İnsan Eklem Kıkırdak Eksplantlarında Atomik Kuvvet Mikroskobu Tabanlı Mikro Girintide Pratik Konuların Ele Alınması

Atomik kuvvet mikroskobu mikro girintileriyle ilgili en yaygın sorunları belirlemek ve ele almak için adım adım bir yaklaşım sunuyoruz. Çeşitli derecelerde osteoartrit kaynaklı dejenerasyon ile karakterize edilen yerli insan eklem kıkırdak eksplantlarında ortaya çıkan sorunları örneklendiriyoruz.

Şüphesiz, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) şu anda biyolojik alandaki mikro ve hatta nano ipuçlarını değerlendirmek için en güçlü ve kullanışlı tekniklerden biridir. Bununla birlikte, diğer mikroskobik yaklaşımlarda olduğu gibi, metodolojik zorluklar ortaya çıkabilir. Özellikle, numunenin özellikleri, numune hazırlama, alet tipi ve girinti probu istenmeyen artefaktlara yol açabilir. Bu protokolde, ortaya çıkan bu sorunları sağlıklı ve osteoartritik eklem kıkırdağı eksplantları üzerinde örneklendiriyoruz. Bu amaçla, ilk olarak, tüm doku eksplantlarının büyük 2D mozaik floresan görüntülemesi yoluyla, farklı dejenerasyon aşamalarına göre ex vivo eklem kıkırdak disklerinin nasıl oluşturulacağını, derecelendirileceğini ve görsel olarak nasıl sınıflandırılacağını adım adım gösteriyoruz. Ex vivo modelin en büyük gücü, erken başlangıçtan ilerlemeye kadar osteoartrit ile ilişkili değişikliklerin araştırılmasına izin veren yaşlı, yerli, insan kıkırdağını içermesidir. Ek olarak, doku hazırlamadaki yaygın tuzakların yanı sıra gerçek AFM prosedürü ve sonraki veri analizi de sunulmaktadır. Numune hazırlama ve işleme, gelişmiş dejenerasyonun neden olduğu topografik numune özellikleri ve numune-uç etkileşimi gibi temel ancak önemli adımların veri toplamayı nasıl etkileyebileceğini gösteriyoruz. Ayrıca AFM'deki en yaygın sorunları incelemeye tabi tutuyoruz ve mümkün olduğunda bunların nasıl üstesinden gelineceğini açıklıyoruz. Bu sınırlamaların bilinmesi, doğru veri toplama, yorumlama ve nihayetinde bulguların geniş bir bilimsel bağlama yerleştirilmesi için son derece önemlidir.

Elektronik cihazların ve sistemlerin sürekli küçülen boyutu nedeniyle, mikro ve nano tabanlı teknoloji ve ekipmanların hızlı gelişimi ivme kazanmıştır. Böyle bir cihaz, biyolojik yüzeyleri tarayabilen ve hem nano hem de mikrometre ölçeklerinde topografik veya biyomekanik bilgileri alabilen^atomik kuvvet mikroskobudur (AFM) ^1,2. Geniş özellikleri arasında, bu araç, çeşitli biyolojik sistemlerin mekanik özellikleri hakkında bilgi edinmek için bir mikro ve bir nano girinti olarak çalıştırılabilir 3,4,5,6. Veriler, ucunda yaklaşık 1 nm kadar küçük olabilen mekanik bir prob aracılığıyla yüzeyle fiziksel temas yoluyla toplanır⁷. Numunenin ortaya çıkan deformasyonu daha sonra konsol ucunun girinti derinliğine ve numuneye uygulanan kuvvete^{göre görüntülenir 8}.

