ブタのNormothermic分離肝灌流

ここで説明した肝臓正常温機械灌流(NMP)のブタモデルは、NMPの保存戦略、生存率評価のツール、および臓器修復のプラットフォームとしての研究にうまく使用できます。高い翻訳価値を持っていますが、技術的には困難で、労働集約的です。

肝臓 のex situ 常温機械灌流(NMP)のブタモデルは、移植研究でますます使用されています。げっ歯類とは対照的に、ブタの肝臓は解剖学的および生理学的にヒトに近く、臓器の大きさと胆汁組成は似ています。NMPは、温かく、酸素化され、栄養豊富な赤血球ベースの灌流液を肝臓血管系に再循環させることにより、肝臓移植片を生理学的に近い状態で保存します。NMPは、虚血再灌流障害の研究、移植前の肝臓 のex situ 保存、移植前の肝臓の機能の評価、臓器の修復と再生のためのプラットフォームの提供に使用できます。あるいは、全血ベースの灌流液を含むNMPを使用して、移植を模倣することもできます。それにもかかわらず、このモデルは労働集約的で、技術的に困難であり、高い財政的コストを伴います。

このブタNMPモデルでは、温かい虚血性損傷肝臓(循環器死後の提供に相当)を使用しています。まず、人工呼吸器による全身麻酔が開始され、続いて胸部大動脈を 60 分間クランプして温虚血を誘発します。腹部大動脈と門脈に挿入されたカニューレは、低温保存液で肝臓を洗い流すことができます。洗い流された血液は、セルセーバーで洗浄され、濃縮された赤血球が得られます。肝切除術後、カニューレは門脈、肝動脈、および肝下大静脈に挿入され、血漿エキスパンダーと赤血球でプライミングされた閉灌流回路に接続されます。中空糸の酸素供給器は回路に含まれ、38 °C.で70-100 mmHgのpO2を維持するために熱交換器に結合される。流量、圧力、血液ガスの値は継続的に監視されます。肝障害を評価するために、灌流液と組織を事前定義された時点でサンプリングします。胆汁は、総胆管のカニューレを介して収集されます。

肝移植は、末期肝不全の唯一の決定的な治療法です。しかし、その成功は、順番待ちリストの患者と潜在的なドナー臓器の利用可能性との間の持続的な不均衡によって制限されています¹。ドナープールを増やすために、ドナーの基準は、ドナーの年齢、脂肪肝、循環器死後(DCD^)2,3など、ドナー基準を徐々に拡大してきました。DCD処置中、肝臓は常に、延命療法の中止、死亡の宣言、およびin situの冷却と保存の間に温性虚血の期間に苦しみ、虚血再灌流障害(IRI)^を悪化させます4。その結果、DCD肝臓は、早期の同種移植片機能不全および胆道合併症の発生率の増加と関連しています^5,6。

これらの高リスクのドナー肝臓の場合、静的な低温保存による従来の保存では、IRIに対する十分な保護が得られません。これまで、常温機械灌流(NMP)などの代替保存戦略が大きな牽引力を得てきました。常温マシン灌流中、肝臓は分離回路に ex situ 接続され、体温で酸素化および栄養豊富な灌流物で灌流されます。臨床試験では、NMPが肝細胞の損傷を軽減することが示唆されており、これはトランスアミナーゼのピーク放出の減少と早期の同種移植片機能障害に反映されています⁷。しかし、NMP⁸の期間中の肝細胞生物学についてはほとんど知られていません。

動物モデルは、肝移植の進化において極めて重要な役割を果たしてきました。げっ歯類モデルとは対照的に、ブタの肝臓は解剖学的および生理学的にヒトに近く、臓器のサイズと胆汁組成が類似しているため、ブタは翻訳価値が高いと考えられています。それにもかかわらず、ブタ肝移植モデルは労働集約的で、標準化が難しく、経済的コストが大幅に高くなります。

ブタの肝臓NMPは、さまざまな目的に使用できます。全血ベースの灌流液を使用する場合のex situ移植の模倣、白血球が枯渇した赤血球ベースの灌流液による保護環境でドナーの肝臓を保存するため、移植前に肝機能をex situで予測する潜在的なバイオマーカーを評価するため、または^{再生療法を研究する}ためのプラットフォームとして適用できます9,10,11。

