Domuz Normomik İzole Karaciğer Perfüzyonu

Burada açıklanan karaciğer normotermik makine perfüzyonunun (NMP) domuz modeli, NMP'yi bir koruma stratejisi, canlılık değerlendirmesi için bir araç ve organ onarımı için bir platform olarak incelemek için başarıyla kullanılabilir. Yüksek bir çeviri değerine sahiptir, ancak teknik olarak zorlu ve emek yoğundur.

Karaciğer ex situ normotermik makine perfüzyonunun (NMP) domuz modelleri, nakil araştırmalarında giderek daha fazla kullanılmaktadır. Kemirgenlerin aksine, domuz karaciğerleri anatomik ve fizyolojik olarak insanlara yakın, benzer organ büyüklüğü ve safra bileşimine sahiptir. NMP, karaciğer damar sistemi boyunca ılık, oksijenli ve besin açısından zenginleştirilmiş kırmızı kan hücresi bazlı bir perfüzatı yeniden dolaştırarak karaciğer greftini fizyolojik koşullara yakın koşullarda korur. NMP, iskemi-reperfüzyon hasarını incelemek, transplantasyondan önce bir karaciğeri ex situ korumak, implantasyondan önce karaciğerin işlevini değerlendirmek ve organ onarımı ve rejenerasyonu için bir platform sağlamak için kullanılabilir. Alternatif olarak, transplantasyonu taklit etmek için tam kan bazlı bir perfüzatlı NMP kullanılabilir. Bununla birlikte, bu model emek yoğundur, teknik olarak zordur ve yüksek bir finansal maliyet taşır.

Bu domuz NMP modelinde, sıcak iskemik hasarlı karaciğerler kullanıyoruz (dolaşım ölümünden sonra bağışa karşılık gelir). Önce mekanik ventilasyon ile genel anesteziye başlanır, ardından torasik aort 60 dakika süreyle klemplenerek sıcak iskemi indüksiyonu yapılır. Abdominal aort ve portal ven içine yerleştirilen kanüller, karaciğerin soğuk koruma solüsyonu ile dışarı atılmasını sağlar. Dışarı atılan kan, konsantre kırmızı kan hücreleri elde etmek için bir hücre koruyucu ile yıkanır. Hepatektomiyi takiben, kanüller portal ven, hepatik arter ve infra-hepatik vena kavaya yerleştirilir ve bir plazma genişletici ve kırmızı kan hücreleri ile hazırlanmış kapalı bir perfüzyon devresine bağlanır. Devreye içi boş bir fiber oksijenatör dahil edilir ve 38 ° C'de 70-100 mmHg'lik bir pO2'yi korumak için bir ısı eşanjörüne bağlanır. NMP, doğrudan arterden ve portal ven boyunca venöz bir rezervuar yoluyla sürekli bir akışla elde edilir. Akışlar, basınçlar ve kan gazı değerleri sürekli olarak izlenir. Karaciğer hasarını değerlendirmek için, perfüzat ve doku önceden tanımlanmış zaman noktalarında örneklenir; Safra, ortak safra kanalındaki bir kanül aracılığıyla toplanır.

Karaciğer nakli, son dönem karaciğer yetmezliği için tek kesin tedavidir; Bununla birlikte, başarısı, bekleme listesindeki hastalar ile potansiyel donör organların mevcudiyeti arasındaki kalıcı bir dengesizlik ile sınırlıdır¹. Donör havuzunu artırmak için, donör kriterleri, daha yaşlı donör yaşı, karaciğer yağlanması ve dolaşım ölümünden sonra bağış (DCD) dahil olmak üzere son on yılda kademeli olarak ^{genişletilmiştir2,3}. Bir DCD prosedürü sırasında, karaciğer her zaman yaşamı sürdüren tedavinin geri çekilmesi, ölüm beyanı ve yerinde soğutma ve koruma, ağırlaştırıcı iskemi-reperfüzyon hasarı (IRI^{) arasında} bir sıcak iskemi dönemine maruz kalır4. Sonuç olarak, DCD karaciğerleri erken allogreft disfonksiyonu ve biliyer komplikasyon insidansının artmasıyla ilişkilidir ^5,6.

