Sıçan Çene Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü Tekniği

Çene kemik iliğinden elde edilen mezenkimal kök hücreler, çeşitli farklılaşma, kendini yenileme ve immün modülasyonda önemli işlevlere sahiptir. Gen terapisi, doku mühendisliği ve rejeneratif tıpta öncü hücrelerin çok önemli bir rezervuarı olarak ortaya çıkmışlardır. Burada, sıçanlarda çene kemik iliği mezenkimal kök hücrelerini izole etmek için benzersiz bir yöntem sunuyoruz.

Kemik iliği mezenkimal kök hücreleri (BMMSC'ler), çok yönlü farklılaşma potansiyeline sahip bir kök hücre türüdür. Apendiküler kemiklerden türetilen BMMSC'lerle karşılaştırıldığında, çeneden türetilen BMMSC'ler daha fazla proliferatif ve osteojenik farklılaşma kabiliyetine sahiptir ve yavaş yavaş çene defekti onarımı için önemli tohum hücreleri haline gelir. Bununla birlikte, mandibula karmaşık bir kemik yapısına ve apendiküler kemiklerden daha az süngerimsi içeriğe sahiptir. Geleneksel yöntemler kullanılarak çok sayıda yüksek kaliteli çene kaynaklı mezenkimal kök hücre elde etmek zordur. Bu çalışma, sıçan çene kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin (JBMMSC'ler) izole edilmesi ve kültürlenmesi için 'saplılık üzerine niş temelli bir yaklaşım' sunmaktadır. Primer sıçan JBMMSC'leri, kemik dilimi sindirim yöntemi ile birlikte tüm kemik iliği yapışık yöntemi kullanılarak izole edildi ve kültürlendi. İzole edilen hücreler, hücre morfolojisi gözlemi, hücre yüzey belirteçlerinin tespiti ve çok yönlü farklılaşma indüksiyonu yoluyla JBMMSC'ler olarak tanımlandı. Bu yöntemle ekstrakte edilen hücreler 'fibroblast benzeri' bir iğ şekli sergiler. Hücreler uzun, iğ şeklinde ve fibroblast benzeridir. Akış sitometrisi analizi, bu hücrelerin CD29, CD44 ve CD90 için pozitif, ancak CD11b/c, CD34 ve CD45 için negatif olduğunu ve BMMSC'lerin özellikleriyle uyumlu olduğunu göstermektedir. Hücreler güçlü çoğalma kapasitesi gösterir ve osteojenik, adipojenik ve kondrojenik farklılaşmaya uğrayabilir. Bu çalışma, kısa sürede güçlü farklılaşma kabiliyetine sahip yeterli sayıda yüksek kaliteli JBMMSC elde etmek için etkili ve istikrarlı bir yöntem sağlar, bu da biyolojik fonksiyonun araştırılması, rejeneratif tıp ve ilgili klinik uygulamaların daha fazla çalışmasını kolaylaştırabilir.

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) ilk olarak kemik iliğinde keşfedildi, bu da kültürde yapışkan koloniler oluşturma yeteneği ve güçlü osteojenik potansiyel^{gösterdi 1}. Pittinger ve ^ark.2 ayrıca kemik, yağ ve kıkırdağa doğru çok yönlü farklılaşma potansiyellerini buldular. Farklı kaynaklardan elde edilen tüm mezenkimal kök hücreler çok yönlü farklılaşma potansiyeline sahip olsa da, kemik iliği mezenkimal kök hücreleri, diğer dokulardan türetilen mezenkimal kök hücrelere kıyasla en güçlü kondrojenik farklılaşma potansiyeline sahiptir ve bu da onları kemik dokusu mühendisliği için en iyi aday hücreler olarak kabul eder³. Bununla birlikte, birçok çalışma, farklı kökenlerden gelen BMMSC'lerin, osteojenik farklılaşma kabiliyeti ve hücresel proliferatif aktivite^gibi bölgeye özgü özellikler ve özellikler sunduğunu kanıtlamıştır ^4,5. Bu, çene ve apendiküler kemikler arasındaki farklı germ tabakalarına veya iliak krest^6'ya bağlı olabilir.

