ラット顎骨髄間葉系幹細胞の単離および培養技術

顎骨髄由来の間葉系幹細胞は、多様な分化、自己複製、免疫調節に重要な機能を持っています。それらは、遺伝子治療、組織工学、および再生医療における前駆細胞の重要な貯蔵庫として浮上しています。ここでは、ラットの顎骨髄間葉系幹細胞を単離する独自の方法を紹介します。

骨髄間葉系幹細胞(BMMSC)は、多方向の分化能を持つ幹細胞の一種です。付属肢骨由来のBMMSCと比較して、顎由来のBMMSCは増殖能力と骨形成分化能力が高く、徐々に顎欠損修復の重要な種子細胞になります。しかし、下顎骨は複雑な骨構造を持ち、付属肢骨よりも海綿状含量が少ない。従来の方法では、高品質の顎由来骨髄間葉系幹細胞を大量に取得することは困難です。この研究は、ラット顎骨髄間葉系幹細胞(JBMMSC)を単離および培養するための「幹細胞性に関するニッチベースのアプローチ」を示しています。初代ラットJBMMSCを単離し、全骨髄付着法と骨切片消化法を組み合わせて培養しました。単離された細胞は、細胞形態観察、細胞表面マーカーの検出、および多方向の分化誘導を通じてJBMMSCとして同定されました。この方法で抽出された細胞は、「線維芽細胞様」の紡錘体形状を示します。細胞は長く、紡錘形で、線維芽細胞様です。フローサイトメトリー解析では、これらの細胞はCD29、CD44、およびCD90に対して陽性であるが、CD11b/c、CD34、およびCD45に対しては陰性であり、これはBMMSCの特性と一致しています。細胞は強力な増殖能力を示し、骨形成性、脂肪形成性、および軟骨形成性の分化を受けることができます。本研究は、分化能の高い高品質なJBMMSCを短期間で十分に得るための効果的かつ安定した方法を提供し、生体機能の探索、再生医療、および関連する臨床応用のさらなる研究を促進する可能性があります。

間葉系幹細胞(MSC)は骨髄で最初に発見され、培養中に接着コロニーを形成する能力と強力な骨形成能力を示しました¹。Pittingerら²はさらに、骨、脂肪、軟骨に対する多方向の分化の可能性を発見しました。異なる供給源由来のすべての間葉系幹細胞は多方向の分化の可能性を秘めていますが、骨髄間葉系幹細胞は、他の組織に由来する間葉系幹細胞と比較して最も軟骨形成性分化能が高いため、骨組織工学の最良の候補細胞と考えられています³.しかし、多くの研究により、異なる起源のBMMSCは、骨形成分化能力や細胞増殖活性などの部位特異的な特性と特性を示すことが証明されています^4,5。これは、顎と付属肢の骨、または腸^骨稜6の間の異なる胚葉が原因である可能性があります。

顎骨髄間葉系幹細胞(JBMMSC)は神経外胚葉の神経堤細胞から発生し、大腿骨由来のBMMSCは中胚葉7に由来^します。長骨や腸骨稜に由来するBMMSCと比較して、JBMMSCは増殖率、ALP活性、骨^{形成能が高い}8。また、BMMSCの組織や臓器への適用効果は、細胞の種類や環境によって異なる場合がある⁹。顎の欠損の修復は、主に顎由来の間葉系幹細胞の動員に依存します。したがって、JBMMSCを研究することは、顎骨組織工学¹⁰におけるその臨床応用のための実験的基礎を提供することができる。しかし、基礎研究や臨床応用は、主に付属肢骨や軸骨に由来するBMMSCに焦点を当てています¹¹。JBMMSCに関する研究は限られており、これは下顎骨の海綿骨の含有量が少ないことと、ラットの顎の海綿骨含有量がさらに少ないという事実によるものかもしれない¹²。したがって、付属肢骨または腸骨稜¹³からBMMSCを単離する際に一般的に使用される通常の骨髄フラッシング法を使用して、顎骨由来骨髄間葉系幹細胞を分離することは困難である。Hongら¹⁴ およびChengら¹⁵の方法に基づいて、高密度骨消化と骨髄フラッシング法の組み合わせにより、ラットJBMMSCを効率的に分離できるという仮説を立てました。