ブタの肝臓NMPモデルの採用は困難であり、外科的および灌流関連の技術的側面はほとんど説明されていません。私たちの研究室では、Butlerらによって最初に記述されたNMPセットアップ¹²を採用して、移植用の肝移植片の保存と移植の模倣の両方に使用できる24時間ブタのex situ単離肝灌流モデルを開発および検証しました。ここでは、手順を追って説明します。方法論的枠組みと潜在的な落とし穴は、他の場所で公開^{されています9。}

すべての実験は、KUルーヴェン動物管理委員会の承認後、ヨーロッパのガイドラインに沿って行われました。

1. 動物情報

注: この研究プロトコルには、体重が約 30 kg 、肝臓重量が 600-700 g の 3 か月齢の雄 TOPIGS TN70 ブタが使用されます。

1. 動物たちを1つの囲いの中で12時間の昼夜のリズムの下に置き、餌と水道水に無料でアクセスし、動物間の視覚、嗅覚、聴覚の接触を確保します。
2. 動物が手術の少なくとも2日前に到着して、環境に慣れるようにしてください。手術の12時間前に豚を絶食し、水に無料でアクセスします。
   注:麻酔はイソフルランで維持され、鎮痛はフェンタニルで維持されます。麻酔中、心電図、パルスオキシメトリー、カプノグラフィー、血圧が継続的に監視されます。実験は末期的です。豚は、継続的な全身麻酔と鎮痛の下で肝臓を調達しながら、放血によって安楽死させます。

2. 灌流セットアップの準備

1. 使い捨て灌流キットの取り付け
   1. リザーバーを肝臓のレセプタクルより約15cm高い固定高さに固定します。
   2. ポンプヘッドを遠心ポンプの指定スロットに接続します。酸素チューブを酸素供給器に接続します。ヒーター/クーラーのインフローチューブとアウトフローチューブを酸素供給器の指定されたスロットに接続します。
   3. リザーバーの下のアウトフローチューブにピンチバルブを1つ取り付けます。Y接続後のリザーバーへの流入チューブに2番目のピンチバルブを取り付け、もう一方のチューブが肝動脈に供給します。
      注:最初のピンチバルブは、門脈への流入を制御します。2番目のピンチバルブを閉じると、流れが増加し、したがって肝動脈内の圧力も増加します。
   4. 最初のピンチバルブから遠位にフローセンサーをリザーバーアウトフローチューブに取り付けます。2番目のフローセンサーをポンプヘッドへのインフローチューブに取り付けます。
      注:最初のフローセンサーは、門脈への流れを測定します。2番目のフローセンサーは、大静脈からの流出を測定します。
   5. 酸素供給器から流出管を切断し、動脈フィルターを正しい方向に挿入します。
      注意: 酸素供給器の後ろにチューブを2cm以下に切断します。長時間放置すると、37°Cの灌流液で灌流したときにチューブが柔らかくなり、ねじれます。それでもよじれる場合は、動脈フィルターをリザーバーのサポートに結び付けてサポートします。
2. 漏れ再循環チューブの取り付け
   1. 灌流キットには、3/16エンドと1/16エンドの2つのチューブが含まれています。1/16の端を3/16の端に挿入して、2つのチューブを相互に接続します。3/16の端をリザーバーに接続します。
   2. 回転方向を考慮して、ローラーポンプにチューブを取り付けます。正しいチューブ径を設定し、速度を毎分15〜18回転(rpm)に設定します。1/16の端を肝臓のレセプタクルに入れ、必要に応じて固定します。
3. 連続インライン血液ガス分析キャリブレーション
   1. ガス分析器のスイッチを入れ、[ 校正]を選択します。
   2. センサーパッケージの正しいシリアル番号を確認し、[ OK]を押します。
   3. 動脈センサーホルダーをカセットから取り出し、上部に青いキャップ、下部に白いフィルターでセンサーを接続します。
   4. フィルターの下の白いキャップを緩めて取り外します。フィルター自体のネジを緩めないでください。上部の青いベントキャップを緩め、取り外さないでください。センサーとセンサーホルダーをキャリブレーションカセットにしっかりと挿入します。
   5. キャリブレーションを開始します。キャリブレーションが終了したら、センサーとセンサーホルダーをキャリブレーションカセットから取り外します。下部の白いフィルターを取り外し、上部の青いベントキャップを締めます。
   6. センサーをsに挿入しますamp灌流キットのライン。灌流回路がプライミングされるまで、ガス分析を開始しないでください。
4. 回路のプライミング
   1. 血漿エキスパンダーの500mLバッグに輸液ラインを挿入し、リザーバーに取り付けます。リザーバー流出ラインにチューブクランプを取り付け、リザーバーに300mLのプラズマエキスパンダーを充填します。
   2. チューブclを取り外しますamp プラズマエキスパンダーが回路を満たします
   3. ポンプヘッドと酸素供給器の空気を抜きます。これで、回路がプライミングされました。ヒーター/クーラーのスイッチを入れ、38°Cに設定します
5. 輸液ラインの準備
   1. 5 mL(25.000 U)の5 U / mLヘパリン溶液を50 mLシリンジに引き込みます。.さらに25 mLの0.9% NaCl溶液を吸引して、総量30 mLのヘパリン溶液を得ます(注入速度:1 mL / h)。
   2. 5 gのタウロコール酸ナトリウムを50 mLの0.9% NaClに溶解し、450 mLの0.9%NaClに引き込むと1%の濃度になります。.総容量168mLが必要です(注入速度:7mL / h)。
   3. 2 mL(200 U)の100 U / mLインスリン溶液を50 mLシリンジに引き込みます。.さらに28mLの0.9%NaCl溶液を吸引して、総量30mLのインスリン溶液を得ます(注入速度:1mL / h)。
   4. 10mLのグリシン緩衝液(希釈剤)を引き出し、それを0.5mgのエポプロステノールバイアルに加える。エポプロステノールキットに付属の微生物フィルターを使用して、50 mLシリンジでグリシンバッファーで再構成したエポプロステノールを含むバイアルから5 mLを引き出します。さらに25 mLの0.9%NaCl溶液を引き出して、総容量30 mLのエポプロステノール溶液を得ます(注入速度:1 mL / h)。

