarısız olmuştur. Ayrıca, izojenik hiPSC çiftlerinin kullanılması değişkenliği azaltır ve gözlenen fenotipik farklılıkların güvenilirliğini artırır. Bu protokol, nörogelişimsel bozukluklar ve insan nörojenezi üzerine çalışan araştırmacılar için özellikle ilgi çekici olacaktır. Özellikle DS'nin insana özgü yönlerini modellemek isteyenler veya trizomi 21 ile ilişkili nörojenez kusurlarını hedef alan terapötik müdahaleler geliştirmekle ilgilenenler için önemlidir.

Aşağıdaki protokolü iki çift Down sendromu ve izojenik öploid insan iPSC'leri izledi. Bir çift^, yeniden programlama^19'un retroviral aracılı dağıtım yöntemi kullanılarak üretildi ve ikinci bir çift (NSi003-A ve NSi003-B), entegre olmayan Sendai virüsü dağıtım yöntemi²⁰ kullanılarak üretildi. Protokol genel olarak iki aşamadan oluşur: Nörojenik aşama (Evre 1) ve nöral farklılaşma aşaması (Evre 2). Ayrıca, nörojenik aşamada Down sendromu ve izojenik öploid hücre dizilerinin proliferasyonundaki farklılıklara dayanan iki faz, yani Erken ve Geç fazlar gözlenir. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin, ortamların ve ekipmanların ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Down sendromu hiPSC'ler ve izojenik euploid hiPSC'lerin kültürü ve bakımı