本研究は、ラットJBMMSCを効率的に単離する方法を確立し、顎骨組織工学に十分なシード細胞源を提供することを目的としている。

このプロトコルは、中国人民解放軍総合病院の施設動物倫理委員会によって承認されました。実験には、13週齢の雄のWistarラットを使用しました。動物、試薬、機器の詳細については、 資料表に記載されています。

1. 実験の準備

1. 眼科用ハサミ、ピンセット、骨管を含むすべての手術器具を高温高圧で滅菌します。
2. 事前に培地を準備してください。
   1. 10%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含むα-MEM完全培地を調製します。
   2. 0.1%II型コラゲナーゼをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で調製します。
   3. 使い捨ての滅菌50mL遠心分離チューブに1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含むPBS50mLを調製します。.

2. ラットJBMMSCの単離と培養

1. 以下の手順に従って、ラットの下顎骨を分離します。
   注:サンプルの無菌性を維持するために、すべての金属製の手術器具は、使用前にアルコールランプの炎で少なくとも3秒間高温で消毒する必要があります。
   1. 腹腔内注射により、ラットに2%ペントバルビタールナトリウム(2 mL / kg)で麻酔をかけます。.
   2. 麻酔をかけたラットを頸椎脱臼(施設で承認されたプロトコルに従う)で犠牲にします。呼吸数が減少し、筋肉が完全に弛緩した後です。
   3. ラットを75%エタノールに30分間浸して消毒し、超清潔なテーブルに移します。
   4. ラットを使い捨ての滅菌布または滅菌容器に置き、仰臥位に保ちます。.
   5. 口角から角筋から枝に沿った関節まで皮膚と筋肉を切開して分離し、さらに顎関節椎間板と両側末梢靭帯を眼科用ハサミで水平に切断することで、関節窩から顆を分離します。
      注:下顎骨を動かし、顆の位置を外部から観察することにより、顎関節の位置を決定します。
   6. 下顎の頬側の前庭溝から左右にハサミで外側下顎の筋肉と結合組織を切断し、分離します。
   7. 下顎骨の舌筋を舌小帯から下顎骨の後部まで切開します。
   8. 頭蓋骨から下顎骨を取り外します。
   9. 下顎骨を眼ハサミで下切歯の間の結合を切って、下顎骨を半分に分割します。
   10. 下顎骨に残っている付着した筋肉、筋膜、その他の軟部組織を、眼科用ハサミと鉗子を使用して慎重に取り除きます。
2. JBMMSC を分離します。
   1. 切歯と第一大臼歯の近心部分の接合部にロンジャーのくちばしを置き、ロンジャーで下切歯と下顎骨との間の接続を切り取り、下部切歯を完全に抽出します。
   2. 骨ロンジャーですべての大臼歯を取り除きます。
   3. 骨ロンジャーで下顎枝を切除し、下顎骨の中央部分を最後の大臼歯¹⁶の遠位端に沿って分離することにより、骨髄腔を露出させます。
   4. α-MEMコンプリート培地を1mLの使い捨て滅菌シリンジで吸引します。針を骨髄腔に挿入し、骨が白くなるまでα-MEM完全培地で骨髄を培養皿に繰り返し流します。
   5. 骨髄フラッシング溶液を15 mLの遠心チューブに集め、800 x g で室温で3分間遠心分離します。
   6. 上清をピペットで捨て、細胞を10 mLのα-MEM完全培地で再懸濁し、新しい10 cm培養皿にプレートします。
   7. 洗い流した下顎骨をロンゲールで1〜3 mm³の骨スライスに分割し、3 mLの0.1% II型コラゲナーゼで3 mL、200 rpm/minのシェーカー、37°Cで90分間消化します。
   8. 消化した下顎骨を800 x g で室温で3分間遠心分離し、上清を捨てます。
   9. 採取した細胞と消化した骨スライスを、α-MEM完全培地で5%_CO2 加湿インキュベーターで37°Cで培養します。
   10. 72時間後に培地の半分を新鮮な培地と交換し、その後2日ごとに完全に交換します。
       注:最初の3日間は培養皿を動かさないでください。
   11. 接着細胞が80%〜90%のコンフルエントに達したら、1:2の比率で接着細胞を継代します。2回目の継代培養中に骨スライスを取り除きます。P2世代またはP3世代の細胞を実験に用いてください。