Osteoartrit (OA), eklemlerde ve çevre dokularda eklem kıkırdağının bozulması ile karakterize, kemik yüzeylerinin tamamen açığa çıkmasına yol açabilen uzun süreli dejeneratif kronik bir hastalıktır. AE'nin yükü büyüktür; Şu anda, 65 yaş ve üstü tüm kadınların yarısı ve tüm erkeklerin üçte biri OA^9'dan muzdariptir. Travmalar, obezite ve bunun sonucunda eklemin^{değişmiş biyomekaniği 10}, ortak bir sonuç olarak görülen eklem kıkırdak dejenerasyonunu belirler. Ganz ve arkadaşlarının öncü çalışması, OA sürecinin ilk adımlarının kıkırdak^11'in biyomekanik özelliklerini içerebileceğini öne sürdü ve o zamandan beri araştırmacılar bu hipotezi^{doğruladılar 12}. Benzer şekilde, dokunun biyomekanik özelliklerinin, hücre-hücre ve hücre-matris karışmasının yanı sıra ultrastrüktürel organizasyon tarafından işlevsel olarak düzenlendiği genel olarak kabul edilir. Herhangi bir değişiklik, genel doku biyomekanik işleyişini önemli ölçüde etkileyebilir¹³. Bugüne kadar, OA tanısı kliniktir ve düz film radyografisine dayanmaktadır¹⁴. Bu yaklaşım iki yönlüdür: birincisi, OA tanısını formüle etmek için tanımlanmış bir dejeneratif kesme eşiğinin olmaması, durumun ölçülmesini zorlaştırır ve ikincisi, görüntüleme yöntemleri duyarlılık ve standardizasyondan yoksundur ve lokalize kıkırdak hasarını tespit edemez^15,16,17. Bu amaçla, kıkırdağın mekanik özelliklerinin değerlendirilmesi, hastalığın etiyolojisinden bağımsız olarak OA'nın seyri sırasında değişen ve çok erken bir aşamada doku işlevselliği üzerinde doğrudan etkisi olan bir parametreyi tanımlaması gibi belirleyici bir avantaja sahiptir. Girinti aletleri, dokunun girintiye direnme kuvvetini ölçer. Bu aslında yeni bir kavram değil; En eski çalışmalar 1980'lere ve 1990'lara kadar uzanıyor. Bu dönemde, çok sayıda çalışma, eklem kıkırdağının artroskopik ölçümleri için tasarlanmış indentasyon aletlerinin kıkırdaktaki dejeneratif değişiklikleri saptamak için çok uygun olabileceğini düşündürmektedir. 30 yıl önce bile, bazı çalışmalar, girinti aletlerinin artroskopi sırasında basınç sertliği ölçümleri yaparak doku dejenerasyonu sırasında kıkırdak yüzeyindeki in vivo değişiklikleri tespit edebildiğini gösterebildi^18,19,20.

Eklem kıkırdağının AFM girintisi (AFM-IT), dokunun önemli bir mekanik özelliği, yani sertlik hakkında bilgi sağlar. Bu, uygulanan, tahribatsız bir yük ile girintili doku alanının²¹ ortaya çıkan deformasyonu arasındaki ilişkiyi tanımlayan mekanik bir parametredir. AFM-IT'nin makroskopik olarak etkilenmemiş kollajen ağlarında sertlikteki yaşa bağlı değişiklikleri ölçebildiği, böylece OA başlangıcı ile ilişkili patolojik değişiklikler arasında ayrım yapabildiği gösterilmiştir (eklem kıkırdağında Outerbridge ölçeğinde derece 0)²². Daha önce, AFM-IT'lerin, erken kıkırdak dejenerasyonu için görüntü tabanlı bir biyobelirteç olarak uzamsal kondrosit organizasyonu temelinde, en erken dejeneratif mekanik değişikliklerin yalnızca ölçülmesine değil, aynı zamanda gerçekten belirlenmesine de izin verdiğini göstermiştik. Bu bulgular başkaları tarafından zaten doğrulanmıştır^23,24. Bu nedenle, AFM-IT, erken dejeneratif değişiklikleri teşhis etmek ve tanımlamak için ilginç bir araç görevi görür. Bu değişiklikler zaten hücresel düzeyde ölçülebilir ve OA patofizyolojik sürecinin anlaşılmasını yeniden şekillendirir.