Bu yüksek riskli donör karaciğerler için, statik soğuk hava deposu ile geleneksel koruma, IRI'ye karşı yeterli koruma sağlamaz. Bu nedenle, normotermik makine perfüzyonu (NMP) gibi alternatif koruma stratejileri önemli ölçüde ilgi görmüştür. Normotermik makine perfüzyonu sırasında, karaciğer ex situ olarak izole edilmiş bir devreye bağlanır ve vücut sıcaklığında oksijenli ve besin açısından zenginleştirilmiş bir perfüzat ile perfüze edilir. Klinik çalışmalar, NMP'nin, azalmış pik transaminaz salınımı ve erken allogreft disfonksiyonu⁷ ile yansıtıldığı gibi hepatosellüler hasarı azalttığını göstermektedir. Bununla birlikte, NMP⁸ sırasında karaciğer hücresi biyolojisi hakkında çok az şey bilinmektedir.

Hayvan modelleri, karaciğer transplantasyonunun evriminde çok önemli olmuştur. Kemirgen modellerinin aksine, domuz karaciğeri anatomik ve fizyolojik olarak insanlara yakın olduğundan, benzer organ büyüklüğü ve safra bileşimi ile domuzun daha yüksek translasyon değerine sahip olduğu düşünülmektedir. Bununla birlikte, domuz karaciğeri nakli modelleri emek yoğundur, standartlaştırılması zordur ve önemli ölçüde daha yüksek bir finansal maliyet taşır.

Domuz karaciğeri NMP, farklı amaçlara hizmet etmek için kullanılabilir. Tam kan bazlı bir perfüzat kullanırken ex situ transplantasyonu taklit etmek, lökosit tükenmiş kırmızı kan hücresi bazlı perfüzat ile koruyucu bir ortamda bir donör karaciğeri korumak, transplantasyondan önce ex situ karaciğer fonksiyonunu öngören potansiyel biyobelirteçleri değerlendirmek için veya rejeneratif tedaviyi araştırmak için bir platform olarak uygulanabilir ^9,10,11.

Domuz karaciğeri NMP modellerinin benimsenmesi zordur, ancak cerrahi ve perfüzyonla ilgili teknik yönler nadiren tanımlanmıştır. Araştırma laboratuvarımızda, hem nakil için bir karaciğer greftini korumak hem de bir nakli taklit etmek için kullanılabilecek 24 saatlik bir domuz ex situ izole karaciğer perfüzyon modeli geliştirmek ve doğrulamak için Butler ve ^ark.12 tarafından orijinal olarak tanımlanan NMP kurulumunu benimsedik. Burada, adım adım bir protokolü açıklıyoruz; Metodolojik bir çerçeve ve potansiyel tuzaklar başka bir yerde yayınlanmıştır⁹.

Tüm deneyler KU Leuven hayvan bakım komitesi onayından sonra ve Avrupa yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Hayvan bilgileri

NOT: Bu çalışma protokolü için 3 aylık, vücut ağırlığı yaklaşık 30 kg ve karaciğer ağırlığı 600-700 g olan erkek TOPIGS TN70 domuzları kullanılmıştır.

1. Hayvanları, yiyecek ve musluk suyuna serbest erişim ve aralarında görsel, koku alma ve işitsel temas olan tek kalemlerde 12 saatlik gündüz/gece ritmi altında tutun.
2. Hayvanların çevrelerine alışmaları için ameliyattan en az 2 gün önce gelmelerini sağlayın. Ameliyattan önce domuzları 12 saat boyunca suya ücretsiz erişim ile oruç tutun.
   NOT: Anestezi izofluran ve fentanil ile analjezi ile sürdürülür. Anestezi boyunca elektrokardiyogram, nabız oksimetresi, kapnografi ve kan basıncı sürekli olarak izlenir. Deneyler terminaldir; Domuzlar, sürekli genel anestezi ve analjezi altında karaciğeri temin ederken kan kaybı ile ötenazi yapılır.