Çene kemik iliği mezenkimal kök hücreleri (JBMMSC'ler) nöroektodermin nöral krest hücrelerinden kaynaklanırken, femur kaynaklı BMMSC'ler mezodermden köken alır⁷. Uzun kemiklerden ve iliak tepeden türetilen BMMSC'lerle karşılaştırıldığında, JBMMSC'ler daha yüksek proliferasyon oranına, ALP aktivitesine ve osteojenik potansiyele^{sahiptir 8}. Ayrıca, BMMSC'lerin doku ve organlardaki uygulama etkisi, farklı hücre tiplerine ve ortamlarına bağlı olarak değişebilir⁹. Çene defektlerinin onarımı esas olarak çene kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin elde edilmesine bağlıdır. Bu nedenle, JBMMSC'leri incelemek, çene kemiği dokusu mühendisliğindeki klinik uygulaması için deneysel bir temel sağlayabilir¹⁰. Bununla birlikte, temel araştırmalar ve klinik uygulamalar esas olarak apendiküler ve aksiyel kemiklerden türetilen BMMSC'lere odaklanmaktadır¹¹. JBMMSC'ler üzerine yapılan araştırmalar sınırlıdır ve bunun nedeni mandibuladaki süngerimsi kemik içeriğinin düşük olması ve sıçanların çenelerinin daha az süngerimsi kemik içeriğine sahip olması olabilir¹². Bu nedenle, BMMSC'lerin apendiküler kemiklerden veya iliak kretten izole edilmesinde yaygın olarak kullanılan sıradan kemik iliği yıkama yöntemini kullanarak çene kemiği kaynaklı mezenkimal kök hücreleri ayırmak zordur¹³. Hong ve ^ark.14 ve Cheng ve ^ark.15'in yöntemlerine dayanarak, yoğun kemik sindirimi ve kemik iliği yıkama yönteminin kombinasyonunun sıçan JBMMSC'lerini etkili bir şekilde izole edebileceğini varsaydık.

Bu çalışma, sıçan JBMMSC'lerini izole etmek için etkili bir yöntem oluşturmayı ve çene kemik dokusu mühendisliği için yeterli tohum hücresi kaynaklarını sağlamayı amaçlamaktadır.

Protokol, Çin PLA Genel Hastanesi Kurumsal Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı. Deney için on üç haftalık erkek Wistar sıçanları kullanıldı. Hayvanlar, reaktifler ve ekipmanla ilgili ayrıntılar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Deney hazırlığı

1. Oftalmik makas, cımbız ve kemik rongeurları dahil tüm cerrahi aletleri yüksek sıcaklık ve basınçta sterilize edin.
2. Kültür ortamını önceden hazırlayın.
   1. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin içeren α-MEM tam ortamı hazırlayın.
   2. Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 0.1 tip II kollajenaz hazırlayın.
   3. Tek kullanımlık steril 50 mL santrifüj tüpünde% 1 penisilin-streptomisin içeren 50 mL PBS hazırlayın.