Bu protokolde, doğal kıkırdak eksplantlarının hazırlanmasından AFM veri toplama ve işlemeye kadar eklem kıkırdak eksplantlarının eksiksiz bir histolojik ve biyomekanik derecelendirme prosedürünü gösteriyoruz. Adım adım bir yaklaşımla, eklem kıkırdak dokusunun farklı dejenerasyon aşamalarına göre nasıl oluşturulacağını, derecelendirileceğini ve görsel olarak sınıflandırılacağını, 2D büyük mozaik görüntüleme ve ardından mikro-AFM girintileri ile gösteriyoruz.

Şu anda, AFM-IT, kıkırdaktaki⁷ biyomekanik değişiklikleri ölçmek için en hassas araçlardan biri olmasına rağmen, diğer herhangi bir enstrümantal teknik gibi, hatalı veri toplamaya yol açabilecek sınırlamaları ve pratik özellikleri²⁵ vardır. Bu amaçla, kıkırdak eksplantlarının AFM ölçümleri sırasında ortaya çıkan en yaygın sorunları incelemeye tabi tutuyoruz ve mümkünse bunların nasıl en aza indirileceğini veya üstesinden gelineceğini açıklıyoruz. Bunlar, numunelerin topografik yönlerini ve bunları AFM uyumlu bir ortamda stabilize etmenin zorluklarını, doku yüzeyinin fiziksel özelliklerini ve bu tür yüzeylerde AFM ölçümlerinin gerçekleştirilmesinde ortaya çıkan zorlukları içerir. Hatalı kuvvet-mesafe eğrilerinin örnekleri de sunulmakta ve bunlara neden olabilecek koşullar vurgulanmaktadır. Konsol ucunun geometrisine özgü ek sınırlamalar ve veri analizi için Hertz modelinin kullanımı da tartışılmaktadır.

Almanya'da Tübingen Üniversite Hastanesi'nde total diz artroplastisi yapılan hastalardan toplanan femoral kondiller kullanıldı. Bu çalışmaya sadece dejeneratif ve posttravmatik eklem patolojileri olan hastalardan alınan eklem kıkırdak örnekleri dahil edildi. Çalışma başlamadan önce bölüm, kurum ve yerel etik kurul onayı alınmıştır (Proje no.674/2016BO2). Katılım öncesi tüm hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı.

NOT: Deney adımlarının kronolojik sırasına göre bir akış şeması Şekil 1'de verilmiştir.