2. Perfüzyon düzeneğinin hazırlanması

1. Tek kullanımlık perfüzyon kitinin kurulumu
   1. Rezervuarı, karaciğer haznesinden yaklaşık 15 cm daha yüksek sabit bir yüksekliğe sabitleyin.
   2. Pompa kafasını santrifüj pompa üzerinde belirtilen yuvaya bağlayın. Oksijen tüpünü oksijenatöre bağlayın. Isıtıcının/soğutucunun giriş ve çıkış borularını oksijenatör üzerinde belirtilen yuvalara bağlayın.
   3. Rezervuarın altındaki çıkış borusuna bir sıkıştırma valfi takın. Giriş borusundaki ikinci sıkıştırma valfini, diğer tüpün hepatik arteri besleyeceği Y bağlantısından sonra rezervuara takın.
      NOT: İlk sıkıştırma valfi, portal damara girişi kontrol edecektir. İkinci sıkıştırma valfinin kapatılması akışı ve dolayısıyla hepatik arterdeki basıncı artıracaktır.
   4. Akış sensörünü rezervuar çıkış borusundaki ilk sıkıştırma valfinden uzağa takın. İkinci akış sensörünü giriş borusuna pompa kafasına takın.
      NOT: İlk akış sensörü, portal damara giden akışı ölçecektir. İkinci akış sensörü, vena kavadan gelen çıkışı ölçecektir.
   5. Çıkış tüpünü oksijenatörden kesin ve arteriyel filtreyi doğru yönde yerleştirin.
      NOT: Tüpü oksijenatörden sonra 2 cm'den daha uzun olmayacak şekilde kesin; çok uzun süre bırakılırsa, 37 ° C'lik bir perfüzat ile perfüze edildiğinde boru daha yumuşak hale geldiğinde bükülür. Hala bükülüyorsa, arteriyel filtreyi rezervuarın desteğine bağlayarak destekleyin.
2. Kaçak devridaim borusunun montajı
   1. Perfüzyon kiti, bir adet 3/16 uçlu ve bir adet 1/16 uçlu iki tüp içerir. 1/16 ucunu 3/16 ucuna sokarak iki tüpü birbirine bağlayın. 3/16 ucunu rezervuara bağlayın.
   2. Boruyu, dönüş yönünü göz önünde bulundurarak silindir pompasına takın. Doğru boru çapını ayarlayın ve hızı dakikada 15-18 dönüşe (rpm) ayarlayın. 1/16 ucunu karaciğer yuvasına yerleştirin ve gerekirse sabitleyin.
3. Sürekli in-line kan gazı analizi kalibrasyonu
   1. Gaz analizörünü açın ve Kalibre Et'i seçin.
   2. Sensör paketindeki doğru seri numarasını kontrol edin ve Tamam'a basın.
   3. Arteriyel sensör tutucusunu kasetten çıkarın ve sensörü üstte mavi bir kapak ve altta beyaz bir filtre ile kasete bağlayın.
   4. Filtrenin altındaki beyaz kapağı sökün ve çıkarın; Filtrenin kendisini sökmeyin. Üstteki mavi havalandırma kapağını gevşetin, çıkarmayın. Sensörü ve sensör tutucuyu kalibrasyon kasetine sıkıca yerleştirin.
   5. Kalibrasyonu başlatın. Kalibrasyon bittiğinde, sensörü ve sensör tutucuyu kalibrasyon kasetinden çıkarın. Alttaki beyaz filtreyi çıkarın ve üstteki mavi havalandırma kapağını sıkın.
   6. Sensörü perfüzyon kitinin örnekleme hattına yerleştirin. Perfüzyon devresi hazırlanana kadar gaz analizine başlamayın.
4. Devrenin hazırlanması
   1. 500 mL'lik bir plazma genişletici torbasına bir infüzyon hattı yerleştirin ve rezervuara takın. Rezervuar çıkış hattına bir tüp kelepçesi yerleştirin ve rezervuarı 300 mL plazma genişletici ile doldurun.
   2. Tüp kelepçesini çıkarın ve plazma genişleticinin devreyi doldurmasına izin verin
   3. Pompa kafasını ve oksijenatörü havadan alın. Devre şimdi astarlanmıştır. Isıtıcıyı/soğutucuyu açın ve 38 °C'ye ayarlayın
5. İnfüzyon hatlarının hazırlanması
   1. 5 mL'lik bir şırıngaya 5 mL (25.000 U) 5 U / mL heparin çözeltisi çekin. Toplam hacim 30 mL heparin çözeltisi elde etmek için 25 mL ilave %0.9 NaCl çözeltisi çizin (infüzyon hızı: 1 mL / s).
   2. 5 g sodyum taurokolatı 50 mL% 0.9 NaCl içinde çözün ve% 1 konsantrasyona ulaşmak için 450 mL% 0.9 NaCl'ye çekin. Toplam 168 mL'lik bir hacim gereklidir (infüzyon hızı: 7 mL / s).
   3. 50 mL'lik bir şırıngaya 2 mL (200 U) 100 U / mL insülin çözeltisi çekin. Toplam hacim 30 mL insülin çözeltisi elde etmek için 28 mL ilave %0.9 NaCl çözeltisi çekin (infüzyon hızı: 1 mL / s).
   4. 10 mL glisin tamponu (seyreltici) çizin ve 0.5 mg epoprostenol şişesine ekleyin. Epoprostenol kitinde verilen mikrobiyal filtreyi kullanarak, 50 mL'lik bir şırıngada glisin tamponu ile sulandırılmış epoprostenol içeren flakondan 5 mL çekin. Toplam hacim 30 mL epoprostenol çözeltisi elde etmek için 25 mL ilave %0.9 NaCl çözeltisi çekin (infüzyon hızı: 1 mL / s).