1. hiPSC'ler için besleyici kaplama
   NOT: Besleyici kalitesi ve yoğunluğu, insan iPSC kültürünün kalitesi için son derece önemlidir.
   1. Besleyici hücrelerle tohumlamadan önce 37 ° C'de en az 1-2 saat boyunca 6 oyuklu bir plakayı kaplamak için 2 mL %0.1 jelatin ekleyin.
   2. Hücreleri kaplamadan önce jelatin kaplı plakayı hücre kültürü davlumbazında en az 30 dakika oda sıcaklığında tutun.
   3. Boncuk banyosu/su banyosunda canlanma için kullanılacak sıcak fare embriyonik fibroblast (MEF) ortamı.
   4. 5 mL MEF ortamını 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne alın.
   5. Sıvı nitrojen tankından (LN2 tankı) bir şişe besleyici hücre çıkarın.
      NOT: Besleyici hücreler, E13.5 Fare embriyonik fibroblastlarının 10 μg / mL Mitomisin C ile 3 saat boyunca muamele edilmesi ve ardından DPBS¹⁸ ile 2-3 kez yıkanmasıyla elde edildi. Besleyici hücreler, ileride kullanılmak üzere doğrudan veya bir LN2 tankında dondurularak kullanılabilir. Tüm fareler Kurumsal Hayvan Etik Kurulu onayından sonra kullanıldı.
   6. Şişeyi 37 °C'de, küçük bir buz parçası kalana kadar yüzer bir raf kullanarak su banyosunda tutun.
   7. Şişeyi biyogüvenlik kabininin içine alın ve biyogüvenlik kabinine koymadan önce alkolle sterilize edin.
   8. 1 mL ılık MEF ortamını ( Malzeme Tablosuna bakın) damla damla ekleyin.
   9. Ortamı şişeden nazikçe çıkarın ve MEF ortamı içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne damla damla dökün.
   10. Oda sıcaklığında 200 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
   11. Bir vakum aspirasyon sistemi (VAS) kullanarak süpernatanı aspire edin.
   12. 1 mL MEF ortamı ekleyin ve 3-4 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
   13. Bir hemositometre kullanarak hücre sayımını yapın. Ölü hücreler Tripan Mavisi kullanılarak dışlandı.
   14. Plaka 3.1-3.3 x 10 6 oyuklu bir plakanın oyuğu başına⁵ canlı besleyici hücre veya MEF ortamında 6 oyuklu plaka başına 2 x 10⁶ hücre.
   15. Plakayı CO₂ inkübatörünün içinde gece boyunca %85 nem ile 37 °C'de tutun. Besleyici hücrelerin homojen bir dağılımını sağlamak için CO₂ inkübatörünün içindeki plakayı öne-arkaya ve yanlara doğru 2-3 kez sallayın.
2. Down sendromu hiPSC'lerin ve izojenik Euploid hiPSC'lerin yeniden canlanması
   NOT: Gerekli hacimde hiPSC ortamını 37 °C'lik bir boncuk banyosunda ısıtın.
   İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC) canlandırma ortamı: HiPSC ortamına taze olarak 25 ng/mL Temel Fibroblast Büyüme Faktörü (bFGF) ve 10 μM Kaya inhibitörü (RI) (Y-27632 2HCl) ekleyin.
   1. MEF ortamını besleyicilerden iyice çıkarın ve kuyu kenarlarından 1 mL/kuyu ılık DMEM/F12 ekleyerek besleyicilere bir yıkama yapın. Ortamı aspire edin ve 2 mL / kuyu ılık hiPSC canlandırma ortamı ekleyin. hiPSC'leri kaplamadan önce plakayı en az 2 saat inkübatörün içinde bırakın.
   2. Bir şişe hiPSC çıkarın.
   3. Şişeyi, küçük bir buz parçası kalana kadar 37 ° C'lik bir su banyosunda yüzen bir rafta tutun.