1. Doku işleme ve kıkırdak disklerinin oluşturulması

1. Doku hazırlığı
   1. Ameliyat sonrası rezeksiyonu takiben, kıkırdak örneklerini %5 (h/h) penisilin-streptomisin ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyeri (DMEM) ile dolu bir kaba koyun. Numunelerin ortama tamamen daldırıldığından emin olun. Cerrahi rezeksiyon ile kıkırdağın daha fazla işlenmesi arasındaki süre 24 saati geçmemelidir. Numunenin kurumasını önlemek için tüm işlem boyunca numunelerin tamamen ortama daldırıldığından emin olun.
   2. Bir neşter kullanarak kıkırdağı kemikten kesin.
2. Kıkırdak disk üretimi
   1. Biyopsi zımbası kullanarak 4 mm çapında kıkırdak diskleri oluşturun.
      NOT: Kıkırdak tabakası kalınlığının 1 mm'yi geçtiği kondil bölgelerinin seçilmesi ve çıkarılması önemlidir. Bu, özellikle kıkırdak tabakasının tipik olarak aşınma ve yıpranma süreçleri veya dejenerasyon nedeniyle kalınlığını kaybettiği yük taşıma bölgelerinde sorunlu olabilir.
   2. Önceden oluşturulmuş 4 mm'lik kıkırdak diskleri özel yapım bir kesme cihazına yerleştirin ve kıkırdak diskleri bir spatula yardımıyla sabitleyin ve sabit tutun. Kıkırdak diskleri kesme cihazına yerleştirirken dikkatli olunmalıdır. Numuneleri, kıkırdağın en üst tabakası (eklem kıkırdağının yüzeysel bölgesi) bıçağa bakmayacak şekilde konumlandırın
   3. Kıkırdak diskleri jiletle kesin. Böylece 4 mm x 1 mm'lik disk şeklinde kıkırdak örnekleri oluşturulur. Numunenin kurumasını önlemek için, doku kesimini mümkün olduğunca çabuk gerçekleştirin.
   4. Her diski bir spatula yardımıyla toplayın ve oluşturulan kıkırdak disklerini %5 (h/h) penisilin-streptomisin ile desteklenmiş 1 mL DMEM içeren 1,5 mL'lik tüplere yerleştirin. Bir tüpe yaklaşık 15 disk yerleştirin.
3. Kıkırdak disklerin kriyotom kesiti (dik dilimler için)
   NOT: Bu adım isteğe bağlıdır ve kıkırdak diskleri içindeki hücresel patern dağılımının yandan görünüşlü bir görselleştirmesi isteniyorsa kullanılabilir. Hücresel paternin dağılımı eklem kıkırdağının 3 boyutlu bir özelliği olduğu için bir doğrulama yöntemi olarak kullanılabilir²⁶. Konfokal mikroskop kullanılarak tüm kıkırdak disklerinin optik kesitleri ve 3D rekonstrüksiyonları da kullanılabilir, bu nedenle numunelerin protokolde açıklandığı gibi kesitlenmesi ihtiyacını ortadan kaldırır.
   1. Kıkırdak diskini suda çözünür gömme ortamı ile örtün ve kriyotom düğmesinin kenarına yerleştirin (diskin yüzeyi düğmenin yüzeyine dik olacak şekilde). Kriyotom cihazında, gömme ortamı düşük sıcaklıklarda donar.
   2. Standart bir kriyotom kullanarak, diskin ortasına ulaşılana kadar (yani kriyoseksiyonlar 4 mm uzunluğa ulaştığında) dokuyu 60 μm kalınlığında yanlara doğru bölümlere ayırın ve dilimleri toplayın. Disk eksplantını dik olarak bölümlere ayırarak, kıkırdağın tüm bölgeleri (yüzeysel, orta ve derin) görselleştirilebilir.
   3. Bölümleri bir cam slayt üzerinde toplayın ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez yıkayarak suda çözünür gömme ortamını çıkarın.