3. Anestezi indüksiyonu

1. Sedasyon
   1. 2 mg / kg ksilazin ve 8 mg / kg Zoletil (4 mg / kg tiletamin ve 4 mg / kg zolazepam), 10 mL% 0.9 NaCl içeren bir şırınga, üç bir valf, bir uzatma hattı ve bir kas içi 21 G iğne içeren bir şırınga hazırlayın.
   2. İğneyi gluteal kasın içine yerleştirin, ksilazin ve tiletamin karışımını enjekte edin ve uzatma hattını %0.9 NaCl ile yıkayın. 15 dakika sonra domuz sakinleştirilir.
   3. Domuzu tartın ve ameliyathaneye taşıyın.
2. Anestezi
   1. Ventilatörü açın
   2. Domuzu ameliyat masasına sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve ekstremiteleri sabitleyin.
   3. 1,5 L O₂, 1,5 L hava ve% 1 izofluran içeren bir ventilasyon maskesi ile önceden oksijenlendirin.
   4. Kuyruğa veya kulağa bir doygunluk probu takın. Sürekli izleme için üç elektrokardiyogram kablosunu bağlayın.
   5. Bir kulak damarına 22 G'lik bir kateter yerleştirin, üç bir valfe bağlayın ve 400 mL / s hızında intravenöz (IV) sıvıların (Plazmalit) damlamasına başlayın.
   6. 50 μg/mL fentanil içeren 60 mL'lik bir şırıngayı otomatik şırınga sürücüsüne yerleştirin. 1 mL'lik bir bolus verin ve 0.16 mL / kg / s oranında sürekli bir infüzyon başlatın.
   7. Ventilasyon maskesini çıkarın ve laringoskopu yerleştirin, epiglotusu kaldırın. Trakeaya bir endotrakeal tüp yerleştirin ve hava sızıntısını önlemek için balonu şişirin. Tüpü bantla domuzun burnuna sabitleyin.
      NOT: Ventilasyon maskesini çıkarırken izofluranı kapatın.
   8. Endotrakeal tüpü ventilatöre bağlayın.
      NOT: Ventilatör ayarları: 0,4 L tidal hacim; 0,5 kPa ortalama hava yolu basıncı; 2.5 kPa hava yolu basıncı; 0,5 kPa pozitif uç ekspiratuar basınç; 15 / dak frekans; 4.7-5.3 kPa gelgit sonu CO₂.
   9. Kapnografı endotrakeal tüpe bağlayın.