2. Sıçan JBMMSC'lerinin izolasyonu ve yetiştirilmesi

1. Aşağıdaki adımları izleyerek sıçan mandibulasını izole edin:
   NOT: Numune sterilitesini korumak için, tüm metal cerrahi aletler kullanımdan önce en az üç saniye boyunca bir alkol lambası alevi üzerinde yüksek sıcaklıkta dezenfekte edilmelidir.
   1. Sıçanı intraperitoneal enjeksiyon ile% 2 pentobarbital sodyum (2 mL / kg) ile uyuşturun.
   2. Anestezi uygulanan sıçanı, solunum hızı azaldıktan ve kaslar tamamen gevşedikten sonra servikal vertebra çıkığı (kurumsal olarak onaylanmış protokollere izleyerek) ile sakrifiye edin.
   3. Fareyi dezenfekte etmek için 30 dakika boyunca% 75 etanole batırın ve ardından ultra temiz masaya aktarın.
   4. Fareyi tek kullanımlık steril bir beze veya steril bir kaba koyun ve sırtüstü pozisyonda tutun.
   5. Cildi ve kası angulus oris'ten ramus boyunca eklemlere kadar kesin ve ayırın ve ardından temporomandibular eklem diskini ve bilateral periferik bağları oftalmik makasla yatay olarak keserek kondili glenoid fossadan ayırın.
      NOT: Mandibulayı hareket ettirerek ve kondilin pozisyonunu dışarıdan gözlemleyerek temporomandibular eklemin pozisyonunu belirleyin.
   6. Alt kesici dişlerin bukkal tarafındaki vestibüler oluktan sol ve sağ taraflara doğru makas kullanarak lateral mandibula kaslarını ve bağ dokularını kesin ve ayırın.
   7. Mandibulanın lingual kaslarını lingual frenumdan mandibulanın arka bölgesine kesin.
   8. Mandibulayı kafatasından çıkarın.
   9. Alt kesici dişler arasındaki simfizi oftalmik makasla keserek mandibulayı ikiye bölün.
   10. Oftalmik makas ve forseps kullanarak mandibula üzerinde kalan bağlı kasları, fasyayı ve diğer yumuşak dokuları dikkatlice çıkarın.
2. JBMMSC'leri izole edin.
   1. Rongeur gagasını kesici dişlerin ve birinci azı dişinin mezial kısmının birleştiği yere yerleştirin, alt kesici dişler ile mandibula arasındaki bağlantıyı rongeur ile kesin ve alt kesici dişleri tamamen çıkarın.
   2. Tüm azı dişlerini bir kemik rongeur ile çıkarın.
   3. Mandibular ramusu bir kemik rongeur ile çıkarın ve mandibulanın orta kısmını son azı dişinin¹⁶ distal kenarı boyunca ayırarak ilik boşluğunu ortaya çıkarın.
   4. α-MEM komple besiyerini 1 mL tek kullanımlık steril şırınga ile emdirin. İğneyi kemik iliği boşluğuna yerleştirin ve kemik iliğini, kemik beyazlaşana kadar α-MEM tam besiyeri ile kültür kabına tekrar tekrar yıkayın.
   5. Kemik iliği yıkama solüsyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplayın ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin.
   6. Süpernatanı bir pipetle atın, hücreleri 10 mL α-MEM tam ortamla yeniden süspanse edin ve bunları 10 cm'lik yeni bir kültür kabına koyun.
   7. Yıkanmış mandibulayı bir rongeur ile 1-3 mm³ kemik dilimlerine bölün ve bunları 37 ° C'de 200 rpm / dak'lık bir çalkalayıcıda 90 dakika boyunca 3 mL% 0.1 tip II kollajenaz ile sindirin.
   8. Sindirilmiş mandibulayı oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
   9. Hasat edilen hücreleri ve sindirilmiş kemik dilimlerini% 5 CO₂ nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C'de α-MEM tam ortam ile kültürleyin.
   10. Kültür ortamının yarısını 72 saat sonra taze ortamla değiştirin ve ardından her 2 günde bir tamamen değiştirin.
       NOT: Kültür kabını ilk üç gün hareket ettirmeyin.
   11. Yapışık hücreleri% 80 -% 90 birleşme noktasına ulaştıklarında 1: 2 oranında geçirin. İkinci alt kültür sırasında kemik dilimlerini çıkarın. Deneyler için P2 veya P3 nesillerinin hücrelerini kullanın.

3. Hücre yüzey belirteçlerinin tanımlanması için akış sitometrisi

1. Akış sitometrisi tamponunda P2 neslinin JBMMSC'lerini yeniden askıya alın. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve konsantrasyonu 3 × 10⁶ hücre / mL'ye ayarlayın.
2. Her mikrosantrifüj tüpüne 100 μL hücre süspansiyonu ve 2 μL monoklonal antikor (CD11b / c, CD29, CD34, CD44, CD45 ve CD90) ekleyin. 4 °C'de 30 dakika^{inkübe edin 17,18}.
3. Numuneyi 200 μL akış sitometrisi tamponu ile iki kez yıkayın ve oda sıcaklığında 250 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın.
4. Her tüpe 100 μL akış sitometri tamponu ve 2 μL PE etiketli floresan ikincil antikor ekleyin. 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.
5. Adım 3.3'ü tekrarlayın.
6. JBMMSC'leri tüp başına 300-500 μL akış sitometri tamponunda yeniden süspanse edin.
7. Bir akış sitometresi kullanarak akış sitometrik analizini gerçekleştirin.
   NOT: Spesifik olmayan antikor kombinasyonunun neden olduğu arka plan lekelenmesini ortadan kaldırmak için homolog antikorları negatif kontroller olarak kullanın.