   4. Şişeyi biyogüvenlik kabinine almadan önce %70 alkol ile sterilize ediniz.
   5. 1 mL ılık hiPSC canlandırma ortamı ekleyin.
   6. Besiyerini flakondan nazikçe çıkarın ve 5 mL hiPSC canlandırma ortamı içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne damla damla dökün.
   7. Oda sıcaklığında 100 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.
   8. Süpernatanı VAS kullanarak aspire edin ve tüpe hafifçe vurarak peleti yerinden çıkarın.
   9. 10 μM RI ile 500 μL hiPSC ortamı dökün ve hiPSC canlandırma ortamı içeren besleyici plakanın üzerine dökün. Plakayı hücrenin adı, geçiş numarası, araştırmacının adı ve tarihi ile etiketleyin.
   10. HiPSC kolonilerini 4x büyütmede ters çevrilmiş bir mikroskop altında gözlemleyin; Hücre kümeleri olmalıdır.
   11. Plakayı CO₂ inkübatörünün içinde tutarken, homojen bir hücre dağılımı elde etmek için plakayı ön-arka ve yanlara doğru 2-3 kez sallayın. Plakayı 24 saat boyunca rahatsız etmeyin.
   12. Ertesi gün, bazı koloniler besleyicilere yapışmış gibi görünebilir ve bazıları yüzer hale gelebilir. Herhangi bir besiyerini aspire etmeden, 25 ng/mL bFGF ve 10 μM RI ile desteklenmiş taze hiPSC ortamı ekleyin.
   13. Canlanmadan sonraki ikinci günde, kolonilerin çoğu yüzeye yapışacaktı. Tam ortamı 25 ng/mL bFGF ile hiPSC ortamı ile değiştirin. İlerleyen günlerde, hiPSC kolonileri görünür olacaktır.
       NOT: hiPSC'lerin canlanması ve pürüzsüz, iyi tanımlanmış sınırlara, tek tip hücre morfolojisine ve yoğun bir koloni merkezine sahip koloniler oluşturması en az bir hafta sürer.
3. Down sendromu hiPSC'lerinin ve izojenik Euploid hiPSC'lerin besleyicilerde geçirilmesi
   NOT: Başlamadan önce tüm reaktifler sıcak olmalıdır. Hücrelerin aşırı pipetlenmesini önleyin. Hücreleri çok nazikçe tutun.
   1. Kolonilerin çoğu birbiriyle birleşmeye başladığında veya çok fazla farklılaşmış koloni ortaya çıktığında geçiş hiPSC'leri. Genel olarak, bölme işleminin ilk geçişten sonraki 5-7 gün içinde yapılması gerekir.
   2. Bölmeden bir gün önce bir şişe besleyiciyi canlandırın.
   3. 1 mL / oyuklu ılık DMEM / F12 ile besleyicilere bir yıkama yapın ve 25 ng / mL bFGF ile desteklenmiş 2 mL / kuyu ılık hiPSC ortamı ekleyin. hiPSC'leri kaplamadan önce plakayı CO₂ inkübatörünün içinde en az 2 saat boyunca 37 °C'de bırakın.
   4. Farklılaşmış koloniler için hiPSC'li plakayı gözlemleyin ve stereomikroskop altında 200 μL'lik bir pipet kullanarak sıyırarak farklılaşmış koloniyi çıkarın.
   5. 1 mL/kuyu ılık DMEM/F12 ile hiPSC'leri bir kez yıkayın.
   6. 1 mg / ml kollajenaz çözeltisinin 1 mL / kuyusu dökün. Plakayı inkübatörün içinde 8-10 dakika tutun ve ardından kolonilerin gevşek kenarları için ters mikroskop altında gözlemleyin.
   7. Kollajenazı aspire edin ve 2 yıkama DMEM / F12 verin. Ardından 1 mL / kuyu hiPSC Medium ekleyin.
   8. 2 mL'lik bir şırınganın ucunu kullanarak kolonileri yatay ve dikey olarak 8-10 kez nazikçe kesin. Kolonilerin çoğunun uygun boyutta kesilip kesilmediğini kontrol etmek için kolonileri ters çevrilmiş bir mikroskop altında gözlemleyin.