4. Ameliyat

1. Derin venöz kateter ve arteriyel hat
   1. Cerrahi alanı betadin ile dezenfekte edin ve orta hattın her iki tarafına perdeler yerleştirin.
   2. Sternumun üst kısmının sol tarafından sternokleidomastoid kasa lateral olarak 7 cm uzunluğunda bir kesi yapın ve ortostatik bir ekartör yerleştirin.
   3. Deri altı dokuyu kastan lateral yönde inceleyin ve dış juguler veni tanımlayın. Damarı serbest bırakın, varsa yan dalları bağlayın.
   4. Dış juguler venin etrafına iki adet 2/0 ligatür yerleştirin ve kraniyal ligatürü bağlayın.
   5. Bağlı ligatürden ven kaudalini kesin ve 12 Fransız venöz kateter yerleştirin.
      NOT: Yerleştirmeden önce venöz kateterin heparinize salin ile yıkandığından emin olun.
   6. Kateteri ikinci ligatür ile sabitleyin. Kulak damarındaki venöz kateter kırılgan veya çok küçükse, IV sıvısını ve fentanil hatlarını derin venöz katetere geçirin. Aksi takdirde, hücre koruyucuya kan alınana kadar kullanmayın.
   7. Sternokleidomastoid kasın medial kenarını diseksiyon yapın ve lateral taraftaki sternokleidomastoid kas ile medial taraftaki trakea arasındaki düzlemi açan ortostatik ekartörü değiştirin.
   8. Karotis arteri ortaya çıkarmak için timusu çıkarın. Arter için adım 4.1.4'ü tekrarlayın.
   9. Arteriyel çizgiyi karotis artere kaudal yönde yerleştirin ve sabitleyin. Arteriyel hattı basınç monitöründen gelen hatta bağlayın.
2. Aort ve vena kava diseksiyonu
   1. Ksifoidden kasık kemiğine kadar orta hat laparotomisi yapın.
      NOT: Erkek domuzlarda, deri altı üretraya zarar vermemek için penisten kaudal, orta hattan 1 cm yanal kesin.
   2. Göbek bağını kesin. Abdominal bir ekartör yerleştirin. Aort ve vena kava'yı görselleştirmek için bağırsakları lateral ve kraniyal olarak sola çekin.
      NOT: Domuz bağırsağı döndürülmemiştir; Bu nedenle, retroperitoneuma erişim sağlamak için kolon mobilizasyonu gerekli değildir.
   3. Aortun yaklaşık 3 cm'lik kısmını, iliak bifurkasyonun hemen kraniyalini diseksiyon ve aortun etrafına iki ligatür yerleştirin.
      NOT: Aortun yakınında büyük bir lenfatik damar vardır; Cerrahi alanı bulanıklaştıracağı ve diseksiyonu zorlaştıracağı için ona zarar vermemeye dikkat edin.
   4. Vena kavayı aort ile aynı seviyede diseksiyon yapın ve iki ligatür yerleştirin.
3. Gastroduodenal ligament diseksiyonu
   1. Diseksiyonu gastroduodenal ligamanın lateral tarafında başlatın, ortak safra kanalını diseksiyon yapın ve bir damar halkası ile çevreleyin.
   2. Portal veni açığa çıkararak safra kanalını medial tarafa geri çekin. Portal venin yan tarafında büyük bir lenf nodunu çıkarın