3. 細胞表面マーカーの同定のためのフローサイトメトリー

1. P2世代のJBMMSCをフローサイトメトリーバッファーに再懸濁します。自動セルカウンターを使用して細胞をカウントし、濃度を3 × 10⁶ 細胞/mLに調整します。
2. 各微量遠心チューブに100 μLの細胞懸濁液と2 μLのモノクローナル抗体(CD11b/c、CD29、CD34、CD44、CD45、CD90)を加えます。4°^C17,18で30分間インキュベートします。
3. サンプルを200 μLのフローサイトメトリーバッファーで2回洗浄し、室温で250 x g で5分間遠心分離します。上清を取り除きます。
4. 各チューブに100 μLのフローサイトメトリーバッファーと2 μLのPE標識蛍光二次抗体を添加します。4°Cで30分間インキュベートします。
5. 手順3.3を繰り返します。
6. JBMMSCをチューブあたり300-500 μLのフローサイトメトリーバッファーに再懸濁します。
7. フローサイトメーターを使用してフローサイトメトリー解析を実施します。
   注:抗体の非特異的な組み合わせによって引き起こされるバックグラウンド染色を排除するために、相同抗体をネガティブコントロールとして使用します。

4. 細胞増殖の判定

1. P3世代のJBMMSCを、ウェルあたり5×10³ セルの密度で96ウェルプレートに播種します。
2. 各ウェルに10 μLのCCK-8溶液を加えます。
3. 96ウェルプレートをインキュベーターに2時間置き、マイクロプレートリーダーを使用して吸光度(450 nmでのOD値)を測定します。
   注意: テストは、7日間連続して毎日同じ時間に実行します。

5.コロニー形成能力

1. 通路3から1000個のJBMMSCを10cmの培養皿に播種し、5%_CO2で37°Cで培養します。
2. 培地は3日ごとに交換してください。
3. クリスタルバイオレット染色は、15日間連続培養した後、行ってください。
4. 次に、細胞をメタノールで5分間固定し、2%クリスタルバイオレットで5分間染色します。