   9. Koloniler yeterince kesilirse, bir hücre kaldırıcı kullanarak kolonileri nazikçe kaldırın.
   10. Kolonilerin büyüklüğüne bağlı olarak 1 mL'lik bir uç kullanarak 5-8 kez kuyucuktaki kolonileri nazikçe pipetleyin.
   11. Tüm hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplayın ve oda sıcaklığında 100 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.
   12. Süpernatanı bir pipet kullanarak nazikçe aspire edin, tüpe hafifçe vurarak hücre peletini yerinden çıkarın ve 25 ng/mL bFGF ve 10 μM RI ile 200 μL hiPSC ortamı ekleyin. 200 μL'lik pipetle 2-3 kez pipetleyin ve 25 ng/mL bFGF ve 10 μM RI ile 300 μL daha fazla hiPSC ortamı ekleyin.
   13. Şimdi bu hücreleri hiPSC ortamı + 25 ng/mL bFGF içeren besleyicilerin üzerine nazikçe yerleştirin. Bir kuyucuk, farklılaşmış koloniler çıkarıldıktan sonra mevcut koloni sayısına bağlı olarak 1:2 veya 1:3'e bölünebilir. Plakayı hücrenin adı, geçiş numarası, araştırmacının adı ve tarihi ile etiketleyin.
   14. Plakayı CO₂ inkübatörünün içinde tutarken, homojen bir hücre dağılımı elde etmek için plakayı ön-arka ve yanlara doğru 2-3 kez sallayın.
   15. Ertesi gün, ılık DMEM / F12 ile nazikçe yıkayın ve 25 ng / mL bFGF ile 2,5 mL hiPSC ortamı ekleyin.
4. Besleyicilerden Down sendromu hiPSC'lerin ve izojenik Euploid hiPSC'lerin dondurulması
   NOT: Dondurma işlemi sırasında insan iPSC'lerinin aşırı pipetlenmesinden kaçınılmalıdır.
   1. hiPSC'leri hala günlük aşamasındayken, yani geçişten 4-5 gün sonra bölün.
   2. Farklılaşmış koloniler için hiPSC'li plakayı gözlemleyin ve stereomikroskop altında 200 μL'lik bir pipet kullanarak farklılaşmış kolonileri çıkarın.
   3. 1 mL/kuyu ılık DMEM/F12 ile hiPSC'leri bir kez yıkayın.
   4. 1 mg / mL kollajenaz çözeltisinin 1 mL / kuyusu ekleyin. Plakayı inkübatörün içinde 8-10 dakika tutun ve ardından kolonilerin kenarlarını kaldırmak için ters mikroskop altında gözlemleyin.
   5. Kollajenazı aspire edin ve 2 yıkama DMEM / F12 verin. Ardından 1 mL / kuyu hiPSC Medium ekleyin.
   6. Bir hücre kaldırıcı kullanarak kolonileri nazikçe kaldırın.
   7. Kolonilerin büyüklüğüne bağlı olarak 1 mL'lik bir uç kullanarak 5-8 kez kuyucuktaki kolonileri nazikçe pipetleyin.
   8. Tüm hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplayın ve oda sıcaklığında 100 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.
   9. Süpernatanı bir pipet kullanarak nazikçe aspire edin, tüpe hafifçe vurarak hücre peletini yerinden çıkarın ve kuyucuk sayısına göre 25 ng/mL bFGF ile desteklenmiş antibiyotiksiz 1 mL hiPSC Ortamı ekleyin. Hücreleri kriyoviyallere dağıtın.
   10. % 10'luk bir nihai DMSO konsantrasyonu elde etmek için kriyoviyallere 25 ng / mL bFGF ve% 20 DMSO ile desteklenmiş antibiyotiksiz hiPSC Ortamı ekleyin.
   11. Yavaş dondurma sağlamak için kriyovialleri izopropanol banyosuna sahip bir buza koyun.
   12. Ayazları gece boyunca -80 °C'de tutun. Şişeleri ertesi gün LN2 tankına aktarın.