   3. Portal veni pankreasa doğru serbest bırakın; Genellikle mide ve pankreastan bağlanması ve kesilmesi gereken bir dal vardır. Portal veni, karaciğerin yan tarafında bir damar halkası ve pankreasın yanında bir bağ ile çevreleyin. Portal veni yanal olarak geri çekin ve kapatmadığınızdan emin olun.
   4. Ortak hepatik arteri tanımlayın ve bir damar halkası ile çevreleyin.
4. Torasik aort diseksiyonu
   1. Karaciğer kaudalini çekin ve diyaframın merkezi tendinöz kısmını suprahepatik vena kavadan ventral olarak açın. Yemek borusunu sağ tarafa çekin ve torasik aortu açığa çıkarın.
   2. Çevreleyen dokudan diseksiyon yapın ve azygos venine zarar vermemeye dikkat edin.
      NOT: Torasik aortu çevrelemek gerekli değildir; Diseksiyon, vasküler bir klemp yerleştirmek için yeterince uzatılmalıdır.
5. Hücre koruyucunun hazırlanması
   1. Rezervuarı siyah halkaya asın, adaptörün tek bacağından kapağı çıkarın ve tüpü kan alma haznesinin altındaki 3/8 inç çıkış portuna takın.
   2. Aspirasyon/antikoagülan tüpün kapağını açın ve kan alma rezervuarının üst kenarındaki 1/4 inç kan giriş portlarından birine bağlayın.
   3. Yıkama kitinin kasesini çevirerek yerleştirin; Bir tık sesi duyulduğundan emin olun.
   4. Boruyu makaralı pompaya ve boru bölücüye yerleştirin.
   5. Direğe bir sitrat fosfat dekstroz adenin (CPDA)-1 kan alma torbası asın ve bağlantının sıkı olduğundan emin olun.
      NOT: CPDA-1 kan torbası bileşimi (63 mL): 2.99 g/L susuz sitrik asit; 26,3 g/L dihidroöz sodyum sitrat; 2.22 g/L monohidrat sodyum fosfat; 31,9 g/L dekstroz monohidrat; 0.275 g/L adenin.
   6. Atık torbasını makinenin yan tarafına asın (düzgün kapatıldığından emin olun) ve yıkama kitine (sarı kapak) bağlayın.
   7. Her iki Y şeklindeki tüpü (beyaz kapaklar) 3 L% 0.9 NaCl'lik bir torbaya bağlayın.
   8. Mavi kapaklı tüpü kan alma haznesinin altındaki adaptör tüpüne takın. Ototransfüzyon sistemini açın.
6. Aort ve vena kava kanülasyonu
   1. 500 IU / kg heparin uygulayın ve 2 dakika boyunca dolaşmasına izin verin. Kuyruk bağını aortun etrafına bağlayın ve aort içine 20 Fransız kanülü yerleştirin ve sabitleyin. Aynı işlem vena kava için de tekrarlanır.
7. Bir DCD prosedürünü taklit etmek için, torasik aortun bir süre, bu durumda 60 dakika boyunca klemplenmesiyle sıcak iskemi indüklenir.
   NOT: Sıcak iskemi sırasında kaval ve juguler drenaj açılır ve hücre koruyucuya kan alımına başlanır. Bu, domuzun kan kaybına neden olur.
8. Karaciğeri yıkamak
   1. Sıcak iskeminin sonunda, aort kanülünden 2 L buz gibi (4-6 ° C) koruma solüsyonu ile soğuk bir yıkama başlatın ve topikal bir sulu buz uygulamasıyla karnı soğutun.