3.麻酔の導入

1. 鎮静
   1. 2 mg / kgキシラジンと8 mg / kgゾレチル(4 mg / kgタイルタミンと4 mg / kgゾラゼパム)を含むシリンジ、10 mLの0.9%NaClを含むシリンジ、三方弁、延長ライン、および筋肉内21 G針を準備します。.
   2. 針を臀筋に配置し、キシラジンとタイルタミンの混合物を注入し、延長線を0.9%NaClで洗い流します。15分後、ブタは鎮静されます。
   3. 豚の体重を量り、手術室に運びます。
2. 麻酔
   1. 人工呼吸器をつける
   2. ブタを手術台の仰臥位に置き、四肢を固定します。
   3. 1.5 LのO₂、1.5 Lの空気、および1%イソフルランを含む換気マスクで予備酸素化します。.
   4. サチュレーションプローブを尾または耳に取り付けます。3本の心電図リード線を接続して、継続的に監視します。
   5. 耳の静脈に22 Gのカテーテルを挿入し、三方弁に接続し、400 mL/hの速度で静脈内(IV)液体(血漿溶解物)の点滴を開始します。
   6. 50 μg/mLフェンタニルを入れた60 mLシリンジを自動シリンジドライバーに入れます。1 mLのボーラスを投与し、0.16 mL / kg / hの速度で連続注入を開始します。.
   7. 換気マスクを取り外し、喉頭鏡を挿入して喉頭蓋を持ち上げます。気管内に気管チューブを挿入し、バルーンを膨らませて空気漏れを防ぎます。チューブをテープで豚の鼻に固定します。
      注意: 換気マスクを取り外すときは、イソフルランを閉じてください。
   8. 気管内チューブを人工呼吸器に接続します。
      注:人工呼吸器の設定:0.4Lの潮汐量。0.5 kPa は気道内圧を意味します。2.5 kPa 気道圧;0.5kPaの呼気終末陽圧。15 /分の周波数;4.7-5.3 kPa 潮汐終末 CO₂.
   9. カプノグラフを気管内チューブに接続します。