4. Hücre proliferasyonunun belirlenmesi

1. P3 neslinin JBMMSC'lerini, kuyu başına 5 × 10³ hücre yoğunluğunda 96 oyuklu bir plakaya tohumlayın.
2. Her kuyucuğa 10 μL CCK-8 çözeltisi ekleyin.
3. 96 oyuklu plakayı 2 saat boyunca inkübatöre yerleştirin ve bir mikroplaka okuyucu kullanarak absorbansı (450 nm'de OD değeri) ölçün.
   NOT: Testi art arda yedi gün boyunca her gün aynı saatte gerçekleştirin.

5. Koloni oluşturma yeteneği

1. 3. geçitten 1000 JBMMSC'yi 10 cm'lik kültür kaplarına tohumlayın ve 37 ° C'de% 5 CO₂ ile kültürleyin.
2. Kültür ortamını her 3 günde bir değiştirin.
3. 15 gün boyunca sürekli ekimden sonra kristal viyole boyama yapın.
4. Daha sonra, hücreleri 5 dakika boyunca metanol ile sabitleyin ve 5 dakika boyunca% 2 kristal viyole ile boyayın.

6. JBMMSC'lerin çok soylu farklılaşması

NOT: Çok soylu farklılaşma için P3 neslinin JBMMSC'lerini kullanın. Kontrol grubu α-MEM tam besiyeri ile kültüre edildi.

1. Osteojenik farklılaşma gerçekleştirin.
   1. Altı oyuklu bir plakada kuyucuk başına 1 ×^{10 5} JBMMSC aşılayın.
   2. Hücre birleşmesi% 70'e ulaştığında, ortamı osteojenik indüksiyon ortamına değiştirin.
      NOT: Osteojenik indüksiyon ortamını her 3 günde bir değiştirin.
   3. 7 günlük osteojenik indüksiyondan sonra Alkalin Fosfataz (ALP) boyaması yapın.
   4. Ortamı altı oyuklu plakadan çıkarın, hücreleri oda sıcaklığında% 4 paraformaldehit ile 30 dakika sabitleyin ve ardından üç kez PBS ile yıkayın.
   5. Hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ALP boyama solüsyonu ile boyayın ve ışıktan koruyun.
   6. Boyama solüsyonu kalmayana kadar hücreleri durulayın ve numuneleri mikroskop altında gözlemleyin.
   7. 21 günlük osteojenik indüksiyondan sonra Alizarin kırmızı boyama yapın.
   8. Hücreleri 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitledikten sonra hücreleri 5 dakika boyunca Alizarin kırmızı boyama solüsyonu ile boyayın.
   9. Alizarin kırmızı boyama solüsyonu kalmayana kadar hücreleri PBS ile yıkayın.
   10. Mikroskop altında kalsiyum nodüllerinin sayısını gözlemleyin.
2. Adipojenik farklılaşma gerçekleştirin.
   1. Altı oyuklu bir plakada kuyucuk başına 1 ×^{10 5} JBMMSC aşılayın.
   2. Hücre birleşmesi% 70'e ulaştığında, ortamı adipojenik indüksiyon ortamına değiştirin.
      NOT: Adipojenik indüksiyon ortamını her üç günde bir değiştirin.
   3. 14 günlük adipojenik indüksiyondan sonra yağ kırmızısı O boyaması yapın.
   4. Ortamı altı oyuklu plakadan çıkarın, hücreleri 20-30 dakika boyunca Yağ kırmızısı O sabitleme solüsyonu ile sabitleyin ve ardından üç kez PBS ile yıkayın.
   5. Sabitleme solüsyonunu çıkarın ve hücreleri iki kez damıtılmış suyla yıkayın.
   6. Hücreleri 20-30 saniye boyunca% 60 izopropanol içine daldırın.
   7. % 60 izopropanolü çıkarın ve hücreleri 20-30 dakika Yağ kırmızısı O boyası ile boyayın.
   8. Boyama solüsyonunu çıkarın, hücreleri 20-30 s% 60 izopropanol ile durulayın ve ardından damıtılmış suyla yıkayın.
   9. Çekirdeği hematoksilen çözeltisi ile 1-2 dakika boyayın.
   10. Hematoksilen çözeltisini çıkarın ve hücreleri 2-3 kez damıtılmış suyla yıkayın. Yağ kırmızısı O tamponunu 1 dakika ekleyin ve çıkarın.
   11. Mikroskop altında lipit damlacıklarının sayısını gözlemleyin.
3. Kondrojenik farklılaşma gerçekleştirin.
   1. Altı oyuklu bir plakada kuyucuk başına 1 ×^{10 5} JBMMSC aşılayın.
   2. Hücre birleşmesi% 70'e ulaştığında, ortamı kondrojenik indüksiyon ortamına değiştirin.
      NOT: Kondrojenik indüksiyon ortamını her 3 günde bir değiştirin.
   3. 21 günlük kondrojenik indüksiyondan sonra Alcian mavisi boyama yapın.
   4. Ortamı altı oyuklu plakadan çıkarın, hücreleri oda sıcaklığında% 4 paraformaldehit ile 30 dakika sabitleyin ve ardından üç kez PBS ile yıkayın.
   5. Hücreleri Alcian mavisi boyama ile 37 ° C'de 1 saat boyayın.
   6. Hücreleri boyama solüsyonu kalmayana kadar durulayın ve mikroskop altında gözlemleyin.