      NOT: Soğuk basması sırasında kalan tüm kan dışarı atılır ve hücre koruyucuya toplanır.
   2. İlk 2 L yıkandığında, kanülü aorttan çıkarın, ligatürü portal ven üzerine bağlayın ve portal veni kanül edin. Ardından, damar halkası ile sabitleyin.
   3. Karaciğeri portal ven yoluyla 2 L buz gibi soğuk (4-6 ° C) koruma solüsyonu ile yıkayın.
9. Hepatektomi (Hepatektomi)
   1. Buzu karından çıkarın. Safra kanalını pankreasa yakın bir yerden geçirin.
   2. Portal kanülü çıkarın ve portal veni bölün. İnfrahepatik vena kava'yı ortaya çıkarmak için bağırsakları sola doğru geri çekin.
   3. Vena kava'yı retroperitoneumdan serbest bırakın ve sadece kranyali renal damarlardan ayırın. Ortak hepatik arteri çölyak artere kadar inceleyin ve aorttan çıkarın.
      NOT: Sağ diyafram kabuğunun kesilmesi maruziyeti iyileştirebilir.
   4. Gastroduodenal arteri bölün ve çölyak arteri aortun bir yaması ile kesin. Mideye yakın olan küçük omentumu kraniyal olarak yemek borusuna kadar kesin
   5. Sol üçgen bağı keserek sol karaciğeri harekete geçirin. Vena kavanın sol tarafındaki diyaframı kesin.
   6. Sağ diyaframı ventralden dorsale keserek sağ karaciğeri mobilize edin, infrahepatik vena kava transeksiyonundan sadece kaudal olarak sonlandırın.
   7. Suprahepatik vena kava'yı kesin ve kalan ekleri kesin. Karaciğer artık serbesttir; Çıkarın ve buzlu su dolu bir kaseye koyun.
10. Arka masa prosedürü
    1. Karaciğeri tartın. Portal veni 25 Fransız kanülü ile kanül edin ve ligatürlerle sabitleyin. Hepatik arteri 14 Fransız takviyeli kanül ile kanül edin ve ligatürlerle sabitleyin.
    2. İnfrahepatik vena kava'yı kanül edin ve kanülün ucunu vena kavada hepatik venlerin boşaldığı seviyeye yerleştirin. Ligatürlerle sabitleyin.
    3. Herhangi bir diyafram damarından kanamayı önlemek için diyaframın kenarına bir çanta ipi koyun ve suprahepatik vena kava'yı bağlayın.
    4. Portal kanülün havasını alın ve 250 mL soğuk plazma genişletici ile portal venin arka masa yıkamasını gerçekleştirin. Herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol edin.
       NOT: Kaval kanülünden yeterli çıkış olup olmadığını kontrol edin.
    5. Portal yıkandıktan sonra, kanül ve portal ven içine hava girmediğinden emin olmak için portal kanül üzerine bir tüp kelepçesi yerleştirin.
    6. Arteriyel kanülü havadan alın ve 250 mL soğuk plazma genişleticiyi hepatik arterden yıkayın. Herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol edin ve yan dalları klipsleyin. Arteriyel ve kaval kanül üzerine bir tüp kelepçesi yerleştirin.