4. 手術

1. 深部静脈カテーテルと動脈ライン
   1. 手術野をベタジンで消毒し、正中線の両側にドレープを置きます。
   2. 胸骨上部の左側から胸鎖乳突筋に向かって7cmの長さの切開を行い、起立性リトラクターを留置します。
   3. 筋肉から皮下組織を横方向に解剖し、外頸静脈を特定します。静脈を解剖し、存在する場合は側枝を結紮します。
   4. 2つの2/0結紮糸を外頸静脈の周りに配置し、頭蓋結紮糸を結びます。
   5. 結ばれた結紮糸から静脈尾側を切り開き、12フレンチ静脈カテーテルを挿入します。
      注:挿入する前に、静脈カテーテルがヘパリン化生理食塩水で洗い流されていることを確認してください。
   6. カテーテルを2番目の結紮糸で固定します。耳の静脈にある静脈カテーテルが壊れやすい、または小さすぎる場合は、IV液とフェンタニルラインを深部静脈カテーテルに切り替えます。それ以外の場合は、セルセーバーに採血されるまで使用しないでください。
   7. 胸鎖乳突筋の内側端を解剖し、起立性リトラクターを交換して、外側の胸鎖乳突筋と内側の気管との間の平面を開きます。
   8. 胸腺を取り外して頸動脈を露出させます。動脈について手順4.1.4を繰り返します。
   9. 頸動脈の動脈線を尾側に挿入し、固定します。幹線を圧力モニターからのラインに接続します。
2. 大動脈と大静脈の解剖
   1. 剣状突起から恥骨までの正中線開腹術を行います。
      注:雄のブタでは、陰茎から尾側にあり、皮下尿道の損傷を避けるために、正中線から1cm外側に切開します。
   2. 臍帯を切断します。腹部リトラクターを置きます。腸を横方向と頭蓋方向に引っ張って、大動脈と大静脈を視覚化します。
      注:ブタ腸は回転していません。したがって、後腹膜にアクセスするために結腸の動員は必要ありません。
   3. 腸骨分岐部の頭蓋骨だけの大動脈の約3cmを解剖し、大動脈の周りに2つの結紮糸を配置します。
      注:大動脈の近くに大きなリンパ管があります。傷つけると術野がぼやけて解剖が複雑になるので注意が必要です。
   4. 大動脈と同じレベルで大静脈を解剖し、2つの結紮糸を配置します。
3. 胃十二指腸靭帯解離術
   1. 胃十二指腸靭帯の外側から解剖を開始し、総胆管を解剖し、血管ループで囲みます。
   2. 胆管を内側に引っ込め、門脈を露出させます。門脈の外側にある大きなリンパ節を切除します
   3. 門脈を膵臓に向けて解放します。多くの場合、胃や膵臓からの枝があり、結紮して切断する必要があります。肝臓の側面に血管ループ、膵臓の側面に結紮糸で門脈を囲みます。門脈を横方向に引っ込め、閉じないように注意してください。
   4. 総肝動脈を特定し、血管ループで囲みます。
4. 胸部大動脈解離
   1. 肝臓の尾側を引っ張り、肝上大静脈から横隔膜の中央の腱部分を腹側に開きます。食道を右側に引っ込め、胸部大動脈を露出させます。
   2. 周囲の組織から解放され、奇静脈を傷つけないように注意してください。
      注:胸部大動脈を囲む必要はありません。解剖は、血管クランプを配置するのに十分なほど伸ばす必要があります。.
5. セルセーバーの調製
   1. リザーバーを黒いリングに吊るし、アダプターのシングルレッグからキャップを取り外し、チューブを採血リザーバーの底にある3/8インチの出口ポートに取り付けます。
   2. 吸引/抗凝固チューブのキャップを外し、採血リザーバーの上端にある1/4インチの血液入口ポートの1つに接続します。
   3. ウォッシュキットのボウルを回して挿入します。カチッという音が聞こえることを確認します。
   4. チューブをローラーポンプとチューブディバイダーに入れます。
   5. クエン酸リン酸デキストロースアデニン(CPDA)-1採血バッグをポールに吊るし、接続がしっかりしていることを確認します。