2. Hücresel uzamsal modelin bir fonksiyonu olarak kıkırdak disk sıralaması

1. Disk şeklindeki kıkırdak örneklerinin boyanması
   1. 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna bir kıkırdak diski (bölüm 1.2) yerleştirin ve her oyuğa 1:1.000 seyreltmede 130 μL hücre geçirgen floresan boya ekleyin.
   2. Tüm plakayı görsel olarak inceleyin ve her bir oyuğa yalnızca bir disk yerleştirildiğinden emin olun. Plakayı 37 ° C'de standart hücre kültürü inkübatöründe 30 dakika inkübe edin.
2. 60 μm'lik kıkırdak dilimlerinin boyanması
   1. Kıkırdak disk kesitlerini (bölüm 1.3) forseps yardımıyla cam mikroskop lamlarına nazikçe yerleştirin.
   2. Kıkırdak bölümlerini nükleer DAPI karşı boyama içeren montaj ortamı ile örtün ve floresan mikroskobu için uygun lameller hafifçe yerleştirin.
   3. Her lamelin kenarlarını normal şeffaf oje ile kapatın ve 3 dakika kurumasını bekleyin.
3. Yukarıdan aşağıya ve yandan görünüşlü kıkırdak sıralama ve görüntüleme
   NOT: Her disk floresan mikroskobu altında incelenmelidir. Bu adımın amacı, diskleri baskın hücresel modellerine (tek sicimler, çift sicimler, küçük kümeler, büyük kümeler veya dağınık) göre sıralamaktır.
   1. 96 oyuklu plakayı floresan mikroskobunun plaka tutucusuna yerleştirin.
   2. Em 495 nm/Ex 515 nm (bölüm 2.1'de hazırlanan kıkırdak disklerinin yukarıdan aşağıya görüntülenmesi için) veya Em 358 nm/Ex 461 nm (bölüm 2.2'de hazırlanan kıkırdak bölümlerinin yandan görünüm görüntülemesi için) ve 10x objektif için uygun floresan filtresini seçin.
      NOT: 10x objektifin kullanılması, diskin tüm çevresinin incelenmesine olanak tanır ve homojen olmayan veya uygun olmayan boyamaya sahip numuneler hariç tutulabilir. Bununla birlikte, yalnızca yukarıdan aşağıya görünümün kullanılması, yüzeysel erozyon ile yukarıdan aşağıya gözlem için görünür hale getirilen daha derin doku katmanlarının analizinin bir sonucu olarak hücresel organizasyondaki değişikliklerin algılanmasına neden olabilir. Örnek olarak, kollajen kemerlerini takip eden artan bir ip, tek bir hücre veya dağınık hücreler (dağınık desen) olarak ^{algılanabilir26}. Sonuç olarak, uygun hücresel model seçimini sağlamak için disklerin her iki tarafı da incelenmelidir.
   3. Her kıkırdak diskinde görüntülenen hücresel deseni görsel olarak belirleyin. Bir diskin yalnızca bir tür hücresel modele sahip olması olası değildir. Diskin kondrosit düzenlemesinin ilgilenilen modelle eşleşmediği kısmı için, numuneleri yalnızca istenmeyen desen AFM ölçümlerinin yapılmadığı (yani, disk sınırından 0,5 mm'ye kadar) en çevredeyse kabul edin ve bunun diskin toplam yüzeyinin %10'unu geçmediğinden emin^{olun 27, 28}.
4. Tüm kıkırdak disklerinin görüntü alımı
   1. Mikroskobun 10x objektifini seçin ve ayrı bir kıkırdak diski içeren önceden seçilmiş kuyunun altına yerleştirin. Hücresel deseni görmek için diske odaklanın.
   2. Tüm kuyuya genel bir bakış elde etmek için Gezgin İşlevini seçin. Farklı bir sahne konumuna gitmek için farenin sol düğmesini kullanın ve sürükleyin. Fare tekerleği ile yakınlaştırın ve uzaklaştırın.
      NOT: Bu noktada, her bir ilgi alanına sırayla çift tıklanarak tüm numuneyi içeren kuyunun bir önizlemesi görülebilir.
   3. Taranacak ilgi alanını kapsayan bir kare seçin; Bu noktada, mozaiği oluşturan tüm tek karolar görünür hale gelecektir.
   4. Hücrelerin arka plandan net bir şekilde görselleştirilebilmesi için pozlamayı/ışık yoğunluğunu ayarlayın. Bu noktada, resmin parlaklığı/kontrastı tüm döşemeler için ayarlanmıştır ve artık her döşeme için ayrı ayrı özelleştirilemez.
      NOT: Diskin kenarına yakın hücreler genellikle merkezdeki hücrelerden daha yüksek bir floresan sinyali yaydığından, pozlama/ışık yoğunluğu ayarlarının uyarlanması gerekir.
      1. Pozlama süresinin belirli bir kanal için uygun olup olmadığını değerlendirmek için, histogramdaki sinyalin dağılımını inceleyin. Mikroskobun görüntü yazılımında bulunan otomatik pozlama mekanizmasını kullanarak, disk içinde bulunan tüm hücreleri görselleştirin.
   5. Yazılımın Odak Haritası Noktası seçeneğini seçin ve ardından ortasına sol tıklayarak her bir döşemeyi seçin.
   6. Odak Haritası seçeneğini seçin. Önceden seçilen tüm kutucukları içeren bir pencere görüntülenir. Görüntülemek ve doğru odağa getirmek için listedeki bir kutucuğa çift tıklayın.
   7. Odak planını kaydetmek ve bir sonraki kutucuğa geçmek için Z Ayarla'yı tıklatın. Her bir döşeme için odak planını ayarladıktan sonra, Taramayı Başlat'a basarak görüntü almaya başlayın.
      1. Tarama daha koyu yatay ve/veya dikey çubuklar görüntülüyorsa, bunun nedeni tek karelerin yanlış ve eşit olmayan şekilde aydınlatılması olabilir. Bunu, gerçek taramadan önce yazılımda bulunan Bağlantılı Gölgelendirme seçeneğini kullanarak çözün.
   8. Görüntüleri kaydedin, dışa aktarın ve doğru şekilde açıklama ekleyin.