6. JBMMSCの多系統化

注:多系統の分化には、P3世代のJBMMSCを使用してください。対照群は、α-MEM完全培地で培養しました。

1. 骨形成分化を行います。
   1. 6ウェルプレートでウェルあたり1×10個の5JBMMSCを接種します。
   2. 細胞の合流が70%に達したら、培地を骨形成誘導培地に変更します。
      注:骨形成誘導媒体は3日ごとに交換してください。
   3. 骨形成導入の7日後にアルカリホスファターゼ(ALP)染色を行います。
   4. 6ウェルプレートから培地を取り出し、細胞を4%パラホルムアルデヒドで室温で30分間固定し、PBSで3回洗浄します。
   5. ALP染色液で室温で30分間染色し、光から保護します。
   6. 染色液が残らなくなるまで細胞をすすぎ、顕微鏡で試料を観察します。
   7. 骨形成導入の21日後にアリザリンレッド染色を行います。
   8. 細胞を4%パラホルムアルデヒドで30分間固定した後、Alizarin赤色染色溶液で5分間細胞を染色します。
   9. アリザリン赤色染色液が残らなくなるまで、細胞をPBSで洗浄します。
   10. カルシウム結節の数を顕微鏡で観察します。
2. 脂肪分化を行います。
   1. 6ウェルプレートでウェルあたり1個×10個の⁵ 個のJBMMSCを接種します。
   2. 細胞のコンフルエンスが70%に達したら、培地を脂肪形成誘導培地に変更します。
      注:脂肪原性誘導培地は3日ごとに交換してください。
   3. 脂肪形成導入の14日後にオイルレッドO染色を行います。
   4. 6ウェルプレートから培地を取り出し、細胞をオイルレッドO固定溶液で20〜30分間固定した後、PBSで3回洗浄します。
   5. 固定液を取り出し、細胞を蒸留水で2回洗浄します。
   6. 細胞を60%イソプロパノールに20〜30秒間浸します。
   7. 60%イソプロパノールを除去し、細胞をオイルレッドO染色で20〜30分間染色します。
   8. 染色液を取り出し、細胞を60%イソプロパノールで20〜30秒間すすぎ、蒸留水で洗浄します。
   9. 核をヘマトキシリン溶液で1〜2分間染色します。
   10. ヘマトキシリン溶液を取り除き、細胞を蒸留水で2〜3回洗浄します。オイルレッドOバッファーを1分間追加し、取り外します。
   11. 顕微鏡で脂肪滴の数を観察します。
3. 軟骨分化を行います。
   1. 6ウェルプレートでウェルあたり1個×10個の⁵ 個のJBMMSCを接種します。
   2. 細胞の結合が70%に達したら、培地を軟骨形成誘導培地に変更します。
      注:軟骨誘発培地は3日ごとに交換してください。
   3. 軟骨導入の21日後にアルシアンブルー染色を行います。
   4. 6ウェルプレートから培地を取り出し、細胞を4%パラホルムアルデヒドで室温で30分間固定し、PBSで3回洗浄します。
   5. 細胞をアルシアンブルー染色で37°Cで1時間染色します。
   6. 染色液が残らなくなるまで細胞を洗い流し、顕微鏡で観察します。

7. リアルタイムPCR

1. RNA抽出キットを使用して全RNAを抽出し、酵素マーカーでRNA濃度を測定します(製造元の指示に従ってください)。
2. 500 ngのRNA¹⁹を使用してcDNAを合成します。
3. 1 μL の cDNA、3.5 μL の二重蒸留水、5 μL の SYBR、および 0.5 μL のプライマーミックス (0.1 μM) を含む 10 μL の qRT-PCR ミックスを使用して、リアルタイムシステムで qRT-PCR を実施します。
   注:プライマー配列を 表1に示します。熱サイクル条件は、50 °C で 2 分間、95 °C で 2 分間、続いて 95 °C で 15 秒、60 °C で 2 分間のサイクルを 40 回繰り返し、その後 60 °C から 95 °C まで 0.5 °C で 5 秒間ずつ増やして融解曲線を経ます。
4. 内部統制としてGAPDHを使用する¹⁶.

細胞接種の72時間後、ほとんどの細胞は懸濁して丸い形をしており、壁に付着している細胞はほとんどありませんでした(図1B)。5日目までに、接着性細胞コロニーが出現し、紡錘体または線維芽細胞様の形状を示しました(図1C)。7日目までに、接着細胞は90%のコンフルエントに達し、少数の間欠的な懸濁細胞で「魚の群れ」の形を形成しました(

骨髄間葉系幹細胞(BMMSC)は、骨髄に存在する非造血幹細胞のサブセットであり、自己複製能力、多方向分化能、および造血の支持機能を特徴としています。これらの細胞は、組織再生、血管新生、細胞活動の調節など、さまざまな生理学的プロセスにおいて極めて重要な役割を果たしている²⁰。その結果、BMMSCは、最適なシード細胞源として、組織修復および再生工学におい?...

著者は何も開示していません。

この研究は、軍事委員会兵站部(19BJZ22)、北京自然科学基金会(7232154)、および第四ミル医科大学の臨床研究プロジェクト(2021XB025)のヘルスケアプロジェクトの支援を受けました。