2. Nöronal farklılaşma

NOT: Besleyici Şartlandırılmış Ortamın (FCM) Hazırlanması: Bir T-75 şişesi kullanın ve şişe başına 4 x 10⁶ besleyici hücre plakası kullanın. Ertesi gün, 4 ng/mL bFGF ile 40 mL hiPSC besiyeri ekleyin. 7 gün boyunca toplayın. Her gün tüpü -20 °C'de 1 aya kadar saklayın. 15 cm'lik bir tabağı, hücreleri ayırmadan önce en az 2 saat boyunca 37 ° C'de 10 mL %0.1 jelatin ile kaplayın. Hücreleri ayırmadan 1 gün önce 6 oyuklu bir plakayı hESC nitelikli bazal membran matrisi (bundan böyle "nitelikli matris" olarak anılacaktır) ile kaplayın. Tüm protokoldeki hücreleri ayırırken, hücre ayırma çözeltisine (Malzeme Tablosuna bakınız), DPBS'ye ve kaplama ortamına (25 ng / mL bFGF ile desteklenmiş FCM) 10 μM RI ekleyin. Her farklılaşma için taze besleyici şartlandırılmış ortam (FCM) hazırlayın. hiPSC'lerin aşırı pipetlenmesini önleyin.

1. Day In vitro (DIV) 2: Tek hücrelerin yapılması ve nörofarklılaşma için hiPSC'lerin tohumlanması
   1. 25 ng/mL bFGF, DPBS, hücre ayırma solüsyonu ve 25 ng/mL bFGF ile takviye edilmiş Besleyici Şartlandırılmış Ortama 10 μM RI ekleyin. Tüm bu reaktifleri 37 °C'de ısıtın.
   2. Besleyicilerde 6 oyuklu bir iPSC plakası alın, farklılaşmış kolonileri çıkarın ve 25ng/mL bFGF ve 10 μM RI ile desteklenmiş taze hiPSC ortamı ekleyin. Plakayı inkübatörde 2 saat tutun.
   3. 2 saat sonra iPSC plakasını çıkarın ve Ca⁺⁺ ve Mg⁺⁺ içermeyen DPBS ile bir yıkama yapın.
   4. 1 mL / kuyu hücresi ayırma çözeltisi (+ 10 μM RI) ekleyin ve plakayı CO₂ inkübatörünün içinde 12-14 dakika tutun.
   5. 12-14 dakika sonra, hücreleri ters mikroskop altında gözlemleyin; Hücrelerin çoğu plakadan ayrılmaya başlar. Bazı hücreler hala yapışıyorsa, plakaya yanlardan hafifçe vurun.
   6. Ca ⁺⁺ ve Mg ⁺⁺ (+ 10 μM RI) ile 3 mL / kuyu DPBS ekleyerek hücre ayırma çözeltisini seyreltin. 5 mL'lik bir pipet kullanarak, kabarcıkların topakları kırmasını önleyerek 2-3 kez nazik pipetleme yapın.
   7. Hücreleri 40 μM'lik bir süzgeçten geçirin.
   8. Hücreleri 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplayın.
   9. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin ve ortamı VAS kullanarak nazikçe aspire edin.
   10. Hücreleri 10 mL hiPSC ortamında (+ 25 ng/mL bFGF + 10 μM RI) yeniden süspanse edin. Besleyicileri çıkarmak için 1,5 saat boyunca %0,1 jelatin kaplı 15 cm'lik bir tabağa hücreler ekleyin, çünkü besleyiciler hiPSC'lere kıyasla jelatin kaplı yüzeye tercihli yapışma özelliğine sahiptir.
   11. 1.5 saat sonra, ortamı hücrelerle nazikçe toplayın ve oda sıcaklığında 200 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. VAS kullanarak aspire ortamı.
   12. Hücreleri 1 mL FCM'de (+ 25 ng/mL bFGF + 10 μM RI) yeniden süspanse edin ve hücre sayısını alın.
   13. FCM (+ 25 ng / mL bFGF + 10 μM RI kullanarak), 30.000-50.000 hücre / mL hücre süspansiyonu yapın ve 5 mL hücre süspansiyonu / 60 mm plaka veya 2 mL / kuyucuk 6 oyuklu plaka veya 500 μL / kuyucuk 24 oyuklu plaka. Plakalar nitelikli bir matris ile kaplanmalıdır (bkz. Malzeme Tablosu).
2. DIV 0: (~48 saat sonra): Besleyici koşullu ortamı NPC ortamına değiştirin (A + N2 Vitamini olmadan DDM + B2) ( Malzeme Tablosuna bakın).
3. DIV 2: DIV 18'e kadar her alternatif günde 0.125 μM Dorsomorfin içeren NPC ortamı ekleyin.
4. DIV 18: Dorsomorphin içermeyen NPC ortamı ekleyin ve DIV 28'e kadar her alternatif günde bir yenileyin.
5. DIV 28-30: Aşama 2 için tek hücrelerin yapılması ve NPC'lerin tohumlanması
   1. DIV 28'de, plakayı (NPC'leri içeren) çıkarın ve ortamı NPC ortamıyla (+ 10 μM RI) değiştirin. Plakayı 2 saat boyunca CO₂ inkübatöre koyun.
   2. 2 saat sonra ortamı aspire edin ve DPBS ile (Ca⁺⁺ ve Mg⁺⁺ olmadan) bir yıkama yapın.
   3. 1 mL / kuyucuk hücre ayırma çözeltisi (+ 10 μM RI) ekleyin ve plakayı inkübatörün içinde 14 dakika tutun.
   4. 14 dakika sonra, hücreleri 4x'te ters çevrilmiş bir mikroskop altında gözlemleyin. Hücrelerin çoğu plakadan ayrılmaya başlar. Bazı hücreler hala yapışıyorsa, plakaya yanlardan hafifçe vurun.
   5. Hücre ayırma solüsyonunu Ca⁺⁺ ve Mg⁺⁺ (+ 10 μM RI) ile 3 mL / kuyu DPBS ekleyerek seyreltin. 5 mL'lik bir pipet kullanarak, kabarcıkların topakları kırmasını önleyerek 2-3 kez nazik pipetleme yapın.
   6. 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirilmiş 40 μM süzgeçten geçirin.
   7. Oda sıcaklığında 200 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. VAS kullanarak ortamı nazikçe aspire edin.
   8. DDM + B27'deki hücreleri A vitamini (+ 10 μM RI) ile yeniden süspanse edin.
   9. Bir hemositometre ile tripan mavisi kullanarak canlı hücreleri sayın.
   10. 48 oyuklu plakanın nitelikli matris kaplı plakasına (1x) 50.000 hücre / kuyu tohumlayın.
6. DIV 33: Ortamı nöral farklılaşma ortamına değiştirin ( Malzemeler Tablosuna bakınız). Ortamı her 5 günde bir değiştirin. DIV 85/90'a kadar medyayı yenilemeye devam edin.

3. İmmünositokimya (ICC)

NOT: Hücreleri kaplayacak kadar her aşamada yeterli tampon ekleyin ve yıkama aşamasında aspirasyon sırasında kuyunun kurumasını önleyin.