      注:CPDA-1血液バッグ組成物(63mL):2.99g / L無水クエン酸;26.3 g / Lクエン酸ナトリウム;2.22 g / Lモノヒスレートリン酸ナトリウム;31.9 g / Lデキストロース一水和物;0.275 g / Lアデニン。
   6. ゴミ袋を機械の側面に吊るし(正しく閉じていることを確認してください)、ウォッシュキット(黄色のキャップ)に接続します。
   7. 両方のY字型チューブ(白いキャップ)を0.9%NaClの3Lのバッグに接続します。
   8. 青いキャップ付きのチューブを採血リザーバーの底にあるアダプターチューブに取り付けます。自家輸血システムのスイッチを入れます。
6. 大動脈と大静脈のカニューレ挿入
   1. 500 IU/kgのヘパリンを投与し、2分間循環させます。尾側結紮糸を大動脈の周りに結び、大動脈に20フレンチカニューレを挿入して固定します。大静脈についても同じ手順が繰り返されます。
7. DCDの手順を模倣するために、胸部大動脈を一定期間(この場合は60分)クランプすることにより、温性虚血が誘発されます。
   注:温性虚血時には、空洞と頸静脈ドレナージが開き、セルセーバーへの採血が開始されます。これにより、豚は放血されます。
8. 肝臓を洗い流す
   1. 温かい虚血の終わりに、大動脈カニューレを通して2 Lの氷冷(4-6°C)保存溶液でコールドフラッシュを開始し、スラッシュアイスの局所塗布で腹部を冷却します。.
      注:コールドフラッシュ中に、残りのすべての血液が洗い流され、セルセーバーに収集されます。
   2. 最初の2Lが洗い流されたら、大動脈からカニューレを取り外し、結紮糸を門脈に結び、門脈をカニューレ状にします。次に、容器ループで固定します。
   3. 門脈 を介して 肝臓を別の2Lの氷冷(4〜6°C)保存溶液で洗い流します。
9. 切除
   1. 腹部から氷を取り除きます。胆管を膵臓の近くで横断します。
   2. ポータルカニューレを取り外し、ポータル静脈を分割します。腸を左に引っ込めて、肝下大静脈を露出させます。
   3. 後腹膜から解放された大静脈を解剖し、腎静脈から頭蓋骨だけを分割します。総肝動脈を腹腔動脈まで解剖し、大動脈から起点を分離します。
      注:右のダイヤフラムクラを切断すると、露出を改善することができます。
   4. 胃十二指腸動脈を分割し、大動脈のパッチで腹腔動脈を切り取ります。胃に近い小網を頭蓋から食道まで横断します
   5. 左の三角靭帯を切って左肝臓を動員します。大静脈の左側にある横隔膜をカットします。
   6. 右横隔膜を腹側から背側に切り落とし、肝下大静脈離断から尾側だけに終了して、右肝臓を動員します。
   7. 肝上大静脈を切断し、残りのアタッチメントを切断します。肝臓は今や自由です。それを取り出し、氷水を入れたボウルに入れます。
10. バックテーブル手順
    1. 肝臓の重さを量ります。25フレンチカニューレで門脈をカニューレ状にし、結紮糸で固定します。14のフランス強化カニューレで肝動脈をカニューレし、結紮糸で固定します。
    2. 肝下大静脈をカニューレし、カニューレの先端を肝静脈が大静脈に排出するレベルに配置します。合字で固定します。
    3. 横隔膜の静脈からの出血を防ぐために、横隔膜の端に巾着のひもを付け、肝上大静脈を結びます。
    4. ポータルカニューレの空気を抜き、250 mLのコールドプラズマエキスパンダーでポータル静脈のバックテーブルフラッシュを実行します。漏れがないか確認してください。
       注意: キャバルカニューレを通る適切な流出を確認してください。
    5. ポータルフラッシュの後、ポータルカニューレにチューブクランプを取り付け、カニューレとポータル静脈に空気が入らないようにします。
    6. 動脈カニューレの空気を抜き、250 mLの冷たい血漿エキスパンダーを肝臓動脈に流します。.漏れがないか確認し、側枝をクリップします。チューブclを配置しますamp動脈カニューレとキャバルカニューレに。