3. Kıkırdak eksplantlarının biyomekanik yaklaşımı

1. AFM ölçümleri için numune hazırlama
   1. Hücresel bir desen (bölüm 2) içeren önceden seçilmiş her kıkırdak diskini biyouyumlu yapıştırıcı ile Petri kaplarına sabitleyin. Diskin üst, alt, sol ve sağ taraflarına yeterli miktarda numune yapıştırıcısı ekleyin.
   2. Diskleri L-glutamin içermeyen 2,5 mL Leibovitz L-15 ortamı ile örtün. Ortam tarafından oluşturulan dalgalar nedeniyle numunenin yüzeyden ayrılmasını önlemek için Leibowitz ortamını numunelerin üzerine nazikçe ekleyin.
2. Numunelerin AFM'ye yüklenmesi
   1. Petri kabını AFM cihazının numune tutucusuna yerleştirin ve 37 °C'ye ayarlanmış Petri bulaşık ısıtıcısını açın. Doku kültürü kabının istenen sıcaklığa ulaşmasına izin verin. Bu, sıcaklık değişiminin neden olduğu olası artefaktları dışlamak için yapılır.
3. AFM-konsol kalibrasyonu
   1. Yazılım kurulumunu daha önce Danalache ve ^ark.29 tarafından açıklandığı gibi başlatın.
   2. Sıvı ölçümleri için uygun bir cam blok konsol tutucu seçin ve dikkatlice AFM kafasına yerleştirin. Bir kilitleme mekanizması, cam bloğu AFM kafasına sabitler. Cam bloğun yansıtıcı yüzeyinin düz ve AFM tutucuya paralel olduğundan emin olun.
   3. Konsolu cam blok konsol tutucunun yüzeyine dikkatlice yerleştirin. Konsolun kendisi, cam bloğun ortasındaki cilalı optik düzlem üzerinde durmalıdır.
   4. AFM kafasında orta yoğuşmayı önlemek için konsol tutucunun tabanına dikkatlice bir silikon etek (silikon membran) yerleştirin.
   5. Step motor fonksiyonunu kullanarak konsolu 100 μm'lik adımlarla tamamen ortama daldırılana kadar indirin.
   6. Danalache ve ^ark.29 tarafından açıklanan yaklaşım parametreleriyle bir tarayıcı yaklaşımı çalıştırın. Petri kabının dibine ulaşıldığında konsolu 100 μm geri çekin.
   7. Tam adımları kullanarak konsolu kalibre edin ve Danalache ve ^ark.29 tarafından açıklanan parametreleri çalıştırın. Kalibrasyonun sonunda, dikey sapma kaydedilir ve fotodiyot dedektörü tarafından orijinal kayıt birimi olan volt (V) yerine Newton (N) kuvvet birimlerinde görüntülenir. Buradaki deneylerde, kalibrasyondan sonra 4.47 nN'lik bir ayar noktası ortaya çıktı.
   8. Step motor fonksiyonunu kullanarak konsolu 1.000 μm'ye kadar geri çekin.
4. AFM altında istenen kıkırdak ölçüm yerinin belirlenmesi
   NOT: Kıkırdak disklerin kalınlığının 1 mm olması nedeniyle, numune üzerinde gezinirken konsol görüş alanında görünmez.
   1. Konsolu tanımlamak için mikroskobun CCD kamerasını kullanın. AFM konsolu, Petri kabının numune alınmayan bir alanına yerleştirilmelidir.
   2. Danalache ve ^ark.29 tarafından açıklanan parametrelerin aynısını kullanarak, Petri kabının temiz, örneksiz bir alanında konsol ile bir tarayıcı yaklaşımı başlatın.
   3. Step motor kontrolü ile konsolu plakanın altından 1.5 mm uzağa geri çekin. Bu adım, konsol ile numune arasında doğrudan bir çarpışmayı önlemek için çok önemlidir.
   4. Parlak alandan floresan görünümüne geçin ve diskin üst kısmını görsel olarak belirleyin.
   5. AFM numune tutucuyu diskin ortasına doğru tam olarak 2 mm hareket ettirin. Bu nokta kıkırdak diskin merkezi olarak kabul edilir.
   6. Bir tarayıcı yaklaşımı çalıştırın ve kıkırdak diskin yüzeyine ulaşıldığında, konsolu 100 μm geri çekin.
5. Kuvvet-mesafe eğrisi ölçümleri