1. Farklılaşmış hücre plakasını hücre kültürü alanının dışına çıkarın.
2. Medyayı aspire edin ve bir DPBS yıkaması yapın.
3. Fiksasyon için hücrelere 1 mL %4 paraformaldehit (PFA) ekleyin. Plakayı alüminyum folyo ile örtün ve 37 °C'de 30 dakika boyunca bir külbütör çalkalayıcı üzerine yerleştirin.
4. PFA'yı aspire edin ve DPBS ile her biri 15 dakikalık üç yıkama yapın (Ca⁺⁺ ve Mg⁺⁺ olmadan).
5. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloke edici tampon (% 3 BSA +% 5 Eşek Serumu (veya ikincil antikorun konakçı hayvanından serum) +% 0.2 Triton-X) ekleyin.
6. 250 μL/kuyu primer antikor ekleyin [Ki67 (1: 100 seyreltme), TUBB3 (1: 500 seyreltme), PAX6 (1: 100)] ve gece boyunca bir külbütör çalkalayıcı üzerinde 4 ° C'de inkübe edin. Seyreltme, bloke edici bir çözelti içinde yapıldı.
7. Primer antikor inkübasyonundan sonra DPBS ile üç kez yıkayın.
8. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca 250 μL / kuyu ikincil antikor (% 3 BSA'da 1: 250 seyreltilmiş + DPBS'de% 0.2 Triton-X) ekleyin.
9. İkincil antikor inkübasyonundan sonra DPBS ile 3 kez yıkayın.
10. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca DAPI (DPBS'de 5 mg / mL stoğunun 1: 1000 seyreltmesi) ekleyin. DPBS ile üç kez yıkayın. Son yıkamayı kültür plakasında bırakın ve mikroskop altında gözlemleyin.

4. Görüntü elde etme ve analiz etme

1. Floresan mikroskobunu kullanarak 20x çözünürlükte görüntü yakalayın.
2. Ki67'nin yanı sıra 540 nm'lik bir uyarma filtresi kullanarak TUBB3 boyama görüntülerini, 6 nm'lik bir uyarma filtresi kullanarak PAX488'yı ve 358 nm'lik bir uyarma filtresi kullanarak DAPI görüntülerini yakalayın.
3. Analiz için on farklı rastgele alandan görüntüler yakalayın.
4. ImageJ yazılımını kullanarak ICC görüntülerini analiz edin.
5. TUBB3 ve PAX6 analizi için, sırasıyla kırmızı ve yeşil sinyaller için tüm görüntüleri ve DAPI için mavi sinyal yoğunluğunu eşikleyin. TUBB3'ün kırmızı piksellerinin ve PAX6'nın yeşil piksellerinin ortalama yoğunluğu, DAPI'nin mavi piksellerinin ortalama yoğunluğu ile normalleştirildi.
6. Ki67 analizi için, ImageJ yazılımındaki otomatik hücre sayacı özelliğini kullanarak hücreleri sayın. Ki67 pozitif hücrelerin sayısını DAPI pozitif hücrelerin sayısı ile normalleştirin.
7. Eşlenmemiş t-testleri kullanarak iki grubu karşılaştırarak istatistik ve grafik yazılımı kullanarak istatistiksel analiz yapın. Veriler, üç bağımsız deneyden elde edilen ortalama ± SEM olarak ifade edilmelidir. 0,05'ten küçük bir p değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edilir.

Tekilleştirilmiş insan iPSC'leri, tek hücreli süspansiyonlar olarak nitelikli matris kaplı tabaklara tohumlandı ve bFGF'nin çıkarılmasıyla farklılaşma başlatıldı. Ektodermal olmayan farklılaşmayı inhibe etmek için, bir BMP sinyal inhibitörü olan Dorsomorfin, DIV 2-18^21'den eklendi. Progenitör hücrelerin nörojenik aşamadan daha fazla farklılaşması için, tek hücreli süspansiyonlar, erken nöral farklılaşmayı gözlemlemek için 6-10 ...

Bu çalışmada, bir izogenik Euploid hiPSC ve DS hiPSC çifti için etkili bir yönlendirilmemiş tek katmanlı kortikal nörodiferansiyasyon protokolü tanımlanmıştır. Hücreler tek tabakalar halinde büyütüldükleri için kültür koşullarına daha fazla maruz kalırlar, bu da genellikle diğer protokollerde kullanılan iPSC'leri ayırt etmek için embriyoid cisimciklerin kullanılmasıyla aynı ölçüde mümkün değildir^14,16

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Yazarlar Prof. Stuart H. Orkin'e bize bir çift Down sendromu ve izojenik öploid hiPSC sağladığı için teşekkür ediyor. Yazarlar ayrıca, bu çalışmayı yürütmek için fon sağladığı için Ulusal Hücre Bilimi Merkezi'ne (BRIC-NCCS), Pune'a müteşekkirdir.