5.ノーマザーミックマシン灌流

1. 灌流液
   1. バックテーブルの準備中に、セルセーバーで生成した洗浄した赤血球を回路に加えて、目的のヘマトクリット値30%を得ます。ポンプを始動して、赤血球を血漿エキスパンダーと混合します。連続ガス分析計を始動します。
      注:目的のヘマトクリット値を得るための赤血球量の式:(肝臓重量+プライミング量)x洗浄後の目的のヘマトクリット/ヘマトクリット。連続ガス分析計は、通常、ヒーターの設定である38°Cと一致する灌流温度に関するフィードバックも提供します。
   2. 10 mLの10%グルコン酸カルシウム、2 mLのヘパリン(10.000 IU)、および750 mgのセフロキシムを10 mLの0.9%NaClに灌流液に加えます。.手動ガスブレンダーを0.5 L / min、FiO₂ 、21%に設定します。
2. 灌流の開始
   1. 圧力センサー、フローセンサー、ローラーポンプのスイッチを入れて、漏れ再循環を行います。
   2. 肝臓をレセプタクルに入れます。チューブクランプを回路のポータルと動脈流入管とキャバル流出管に置き、Yコネクタを切り取ります。
   3. カニューレをそれぞれのインフローチューブとアウトフローチューブに接続し、その間にT接続ピースを挟みます。回路に空気が入らないようにしてください。
   4. T接続ピースに三方タップを取り付け、圧力ラインを接続します。ラインの圧力をゼロにし、継続的な圧力監視を開始します。
   5. ピンチバルブをほぼ完全に閉じてセットし、生理学的上流と内皮ストレスを防ぎます。
   6. ポータルの流入からチューブクランプを取り外して灌流を開始します。ポータルの流入が始まった直後に、キャバルの流出からクランプを取り外し、ポンプを始動します。ポンプ速度は圧力制御されているため、キャバル流出の圧力は-5 mmHgから-2 mmHgの間を目指してください。0.75 mL/min/g肝臓の門脈流量を目指します。
   7. 門脈灌流が安定し、キャバル圧力が適切な場合は、動脈チューブからクランプを取り外します。圧力は約55〜60 mmHgで、肝臓は約0.25 mL / min / gの流量を目標にしてください。
3. 安定した灌流血行動態の維持
   1. 表面からの熱損失を防ぐために、肝臓をガラスのドームまたはラップで覆います。
   2. ポータルの流量が高すぎる場合は、ポータル流入チューブのピンチバルブを閉じます。
   3. キャバル圧力が負になりすぎると、大静脈内に真空が発生するリスクが高まります。過度の負圧は、ポンプ速度を遅くすることで対抗できます。あるいは、門脈からの流入を増やすと、大静脈により多くの量を提供することにより、負の流出圧力が減少します。
   4. 動脈圧が低すぎる場合は、ポンプ速度を上げるか、ピンチバルブをポータルリザーバーに向かって閉じて、動脈流入チューブを介してより多くの流れを押し出すことで、動脈圧を上げることができます。
4. サンプリング
   1. 灌流液のサンプルは、キャバルアウトフロー三方弁、または酸素供給器とポータルリザーバーの間の指定されたサンプリングラインから採取します。
   2. 灌流全体で針生検を受けます。回路のヘパリン化による凝固がないため、針穴を縫合する必要があります。
   3. 胆管に8フレンチカニューレを固定して胆汁を収集します。嚢胞性管を結紮するようにしてください。

提示された灌流プロトコルは、肝臓の血流の自己調節を使用して、最大 24 時間の安定した血行動態状態を達成し、門脈と肝動脈の血流の生理学的分布をシミュレートします。 図1 は、灌流回路の概略図を示しています。 図2A は、血流の一貫した分布を示しており、門脈と肝動脈は、それぞれ総肝流量の約75%と25%を占めて?...

ここでは、ブタの肝臓NMPの経験について詳しく説明します。この手法の利点には、高い翻訳価値と汎用性が含まれます。ブタ肝NMPは、この強化された保存技術を調査して理解を深めるため、または移植を模倣するために適用することができます。この設定により、灌流のあらゆる側面を手動で制御できるため、門脈と動脈の両方の圧力と流量をさまざまな方法で調整...

著者は何も開示していません。

筆者らは、これらの実験に携わったKUルーヴェン大学医学部の研究生の皆さんに感謝いたします。