5. Normothermic makine perfüzyonu

1. Çürütmek
   1. Arka masa hazırlığı sırasında, istenen %30'luk hematokrit elde etmek için hücre koruyucu tarafından üretilen, yıkanmış kırmızı kan hücrelerini devreye ekleyin. Kırmızı kan hücrelerini plazma genişletici ile karıştırmak için pompayı çalıştırın. Sürekli gaz analizörünü başlatın.
      NOT: İstenen hematokrit'i elde etmek için kırmızı kan hücresi hacmi formülü: (karaciğer ağırlığı + hazırlama hacmi) x yıkamadan sonra istenen hematokrit / hematokrit. Sürekli gaz analizörü ayrıca, normalde ısıtıcının 38 °C'deki ayarına uyan perfüzyon sıcaklığı hakkında geri bildirim sağlar.
   2. Perfüzata 10 mL %10 kalsiyum glukonat, 2 mL heparin (10.000 IU) ve 10 mL %0.9 NaCl içinde 750 mg sefuroksim ekleyin. Manuel gazlı karıştırıcıyı %21'in 0,5 L/dk FiO_2'sine ayarlayın.
2. Perfüzyonun başlatılması
   1. Sızıntı devridaim için basınç sensörlerini, akış sensörlerini ve silindir pompasını açın.
   2. Karaciğeri hazneye yerleştirin. Tüp kelepçelerini portala ve arteriyel giriş tüpüne ve devrenin kaval çıkış tüpüne yerleştirin ve Y konektörünü kesin.
   3. Kanülleri, aralarında bir T bağlantı parçası olacak şekilde ilgili giriş ve çıkış tüplerine bağlayın. Devreye hava girmesini önleyin.
   4. T bağlantı parçalarına üç musluklar takın ve basınç hatlarını bunlara bağlayın. Hatlara sıfır basınç uygulayın ve sürekli basınç izlemeye başlayın.
   5. Suprafizyolojik akışları ve endotel stresini önlemek için sıkıştırma valflerini neredeyse tamamen kapatacak şekilde ayarlayın.
   6. Tüp kelepçelerini portal girişinden çıkararak perfüzyonu başlatın. Portal girişi başladıktan hemen sonra, kelepçeleri kaval çıkışından çıkarın ve pompayı çalıştırın. Pompa hızı basınç kontrollüdür, bu nedenle kaval çıkışında -5 mmHg ile -2 mmHg arasında bir basınç hedefleyin. 0.75 mL / dak / g karaciğer portal akışı hedefleyin.
   7. Portal perfüzyon stabil olduğunda ve kaval basınçları yeterli olduğunda, kelepçeleri arteriyel tüpten çıkarın. 55-60 mmHg civarındaki basınçları hedefleyin ve 0,25 mL/dk/g karaciğer civarında akar.
3. Stabil perfüzyon hemodinamiğinin korunması
   1. Yüzeyden ısı kaybını önlemek için karaciğeri bir cam kubbe veya plastik sargı ile örtün.
   2. Portal akışı çok yüksekse, portal giriş borusundaki sıkıştırma valfini kapatın.
   3. Kaval basıncı çok negatif hale gelirse, vena kava içinde bir vakum oluşturma riski artar. Aşırı negatif basınçlar, pompa hızını yavaşlatarak önlenebilir. Alternatif olarak, portal ven boyunca artan akış, vena kavaya daha fazla hacim sağlayarak negatif çıkış basıncını azaltır.
   4. Arteriyel basınç çok düşükse, pompa hızını artırarak veya arteriyel giriş borusundan daha fazla akış itmek için sıkıştırma valfini portal rezervuara doğru kapatarak artırılabilir.
4. Örnekleme
   1. Perfüzat numunelerini kaval çıkış çıkışlı üç vanadan veya oksijenatör ile portal rezervuar arasındaki belirlenmiş bir numune alma hattından alın.
   2. Perfüzyon boyunca iğne biyopsileri alın. Devrenin heparinizasyonuna bağlı olarak pıhtılaşma olmadığı için iğne delikleri dikilmelidir.
   3. Safra kanalına 8 Fransız kanülü sabitleyerek safra toplayın. Kistik kanalı bağladığınızdan emin olun.

Sunulan perfüzyon protokolü, 24 saate kadar stabil hemodinamik koşullar elde etmek ve portal ven ve hepatik arterdeki kan akışının fizyolojik dağılımını simüle etmek için karaciğerin kan akışının kendi kendini düzenlemesini kullanır. Şekil 1 , perfüzyon devresinin şematik bir genel bakışını temsil etmektedir. Şekil 2A , portal ven ve hepatik arterin toplam hepatik akışın sırasıyla yaklaşık% 75...

Burada, domuz karaciğeri NMP ile ilgili deneyimimizi detaylandırdık. Bu tekniğin avantajları arasında yüksek çeviri değeri ve çok yönlülük bulunur. Domuz karaciğeri NMP, bu gelişmiş koruma tekniğini araştırmak ve anlamayı artırmak için veya alternatif olarak transplantasyonu taklit etmek için uygulanabilir. Bu kurulum, perfüzyonun her yönü üzerinde manuel kontrole izin vererek, hem portal hem de arteriyel basıncın ve akışın çeşitli şekillerde ayarlanmas...

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Yazarlar, bu deneylerde yer alan KU Leuven tıp fakültesinden tüm araştırma öğrencilerine teşekkür eder.