   1. İstenilen ölçüm bölgesinde konumlandırılan hücrelere odaklanın. Ölçümleri ve hedeflenen konumda kuvvet-mesafe eğrilerinin oluşturulmasını başlatmak için Çalıştır düğmesine tıklayın.
   2. Her ölçüm bölgesinde beş kuvvet-mesafe eğrisi elde edin. Konsolu 500 μm geri çekin ve konsolu bir sonraki ölçüm alanına taşıyın.
      NOT: Kıkırdak disk yüzeyi homojen olmadığı ve düzensizlikleri olduğu için konsolun geri çekilmesi çok önemli bir adımdır. Numunenin yüzeyindeki yüksek bir tepecik, dramatik bir çarpışmaya neden olarak istenmeyen konsol ucuna/numune hasarına yol açabilir. Diskin yüzeyine dağılmış en az beş farklı ölçüm bölgesi seçmenizi ve her bölgede en az beş kuvvet mesafesi eğrisi elde etmenizi öneririz.
   3. Kuvvet mesafesi eğrilerini inceleyin ve kaydedin.
6. Hertz uyum modeli kullanılarak Young moduli'nin tahmini
   1. Analiz edilecek oluşturulan kuvvet-mesafe eğrilerini (.jpk dosyası) veri analiz yazılımında Toplu Spektroskopi Eğrileri Aç seçeneğini kullanarak açın.
   2. Hertz sığdırma modelini seçin ve ardından Esneklik sığdırma seçeneğini belirleyin.
      1. Esneklik sığdırma seçeneği, seçilen kuvvet mesafesi eğrisi üzerinde aşağıdaki hesaplamaları otomatik olarak gerçekleştirir: taban çizgisini hesaplar ve taban çizgisi uzaklığını kaldırmak için tüm eğriden çıkarır (taban çizgisi y ekseninde sıfıra geri getirilir); kuvvet-mesafe eğrisinin sıfır kuvvet çizgisini geçtiği noktayı tespit ederek temas noktasını belirler (temas noktası x ekseninde sıfıra ayarlanır); uç-numune ayrımını hesaplar (konsolun bükülmesini hesaba katan piezo'nun yükseklik sinyali çıkarılır); ve kuvvet-mesafe eğrisini seçilen modele otomatik olarak uyar. İstenirse, bu adımların her biri bağımsız olarak da gerçekleştirilebilir.
   3. Aşağıdaki uyum parametrelerini kullanarak uyarlayın: 0,5 Poisson oranı ve uygun konsol ucu yarıçapı.
      NOT: Küresel konsol uçlu bir konsol kullanırken, Hertz fit modeli kullanılmalıdır. Bu çalışmada kullanılan konsol, 5 μm yarıçaplı küresel bir uca sahipti. Uygulanan maksimum kuvvete ulaşılana kadar (ayar noktası) kuvvet mesafesi eğrisini takmanızı öneririz.
   4. Doğruluğu sağlamak için kuvvet-mesafe eğrisinin uyumunu görsel olarak kontrol edin. Bu adım, analiz edilen kuvvet-mesafe eğrilerinin her biri için yapılmalıdır.
7. Girinti derinliği belirleme
   NOT: Kullanılan veri analiz aracına bağlı olarak bu işlem farklılık gösterebilir. Deneyci, veri analiz programında yer alan bir dizi adımı izleyerek girinti derinliğini kolayca okuyabilir.
   1. Oluşturulan kuvvet-mesafe eğrilerinin her birini veri analiz yazılımında açın ve analiz süreci olarak Hertz fit Modelini seçin.
   2. Dikey sapma eksenini (y ekseni) sıfırlamak için Taban Çizgisi Uzaklığını Çıkar seçeneğini uygulayın ve Kaydırma + Eğim işlevini seçin.
   3. Otomatik olarak sıfır x koordinatına getirilen temas noktasını otomatik olarak tanımlamak için Temas Noktası Bul işlevini kullanın.
   4. Dikey Uç Konumu işlevini kullanarak, girinti sırasında ham piezo yüksekliğinden yalnızca konsol sapmasını hesaba katan mesafeyi çıkarın.
   5. İşlenmiş kuvvet-mesafe eğrisini görüntülemek için Esneklik Sığdırma seçeneğini belirleyin ve grafiğin alanını, Dikey Uç Konumu Ekseninde (x ekseni) en negatif değerle hizalanacak şekilde seçin.
   6. Girintiyi parametre sekmesindeki X Min kutusundan okuyun ve belgeleyin. Sonuçları kaydedin ve belgeleyin.