7. Gerçek zamanlı PCR

1. RNA ekstraksiyon kitini kullanarak toplam RNA'yı çıkarın ve RNA konsantrasyonunu bir enzim işaretleyici ile ölçün (üreticinin talimatlarını izleyerek).
2. 500 ng RNA¹⁹ kullanarak cDNA'yı sentezleyin.
3. 1 μL cDNA, 3,5 μL çift damıtılmış su, 5 μL SYBR ve 0,5 μL primer karışımı (0,1 μM) içeren 10 μL qRT-PCR karışımı ile Gerçek zamanlı bir sistemde qRT-PCR gerçekleştirin.
   NOT: Primer dizileri Tablo 1'de listelenmiştir. Termal döngü koşulları şu şekildedir: 2 dakika boyunca 50 °C, 2 dakika boyunca 95 °C, ardından 15 saniye boyunca 95 °C'lik 40 döngü, 2 dakika boyunca 60 °C ve ardından erime eğrisi için 60 °C'den 95 °C'ye 5 saniye boyunca 0,5 °C'lik artışlar.
4. GAPDH'yi iç kontrol olarak kullanın¹⁶.

72 saatlik hücre inokülasyonundan sonra, çoğu hücre askıya alındı ve yuvarlak şekilliydi, çok azı duvara yapışmıştı (Şekil 1B). Beşinci günde, iğler veya fibroblast benzeri şekiller sergileyen yapışık hücre kolonileri ortaya çıktı (Şekil 1C). Yedinci günde, yapışık hücreler %90 birleşmeye ulaştı ve az sayıda aralıklı askıda hücre ile bir "balık okulu" şekli oluşturdu (Şekil 1D). Pasajlı...

Kemik iliği mezenkimal kök hücreleri (BMMSC'ler), kemik iliğinde bulunan hematopoietik olmayan kök hücrelerin bir alt kümesini temsil eder ve kendini yenileme yetenekleri, çok yönlü farklılaşma potansiyelleri ve hematopoez için destekleyici işlevleri ile karakterize edilir. Bu hücreler, doku yenilenmesi, anjiyogenez ve hücresel aktivitelerin düzenlenmesi gibi çeşitli fizyolojik süreçlerde çok önemli roller oynar²⁰. Sonuç olarak, BMMSC'ler doku onarımı ve rejeneratif mühe...

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Bu çalışma, Askeri Komisyon Lojistik Departmanı (19BJZ22), Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (7232154) ve Dördüncü Mil Med Üniversitesi Sağlık Hizmetleri Projeleri (2021XB025) tarafından desteklenmiştir.