4. İstatistiksel analiz

1. İstatistik yazılımını açın. Açılan menüden Yeni Veri Kümesi'ni seçin.
2. DataSet dosyasını seçtikten sonra Değişken Görünümü sekmesini açın. Her hücresel örüntü kategorisi için sayısal değişkenleri tanımlayın: tek diziler = SS, çift diziler = DS, küçük kümeler = SC, büyük kümeler = BC, dağınık ve Young moduli.
3. Veri görünümü sekmesinde, karşılık gelen hücresel model kategorilerinin her biri için ölçülen Young modül verilerini girin. Menü çubuğundan Çözümle'yi ve ardından Araştırmacı Veri Analizi'ni seçerek veri dağıtımını analiz edin.
4. Bağımlı değişken olarak Young'ın Moduli'sini ve faktör listesi olarak Hücresel Model'i seçin. Sonuçlar bölümü için kullanılan bir kutu çizimi, çıktı dosyasındaki sonuçlar arasında görüntülenir.
5. İstatistiksel bir analiz yapmak için, analiz menü çubuğu sekmesinin parametrik olmayan test bölümünde Bağımlı Örnekler'i seçin. Alanlar sekmesi altında Test Alanları olarak Young's Moduli'yi ve Gruplar olarak Hücresel Desen'i seçin. Çalıştır'a basın.
   NOT: Sonuçlar çıktı dosyasında görüntülenir. İstatistiksel analiz için bir Friedman testi yapılır.
6. Parametrik olmayan testin p değerlerini, adım 4.4'te oluşturulan kutu grafiğine dahil edin. Menü çubuğunda Dosya'ya tıklayıp Kaydet'i seçerek sonuçları kaydedin.

Kendi kendine yapılan bir kesme cihazı kullanarak, tek bir hücresel uzamsal desen içeren taze insan kondillerinden küçük (4 mm x 1 mm) kıkırdak diskleri çıkarabildik ve üretebildik³⁰ tek sicim (SS, Şekil 2A), çift sicimler (DS), küçük kümeler (SC), büyük kümeler (BC; Şekil 2A) ve dağınık (Şekil 2B). Temsili bir kıkırdak eksplantı Şekil 3A'da gösteri...

İlerleyici ve multifaktöriyel bir hastalık olan OA, eklem kıkırdağında yapısal ve fonksiyonel değişiklikleri tetikler. OA seyri boyunca, mekanik özelliklerdeki bozulmalara eklem kıkırdağı yüzeyindeki yapısal ve biyokimyasal değişiklikler eşlik eder^27,31. OA'da meydana gelen en erken patolojik olaylar, kollajen ağının bozulması ile birlikte proteoglikan tükenmesidir^32,33,34

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Tübingen Üniversite Hastanesi Ortopedik Cerrahi Anabilim Dalı'ndan ortopedi cerrahlarına doku örneklerini sağladıkları için teşekkür ederiz.